Maintien des lignées génétiquement modifiées

Une restriction alimentaire de trente à trente-cinq jours, commencée à cinq semaines d'âge, reproduit chez des souris adolescentes la dénutrition chronique de l'anorexie mentale. 1 232 souris vont être utilisées, 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 848 un niveau modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. S'y ajoutent cinq injections sous-cutanées, quinze mesures de glycémie, quatre prélèvements à la veine caudale, la pose de microélectrodes sous anesthésie légère et, pour les lignées génétiquement modifiées, une biopsie de l'oreille entre le septième et le dixième jour de vie. Le porteur signale que la restriction peut provoquer hyperactivité, hypothermie, stress et compétition pour la nourriture, et annonce cinq tests comportementaux qu'il qualifie de non dommageables sans préciser lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires caractérisé par une restriction alimentaire sévère et une activité physique compulsive, conduisant à une dénutrition chronique et à des complications somatiques et psychiatriques graves. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM présente le taux de mortalité le plus élevé ainsi qu’un risque de rechute important. Malgré un déficit énergétique majeur, les patients atteints d’AM développent des adaptations métaboliques remarquables, notamment la capacité à maintenir une glycémie stable. Dans un contexte de restriction alimentaire prolongée associée à une augmentation de la dépense énergétique due à l'exercice physique, l’organisme met en place des mécanismes d’adaptation, en particulier au niveau de la production endogène de glucose. Cette production, essentielle à la survie en dehors des périodes de repas, est activée en réponse au jeûne. Chez ces patients, on observe également une préférence marquée pour les aliments connus pour réduire la sensation de faim en stimulant la production de glucose. Nous formulons l’hypothèse que chez les patients atteints d’AM, la production de glucose est influencée par deux facteurs majeurs : l’activité physique excessive et la consommation préférentielle de certains types d’aliments, permettant ainsi à l’organisme de mieux faire face au déficit énergétique. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et neurobiologiques impliqués dans cette adaptation métabolique en utilisant un modèle animal validé. Les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’amélioration des stratégies de prise en charge nutritionnelle des patients souffrant d’AM et à l’adaptation des recommandations concernant leur activité physique

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle de souris conçu pour s’approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l’AM peut aider à trouver des méthodes plus spécifiques de prise en charge. Il est également important de noter que le taux d'échec du traitement de l'anorexie est très élevé (environ 40% des patients). Ce projet permettra de faire de nouvelles découvertes sur les stratégies nutritionnelles et les adaptations métaboliques associées à la dénutrition, ainsi que l’adaptation des recommandations concernant l’activité physique, avec un impact économique et sociétal important.

Procédures

- Les souris recevront des injections pendant 5 jours consécutifs à partir de l’âge de 5 semaines en sous-cutané (10 secondes, 5 fois). -Pendant une période maximale de 30-35 jours, les souris auront une restriction alimentaire. -Deux à trois fois par semaine, une mesure de la glycémie sera réalisée (5 secondes, 15 fois). -Une mise à jeun de 6h sera réalisée pour certains lots de notre projet -Un prélèvement de sang en cours de protocole sera réalisé au niveau de la veine caudale (4 prélèvements réalisés en 1 min chacun) -Certains animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique (10 secondes maximum) et puis 10 min plus tard, d’anesthésique en intrapéritonéal (10 secondes maximum) puis subiront une chirurgie terminale. - Des microélectrodes seront posées en sous-cutané pendant 10-15 min sous anesthésie légère, pour réaliser un électrocardiogramme. - Pour l’élevage des souris KO GHSR, une biopsie d'oreille est réalisée entre le 7eme et 10eme jour postnatal (durée 30 secondes, 1 fois). - Le niveau d'anxiété des souris sera évalué par cinq tests comportementaux non dommageables d'une durée de 5 à 30 min selon les tests en question.

