Tests réglementaires

1 350 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie filtrante de l'œil sous anesthésie générale, puis un mois d'instillations, d'injections oculaires et de mesures quotidiennes de la pression de l'œil, pouvant provoquer rougeurs, saignements, inflammation et érosion de la cornée. L'objectif est de mettre au point cette chirurgie chez le lapin pour tester des traitements et des dispositifs contre le glaucome. Le porteur retient le lapin pour la taille de son œil proche de celui de l'homme et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative validée pour ce type d'évaluation.

Objectifs

Le glaucome est une maladie de l’œil au cours de laquelle une pression oculaire trop élevée endommage progressivement le nerf optique. Sans traitement, cette maladie peut entraîner une cécité totale. Aujourd’hui quatre-vingts millions d’individus sont touchés par cette maladie, un million en France, principalement des personnes âgées de plus de quarante-cinq ans. C’est la deuxième cause de cécité dans le monde. L’objectif du projet est de mettre en place, dans le plus grand respect du bien-être animal, une technique de chirurgie filtrante chez le lapin dans le but d’améliorer le traitement de l'élévation de la tension oculaire et du glaucome.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements ou dispositifs médicaux pouvant améliorer le traitement par la chirurgie de l'élévation de la tension oculaire et du glaucome. Aujourd’hui plus de quatre-vingts millions d’individus sont touchés par cette maladie et malheureusement dans certains cas le glaucome peut évoluer défavorablement même avec la mise en place d’un traitement médicamenteux par collyres ou implants. En effet, une opération peut devenir nécessaire lorsque les traitements de première intention deviennent inefficaces, que le traitement médical n’est plus suivi ou mal toléré par exemple. En général, l'opération présente un taux de réussite variant de quatre-vingts à quatre-vingt-dix pour cent mais elle nécessite de nombreux ajustements et retouches postopératoires en fonction notamment de la cicatrisation afin de maîtriser le débit de filtration. C’est pour cela, que de nouveaux traitements et dispositifs sont continuellement étudiés et évalués afin de rendre cette opération encore plus efficace, mieux tolérée et moins invasive.

Procédures

Au premier jour de la procédure qui durera un mois, une chirurgie filtrante d’une trentaine de minutes sous anesthésie générale est réalisée sur l’ensemble des animaux. Par la suite, une série d’administrations de produits à tester sera faite soit par : . Instillations 2 à 4 fois par jour sur animal vigile. Injection intra ou péri-oculaire 1 à 2 fois par jour sur animal anesthésié. Une série d’examens quotidiens (observation en lampe à fente, mesure de la pression intra-oculaire) sur animal vigile est ensuite pratiquée pour suivre l’efficacité des traitements et prévenir toutes complications ou effets indésirables. La mesure de la pression oculaire est réalisée quotidiennement sous anesthésie locale et a pour but de suivre la tension exercée dans l’œil et l’efficacité des traitements. Ces examens et mesures ne durent également que quelques secondes ou minutes. Tous les examens réalisés durant ce mois de procédure sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale (chirurgie comprise). Les autres examens (lampe à fente, mesure de la pression intra-oculaire) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver de nouveaux traitements ou dispositifs médicaux pouvant améliorer la prise en charge par la chirurgie de l'élévation de la tension oculaire et du glaucome. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel des complications mineures de la chirurgie. L'œil de l'animal peut présenter des rougeurs, un léger saignement, une inflammation, une érosion de la cornée. Ces signes de complications sont légers et fréquents chez l'homme aussi et disparaissent naturellement ou à l’aide de gouttes d'anti-inflammatoires et d'antibiotiques sous quelques jours. Malgré le soin et la vigilance apportés à la manipulation des animaux, un stress est toujours possible au moment de leur manipulation lors des observations, de l’administration de l’anesthésie ou des traitements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Contrairement aux tests d’irritation oculaire (test d’irritation oculaire de Draize par exemple), ou de cicatrisation où plusieurs méthodes alternatives permettant de s’affranchir d’essais sur l’animal ont été validées, il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’un nouveau traitement ou d’un dispositif médical dans le cadre de la chirurgie filtrante du glaucome. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé, relié à la circulation afin de pouvoir avoir une production et une élimination continue de l’humeur aqueuse ainsi que les mécanismes impliqués dans les phénomènes inflammatoires et de cicatrisation. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans nos procédures expérimentales est nécessaire pour atteindre les objectifs de ce projet, les modèles alternatifs ne pouvant pas prendre en compte ou faire intervenir à ce jour, toutes les interactions et tous les acteurs impliqués.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests de Dunn ou de Dunnett pour des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique et/ou d'analgésique pourra être réalisée. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et en l’atténuant après l’intervention. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales présentées sont largement utilisées et décrites sur le lapin dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin est choisi pour la taille de son œil, proche de celle de l'homme. Les techniques chirurgicales et les observations cliniques en sont de ce fait facilitées et plus largement extrapolables à l'oeil humain. Les animaux seront de jeunes adultes. Les lapins auront un minimum de 8 à 12 semaines. Cet âge correspond à la maturité fonctionnelle et visuelle chez ces animaux.

