Maintien des lignées génétiquement modifiées

Deux injections intrapéritonéales espacées de 46 à 52 heures, trente secondes chacune : 68 500 rongeuses vont être utilisées de cette manière, 65 000 souris, 2 500 rates et 1 000 hamsters dorés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie sera tuée pour prélever ovocytes et embryons, une autre expédiée vivante vers des laboratoires de recherche. Les femelles sont injectées avant leur maturité sexuelle, ce qui garantit selon le porteur une réponse de 100 %, contre 0 à 100 % chez des femelles adultes. Il présente cette production massive d'ovocytes comme un moyen de réduire le nombre de femelles utilisées, sans jamais rapporter ce chiffre de 68 500 à ce qu'exigerait une reproduction ordinaire.

Objectifs

La superovulation des rongeurs de laboratoire permet d’augmenter le nombre d’ovules fécondables produits par une femelle. Cette méthode est utilisée pour obtenir plus d’embryons en une seule fois. L’objectif de ce projet est donc d'obtenir plus d'ovules fécondables et d'embryons tout en réduisant le nombre de femelles nécessaires. La superovulation permet d'assurer la cryoconservation ou la reproduction assistées de modèles de rongeurs de laboratoires visant à sauvergarder ou à produire des animaux expérimentaux d'intérêts.

Bénéfices attendus

La superovulation permet de réduire le nombre de femelles nécessaires pour une production d'oeufs fécondables et d'embryons. Moins d'animaux seront nécesssaires pour produire un lot de qualité, dans des délais raccourcis, et avec un haut statut sanitaire. A terme, les embryons obtenus contribueront à développer des modèles indispensables pour comprendre certaines maladies, tester des traitements innovants ou perfectionner des techniques de reproduction.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections, avec un intervalle de 46 à 52h entre les 2 injections. La durée maximale de l'injection sera de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère peut être induite lors de l'introduction de l'aiguille en intra péritonéale puis lors de l'injection du produit

Devenir

Les femelles seront soient mise à mort pour prélevement d'ovocytes ou d'embryons, soient gardés en vie pour envoi à des laboratoires de recherche.

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins utilisés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux exprimés par les chercheurs. Le nombre d’animaux est calculé de manière à en utiliser le minimum possible permettant l’obtention des résultats attendus. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé. Toute atteinte d’un des points limites déterminés pour ce projet amènera la mise à mort de l'animal. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire nécessaire au maintien en bonne santé des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie comme le fond génétique est lié aux caractéristique du modèle étudié. Les souris, rats et hamsters sont les espèces les plus utilisées en recherche biomédicale et reproductive. Aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet actuellement de reproduire fidèlement ces processus. Les femelles sont injectées de préférence avant leur maturité sexuelle, soit avant 6 semaines pour les 3 espèces indiquées. Ceci permet une réponse au traitement maximale (100%) contrairement à la superovulation d'indivus femelles sexuellement matures dont la phase du cycle oestral peut faire varier celle dernière de 0 à 100%

104 000 femelles, 100 000 souris, 2 500 hamsters dorés et 1 500 rates, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 46 à 52 heures pour déclencher une ovulation multiple, avant leur maturité sexuelle afin d'obtenir une réponse de 100 %. Le porteur présente cette superovulation comme un moyen de réduire le nombre de femelles "nécessaires" à la production d'embryons, et annonce des modèles "indispensables" pour comprendre des maladies et perfectionner les techniques de reproduction. Une partie de ces femelles est tuée pour prélever ovocytes et embryons, l'autre expédiée vivante à des laboratoires de recherche.

Objectifs

La superovulation des rongeurs de laboratoire permet d’augmenter le nombre d’ovules fécondables produits par une femelle. Cette méthode est utilisée pour obtenir plus d’embryons en une seule fois. L’objectif de ce projet est donc d'obtenir plus d'ovules fécondables et d'embryons tout en réduisant le nombre de femelles nécessaires. La superovulation permet d'assurer la cryoconservation ou la reproduction assistées de modèles de rongeurs de laboratoires visant à sauvergarder ou à produire des animaux expérimentaux d'intérêts.

