Maintien des lignées génétiquement modifiées

1140 rats Nude, dépourvus de lymphocytes T et donc très vulnérables aux infections, vont être élevés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur absence de poils et leur difficulté à réguler leur température imposent un logement stérile maintenu à 24 °C. Cette lignée est entretenue pour accueillir des greffes de cellules humaines, sa taille supérieure à celle de la souris permettant prélèvements répétés et imagerie. Aucun animal n'est tué pour ce projet, tous étant gardés pour la reproduction de la lignée ou dirigés vers d'autres expériences.

Objectifs

Gestion d'une lignée rat nude, immunodéprimée en vue d'une utilisation dans le cadre de projets scientifiques.

Bénéfices attendus

Le rat RNU Nude a été choisi car il ne rejette pas les cellules humaines implantées, grâce à une déficience de son système immunitaire. Sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des manipulations précises, de prélever des échantillons à plusieurs reprises et d’utiliser des techniques d’imagerie. Ce modèle, bien connu, réduit le nombre d’animaux nécessaires et permet d’améliorer le confort et le bien-être des rats, conformément aux principes de réduction et de raffinement des expérimentations animales. Il constitue également une alternative éthique et efficace à d’autres espèces plus sensibles.

Procédures

Le rat nude est un rat de laboratoire porteur d’une mutation génétique qui empêche le développement normal de certaines cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T. Cela le rend très sensible aux infections, en particulier cutanées et respiratoires. Comme il n’a presque pas de poils, sa peau est fragile et doit être protégée. Pour limiter les risques, ces rats sont élevés dans des conditions sanitaires strictes, avec une hygiène renforcée et un environnement contrôlé. Sans ces précautions, ils peuvent rapidement tomber malades ou montrer des signes de souffrance. En dehors de cette vulnérabilité aux infections, la mutation ne cause pas de douleur directe. Les rats sont surveillés quotidiennement et reçoivent des soins adaptés afin de garantir leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les rats RNU nude présentent des caractéristiques liées à leur génétique, telles que l’absence totale de poils, une sensibilité accrue aux infections et des difficultés à réguler leur température. Ces effets sont atténués grâce à un logement dans des conditions sanitaires strictes, au maintien d’une température contrôlée de 24 °C et à un enrichissement adapté visant à leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée soit à destination de l'expérimentation.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire, car il n’existe pas de méthode alternative fiable permettant d’étudier comment des cellules humaines greffées interagissent avec un organisme vivant. Les expériences en laboratoire, telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes, ne permettent pas de reproduire la complexité complète du corps et du système immunitaire. Le choix du rat nude RNU s’explique par sa déficience immunitaire, qui permet d’accueillir des greffes de cellules humaines, par sa taille, qui facilite certaines interventions, et par son utilisation déjà établie dans ce type de recherches. Des recherches ont été menées afin de vérifier qu’aucune méthode alternative n’était adaptée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été minimisé autant que possible, tout en garantissant que les résultats soient fiables. Chaque animal est étudié de manière à obtenir plusieurs types de données (par exemple : analyses, imagerie, prélèvements), et les groupes de contrôle sont mutualisés lorsque cela est possible. L’utilisation d’un rat nude RNU bien caractérisé permet de réduire les différences entre animaux et, par conséquent, le nombre nécessaire. Enfin, les données sont partagées entre projets afin d’éviter de répéter inutilement les expériences.

Raffinement

Les rats RNU Nude sont élevés dans des conditions très strictes afin de les protéger des infections et de prendre soin de leur peau. Les manipulations sont limitées au strict minimum et réalisées par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement et, en cas de détérioration grave de leur état, ils reçoivent rapidement des soins, voire une euthanasie si nécessaire, afin de garantir leur bien-être..