Impact sur les animaux

La restriction alimentaire entraîne une perte de poids et peut provoquer une hyperactivité, une hypothermie et un stress. Une compétition pour la nourriture est susceptible d’apparaitre. Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress et une douleur légers. Les souris invalidées pour le gène d'intérêt présentent une anxiété légère. Les tests comportementaux utilisés peuvent générer un stress léger. Les injections en sous-cutané de tamoxifène causent un stress et une douleur légère de courte durée. La pose des microélectrodes pour mesurer l'électrocardiogramme peut induire une légère douleur au réveil. La biopsie d'oreille pour le génotypage genère une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, l’anorexie mentale, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et un dialogue soutenu et complexe entre le système nerveux central et plusieurs organes périphériques. Notre étude nécessite ainsi une approche intégrée que nous ne pouvons obtenir que par l’utilisation de modèles animaux. Les autres approches disponibles ne prennent pas en compte les variations induites par les communications subtiles entre différents systèmes fortement interconnectés dans le cadre de cette maladie qui font de tous les organismes vivants de réels écosystèmes dont la complexité est difficilement réductible à l’utilisation de modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste à partir des résultats d’études précédentes menées par notre laboratoire et nos collaborateurs. Ce nombre a été établi sur différents paramètres statistiques ainsi que sur la variabilité inter-individus. Les années de pratique du laboratoire et du personnel qualifié nous ont permis de standardiser nos expérimentations le plus possible afin de diminuer les sources extérieures de variabilité inter-individus. Nos résultats seront analysés grâce à des tests statistiques adaptés.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi quotidiennement (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis et précoces, sera communiqué au responsable du projet et les mesures pour remédier à la souffrance de l’animal seront mises en œuvre en cas de point limite atteint (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). De même, en cas de petites plaies causées par les souris, une crème aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée. Une habituation débutera dès l’arrivée des animaux. Les animaux seront hébergés par groupe de 2, pour limiter le stress et l’hypothermie induits par la restriction alimentaire, avec enrichissement, et seront manipulés régulièrement. Lors du nourrissage, une portion sera distribuée sous forme de 3 repas pour limiter le stress de la restriction alimentaire. Pour limiter l’apparition de dominance, 2 souris de poids similaire seront hébergées dans une même cage. Les changes des cages et la manipulation des animaux sont réalisés par la même personne pour limiter tout stress supplémentaire. Dans les conditions d’hébergement, aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris invalidées pour le gène d'intérêt.

Choix des espèces

Le modèle de souris de restriction alimentaire chronique utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour explorer le comportement alimentaire, la régulation du glucose, les processus addictifs et le métabolisme énergétique de manière plus générale. Les processus biologiques mis en jeu sont particulièrement bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’humain. L’anorexie mentale (AM) est un trouble neuropsychiatrique qui touche des sujets jeunes adultes et des adolescents. La majorité des procédures sera donc débutée chez des souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de 5 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les protocoles que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines ; ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 14-15 semaines (souris adultes).

Les souris élevées ici sont transgéniques et immunodéficientes, ce que le porteur qualifie de "phénotype dommageable" et qui les expose à développer des infections. 1 225 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 103 d'entre elles et modéré pour 122, la seule intervention déclarée étant le déclenchement de ce phénotype. Le porteur affirme pourtant que ce phénotype ne s'exprime pas, les conditions d'hébergement en cages ventilées avec litière et aliments stérilisés l'empêchant, et que ces souris se reproduisent normalement en l'absence de pathogène. L'élevage sert à produire des souriceaux pour des greffes de neurones humains, les géniteurs étant tués en fin de fertilité vers six mois et les autres transférés en zone d'expérimentation pour être inclus dans d'autres projets.

Objectifs

Nous élevons des souris immunodéprimées en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation (greffes).

Bénéfices attendus

Cette lignée est utilisée car son immunodéficience rend possible la greffe de neurones d'autres espèces, et donc la recherche en neurobiologie humaine.

Procédures

La seule intervention qui pourrait intervenir sur les animaux est le déclenchement de leur phénotype dommageable, soit le développement d'infections à cause de l'immunodéficience.