Bénéfices attendus

La superovulation permet de réduire le nombre de femelles nécessaires pour une production d'oeufs fécondables et d'embryons. Moins d'animaux seront nécesssaires pour produire un lot de qualité, dans des délais raccourcis, et avec un haut statut sanitaire. A terme, les embryons obtenus contribueront à développer des modèles indispensables pour comprendre certaines maladies, tester des traitements innovants ou perfectionner des techniques de reproduction.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections, avec un intervalle de 46 à 52h entre les 2 injections. La durée maximale d'une injection sera de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère peut être induite lors de l'introduction de l'aiguille en intra péritonéale puis lors de l'injection du produit.

Devenir

Les femelles seront soient mise à mort pour prélevement d'ovocytes ou d'embryons, soient gardés en vie pour envoi à des laboratoires de recherche.

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins utilisés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux exprimés par les chercheurs. Le nombre d’animaux est calculé de manière à en utiliser le minimum possible permettant l’obtention des résultats attendus. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé. Toute atteinte d’un des points limites déterminés pour ce projet amènera la mise à mort de l'animal. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire nécessaire au maintien en bonne santé des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie comme le fond génétique est lié aux caractéristique du modèle étudié. Les souris, rats et hamsters sont les espèces les plus utilisées en recherche biomédicale et reproductive. Aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet actuellement de reproduire fidèlement ces processus. Les femelles sont injectées de préférence avant leur maturité sexuelle, soit avant 6 semaines d'âge pour les 3 espèces indiquées. Ceci permet une réponse au traitement maximale (100%) contrairement à la superovulation d'indivus femelles sexuellement matures dont les phases du cycle oestral peuvent faire varier cette réponse de 0 à 100%.

Pour génotyper des lignées génétiquement modifiées, 2 880 souris subissent une coupe du bout de la queue et une entaille à l'oreille au sevrage, à quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte dure environ cinq minutes, sous anesthésie gazeuse et anesthésie locale, et peut laisser un saignement arrêté par compression s'il dépasse deux minutes. Le porteur indique avoir abandonné le génotypage par poils, infructueux, et par bout d'oreille, non concluant dans plus de 90 % des cas. Les souris du bon génotype partent en accouplement ou vers d'autres projets, celles dont le génotype ne convient à aucun groupe expérimental sont tuées après analyse.

Objectifs

La présente demande est réalisée afin de couvrir réglementairement la réalisation d’une biopsie de queue dans le cadre du génotypage des animaux transgéniques utilisés dans nos projets de recherche. Le génotypage sur biopsie de queue est à l’heure actuelle plus fiable et robuste que le génotypage à partir d’une biopsie d’oreille, ce dernier menant souvent (plus de 50 % des cas) à des résultats non concluants ou non robustes. L’entretien des lignées de souris transgéniques est déjà réglementairement encadré par d’autres demandes d’autorisation de projet.Le monde est aujourd’hui affecté par une explosion de maladies métaboliques caractérisées par un déséquilibre de l’homéostasie glucidique telles que l’obésité ou le diabète de type II. Ces maladies ont de lourdes conséquences socio-économiques sur nos sociétés et représentent un enjeu majeur de santé publique. La compréhension des mécanismes permettant la régulation centrale de la glycémie ainsi que de leurs dysfonctionnements physiopathologiques est cruciale pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de ces maladies. Nos projets de recherche s’inscrivent dans ce contexte puisque nous nous intéressons aux systèmes moléculaires de l’hypothalamus, identifiés comme des acteurs clés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Afin de mener à bien nos études, nous avons recours à l’utilisation de modèles murins transgéniques. L’invalidation de ces systèmes nous permet de mieux comprendre leurs rôles dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune technique efficace pour marquer ces neurones, nous utilisons également des souris transgéniques exprimant une molécule fluorescente nous permettant leur visualisation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ces projets que nous puissions génotyper ces animaux de manière fiable et robuste : à partir d’une biopsie caudale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de permettre un génotypage fiable et robuste des différents animaux transgéniques qui serviront d’une part à l’entretien et à la reproduction des lignées de souris et d’autre part aux expérimentations. Les expérimentations réalisées sur ces modèles transgéniques ont pour but de mieux comprendre les rôles respectifs et conjoint des systèmes moléculaires d’intérêt dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique ainsi que d’étudier leurs altérations dans un contexte pathologique d’obésité / de diabète. Ces études ont pour objectif de proposer des stratégies thérapeutiques innovantes dans la lutte contre l’explosion actuelle des maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type II.

