Tests réglementaires

160 cochons vont être utilisés, réutilisés ensuite dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir l'implantation chirurgicale d'une chambre vasculaire ou d'un cathéter, l'administration d'un candidat-médicament, des prélèvements de sang, d'urine et de biopsies, puis un isolement de 24 à 48 heures en cage à métabolisme. Le porteur décrit l'étude pharmacocinétique comme une étape "indispensable" avant l'administration à l'homme et affirme qu'aucune méthode de substitution in vitro ou in silico ne suffit. Il présente comme bénéfice pour l'animal une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique d'un candidat médicament chez le porc grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons sanguins et/ou d'urine et/ou de biopsies (par exemple de peau) chez le porc vigile, après administration du produit à tester. Le but est de mesurer la concentration du produit dans le sang et/ou l'urine et/ou dans les organes, et d'éventuels marqueurs biologiques après administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (porc) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Au maximum, un porc aura une implantation (chambre vasculaire ou cathéter central, chirurgies de moins de 2h) avec administration du produit à tester (

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les porcs de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant la chirurgie, un stress lié à l'anesthésie/sédation, un stress post-opératoire, un stress lié à la contrainte du cathéter veineux central ou de la chambre vasculaire, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le porc est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 ou 4/ par groupe. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’animaux qui sera utilisé est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole d'analgésie adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

384 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études. Ils subissent jusqu'à cinq chirurgies, dont l'implantation d'un émetteur de télémétrie de quatre heures et demie à cinq heures et demie, un isolement après l'opération de six à huit jours, puis l'administration de candidats médicaments et des prélèvements. Le projet évalue les effets de médicaments sur le système cardiovasculaire dans un cadre réglementaire. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que le chien reste "l'une des espèces les plus adaptées".

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardiovasculaires chez le chien vigile ou anesthésié en utilisant la télémétrie dans le cadre réglementaire de l'évaluation de la sécurité des médicaments sur les fonctions vitales de l'organisme. Sur animal vigile, la télémétrie permet de mesurer différents paramètres physiologiques chez l'animal vigile libre de ses mouvements. Sur animal anesthésié, la télémétrie permet de ne pas rajouter d'équipement supplémentaire lors des mesures, et de réaliser plusieurs expériences successives sur un même animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire. Pour l'animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée (le chien) par le développement d'outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l'espèce la plus prédictive en fonction de l'objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet, les animaux pourront être soumis à 3 types de chirurgies : - chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie avec ou sans cathéter de mesure de la pression ventriculaire gauche cardiaque (PVG) - chirurgie d'implantation de chambre vasculaire ou minipompe - chirurgie de retrait de chambre vasculaire ou minipompe. La durée de la chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie sera entre 4h30 et 5h30. Si l'implantation de la chambre vasculaire ou minipompe est réalisée lors de la même chirurgie, la durée de l'intervention sera augmentée de 1h. Si l'implantation de la chambre vasculaire ou minipompe est réalisée séparément de l'implantation de l'émetteur de télémétrie, la durée de l'intervention sera d'envion 1h. En cas de besoin, et au maximum, l’animal pourra être soumis à une chirurgie pour implantation de l'émetteur et 2 chirurgies pour implantation/retrait minipompe, soit 5 chirurgies au maximum. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 30sec/prélèvement), d'urine ou de déjections (hébergement en cage de collecte pendant 48h maximum), des mesures d'échocardiographie pour observer le fonctionnement du coeur sans chirurgie ni anesthésie (15-30 min par mesure), des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation), un test de mesure du taux d’oxygène dans le sang (durée environ 1min), et/ou un test d'inclinaison pour détecter de potentielles baisses de tension (durée de 3 à 5 min). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, sous-cutanée, transdermique, intranasale, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes, sauf pour la perfusion intraveineuse où les animaux sont maintenus pendant la durée de la perfusion). Et si l’administration se fait par une perfusion de longue durée (supérieure à 1h), les animaux porteront des gilets (avec une minipompe embarquée) et seront isolés pendant maximum 24h. Dans le cas d'expérience sous anesthésie, les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies d'une durée de 4h maximum chacune.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés, après une mise à jeun préalable, à une ou plusieurs reprises pour implantation de l'émetteur de télémétrie et/ou de la chambre vasculaire/minipompe. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8j). Cet isolement engendrera un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale.Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 30sec/prélèvement), à des échographies cardiaques (15-30 min par mesure), à des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation) et à des tests de changements de postures (test d'inclinaison). Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l'objet d'échanges avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d'observation des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.Dans le cas d'expérience sous anesthésie, les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies d'une durée de 4h maximum chacune.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude du même projet ou dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires de ces candidats médicaments. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le chien est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle car il présente un système cardiovasculaire proche de celui de l’homme.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par: - La mise au point de procédures rigoureuses, - La formation du personnel, - L'utilisation de la télémétrie sans fil (animal libre de ses mouvements pendant les phases d’enregistrement), - La validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, -L’utilisation d’une chambre vasculaire permettant d’éviter les piqûres répétées ou une restriction physique sur une longue période - Un suivi quotidien de l'état de santé des animaux, - Le recours à des procédures les moins invasives possible, - Le suivi d'éventuels signes cliniques, - La détermination des points limites, - Le recours aux procédures d'euthanasie dès que nécessaire, - Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post- opératoire de l'état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, - La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l'amélioration de la sensibilité des méthodes d'analyse, - La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il représente un modèle prédictif validé d'un point de vue règlementaire pour les effets cardiovasculaires d'un produit chez l'homme (système cardiovasculaire proche de celui de l’homme). Animaux adultes : ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