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle expérimental largement utilisé en recherche biomédicale en raison d’homologies anatomiques, physiologiques et génétiques avec l’humain dans plusieurs systèmes biologiques. Sa taille permet de réaliser certaines interventions, analyses et implants complexes, et de nombreux modèles sont disponibles pour répondre aux besoins scientifiques. Les méthodes alternatives, en laboratoire ou sur ordinateur, ne peuvent pas reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation du rat est nécessaire pour obtenir des résultats fiables et transposables à l’humain. Pour la reproduction, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines minimum.

2756 souris de deux lignées fortement immunodéprimées vont être élevées sur site, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger limitées à une biopsie de l'oreille pour génotypage. Leur déficit immunitaire les rend très sensibles aux infections, au stress et aux variations d'environnement. L'élevage vise à fournir des modèles dits humanisés pour des études de thérapie génique et de biosécurité, que le porteur présente comme "indispensables" et non remplaçables par une méthode in vitro. Sur le total, 2024 animaux sont destinés à d'autres projets et 96 gardés pour la reproduction, 636 étant tués comme "excédentaires".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’assurer l’élevage sur site de deux lignées spécifiques de souris, nommées BRGSF A2-DR2 et NBS GW, largement utilisées en recherche biomédicale, notamment pour l’étude des greffes de cellules humaines et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Au sein de la plateforme de recherche préclinique, ces modèles murins sont couramment employés dans des études de biodistribution et de biosécurité. Ces travaux visent à vérifier l’innocuité des thérapies et à évaluer la distribution du transgène dans l’organisme. Ces études réglementaires sont essentielles pour l’obtention de l’autorisation de passage vers le développement clinique. Notre plateforme a d’ores et déjà réalisé plusieurs études de ce type et a contribué au passage en essai clinique d’un traitement de la drépanocytose par thérapie génique. Le présent projet a pour objectif l’élevage sur site des lignées de souris nommés BRGSF A2-DR2 et NBSGW. En assurant un élevage éthique, contrôlé et scientifiquement justifié, il contribue à la fois à l’excellence de la recherche et au respect du bien-être animal.

Bénéfices attendus

L’élevage sur site des lignées de souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW présente de nombreux avantages, tant pour la qualité de la recherche scientifique que pour l’organisation des projets et le respect du bien-être animal. Ces souris, génétiquement modifiées de façon très ciblée, sont indispensables à la création de modèles dits « humanisés », qui permettent d’étudier le fonctionnement du système immunitaire humain au sein d’un organisme vivant. Elles jouent un rôle clé dans les travaux portant sur la thérapie génique, l’immunothérapie et les greffes cellulaires. En raison de leur déficit immunitaire marqué, ces animaux sont particulièrement sensibles aux infections, au stress et aux variations de leur environnement, en particulier lors du transport. Leur approvisionnement via les circuits habituels est donc complexe, avec des délais souvent longs et imprévisibles, parfois incompatibles avec les contraintes des programmes de recherche. La mise en place d’un élevage local permet de sécuriser la disponibilité des animaux tout en améliorant leurs conditions de vie et leur adaptation à l’environnement d’hébergement. La production sur site garantit également une disponibilité continue, facilitant la planification et la conduite des projets dans de meilleures conditions. D’un point de vue éthique, cette organisation limite les transports, sources de stress et de pertes animales, et permet d’ajuster la production aux besoins réels, réduisant ainsi le gaspillage. Cette démarche s’inscrit pleinement dans le respect de la réglementation encadrant l’utilisation des animaux à des fins scientifiques, en contribuant à la réduction du nombre d’animaux utilisés et à l’amélioration de leurs conditions de vie. Enfin, en centralisant l’élevage au sein d’une structure spécialisée et rigoureusement encadrée, ce projet renforcera l’autonomie des équipes de recherche et soutiendra le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Aucun prélèvement biologique (sang, tissu ou organe) n’est prévu chez les animaux BRGSF A2 DR2. Concernant les souris NBS GW, des biopsies réalisées en bordure du pavillon de l’oreille pourront être effectuées, de manière non systématique, exclusivement à des fins de génotypage : - Âge : entre 10 et 21 jours (avant le sevrage), conformément aux recommandations réglementaires - Méthode : biopsie de ≤ 2 mm à l’extrémité distale du pavillon de l’oreille, réalisée à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux adaptés, suivie de l’application d’un antiseptique local - Fréquence : une seule intervention par animal, et uniquement pour certains individus - Nombre d’animaux concernés : 1 378 souris NBS GW Aucun autre prélèvement sanguin ou tissulaire n’est prévu chez les souris NBS GW dans le cadre de cette procédure.