Procédures

Les animaux subiront, de façon concomittante, une biopsie caudale et une entaille à l’oreille pour le marquage, sous anesthésie / analgésie lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge, une seule fois, l’acte dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie caudale réalisée pour génotyper les animaux peut induire une douleur légère et de courte durée, prise en charge par anesthésie / analgésie des animaux. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La désinfection du bout de la queue préalablement à la biopsie permettra de limiter le risque d’infection et toute éventuelle complication de cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.

Devenir

Une partie des animaux (dont le génotype sera adéquat en fonction des besoins en expérimentation) sera placé en accouplement, dont l’entretien des lignées est encadré par d’autres demande d’autorisation de projet. L’autre partie des animaux de génotype adéquat (en fonction des besoins en expérimentations) sera utilisée dans des procédures d’expérimentations encadrées par d’autres demandes d’autorisation de projet. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation. Les animaux de génotypes inadéquats (ni mutants, ni pouvant convenir pour un groupe contrôle adapté au plan expérimental donné) donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage.

Remplacement

Le génotypage de nos lignées de souris à partir de poils ou bien du surplus de bout d’oreille généré lors du marquage des souris s’est avéré infructueux. Nous n’avons pas réussi à génotyper les souris à partir de poils. De même, malgré plusieurs tentatives de mise au point du protocole, à partir de l’excédent de bout d’oreille, les résultats étaient insatisfaisants dans plus de 90% des cas : soit nous n’avions pas de résultat, soit le résultat n’était pas fiable : deux tests sur le même échantillon donnaient deux résultats différents. Lorsque deux tests sur le même échantillon ne donnent pas de résultat ou un résultat douteux, nous avons besoin de prélever à nouveau la souris afin de lever le doute, multipliant donc les interventions sur cette dernière. Nous souhaitons par conséquent réaliser le génotypage de nos animaux à partir d’une biopsie de l’extrémité de la queue des souris. Cette technique est utilisée car elle est robuste, c’est-à-dire efficace, répétable et fiable : un prélèvement unique nous permet dans plus de 99% des cas de génotyper nos souris correctement. De plus, ce prélèvement n’entraine pas de signes visibles de douleur.

Réduction

La stratégie de reproduction choisie (encadrée par nos autres demandes d’autorisation de projet) vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles dont les proportions sont calculées selon les règles de la génétique mendélienne. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos, afin d’évaluer les rôles des systèmes moléculaires étudiés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites et d’augmenter la fiabilité des résultats puisque les animaux contrôles seront les « littermates » des animaux mutants. L'utilisation de test de puissance statistique est ici sans objet dans la mesure où nous nous fondons sur les probabilités mendéliennes pour estimer le nombre d'animaux du génotype recherché dans les portées obtenues.