Impact sur les animaux

En présence de pathogène, ces souris risquent de développer des infections. Cependant, en l'absence de pathogène, ces souris se reproduisent normalement et n'ont pas de phénotype dommageable. Vues les conditions d'hébergement, ce phénotype ne s'exprime pas.

Devenir

Les animaux arrivant en fin de fertilité (maximum 6 mois d’âge) sont mis à mort. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d’Expérimentation et inclus dans d’autres projets d'expérimentation en utilisation continue.

Remplacement

Nous utilisons des souris pour un projet expérimental de greffe de neurones humains. Pour qu'il y ait tolérance de ces neurones, nous devons travailler avec des souris immunodéficientes.

Réduction

Nous élevons les souris en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation. Il s'agit donc de produire de manière optimale des femelles et des mâles pour accouplement, et des petits pour expérimentation.

Raffinement

Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Nos conditions d’élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s’exprimer: cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment et eau stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d’animaux dans la cage. Les points limites définis dans le cadre du suivi des animaux sont précoces avec grille de décision et d'administration d'analgésique de manière à éviter une installation de la douleur.

Choix des espèces

Nous étudions le cervelet humain. Nous avons pour cela besoin d'un modèle mammifère de cervelet. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons pour des raisons éthique la souris comme modèle plutôt q'un primate ou autre Mammifère. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux utilisés auront entre 2 et 6 mois.

8 106 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant subir une biopsie de la queue, un gavage hebdomadaire pendant douze semaines et cinq jours consécutifs d'injections intrapéritonéales de tamoxifène. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 5 166 d'entre elles et modéré pour 2 940, avec un stress lié à la contention, une douleur modérée à la biopsie caudale et des pertes de poids possibles. Les intestins et les fèces sont prélevés après mise à mort, pour comprendre comment l'alimentation agit sur le renouvellement de l'épithélium intestinal, les souris non retenues pour les procédures étant elles aussi tuées. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement", tout en indiquant que certaines études pourront être menées sur des organoïdes issus de ces mêmes souris, et aucun effectif n'est avancé pour justifier les 8 106 animaux.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objectif de comprendre comment les tissus de l'intestin se renouvellent et d'identifier les mécanismes contrôlant ce renouvellement. Il propose d'étudier les effets de l’alimentation sur ce renouvellement. Il vise à identifier les protéines essentielles à la physiologie intestinale et pouvant être les médiatrices des effets de l'alimentation sur l’intestin. En outre, la contribution de la flore intestinale dans les effets de l'alimentation sur ce tissu sera étudiée.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques (alimentation pauvre en calories) ou délétère (régimes riches en graisses) de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.

Procédures

• biopsie de queue : 10 secondes. • Contention pour gavage : 20 secondes (1X par semaine pendant 12 semaines)• Contention pour injection intrapéritonéale tamoxifène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). Contention pour injection intrapéritonéale d’anesthésique: 20 secondes. Prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de la contention, des injections intrapéritonéales et des gavages. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. Une douleur modérée lors de la biopsie caudale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés. Certaines études pourront être réalisées sur des organoïdes issus de ces animaux, permettant ainsi de tester plusieurs drogues à partir d’une seule souris.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des grilles de points limites spécifiques sont établies. Le raffinement comprend l’utilisation d’anesthésiques avant le prélèvement sanguin. Pour les gavages des canules en inox adaptées à l'âge des souris sont utilisées.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 8 à 16 semaines, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

À cinq à dix jours de vie, on leur coupe l'extrémité de la queue pour lire leur génotype. Celles qui portent les mutations recherchées reçoivent ensuite une injection quotidienne pendant cinq jours au plus, qui peut leur faire perdre du poids et de la mobilité pendant autant de temps, et une partie des femelles gestantes passe jusqu'à trois jours isolée. 4 078 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, pour décrire les étapes précoces d'un type de tumeur cérébrale qui représente moins de 10 % des gliomes. Les non-porteuses sont tuées faute de pouvoir être placées ailleurs, les reproductrices dès que leur fertilité baisse, les porteuses pour qu'on prélève leurs organes.