Impact sur les animaux

En raison de leur phénotype fortement immunodéficient, les souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW présentent une sensibilité accrue aux agents pathogènes opportunistes, susceptible d’entraîner une morbidité plus élevée en cas de défaillance du confinement sanitaire.

Devenir

Au terme des 5 ans : - 2 024 souris (mâles et femelles) seront conservées pour être inclus dans les projets applicatifs - 96 animaux (36 mâles et 70 femelles) seront gardés pour le maintien des lignées. - 636 animaux excédentaires seront euthanasiés de manière éthique par du personnel formé, selon les méthodes conformes à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est indispensable au regard de la nature des études précliniques envisagées qui reposent sur l’interaction de cellules humaines avec un environnement immunitaire in vivo. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire de manière fiable et fonctionnelle la complexité de ces interactions. Les souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW constituent des modèles hautement pertinents pour l’étude des réponses immunitaires humaines dans un cadre expérimental contrôlé. Néanmoins, chaque fois que cela est possible, des approches complémentaires in vitro (cultures cellulaires, co-cultures, organoïdes) ainsi que des outils de modélisation in silico seront mis en œuvre en amont ou en parallèle, afin de limiter le recours aux animaux conformément aux principes de remplacement et de réduction. À titre d’exemple, l’un des projets applicatifs rendus possibles par cet élevage concerne la réalisation d’études de biosécurité. Avant toute application clinique, il est indispensable d’évaluer la biodistribution du matériel génétique administré lors d’une thérapie génique et de vérifier notamment l’absence d’intégration dans des régions génomiques à risque oncogène ou dans les gonades. Seul un modèle in vivo permet actuellement de répondre à ces questions, aucun système expérimental alternatif ne reproduisant de manière suffisamment intégrée et fonctionnelle la complexité d’un organisme entier.

Réduction

Ces deux lignées figurent parmi les modèles les plus utilisés et reconnus dans la recherche en thérapie génique. Leurs modalités de production sont bien établies et largement documentées. Forts de notre expérience et de l’historique de production du laboratoire, nous mettrons en œuvre des stratégies d’accouplement raisonnées et ajustées aux besoins expérimentaux. Les souris femelles sont privilégiées pour les études de développement en thérapie génique car, d’après nos données historiques, elles se montrent plus permissives à la greffe de cellules humaines (humanisation) et permettent une meilleure reconstitution des sous-populations de cellules hématopoïétiques. Toutefois, afin de limiter le nombre d’animaux surnuméraires, les souris mâles comme femelles pourront être intégrées dans d’autres projets autorisés lorsque cela est scientifiquement pertinent.

