Tests réglementaires

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse une dose unique de candidats anticancéreux, subissent des prélèvements de sang répétés à la queue, puis un prélèvement terminal de grand volume par ponction cardiaque sous anesthésie "pouvant induire un arrêt cardiaque", les effets indésirables attendus allant de la perte d'appétit à la diarrhée. Le porteur précise que les souris écartées du protocole, trop légères ou mal injectées, servent d'abord à s'entraîner aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est "nécessaire" pour ces analyses de tolérance.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

# Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins(en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement). # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de cheveux…), pouvant aller jusqu'à l'atteinte des critères ethiques. Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

L’ensemble des animaux entrés en procédure seront euthanasié : - Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. - Les animaux ayant atteint les critères éthiques et dont l’état ne permet pas de pratiquer ce prélèvement de grand volume , seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. - Les souris non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g...), seront reformées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme.. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

160 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par gavage avec des parasites intestinaux, ils peuvent développer une inflammation de l'intestin, des diarrhées et une chute de l'hématocrite, portent un harnais de collecte des excréments et subissent un jeûne avant d'être tués. Le projet entretient des souches de parasites, que le porteur nomme "matériel biologique", pour tester des antiparasitaires. Il retient des mâles, plus sensibles à l'infestation, pour "produire plus de parasites avec moins d'animaux", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit le cycle complet du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes et adultes de parasites intestinaux d'intérêt vétérinaire) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique, criblage de molécules). Pour cela, il est nécessaire de conduire des infestations expérimentales pour i) produire le matériel de façon régulière, ii) disposer d'isolat parasitaire et caractériser leurs propriétés de résistance et de virulence, iii) contrôler les doses infestantes et cibler l'espèce d'intérêt (à la différence d'infestation naturelle non contrôlées), iv) maintenir les isolats parasitaires multi-résistants en confinement. Toutes ces contraintes ne rendent pas possible l'utilisation d'animaux en infestation naturelle ou d'animaux d'élevage commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en comprenant i) les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques. Ces bénéfices couvrent des enjeux à court et moyen terme.

Procédures

1) Le déparasitage consiste à traiter les animaux avec un anticoccidien et un anthelminthique. Les deux sont par voie orale ( 1 fois et entre 5 et 10 min). 2) Des prises de sang sur animal vigile pour suivre l'hématocrite (entre 3 et 5 fois et 5 min). 3) Infestation par gavage de parasite en fonction du niveau de résistance de l'isolat (1 fois et entre 5 et 10 min). 4) Transfert des animaux infestés par des isolats résistants dans les parc sur grille et mise en place des harnais (1 fois et environ 30 min). 5) En fonction de la pression sélection, application d'un traitement antiparasitaire (1 fois et en entre 5 et 10 min) 6 ) Récolte des fécès grâce au pot rattaché au harnais (en fonction de besoin scientifique et en continu). 7) Prélèvement rectal pour collecter de petites quantités de parasites (ponctuelle selon les besoins et environ 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de quatre ordres : 1. l'effet de l'infestation : les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en parc avec plateau de récolte des fècés par deux des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux. 3. Les harnais de collecte et le prélèvement rectal peuvent provoquer un léger inconfort. 4. Une mise à jeûn une nuit (< 16h) avant l'euthanasie constitue un stress important pour l'animal. 5) La prise de sang : la contention peut générer du stress ainsi qu’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminés dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro car aucune méthode alternative n'est disponible à l'heure actuelle.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe soit 160 agneaux sur les cinq années à venir au maximum. Aucun test statistique n'est prévu dans le cadre des projets car il s'agit d'assurer une production continue de matériel biologique. Un minimum de deux animaux est considéré pour prévenir un isolement social.