Objectifs

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primitives malignes de l’adulte. Les mutations génétiques impliquées dans l’apparition de ces tumeurs ont été caractérisées et ont permis de mettre en évidence différents sous-groupes de gliomes, dont la prise en charge peut différer en fonction des altérations identifiées. Cependant, les traitements actuels ne sont pas suffisants pour éradiquer ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les études ont mis en évidence une forte complexité de la biologie de ces tumeurs. En effet, elles sont composées de nombreuses populations cellulaires dont les fonctions évoluent en fonction du stade de développement de la tumeur. Il apparait donc impératif de mieux caractériser la dynamique de ces populations cellulaires et de leurs interactions et d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents. De plus, peu d’études scientifiques ont caractérisé les dynamiques cellulaires dans les étapes précédant la formation de tumeurs, lorsque seulement une ou deux mutations génétiques sont présentes. Ce projet aura pour objectif de renforcer les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement d’un type de gliome spécifique, les oligodendrogliomes, grâce à différentes lignées de souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Les oligodendrogliomes représentent moins de 10 pourcents des gliomes qui touchent environ 4000 nouvelles personnes par an en France. Les oligodendrogliomes sont rares, ont un pronostique plus favorable que d’autres tumeurs cérébrales. Pourtant, il n’existe pas de traitement curatif pour ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les différentes étapes du développement tumoral, notamment les étapes précoces, ne sont pas vraiment caractérisées pour le type de tumeurs cérébrales que nous souhaitons étudier au cours de ce projet (les oligodendrogliomes). Ainsi, ce projet pourrait permettre de décrire pour la première fois les conséquences des modifications génétiques spécifiques dans l’apparition et le développement des oligodendrogliomes. De plus, il pourrait permettre de comprendre comment un type de cellules spécifiques modifiées impactent le fonctionnement des autres cellules cérébrales. Les données obtenues pourront être évaluées sur de nouveaux modèles tumoraux in vitro, afin de réduire le recours aux animaux pour ce type de tumeurs. A terme ce projet renforcera les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des oligodendrogliomes et pourrait permettre l’identification de biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de ces tumeurs.

Procédures

Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animal vigile pour l’ensemble des jeunes animaux produits pour identifier leur patrimoine génétique (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal). Une partie des animaux recevra une injection quotidienne d’une molécule permettant de mettre en place le modèle (animal vigile, moins d’une minute par injection, maximum 5 jours consécutifs). Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes pendant 3 jours maximum. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux ils ressentiront une légère et brève douleur. Les injections seront associées à une légère douleur et un inconfort. Les injections de la molécule permettant de mettre en place le modèle chez les souriceaux de deux lignées génétiquement modifiées peuvent s’accompagner d’une perte de poids et de mobilité, qui peut durer jusqu’à 5 jours. Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes, maximum 3 jours, cela pourra générer un stress social.