320 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immunisé de façon répétée puis subit des prélèvements de sang portant sur plus de 10 % du volume sanguin sans reconstitution, avant une exsanguination finale sous anesthésie pour récolter le sérum. Le porteur indique maintenir les animaux en vie de 11 à 24 mois pour produire ces anticorps destinés à la transplantation et à la cancérologie. Il justifie le choix du porc par le volume de sérum récolté, un animal remplaçant selon lui plus de cent "petits animaux".

Objectifs

L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales, pour des applications de développement clinique en transplantation et en cancérologie. Cette saisine est un amendement à l’autorisation APAFIS dans le but d’optimiser le protocole d’immunisation avec notamment la recherche de la meilleure voie d’administration.

Bénéfices attendus

Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue vis-à-vis des cellules ciblées, 3- une activité anti-inflammatoire. 4- une spécificité démontrée par une série d’analyses histologiques sur tissus humains.

Procédures

Prélèvements de sang sous tranquillisation (animaux à moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation ; - 10 minutes pour l’administration injectable de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Il est à noter que plusieurs animaux peuvent être manipulés en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens). Les temps pris par les procédures vont s’intercaler ce qui permet aux opérateurs de réduire le temps global des procédures.

Impact sur les animaux

Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

Devenir

A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou par un euthanasiant.

Remplacement

Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels (existant principalement dans les domaines de l’envenimation, de la transplantation et de l’anémie aplastique sévère) par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans).

Réduction

Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le petits animaux), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. Un porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux. Aucun test statistique ne soutient cette comparaison qui est évidente à l’ égard de la différence de taille entre ces espèces (un porc pesant en moyenne 110 Kg). En outre, le porc est maintenu en vie pendant une période de 11 à 24 mois, alors que les protocoles de prélèvement de sérum sur petit animal comprennent en général une à 2 prises de sang avant mise à mort par exsanguination. Ces 2 facteurs justifient les différences importantes dans le nombre d'animaux nécessaires pour collecter une quantité identique de sérum, lorsque des porcs sont choisis et non des petits animaux (tels que des lapins). En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. C’est pour cette raison que nous réalisons cet amendement. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps.

Raffinement

Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas pour éviter l’écrasement des porcelets. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage. L’optimisation du protocole d’immunisation permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection).