Raffinement

Les conditions de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour la biopsie caudale, l’extrémité de la queue de la souris sera d’abord désinfectée à la Bétadine® puis localement analgésiée grâce à l’application de Lidocaïne® liquide vétérinaire. La souris sera ensuite anesthésiée par inhalation d’isoflurane. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle in vivo chez l’animal est indispensable pour une compréhension globale du rôle physiologique des systèmes moléculaires étudiés, de leurs interactions fonctionnelles avec d’autres systèmes, de la physiopathologie de l’obésité et du diabète, ainsi que pour caractériser les altérations neuroanatomiques et le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques dans la régulation de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. L’acte de biopsie caudale ne peut se faire par définition que sur le modèle animal. La biopsie caudale permettant le génotypage des souris se fera lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge.

Un morceau de queue est coupé sur chaque souriceau pour lire son patrimoine génétique, l'oreille étant entamée en cas de second prélèvement. 10 800 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour entretenir des lignées génétiquement modifiées destinées à l'étude de circuits du néocortex. Les animaux qui ne portent pas la mutation recherchée sont tués, le porteur indiquant qu'ils ne peuvent être ni réutilisés ni replacés du fait de leur modification génétique. Sur l'effectif annoncé, 1 450 souris resteront en vie pour les lignées et 6 040 partiront vers d'autres projets, ce qui laisse environ 3 300 souris tuées pour n'avoir pas hérité du bon gène.

Objectifs

Le néocortex des mammifères, siège de fonctions cognitives majeures telles que la perception sensorielle, l’initiation des mouvements ou encore la mémoire de travail, est organisé en aires corticales hiérarchisées. Cette région du cerveau se caractérise par une grande diversité fonctionnelle, avec des zones spécialisées reposant sur un large éventail de sous-types neuronaux. Ces populations multiples s’agencent en réseaux hétérogènes dotés de signatures moléculaires, physiologiques et plastiques spécifiques, observables notamment au niveau synaptique. Une question fondamentale demeure : comment l’activité corticale, à l’origine de comportements adaptés et complexes, émerge-t-elle de cette diversité cellulaire et moléculaire ? L’étude de ces dynamiques à différentes échelles nourrit notre compréhension générale du fonctionnement cérébral et ouvre des perspectives pour des applications cliniques. Afin d’explorer le rôle de chaque population neuronale, nous modifions leur fonctionnement par des approches génétiques ciblées. Dans le cadre de ce projet et pour répondre à cette question, nous utilliserons des souris dont certains gènes ont été modifiés, afin d’observer plus précisément le rôle des différentes catégories de cellules cérébrales et la façon dont elles interagissent. Ces expériences servent à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau, notamment les mécanismes reliés à la mémoire, à l’apprentissage et à la régulation de l’activité nerveuse. Ce savoir est important pour progresser dans la recherche sur des maladies comme l’épilepsie, la schizophrénie, l’autisme, la dépression ou certaines formes de déficience intellectuelle. Le projet consiste aussi à entretenir ces lignées de souris modifiées et à identifier précisément celles qui portent les caractéristiques nécessaires pour les études scientifiques.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau entraînent des répercussions majeures sur la santé des individus, sur leur autonomie, leur éducation, leur emploi et leur mobilité, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est donc primordial d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour leur prise en charge. Ce projet nous permettra de connaitre le patrimoine génétique des animaux produits à partir de lignées génétiquement modifiées d’intérêt afin de les utiliser par la suite dans nos projets de recherches sur cette thématique. Les bénéfices attendus à plus long terme sont donc liés à ces projets de recherche et concerneront toutes les informations que nous pourrons obtenir pour comprendre le fonctionnement du néocortex et l’origine de ses dysfonctionnements. Ces informations pouvant ensuite amener à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients impactés par un tel dysfonctionnement.

Procédures

Un petit prélèvement de tissu sera fait sur tous les jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1minute) afin de connaitre leur patrimoine génétique. En cas de problème technique (rare) il pourrait arriver que certains animaux aient un autre prélèvement (1 fois, moins d’1 minute).