Devenir

Tous les animaux reproducteurs seront euthanasiés lorsque l’on observe une baisse de la fertilité. Les animaux générés non porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer du fait de leur modification génétique. Les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes d’intérêt pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Les tumeurs cérébrales, depuis la première mutation jusqu’à la tumeur formée, sont des pseudo-organes complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales. En effet, dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement composé de molécules et cellules cérébrales saines (cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, neurones). Ce microenvironnement joue un rôle clé dans le développement et la résistance au traitement des tumeurs. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Nous utilisons des modèles in vitro qui nous permettent de mettre en évidence les effets directs des mutations sur la biologie de la cellule mais uniquement sur du court terme car ces modèles ne se maintiennent pas au-delà de 8 jours. Cependant ces modèles cellulaires ne nous permettent pas d’explorer les interactions avec d’autres populations cellulaires. Nous mettons actuellement en place des modèles de co-culture de plusieurs populations cellulaires afin de répondre à certaines de nos questions scientifiques tout en réduisant notre recours à l’animal. Malgré tout, ces modèles restent imparfaits car ne reconstituent pas complètement le contexte biologique (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales. L’utilisation d’organismes entiers est donc importante pour décrire et comprendre, au cours du temps, les effets des mutations sur certaines cellules spécifiques dans le cerveau, et les conséquences sur les autres populations cérébrales. C’est la raison pour laquelle dans ce projet nous utiliserons des lignées de souris génétiquement modifiées présentant des mutations dans les gènes d’intérêt pour notre objectif scientifique.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences. Le nombre d’animaux choisi est basé sur des données que nous avons précédemment obtenues ainsi que sur des calculs utilisant des outils statistiques. Ces calculs nous permettent de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des données scientifiques valides. Nos lignées de souris génétiquement modifiées ont une génétique complexe, ce qui nécessite de nombreux croisements avant d’obtenir les animaux portant le patrimoine génétique d’intérêt. Nous optimiserons nos stratégies de croisement afin que le maximum de souris soient utilisés et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires. Au total nous prévoyons 4078 souris dans ce projet afin de maintenir nos lignées et produire les lots expérimentaux nécessaires pour nos analyses.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et les conditions d’enrichissement de l’environnement, de sociabilité et soins respectent la règlementation de la directive européenne et sont contrôlés quotidiennement. Les animaux bénéficient d’eau et de nourriture (adaptée au stade physiologique) à volonté. Ils sont observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et 2 fois par semaine par l’équipe de recherche. En cas d'anomalie un suivi est mis en place en collaboration entre l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Le prélèvement pour génotypage est rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et est de la taille la plus petite possible. On utilise du matériel propre et désinfecté entre chaque animal, et on s’assure après le geste que le souriceau soit bien repris en charge par sa mère. Concernant les animaux dont l’état général peut être dégradé suite à l’injection de la molécule permettant d’induire la modification génétique, ils seront suivis quotidiennement, par examen de leur aspect physique. Un apport alimentaire et hydrique complémentaire sous forme de gel pourra être apporté, en consultation avec la SBEA. Les animaux recevant une injection d’un agent euthanasiant seront sédatés au préalable pour réduire leur stress et éviter toute douleur liée à l’euthanasiant.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal classiquement utilisé dans les expériences et les études thérapeutiques menées en cancérologie. De très nombreuses connaissances sur les mécanismes de formation des tumeurs ont été découverts et caractérisés chez la souris. De plus nous avons dans cette étude besoin de mammifères modifiés génétiquement, et les souris sont les animaux pour lesquels cette technique est la plus développée. Nous utiliserons des souriceaux, jeunes adultes et adultes. L’utilisation des souriceaux (stades postnataux) permettra de cibler un nombre important de cellules d’intérêt afin d’étudier l’impact des gènes d’intérêt sur différents processus cellulaires. Les stades adultes permettront de déterminer si les cellules d’intérêt adultes sont également sensibles aux différentes mutations. Enfin, l’utilisation des animaux à différents temps post-induction des mutations génétiques permettra de comprendre les effets courts et long terme des mutations. Ceci est particulièrement important car chez les patients les mutations semblent apparaitre tôt au cours de la vie (enfance-adolescence) alors que les tumeurs sont diagnostiquées à l’âge adulte (40 ans). Nous prélèverons les animaux pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 5 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre leur modification génétique très tôt pour leur inclusion dans nos lots expérimentaux.

Venues d'élevages commerciaux ou de lignées jugées sanitairement douteuses, 1 075 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Vingt mâles sont vasectomisés, les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones puis sont tuées pour qu'on récupère leurs ovocytes, et les receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryons de dix minutes. Elles ne seront pas réimplantées une seconde fois, le porteur indiquant que la zone devient trop vascularisée et saignerait abondamment. Une partie des femelles finira replacée comme "femelles de compagnie" des mâles vasectomisés, vingt par an selon le texte, deux cents selon le décompte joint au résumé, les autres étant tuées.