2820 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Des substances chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques sont appliquées sur leur peau rasée et injectées dans le derme pour vérifier si elles provoquent une allergie, selon deux tests réglementaires (Magnusson-Kligman et Buehler). Le porteur décrit des effets locaux pouvant aller jusqu'à la nécrose du derme, des escarres, des croûtes et une destruction de l'épiderme, ce qui contraste avec la gravité seulement "modérée" retenue. Il affirme que les modèles in vitro ne sont pas encore assez élaborés et que ces tests restent imposés par la réglementation européenne.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une réation allergique par contact cutané. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimique, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de sensibilisation cutanée sur le modèle du cobaye (SMK : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Magnusson et Kligman ou SMB : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Buehler). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du cobaye afin de vérifier, par l’observation d’érythème, si une réaction allergique se produit.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une àune substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.

Procédures

- SMK : sur 15 animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort - SMB : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un phénomène de sensibilisation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMK : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMB : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.

Devenir

SMK et SMB : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente ultérieurement. Ils sont donc mis à mort en fin d’essai.

Remplacement

Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour jouer un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances chimiques à tester. On doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. L’évaluation du potentiel sensibilisant des produits chimiques est de plus imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché. Conformément à la réglementation des produits chimiques, deux tests in vitro sont réalisés sur les produits et doivent être négatifs avant de passer chez l'animal pour étudier le pouvoir sensibilisant du produit d'essai.

Réduction

Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 3 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le cobaye reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée, comme le décrit la ligne directrice de la norme que nous suivont qui a été révisée en 2022. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

1050 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et le reste tué. Ils reçoivent des substances chimiques sur la peau rasée ou dans l'œil pour des tests d'irritation cutanée et oculaire de type Draize, qui peuvent provoquer érythèmes, escarres, œdèmes et atteintes de la cornée et de l'iris. Les lapins sans irritation sont réutilisés pour d'autres essais, ceux plus atteints étant tués. Le porteur indique que les tests in vitro suffisent "dans la grande majorité des cas" et ne recourt au lapin que lorsque la substance est incompatible avec ces méthodes.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une irritation par contact cutané et/ou oculaire. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests d’irritation cutanée et occulaire sur le modèle du lapin (IC : irritation cutanée sur le lapin et IO ; irritation oculaire chez le lapin). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du lapin ou dans le sac conjonctival de l’œil du lapin afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation se produit.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.

Procédures

- Irritation cutanée : C'est un traitement local par patchage / dépatchage (mise d’un pensement puis retrait), sur un animal vigile. Il y a 3 applications pour l’animal de l’essai initiale puis 1 application pour les 2 animaux de l’essai de confirmation. Les animaux sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7 et J14. A la fin de l'étude les animaux sont euthanasiés par injection intraveineuse. - Irritation oculaire : C'est un traitement local par instillation dans le sac conjonctival sur 1 à 3 animaux vigiles. Des injections sous cutanées sont faites aux animaux pour l'analgésie (3 à J0 puis 2/jour si nécessaire). Ils sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7, J14 et J21, nécessitant une instillation de fluoréscéine 10%. A la fin de l'étude, les animaux ne pouvant pas être utilisé pour une autre étude sont euthanasiés par injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Un phénomène d’irritation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours pour l’irritation cutanée et 21 jours pour l’irritation oculaire. - test IC : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau pouvant provoquer une douleur à l’animal. Un stress physique peut être engendré dû à la pose du patch de traitement que l’animal garde 4h. - test IO : peuvent apparaître du larmoiement, de l’œdème des conjonctives, de l’érythème des conjonctives, une atteinte cornéenne (opacité, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris pouvant provoquer une douleur à l’animal. De plus un stress physique au moment du traitement et des observations post traitement.