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par deux minimum. Chaque parc avec grille pour la collecte des fèces dispose d’un tapis pour le confort pour le couchage. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte : elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Enfin, des granulés sont donnés après chaque prise de sang. Les animaux sont observés quotidiennement. Dans le cas où l'animal présenterait un état clinique détérioré (apathie, anorexie, diarrhée), une coproscopie de contrôle sera réalisée. Pour l'infestation par H. contortus (parasite hématophage), tout animal présentant une perte d'hématocrite supérieure à 30% de son hématocrite initial sera vermifugé (isolat sensible ou mono-résistant) ou euthanasié (isolat multi-résistant). L'hématocrite sera établi avant puis 30j et 45j après infestation, ainsi qu'après toute coproscopie supérieure à 15000 oeufs/g lors du suivi hebdomadaire. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Les vers gastro-intestinaux, parasites d'intérêt, sont inféodés à cette espèce. Les agneaux auront entre 2.5 à 6 mois. A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises à jeun hydrique et isolées, elles passent dix-sept tests de double choix entre deux boissons pour mesurer leur préférence pour des "faux lipides", avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'isolement pendant les tests peut être source de stress et prévoit un enrichissement supplémentaire. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer la souris pour l'évaluation orosensorielle liée à l'obésité.

Objectifs

Des études récentes chez l’Homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) que les saveurs sont détectées. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Ainsi ces deux lipido-récepteurs pourraient représenter la cible pour développer de nouvelles molécules (agoniste / antagoniste) permettant de moduler le comportement alimentaire lipidique chez les obèses. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras, nous avons synthétisé de faux lipides (agonistes de lipido-récepteurs), à partir de d’acides gras naturels, capables d’interagir avec les lipido-récepteurs mimant le goût du gras sans apporter de calories car ils ne sont pas métabolisables. Nous avons démontré l’absence d’effets génotoxiques et tératogènes de ces faux lipides. Cette demande représente l’extension de la précédente autorisation accordée concernant les faux lipides A et faux lipides B et qui sont brevetés L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouvelles molécules biosourcées « faux lipides » sur la préférence des aliments gras, et portera essentiellement sur l’évaluation orosensorielle vis-à-vis de ces faux lipides chez souris C57/BL6. Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules réduisent l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules modifient la préférence pour les molécules lipidiques et réduisent à long terme l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Les animaux, seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel (test de double choix entre deux boissons) afin de déterminer si les souris présentent une certaine préférence pour les molécules d'intérêt. Pour ce faire, Les animaux seront soumis à une mise à jeun hydrique de 4h avant les tests et pendant le test orosensoriel (durée 4h) les souris seront individualisées, les croquettes seront retirées et auront à leur disposition une bouteille d’eau et une bouteille de solution « test » pendant le test. Chaque lot de 15 souris subira 17 tests de double choix, avec une pause de deux ou trois jours entre les tests. A la fin de l’étude Les animaux seront mis à jeun pendant 4h et soumis à un prélèvement de sang terminal en intra-cardiaque sous anesthésie à l’Isoflurane (3%). Enfin, après mise à mort de l’animal, des prélèvements d’organes auront lieu. Aucun autre prélèvement sur animal vigile n’est envisagé.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact chez les souris puisqu’on est amené à les mettre en cages individuelles (pendant 12 h) lors des tests de double choix. Les animaux peuvent subir un stress suite à l’individualisation pendant la durée des tests. Pour minimiser l'effet de ce stress, un enrichissement supplémentaire (igloo en cellulose en plus des sizzle pad) sera apporté.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal (souris) s’impose dans ce projet d’une part du fait que nos molécules « faux lipides » sont nouvelles et par conséquent il n’existe aucun outil pharmacologique qui aurait pu permettre la mise en place d’une étude clinique et d’autre part par le besoin d’analyser les mécanismes multifactoriels impliqués dans la perception gustative. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En effet, malgré les résultats obtenus, in vitro, utilisant des cellules gustatives, Il n’est pas possible de se limiter à des approches in vitro pour des évaluations orosensorielles de faux lipides