Objectifs

Le but du projet est de produire des souris génétiquement modifiées en bonne santé, dans un environnement totalement sain, c’est-à-dire sans microbes ou parasites. Pour cela, on utilise une méthode qui consiste à réimplanter des embryons dans des conditions stériles. Ces embryons peuvent venir de souris vivantes, de sperme ou d’embryons congelés. Il est essentiel que les souris utilisées en recherche soient exemptes de toute pathologie pour garantir leur bien-être et assurer la fiabilité des résultats scientifiques. Lorsqu’une lignée provient d’un établissement dont les normes sanitaires sont moins strictes, une procédure de « décontamination » est nécessaire. Celle-ci vise à éliminer tout agent pathogène ou microbe potentiel, afin de permettre l’intégration des animaux dans la plateforme d’hébergement dans des conditions sanitaires optimales. Cette décontamination se fait en récupérant les embryons de souris donneuses, en les lavant soigneusement, puis en les transférant dans des femelles receveuses saines. Les souris donneuses sont traitées par injection d’hormones sexuelles afin de produire un grand nombre d’œufs (ovocytes), qui seront ensuite fécondés. Les femelles dans lesquelles seront réimplantés les embryons (femelles receveuses) seront préalablement accouplées avec des mâles rendus stériles (par vasectomie) pour que les embryons réimplantés soient dans un environnement hormonal propice à leur développement au cours de la gestation. Les embryons peuvent être obtenus naturellement par accouplement, ou créés en laboratoire par fécondation in vitro à partir de sperme frais ou congelé. Aujourd’hui, le transport de souris se fait de plus en plus souvent sous forme de matériel génétique (embryons ou sperme congelé), plutôt que de déplacer des animaux vivants entre animaleries parfois très éloignées. Grâce à ce matériel congeler, il est ensuite possible de « faire revivre » une lignée en recréant des souris vivantes, tout en limitant les risques sanitaires liés au transport d’animaux. Les souris produites sont utilisées par les chercheurs afin de mieux comprendre le rôle de certains gènes, à étudier des mutations génétiques, et à tester de nouvelles thérapies, quand les modèles alternatifs ne peuvent pas être utilisés. En moyenne, la plateforme réalise environ quinze projets de transfert d’embryons par an, soit en décontaminant des animaux vivants, soit en réimplantant des embryons obtenus à partir de matériel congelé.

Bénéfices attendus

Le transfert aseptique d’embryons permet de garantir que toutes les souris élevées de la plateforme d’hébergement grandissent dans un environnement totalement sain, sans microbes ou germes nuisibles. Ce niveau sanitaire de propreté est défini par l’absence de bactéries, virus et parasites définis par une liste officielle de référence. Grâce à cette méthode, les souris vivent sans risque d’infections tout au long de leur vie. Cela permet non seulement de garantir leur bien-être, mais aussi d’assurer une bonne reproduction et des résultats fiables pour les recherches scientifiques. Enfin, comme ces souris sont élevées dans des conditions sanitaires très strictes, elles peuvent être envoyées sans problème dans d’autres centres de recherche pour y poursuivre des expérimentations.