Raffinement

L’ensemble des pratiques d’élevage et de manipulation est spécifiquement conçu afin de limiter le stress, la douleur et toute forme de souffrance potentielle, en tenant compte des particularités liées à l’immunodéficience des souches BRGSF A2-DR2 et NBSGW. Les effets indésirables potentiels associés à cette immunodéficience sont anticipés et maîtrisés grâce à un environnement d’élevage strictement contrôlé (isolateurs) et à des pratiques fondées sur notre longue expérience dans la gestion de ces deux lignées. Dans les conditions prévues par ce projet, aucun phénotype dommageable ne devrait s’exprimer.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence en biologie et en médecine expérimentale, en raison de sa taille, de son cycle de reproduction court, de sa facilité de manipulation et, surtout, de la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Les lignées BRGSF A2-DR2 et NBSGW ont été spécifiquement développées pour étudier le système immunitaire humain chez la souris. En effet, ces animaux sont fortement immunodéficients, ce qui permet une excellente prise de greffe de cellules humaines (humanisation) ainsi qu’une reconstitution efficace des sous-populations hématopoïétiques humaines. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés aux études de biodistribution et de biosécurité. Ces lignées ont également été conçues pour permettre l’étude des interactions et des réponses immunitaires humaines dans le cadre de la thérapie génique. Elles intègrent des transgènes humains — notamment HLA-A2 et TCR DR2 pour les souris BRGSF A2-DR2 — indispensables pour reproduire certaines réponses immunitaires spécifiques in vivo, non modélisables chez d’autres espèces. L’utilisation de ces deux souches est validée et largement reconnue par la communauté scientifique pour les applications précliniques, ainsi que par les agences réglementaires telles que l’ANSM. Dans notre laboratoire, leur emploi dans des études de biosécurité a déjà contribué au passage en phase clinique de plusieurs thérapies géniques, notamment dans le traitement de la drépanocytose.

Ces souris développent une dystrophie musculaire qui leur coûte jusqu'à 50 % de leur poids et réduit leurs déplacements, sans qu'aucune procédure leur soit appliquée. 900 souris vont être élevées ainsi, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur indique qu'aucune intervention n'est prévue et que la pathologie se développe seule, les animaux étant utilisés entre 8 et 12 semaines, au pic de l'atteinte musculaire. Leurs muscles sont prélevés puis exploités pour plusieurs expériences, jusqu'à "épuisement de la ressource".

Objectifs

Ce projet concerne l'élevage d'un modèle de souris qui développent une maladie musculaire qui mime la myopathie de Duchenne au bout de quelques semaines. Le modèle de souris présente un muscle malade sans que des signes cliniques soient observables à la période étudiée.

Bénéfices attendus

L'utilisation des muscles de ces souris permet l'étude des mécanismes impliqués dans la myopathie de Duchenne

Procédures

Aucune intervention n'est prévue, la pathologie se développe naturellement.

Impact sur les animaux

Les souris développent une maladie qui mime une dystrophie musculaire et comportent des signes physiques qui les différencient d'une souris saine. Leur poids est jusqu'à 50% plus faible mais possèdent un développement normal. Elles se déplacent normalement, mais moins que des souris sauvages. Les signes de dystrophie musculaire atteignent un niveau maximal entre 8 et 16 semaines et s'améliorent à partir du 8e mois. Les souris sont utilisées entre 8 et 12 semaines lorsque la maladie atteint une sévérité élevée dans la muscle. Les conditions d'élevage sont en accord avec les dernières recommandations de février 2025 concernant l'élevage de souris comportant des pathologies musculaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever et analyser les muscles.

Remplacement

La compréhension des évènements cellulaires et moléculaire liés à la progression de la myopathie de Duchenne nécessite des analyses ex vivo à partir d'animaux affectés par la pathologie. En effet, la pathologie n'est actuellement pas modélisable in vitro car elle engage de nombreux types celulaires qui communiquent ensemble. Néanmoins, autant que faire se peut, le laboratoire utilise des cellules d'origine humaine, mais qui sont très rares et dont la quantité est limitée.

Réduction

Les souris sont uniquement utilisées pour prélèvements de tissus. Les prélèvements sont utilisés pour de multiples expériences jusqu'à épuisement de la ressource. La pathologie humaine touche les hommes et les analyses sont réalisées à partir des tissus provenant d'individus mâles. Cependant, toutes les mises au point expérimentales sont réalisées à partir de tissus prélevés chez les femelles

Raffinement

Les souris montrent un phénotype dommageable à partir de 12 mois et seront mises à mort à 6 mois au plus tard. Les animaux présentent un poids inférieur que les souris normales ou mdx et sont sujettes au stress. Il y aura un enrichissement de leur environnement pour limiter le stress, ainsi que des conditions de contentions spécifiques les premières semaines.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la structure du muscle est très similaire à celle observée chez l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines, au pic de la pathologie musculaire observée au niveau du tissu musculaire.

Tuées après une chirurgie terminale de quinze minutes destinée à prélever leurs tissus, 207 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse et deux injections intrapéritonéales, contenu à la main. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet d'évaluer les effets d'une molécule sur l'"organisme entier" et qualifie le passage in vivo de prérequis "indispensable". Le bénéfice annoncé se réduit, lui, à fournir des informations sur le potentiel thérapeutique d'une molécule contre des myopathies congénitales qui restent sans traitement.

Objectifs

Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien et qui affectent considérablement leur qualité de vie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de molécules qui pourraient servir de traitement pour les myopathies congénitales et de déterminer les paramètres optimaux d’utilisation des molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de fournir des informations relatives au potentiel thérapeutique d’une molécule qui pourrait servir pour le traitement de myopathies congénitales.

Procédures

Les animaux recevront une injection intraveineuse d’une molécule dont l’administration ne durera pas plus de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes afin de réaliser une chirurgie terminale qui ne durera pas plus de 15 min.

Impact sur les animaux

Chaque animal recevra 1 injection intraveineuse et 2 injections intrapéritonéales réalisées sur animal vigile. L’injection sera à l’origine d’une douleur légère au point de piqûre et la contention manuelle de l’animal génèrera un stress léger/inconfort.

Devenir

Les animaux seront mis à mort après prélèvement des tissus nécessaires pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Dans ce projet qui consiste à évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule, le modèle murin est privilégié car il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation in vivo des effets de potentiels traitements est un prérequis indispensable avant toute application clinique.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur un nombre d’animaux restreint car il s’agit d’expérimentations pilotes qui vont servir à identifier une molécule à fort potentiel thérapeutique et ses paramètres optimaux d’utilisation. De plus, les résultats d’une procédure pourront être réutilisés pour une autre procédure ce qui permet de s’affranchir d’un groupe expérimental et de réduire ainsi le nombre d’animaux. Les travaux antérieurs ont démontré qu’un échantillon de 4-5 animaux par groupe est requise pour garantir la fiabilité des tests statistiques utilisés pour vérifier l’activité de la molécule dans l’organisme et comparer les différents groupes d’animaux entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés et pesés 2 à 3 fois en une semaine. Si une perte de poids >5% au cours de 48h est notée, de la nourriture humidifiée ou gélifiée sera placée au sol dans la cage et les animaux seront alors pesés quotidiennement. Les prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiants et analgésiants. Des points limites adaptés et spécifiques à ce projet ont été définis et seront mis en place.

Choix des espèces

Le modèle rongeur a été sélectionné pour sa pertinence scientifique et le choix de la souris repose sur sa proximité de nombreux mécanismes physiologiques avec ceux observés chez l’être humain ainsi qu’un niveau d’organisation similaire à celui de l’Homme. Le modèle murin permet ainsi d’étudier de manière pertinente les effets biologiques d’une molécule dans un organisme entier, intégrant les interactions entre les différents organes et systèmes. Les animaux seront inclus dans l’étude à l’âge de 8 à 10 semaines et évalués jusqu’à 9 à 11 semaines. Ce stade de développement, considéré comme jeune adulte chez la souris, est adéquat car la croissance de l’animal est stabilisée et ses fonctions physiologiques sont matures et homogènes. Ce choix d’âge permet donc d’analyser l’effet de la molécule dans des conditions physiologiques stables, comparables à celles d’un organisme adulte, tout en limitant la variabilité liée au développement ou au vieillissement. Ce cadre expérimental garantit ainsi la pertinence scientifique des résultats tout en optimisant la reproductibilité des données.