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux

Raffinement

Les animaux seront parfois isolés pendant la durée du teste double choix (4 h), cependant en dehors des périodes de tests Les animaux seront hébergés en groupes (3-4 souris par cage) dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose en plus des sizzle pad). L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière et dès l’apparition de signes précoces de souffrance (des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix lors de l’étude des évaluations orosensorielles et les investigations de la modulation du comportement alimentaire par les faux lipides et son incidence à long terme sur l’obésité. A la suite de ce projet nous envisageons dans une seconde étape de tester les molécules les plus préférées par les souris sur l’incidence de l’obésité dans le même modèle de souris. La souris est le modèle de l’obésité qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue puis une série de prélèvements de sang répétés sur animal vigile, échelonnés sur vingt-huit jours, pour suivre le devenir sanguin de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que le micro-échantillonnage réduit le volume de sang prélevé et le nombre de souris. Il affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire. 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire (10min, 1h, 6h, 24h, 72h, 3 jours, 7 jours, 14 jours, 21 jours et 28 jours).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront euthanasiés.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 10% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes non anticipables afin de ne pas mettre en péril les résultats de cette expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent une molécule qui endommage la barrière de l'intestin et reçoivent un agent qui provoque des tumeurs, développant diarrhée, douleur viscérale, saignements et perte de poids, avec prélèvements de sang répétés et traitements deux fois par jour. L'objet est de tester des molécules anti-inflammatoires et anticancéreuses contre les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer du côlon, y compris sur des souris au système immunitaire humanisé. Le porteur qualifie ces modèles d'"indispensables" tout en reconnaissant que la réponse immunitaire de la souris diffère de celle de l'humain.

Objectifs

Les deux principales formes de maladies inflammatoires de l'intestin, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, sont des troubles inflammatoires chroniques récidivants du tractus gastro-intestinal. L'étiologie est très probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux favorisant la désintégration de la barrière épithéliale intestinale et la dérégulation de la réponse immunitaire au microbiote intestinal. Rien qu'en France, on dénombre plus de 200 000 patients atteints de MICI. Les cancers de l’intestin, notamment le cancer colorectal, peuvent être associés à la forme chronique des MICI et/ou aux traitements associés. N’ayant pas de traitement efficace pour les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer colorectal, de modèles pré-cliniques sont nécessaires afin de tester l’efficacité de produits candidats à visée thérapeutique. L'un des modèles les plus utilisés pour étudier les maladies chroniques de l’intestine est le modèle d'inflammation intestinale induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium). Afin de modéliser le cancer du colon, l’injection d’azoxymethane (AOM) associé au modèle chronique de DSS est ainsi un outil indispensable. Les modèles précliniques sont donc indispensables pour tester l'efficacité des médicaments à cet égard. Les modèles murins d’inflammation intestinales sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction de la barrière intestinale ainsi que le microbiote. En revanche, on craint de plus en plus que les mécanismes immuno-pathogènes observés dans les ces modèles ne soient pas les mêmes que ceux que l'on pense observer chez l'homme. Nombreuses études ont démontré que la réponse immunitaire murine différencie en structure et en fonction dans des nombreux cas de celles de l’homme, ce qui peut expliquer les taux d’échec dans l’utilisation des données précliniques prometteuses en nouveaux traitements en clinique. Cette réalité inconfortable a incité un certain nombre de chercheurs à entreprendre une série d'études visant à humaniser le système immunitaire murin par le transfert adoptif de cellules progénitrices lymphoïdes ou hématopoïétiques dans une nouvelle génération de receveurs immunodéficients. Ainsi, les souris humanisées au niveau du système immunitaire permettront de comprendre l’interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et également avec les tumeurs.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, le projet validera les doses de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d'AOM (azoxymethane), avant de tester l'efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires et anticancéreux) en utilisant différents modèles/stades de pathologies intestinales. En outre, ce projet évaluera ces maladies intestinales dans un modèle de souris au système immunitaire humanisé. Ces souris recevront des cellules souches humaines capables de se différencier en cellules immunitaires humaines. Il s'agit d'un modèle innovant, car peu étudié à ce jour, et qui répondra à la crainte de plus en plus exprimée vis-à-vis des modèles murins traditionnels : la réponse immunitaire humaine diffère de la réponse murine, donc les souris humanisées au niveau du système immunitaire (NXG-HIS) seront un atout comme modèle préclinique pour l'étude de ces maladies, où la composante inflammatoire et le système immunitaire jouent bien évidemment un rôle primordial. Ce modèle nous permettra également de comprendre l'interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et avec les tumeurs.