Impact sur les animaux

Les petits prélevés pour génotypage pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement pour génotypage (queue, ou pavillon de l’oreille en cas de nécessité de reprélèvement). Il existe un faible risque de saignement suite à ces prélèvements.

Devenir

Les animaux non porteurs des mutations génétiques d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés du fait de leur modification génétique spécifique. La majorité des animaux produits sera maintenu en vie soit pour le maintien de nos lignées (1450) soit pour leur utilisation continue dans des procédures expérimentales dédiées d'autres projets autorisés (6040).

Remplacement

Nos recherches portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. A l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de modéliser la complexité de ces connexions. Ainsi il nous est nécessaire de recourir à l’utilisation d’animaux pour nos projets de recherche.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (10800) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos projets de recherche et en limitant au maximum le nombre d’animaux produits non porteurs des modifications génétiques d’intérêt. La production d’animaux non utilisées en expérimentation est strictement limitée au minimum nécessaire, et la possibilité de recourir à la cryopréservation sera envisagée afin de réduire davantage le nombre d’animaux élevés. S’agissant d’un projet d’élevage il n’y aura pas de tests statistiques. Pour les projets dans lesquels les animaux produits seront transférés, les effectifs par groupe auront été définis sur la base d’études précédentes et à l’aide de tests statistiques si cela est possible. Les données générées seront ensuite analysées à l’aide des tests statistiques appropriés. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’Union Européenne (ebrains.eu) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter des données générées, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et par conséquent amènera à réduire le nombre d’animaux utilisés de manière plus globale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, à l’aide de matériel désinfecté entre chaque animal afin de prévenir tout risque d’infection ou de contamination croisée. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. L’état du souriceau est vérifié immédiatement après le prélèvement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il soit bien repris en charge par sa mère. Si un re-prélèvement était nécessaire sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La taille des prélèvements est limitée au strict nécessaire et est donc la plus petite possible. Les animaux sont observés quotidiennement. En cas d’anomalie un suivi est mis en place par la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire et des conseils sont donnés à l’équipe de recherche pour assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris permet de modéliser de nombreuses pathologies humaines, en effet sa forte homologie génétique avec l’humain et les nombreux outils disponibles pour générer des modifications génétiques chez cette espèce en font un modèle de choix. Nos projets de recherche portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. En utilisant différentes lignées de souris génétiquement modifiées nous pourrons étudier l’effet et le rôle de cellules spécifiques pour comprendre le fonctionnement et identifier les interactions entre ces différentes zones du cerveau. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre le plus tôt possible les mutations génétiques d’intérêt, nous permettant ensuite de réaliser nos procédures à différents stades de développement pour répondre à nos questions scientifiques.

Génétiquement modifiées et élevées pour fournir des lignées modèles de déficience intellectuelle et d'autisme, 1 500 souris subissent le prélèvement de deux millimètres de l'extrémité de la queue, sur animal vigile sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération dure cinq secondes et se pratique entre le treizième et le vingt-huitième jour de vie, âge où la queue est peu ossifiée, ce qui permet de s'en tenir à une contention sans anesthésie. Le porteur indique avoir écarté trois méthodes non invasives, dont le prélèvement de poils, parce que "le souffle sous la hotte de change fait voler les poils hors des tubes". Le sort de chaque souris dépend ensuite du génotypage : celles qui portent le génotype recherché rejoignent un projet expérimental ou l'élevage, les autres sont tuées.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il est donc nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés et ceux nécessaires au maintien des lignées. Nous avons testé des prélèvements par 3 méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fèces, ou via un écouvillonnage bucal. Elles ne sont pour l’instant pas adaptées à nos conditions de diagnostics et manquent de fiabilité: 1) l'écouvillonnage bucal donne des résultats de très faible intensité et parfois même ne mettant pas en évidence une mutation, 2) le prélèvement de poils donne des intensités faible et il y a aussi une forte probabilité d'erreur due au souffle sous la hotte de change qui fait voler les poils hors des tubes, 3) l’utilisation d’encoche à l’oreille ne permet pas un marquage fiable d’un nombre important d’animaux sur les moyens et longs termes. Dans tous les cas, cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter des prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L’objectif de ce projet est une procédure de prélèvement par biopsie utilisée au sein de notre équipe pour le génotypage (technique permettant de relever les différences génétiques entre les animaux d'une même fratrie) identification des animaux qui sera associée à une identification par pose d'une bague auriculaire. Les animaux produits seront utilisés sur des projets concernant l’étude l’étude des maladies neurodéveloppementales présentant déficiences intellectuelle (DI) et/ou troubles du spectre autistique (TSA) comme dans le Syndrome de l’X fragile.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de sélectionner les animaux ayant un gène d'intérêt afin d'optimiser la gestion de l'élevage et de fournir les animaux nécessaires aux projets de l'équipe.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure sauf ceux dont le génotypage ne correspond pas à nos besoins. Leur devenir dépendra du résultat du genotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, si génotypage donnant les génotypes attendues, c) Mise à mort avec ou sans prélèvements post mortem pour les animaux au génotype non recherché .