Procédures

Le transfert aseptique d’embryons nécessite 3 types d’intervention sur 3 lots différents de souris. Pour un projet de décontamination d’une lignée : - Un lot de 20 souris mâles sera rendu stérile par vasectomie. Ils seront utilisés pour tous les projets de transfert aseptique d’embryon réalisés au cours d’un année. Ces souris subiront une chirurgie visant à couper le canal délivrant les spermatozoïdes dans le sperme. Afin de limiter la douleur, les animaux seront anesthésiés par injection d’un mélange d’anesthésiant et d’analgésiques. Chaque animal recevra une injection d’antidouleur sous la peau (5 sec), suivi 30 min après d’une injection antalgique/anesthésique sous la peau (5 sec). Pendant l’anesthésie, ils recevront une injection d’anesthésique local sous cutanée sur la zone d’incision. L’opération chirurgicale de transfert d’embryons dure 10 min. Une deuxième injection d’antidouleur sous la peau (5 sec) sera réalisée 6-8h après l’opération. Les injections ne nécessitent pas de contention en main pour immobiliser les souris ce qui limite le stress. - Un lot de 8 souris (maximum) donneuses d’embryons par projet recevra deux injections (5 sec/injection) sous la peau avec deux hormones sexuelles séparées de 48h. - Un lot de 5 femelles receveuses par projet sera réimplanté sous anesthésie après réalisation d’une petite incision permettant l’accès aux ovaires. Ces animaux subiront le même type d’intervention que les mâles qui subissent une vasectomie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés dans ces procédures sont principalement liés aux injections et aux petites chirurgies réalisées sur les souris. La piqûre d’aiguille pour les injections réalisées sous la peau (comme celles d’hormones, d’anesthésiques ou d’antidouleurs) entraine une légère douleur et de courte durée et un léger stress physique de très courte durée (quelques secondes). Les interventions chirurgicales des mâles vasectomisés et des femelles recevant les embryons sont peu invasives et peuvent un léger stress physique. Elles entrainent une douleur qui peut se prolonger quelques heures après l’opération. Elles peuvent provoquer une gêne passagère.

Devenir

Chaque mâle rendu stérile sera utilisé pour plusieurs projets de transfert d’embryons pendant 12 à 18 mois ou jusqu’à l’observation d’absence de bouchons vaginaux lors de l’accouplement avec des femelles. Il pourra être ensuite utilisé comme animal de compagnie pour une souris femelle qui a dû être isolée. Les femelles qui ont été traitées pour produire des ovules en grande quantité seront mises à mort pour récupérer les ovocytes fécondés ou à féconder in vitro. Les femelles réimplantées avec des embryons ne pourront pas être réimplantées une seconde fois à cause d’une vascularisation important de la zone de réimplantation provoquant des saignements abondants. Néanmoins, 20 femelles par an, soit au total 100 souris, pourront être replacées comme femelles de compagnie des mâles vasectomisés.

Remplacement

Le but du projet de transfert aseptique d’embryons est de « décontaminer » des lignées de souris porteuses de microbes ou de les faire revivre à partir d’embryons ou de sperme congelés. Pour ce type de travail, il n’est pas possible d’utiliser une autre espèce que les souris. Il n’existe pas de méthodes alternatives non-animales. Cette technique est la plus efficace pour obtenir un bon nombre de souris saines, sans microbes. Traiter les souris contaminées avec des médicaments ne permet pas d’éliminer tous les microbes et peut mettre en danger les autres lignées de souris élevées dans des conditions très strictes. Une contamination pourrait nuire gravement à l’élevage des souris et compromettre les recherches en cours. Avant d’accepter une nouvelle lignée par transfert d’embryons, la plateforme s’assure que l’équipe de recherche a bien obtenu l’autorisation de son comité d’éthique, notamment sur les questions liées au remplacement des animaux ou à leur utilisation. Enfin, ce transfert d’embryons ne sera réalisé que si la lignée concernée n’est pas déjà disponible ailleurs avec un statut sanitaire optimal, similaire à celui requis pour l’élevage de ces souris.