Choix des espèces

Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné dès l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’anticorps pour soigner de 100 à 1000 patients (en fonction de la dose administrée dans les indication de Transplantation ou d’oncologie). Les porcelets sont élevés puis immunisés à partir d’un minimum de 6 semaines d’âge (> 20Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

1 360 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est vacciné puis, 28 jours plus tard, reçoit en six points une injection intradermique de toxine diphtérique pour contrôler l'activité du vaccin, ce qui provoque des érythèmes et un inconfort dans les 48 heures. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré, faute de données sur son interaction avec l'essai. Il affirme que l'évaluation de l'activité du vaccin exige un "organisme entier" et qu'aucune méthode in vitro n'est disponible.

Objectifs

L'objectif du projet est de vérifier la conformité des vaccins contenant la valence diphtérie vis à vis de leur activité antidiphtérique avant leur libération sur le marché.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats d'activité des vaccins pour la valence antidiphtérique est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.

Procédures

6 jours après l'arrivée, chaque lot de cobayes est vacciné par voie sous-cutanée au niveau de l'aine avec une dose de vaccin comprenant la valence antidiphtérique. Cette vaccination dure moins de 30 s par animal. 28 jours après la vaccination, les animaux sont challengés avec différentes doses de toxine diphtérique pour vérifier la protection du vaccin. Pour cela chaque cobaye reçoit en 6 points 6 doses différentes de toxine. L'administration se fait par voie intradermique en 3 points sur chaque flanc préalablement rasé. Les injections de toxine durent environ 2 min par cobaye.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie sous-cutanée n’entraine pas de nuisances visibles ni au niveau du comportement ni de l’aspect des animaux. L'administration de la toxine par voie intradermique 28 jours après n'entraine pas non plus de nuisances visibles au moment de l'injection. On peut néanmoins s'attendre à un léger stress lié à la contention et une douleur modérée pour ces injections. Dans les 48h suivant cette épreuve, les cobayes développent des réactions aux points d'injection sous forme d'érythèmes plus ou moins étendus qui peuvent créer un inconfort.

Devenir

A la fin d'un essai tous les animaux sont euthanasiés car ils ne peuvent être réutilisés en essai.

Remplacement

La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer l'activité des vaccins diphtériques.

Réduction

Plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - contrôle en méthode monodose lorsque la méthode a pu être validée, -optimisation des essais : le test de plusieurs lots de vaccins en même temps versus une même référence est privilégié lorsque la programmation des essais le permet -limitation des retests au maximum - mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots pour certains vaccins dont la stabilité de la production a été prouvée.

Raffinement

L'enrichissement mis à disposition des animaux est le suivant: - Mise à disposition permanente de foin compressé - Utilisation de tubes en PVC servant de cachette en semaine, remplacés par des balles les week-ends. En cas d'observation d'anomalies du bien-être, les animaux sont isolés et bénéficient d'une surveillance renforcée. Si l'anomalie engendre une souffrance trop importante, les animaux sont immédiatement euthanasiés. Les médications antalgiques ne peuvent pas être administrées en l'absence de connaissances sur leurs interactions avec l'essai.

Choix des espèces

Le cobaye est le modèle le plus sensible utilisé pour les essais basés sur les réactions dermiques inflammatoires c’est pourquoi il a été retenu par la Pharmacopée Européenne. Les cobayes pèsent entre 250 et 300 g à leur arrivée ce qui correspond à un âge de 4-5 semaines.

4800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules dans le péritoine, qui provoque une production de liquide d'ascite et un gonflement de l'abdomen surveillé chaque jour, le liquide étant récolté après mise à mort. Ce liquide d'ascite entre dans la fabrication de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. Le porteur indique que cette cellule ne peut à ce jour être conservée qu'in vivo et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".

Objectifs

La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.

Bénéfices attendus

Cette ascite issue de la multiplication d'une cellule qui est utilisé directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité des tests.

Procédures

Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.

Impact sur les animaux

La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne et une cotation est réalisée chaque jour afin d'évaluer la douleur engendrée par ce geste.

Devenir

Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, Le liquide d'ascite est récolté post mortem.

Remplacement

La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.

Réduction

La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé du fait de l'origines des cellules à multiplier Pour cette application, nous utilisons des animaux matures âgées à minima de 8semaines.