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype (constitution génétique) non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, c’est-à-dire ayant des gènes identiques, si phénotype non dommageable, c'est-à-dire que l'ensemble des caractères observables d'un individu n'a pas de conséquence sur l'animal) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir

Raffinement

La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de répondre à de nombreuses questions scientifiques en biologie, avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (ex: autisme). Les prélèvements de l’extrémité de la queue peuvent être réalisés entre P13 (animaux agés de 13 jours) et P28 (animaux agés de 28 jours), à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.

Tués si leur génotype ne convient pas, versés dans des protocoles de recherche s'il convient, 2 500 souris et 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une biopsie de moins d'un millimètre à l'extrémité de la queue vers 15 jours, sur animal vigile, ou à l'oreille sous anesthésie générale à partir de 4 semaines. Le projet ne poursuit aucune question scientifique : il couvre l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement. Le porteur présente son bénéfice attendu comme statistique, faire figurer dans les comptes annuels les animaux génotypés de façon invasive, et indique que des techniques non invasives restent "en cours d'évaluation".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de couvrir l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de prendre en compte les animaux qui sont génotypés de manière invasive en plus de leur identification par tatouage dans les statistiques annuelles de l'établissement. Cela permet de continuer à travailler sur des mesures de raffinement de ce génotypage et d'encourager les équipes à développer des méthodes non invasives.

Procédures

les animaux sont soumis à une biopsie de tissu à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de l’animal, qui sera inférieure à 1mm. Pour les animaux de moins de 15jours l'intervention sera faite sur desanimaux vigiles et anesthésiés pour des animaux plus âgés. Cette intervention dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

La biopsie de tissu pour génétypage sera réalisée à l’extrémité de la queue ou à l’oreille cela implique un stress léger lors de la contention de l'animal et une douleur de courte durée lors de la coupe de tissu.

Devenir

En fonction du génotype, les animaux seront soit euthanasiés soit incorporés dans des protocoles de recherche.

Remplacement

L’utilisation d’animaux transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.

Réduction

Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour garantir le fonds génétique et éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 animaux maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées dansles projets de recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Les animaux de mauvais généotypes pourront être proposés en interne pour une utilisation par d'autres équipes.

Raffinement

La biopsie de la queue sera réalisée précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, une biopsie de la pina de l’oreille sera privilégiée et sera réalisée sous anesthésie générale. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque le génotypage sera validé et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.

Choix des espèces

La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et depuis récemment chez le rat et l’établissement utilisateur possède à la fois un zone d’élevage et d’expérimentation sur les différents modèles de souris et rats transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. La biopsie caudale sera réalisée à l’âge de 10-15 jours afin de limiter les nuisances du prélèvement. La biopsie de la pina de l’oreille sera réalisée à l’âge de 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifié.