Tests réglementaires

Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.

Remplacement

Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Choix des espèces

Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.

Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.

Objectifs

L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.

Bénéfices attendus

La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Procédures

Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

Le dossier réglementaire exigé avant une première administration chez l'être humain repose sur 182 macaques à longue queue, tous tués pour évaluer la toxicité et la biodistribution du produit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures, jusqu'à quatre heures pour un traitement bilatéral, et parfois deux chirurgies espacées d'un mois. Les prises de sang se font sur animal éveillé sous contention manuelle, le liquide cérébrospinal est ponctionné sous anesthésie, et le recueil des urines et des fèces impose un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce comme effets indésirables possibles une perte d'équilibre, un défaut de clignement des paupières et une paralysie faciale transitoire, et présente la réalisation de ce projet chez le primate comme "indispensable".

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le primate afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier les surdités génétiques/héréditaires tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un implant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 et 2 heures (traitement unilatéral) et jusqu’à 4 heures (traitement bilatéral). Chaque animal est soumis à une chirurgie généralement. Potentiellement, un animal peut être soumis à deux chirurgies espacées d’au moins 1 mois pour réaliser des injections bilatérales non simultanées. Examens cliniques : les animaux sont suivis quotidiennement mais des examens spécifiques peuvent être conduits pour suivre les paramètres cardiovasculaires, la pression artérielle par exemple. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces examens sont réalisés entre 2 et 4 fois selon la durée de l’étude. Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes). Liquide de l’oreille, liquide cérébrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie sous anesthésie générale et à la nécropsie après euthanasie). Larmes, salive, température corporelle : ces prélèvements non invasifs sont réalisés chez les animaux avec une contrainte manuelle légère pour que l’animal ne bouge pas le temps du prélèvement (durée : quelques secondes et moins d’1 minute). Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces prélèvements sont généralement réalisés une fois dans les semaines précédant le traitement, deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines après traitement, puis en milieu et en fin d’étude. Les urines et les fèces sont collectés quand l’animal est hébergé dans une cage dédiée pour le recueil de ces fluides. L’hébergement individuel ne peut dépasser 24 heures. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Chaque animal est soumis à 4 collectes généralement, réalisées une fois dans les semaines précédant le traitement, une fois dans les 2 premières semaines après traitement en milieu d’étude et en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère, ponctuelle et transitoire de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre, un défaut de clignement des paupières et/ou une paralysie faciale transitoire(s). Des effets indésirables liés aux prélèvements et/ou aux examens cliniques sont liés à la contention légère des animaux qui peut induire un léger inconfort ou stress aux animaux, qui restent transitoire. Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le primate afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum requis pour permettre une analyse statistique, conformément aux recommandations des lignes directrices. L’estimation du nombre d’animaux a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et d’une éventuelle variation de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire, de réveil et les jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement notamment l’activité et la mobilité des animaux, les interactions sociales, l’apparence physique, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. Toute anomalie est signalée au vétérinaire pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se font sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a des signes d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de Macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.

Objectifs

La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.

Bénéfices attendus

Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.

Procédures

La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Mesurer le devenir d'un candidat médicament dans l'organisme, au service du développement préclinique de molécules, conduit à utiliser 2 500 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart sont tuées pour des prélèvements terminaux de tissus, 250 étant réutilisées dans d'autres projets, dont des formations. Chaque animal peut recevoir jusqu'à deux administrations par jour pendant quinze jours, subir une chirurgie de dix à quarante-cinq minutes pour l'administration du produit, puis jusqu'à cinq prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur écrit que l'animal constitue un passage obligatoire avant toute administration à l'homme, et que les méthodes de substitution, quand elles existent, ne suffisent pas.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule. Pour cela, au cours de chaque étude, le candidat-médicament est administré par differentes voies d'administration possible. Des prélèvements sanguins répétés sont ensuite effectués pour mesurer dans le temps la concentration plasmatique du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents marqueurs biologiques pertinents. En fin d'étude, différents prélèvements terminaux de tissus et/ou organes peuvent également être effectués afin dans ce cas également de mesurer la concentration de la molécule d'intérêt.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 45 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques et n'exèderont pas 2 administrations par jour pendant 15 jours. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés (maximum 5 prélèvements sur 24h en suivant les temps de récupération indiqués dans les recommandations éthiques). Les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min. Des prélèvements de tissus pourront également être réalisés en terminal sous anesthésie profonde et analgésie.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaires, sous-cutanés, intrapéritonéales, intradermique, intramusculaire et intraveineuse ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour étudier la pharmacocinétique ou la biodistribution d'un candidat médicament. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : en moyenne 5 animaux par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux,• La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris fait partie des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, les rongeurs et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques (plus de 90% de gènes en communs). De plus, les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles reproductifs et de vie courts. Par conséquent, la souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution qui permettent d’analyser le devenir du produit testé dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.