Procédures

Pour induire l’inflammation intestinale chez la souris, de l’eau de biberon contenant du DSS (Dextran Sulfate Sodium-une molécule capable d’endommager la barrière intestinale) sera donner aux animaux pendant 7 jours (modèle aigu) ou 5 jours (modèles chroniques) en 3 cycles. Pour l’induction de la tumeur au niveau du côlon, une injection d’azoxymethane (intrapéritonéale) sera donnée avant les cycles de DSS. Les animaux auront des prélèvements de sang en avant l'induction de l'inflammation intestinale ou de la tumorigenèse. Le prélèvement sera fait à la veine maxillaire (en vigile) ou au sinus retro orbitaire (sous anesthésie). D’autres prélèvements au cours de l’étude sont prévus : 1 fois après 15 jours d'intervalle pour le modèle aigu et 3 fois avec un intervalle de 12 jours entre chaque prélèvement pour les modèles chroniques. Le volume à prélever sera de maximum 10% du volume total de sang circulant de l'animal par prélèvement (64mL/kg). Les animaux seront quotidiennement traités par une des voies suivantes : orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, deux fois par jour en respectant le volume journalier à être administré. Pour le DAI (l’indice d’activité de la maladie), les fèces seront récoltées quotidiennement (pendant 12 jours, en modèle aigu et 60 jours, en modèles chroniques) afin de vérifier la présence de sang et sa consistance. La récolte est faite par isolement de l’animal dans une cage propre et sans enrichissement, nourriture et l’eau pendant maximum 30 minutes/jour. A la fin de la phase expérimentale, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement maximal de sang par ponction cardiaque. Ensuite, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’effet attendu du DSS (Dextran Sulfate Sodium) est l’inflammation intestinale qui perturbe la digestion et l’absorption des nutriments dû à l’altération de la barrière intestinale. Les effets du DSS sur la santé de l’animal seront la diarrhée, la douleur viscérale, le saignement, la perte de poids et l’apathie, principalement. Le score de l’indice d'activité de la maladie qui consiste en évaluer la perte de poids corporel, la diarrhée et le saignement) est mesuré tous les jours pendant la phase expérimentale et permettra rapidement de connaître l’avancement de la maladie et la détérioration de l’état de santé de l’animal. L’objectif du modèle est d’avoir des animaux malades, mais pas dans un état sévère d’inflammation. L’AOM (azoxymethane) est un mutagène qui induit la formation des tumeurs. Il est donc attendu que les souris perdent du poids, aient de la diarrhée, des douleurs abdominales et deviennent apathiques. On attend le développement des tumeurs au niveau intestinal, sans pour autant induire la mort des animaux. Les effets secondaires des candidats thérapeutiques à tester ne sont pas connus, ni leur nature. De ce fait, il nous est impossible de prévoir les nuisances pour les animaux. En ce qui concerne la souris humanisées et son phénotype, celui-ci n’est pas dommageable pour la souris, c’est-à-dire cela n’augmente pas la sévérité des pathologies étudiées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles in vitro, tels que les organoïdes intestinaux ou simplement des lignées cellulaires, ne peuvent pas mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En revanche, ces modèles permettent de sélectionner au préalable des molécules d’intérêt avant de passer dans un modèle pré-clinique in vivo. Ensuite, une fois les pilotes in vivo faites et le screening in vitro réalisés, des tests peuvent être fait en nombre réduit d’animaux à une quantité relevant pour garantir la puissance statistique.

Réduction

L’objectif des études pilotes prévues dans ce projet est de limiter le plus possible le nombre d’animaux dans les modèles qui seront ensuite utilisés. Pour les études pilotes, le suivi quotidien et accru des animaux permettra de sélectionner la dose de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d’AOM (azoxymethane) la plus juste afin d’avoir un phénotype pathologique, sans pour autant induire la mort des animaux. En revanche, dans les modèles pré-cliniques, le fait de ne pas connaître les effets indésirables des molécules à visée thérapeutique in vivo et avec l’objectif de garder la puissance statistique, la quantité d’animaux devra être augmentée de 20% par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages qui hébergent les animaux (tunnel, Aspen brick, igloo et Sizzle-Nest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence des points limites à savoir : la prostration ou absence de mouvement, la perte de poids supérieure à 20% du poids d’origine et la diarrhée liquide accompagnée d’un saignement accru. Si un animal présente un des points limites, il serait pris en charge par l'équipe zootechnique. Si son état ne s’améliore pas dans les 24h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieront. Si l’animal présente une plaie, par exemple, des soins de nettoyage et désinfection seront effectués.

Choix des espèces

Les modèles d’inflammation intestinale par DSS (Dextran Sulfate Sodium) et le modèle de cancer du colon induit par l'AOM (azoxymethane) suivi de l'inflammation chronique induite par DSS sont très bien décrits et caractérisés dans la littérature. Pour les souris normalles, non-humanisées, la maturité sexuelle est atteint pour les mâles à 8 semaines et pour les femelles à 6 semaines. Donc, pour que les animaux soient matures, ils rentreront en étude qu'à partir de l'âge de 8 semaines. En revanche, pour les animaux humanisés, dû au processus d’humanisation, les animaux rentreront en étude à partir de 15 semaines d'âge.

16 575 animaux non-humains, 15 750 souris, 615 rats et 210 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une administration unique d'un candidat médicament, par voie orale ou par injection, puis un prélèvement de sang sous anesthésie profonde avant la mise à mort et le prélèvement d'organes. L'objet, pour une entreprise pharmaceutique, est de mesurer la distribution du produit dans l'organisme. Le porteur affirme que des cellules isolées ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

L'entreprise développe des médicaments pour l'homme qui ciblent certains récepteurs, en particulier ceux du cerveau. Il est donc important de connaître la distribution du produit dans le corps entier, en particulier dans les organes cibles et pour cela, il faut faire des études pour voir comment le médicament se distribue après administration (orale ou injection). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer l'exposition dans le temps d'un futur médicament et de ses produits dans les divers organes chez différentes espèces animales rongeurs (rat, souris, cobaye) après un traitement unique. Les dosages dans les tissus et dans le sang nous donneront alors une bonne indication quant à l'exposition au composé dans le temps et nous aideront à relier les expositions aux effets bénéfiques et toxiques de la molécule en développement. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de recherche plus global de la molécule au profit de la santé humaine qui sera en complément d'autres études au laboratoire.

Bénéfices attendus

L'implication des animaux dans ce projet va permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du médicament dans un organisme proche de l'homme et d'obtenir les expositions du médicament dans les tissus et le sang.

Procédures

Prélèvement sanguin (environ pendant 2 minutes) sous anesthésie générale profonde après administration du produit (administration orale ou injection d'une durée d'environ 1-3 minutes) puis, prélèvement de divers organes après mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention pouvant induire un stress chez l'animal, l'administration du produit à tester et aux effets indésirables du produit.

Devenir

Le cerveau et le cœur au minimum étant récupéré pour être analysés, chaque animal est donc mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux pour des évaluations de distribution d'un médicament est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier reflétant l'humain. La complexité et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas d'utiliser des modèles avec des cellules isolées car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux par temps est de minimum 3 à maximum 5 individus pour avoir une fiabilité de résultats. 5 à 9 points de temps nécessaire pour avoir assez de points pour le calculs des paramètres d'exposition.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant toute expérimentation pour s'habituer au nouvel environnement. Pour le bien-être de l'animal et lui éviter un stress, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin (exemple : désinfection d'une plaie). Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal anxieux soit durant le temps d'acclimatation, soit le jour même de l'expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie. Les traitements se feront par du personnel formé avec du matériel adéquat pour chaque animal.

Choix des espèces

Les espèces rongeurs sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats à l'homme. Les animaux sont utilisés au stade adulte, cela permet de refléter un organisme mature et développé (en particulier au niveau du foie).