Réduction

Grâce à plus de 15 ans d’expérience, la plateforme de conservation et d’élevage des souris génétiquement modifiées a optimisé l’utilisation des souris pour les projets de décontamination par transfert d’embryons ou de reviviscence à partir de matériel génétique congelé. En général, 5 réimplantations suffisent pour obtenir entre 5 et 15 souriceaux. Ce bon résultat est possible grâce à une collaboration efficace entre l’équipe d’élevage et l’équipe spécialisée en embryologie (qui s’occupe de récupérer, congeler ou féconder les embryons). Aujourd’hui, 90 % des projets réussissent dès la première tentative, ce qui montre la fiabilité des méthodes mises en place Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’équipe reste attentive aux dernières avancées scientifiques dans le domaine. Par exemple, l’injection des hormones classiquement utilisées pour stimuler l’ovulation a été remplacée par un mélange plus efficace. Cela a permis de réduire le nombre de femelles donneuses de 10 à 8 souris par projet. Cette amélioration est déjà appliquée pour les projets de relance de lignées congelées. Les mâles vasectomisés sont aussi utilisés au maximum tout au long de leur vie, en vérifiant leur efficacité à chaque fois. Toutes les idées ou innovations qui peuvent permettre de réduire encore le nombre de souris utilisées seront étudiées avec la structure chargée du bien-être animal ou le comité d’éthique, afin de les appliquer pendant la durée du projet.

Raffinement

Les souris reçues d’élevage commerciaux ont au moins une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les procédures. Nous avons amélioré nos pratiques pour rendre les injections moins stressantes. Les injections d’hormones, d’analgésiques et d’anesthésiques sont maintenant systématiquement réalisées sous la peau, alors qu’elles étaient effectuées dans l’abdomen. Cette méthode est tout aussi efficace et provoque moins de douleur et ne nécessite plus d’immobiliser l’animal. Lors des injections, le volume minimal nécessaire est injecté. Pour les chirurgies, tout est mis en place pour réduire au maximum la douleur et le stress. Les souris sont endormies avec une anesthésie générale, et elles reçoivent des antidouleurs avant et après l’opération. Elles sont installées sur des tapis chauffants avant, pendant et après la chirurgie pour rester à bonne température. Tout le matériel est stérile, les surfaces sont bien nettoyées, et on protège leurs yeux avec un gel pour éviter qu’ils ne sèchent. Au réveil des souris, des croquettes humides sont mises à disposition pour qu’elles puissent manger et boire facilement, même si elles sont encore un peu fatiguées. Nous avons aussi défini des critères très précis pour repérer si un animal ne récupère pas bien après une opération. Dans ce cas, une décision d’euthanasie peut être prise pour éviter toute souffrance inutile. Les jours suivant une chirurgie, la surveillance des animaux est accrue pour s’assurer qu’ils vont bien et qu’ils ne souffrent pas. Un score de douleur est établi lors des surveillances quotidiennes après la chirurgie et un protocole de gestion de la douleur peut être mis en place si nécessaire. Afin d’éviter un stress lié à l’isolement, les mâles vasectomisés seront maintenus en permanence avec une femelle dites de « compagnie » après leur premier accouplement. Ils ne peuvent pas être hébergés avec leur congénère car ils deviennent souvent agressifs après accouplement.

Choix des espèces

Les équipes de la plateforme développent des souris génétiquement modifiées (ou transgéniques), car cette espèce est particulièrement bien adaptée aux techniques de modification génétique. Ces techniques consistent, par exemple, à injecter un gène dans l’embryon ou à modifier des cellules souches embryonnaires. Une fois le modèle créé, la lignée de souris est conservée vivante pour produire les animaux nécessaires aux futures expériences et la justification de leur utilisation fera l’objet d’autres demandes d’autorisation de projets. Les souris sont utilisées à différents stades de développement : Mâles vasectomisés: ils sont opérés à 4 semaines d’âge, puis utilisés à partir de 7 semaines pour une durée d’au moins un an, voire 18 mois. Femelles pour la production d’ovocytes en grand nombre : pour que la stimulation hormonale soit la plus efficace possible, on utilise des femelles encore immatures (environ 4 semaines), car leurs ovaires n’ont pas encore été influencés par leurs propres hormones. Femelles receveuses : elles doivent être sexuellement matures (entre 7 et 26 semaines, ou entre 20 et 30 grammes). Si elles pèsent plus de 30 g, la graisse autour de leurs ovaires peut compliquer la chirurgie.