Devenir

- IC : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation cutanée ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation cutanée observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour la peau. - IO : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation oculaire ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation oculaire observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour les yeux.

Remplacement

Ces tests ne sont réalisés qu’après avoir évalué, par une analyse du poids de la preuve, toutes les données relatives au caractère potentiellement corrosif ou irritant de la substance pour la peau. Ces tests ne sont réalisés qu’après l’évaluation sur le produit chimique des données existantes en in-vivo humaine, en in vitro et de ses propriétés physicochimiques. - IC : Dans la grande majorité des cas, il n’est pas nécessaire de mettre en œuvre un test in vivo pour évaluer l’irritation cutanée. Les tests in vitro selon l’OCDE 439, l’OCDE 431 et l’OCDE 435 suffisent pour évaluer cet effet. Le test in vivo n’est mis en œuvre que lorsque le produit à tester n’est pas compatible avec le système d’essai in vitro (résultats faux positifs, faux négatifs ou interaction empêchant la réalisation du test).

Réduction

Ces tests ne sont réalisés que si nécessaire et après obtention des données montrant l’absence d’effet corrosif par la peau. Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale par une autre voie d’administration et dans lesquelles aucun effet ou des effets très légers ont été observés, ou de test d’évaluation de la pyrogénécité dont les résultats sont négatifs. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Ces tests sont réalisés par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. L’étude nécessite de traiter trois animaux mais seulement un animal est traité dans un premier temps. Si le produit n’induit pas d’effet corrosif sur le premier animal alors uniquement dans ce cas les deux autres animaux seront traités.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et le plateau contenant les fécès et les urines est nettoyé 3 fois par semaine. - IC : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Le produit est appliqué à des temps croissants (3 minutes, 1 heure puis 4 heures). Si un effet corrosif est obtenu à l’un des premiers temps alors le produit ne sera pas appliqué à un temps plus long. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. - IO : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Un protocole d’analgésie générale et d’anesthésie locale permet d’éviter toute souffrance pendant ces études. L’anesthésie locale est réalisée avant traitement, l’analgésie générale est réalisée pré et post traitement le jour du traitement ainsi que quotidiennement si des lésions importantes de l’œil ou un comportement de souffrance est perceptible chez l’animal. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le lapin reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance locale comme l’irritation cutanée et oculaire. Il est décrit dans les lignes directrices de l’OCDE 404 et de l’OCDE 405 dont les versions originales ont été adoptées en 1981 et ont été mises à jour en juillet 2015 et en juin 2021, respectivement. De plus, le lapin est historiquement l’espèce utilisée pour l’évaluation du potentiel irritant par contact cutané et oculaire des produits chimiques, comme décrit dans le test de Draize mis au point en 1944. L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser sont imposés par les normes OCDE correspondantes. Lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau un dispositif puis on y dépose la bactérie Staphylococcus aureus, avant un prélèvement du cœur et une dislocation cervicale, pour tester un implant recouvert d'une molécule antibactérienne contre le biofilm. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui risquerait d'aggraver l'infection, et n'attend surtout que des atteintes locales. Il répond à la "demande de l'industriel" et présente l'essai in vivo comme un "besoin incontestable".

Objectifs

L’objectif de ce projet d’évaluer l’efficacité d’un implant coaté d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer un matériel innovant permettant de réduire ou même d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme. Les biofilms bactériens sont généralement définis comme des agrégats de cellules bactériennes attachés à une surface et enrobés d’une matrice visqueuse. La formation d’un biofilm se fait selon un modèle bien établi et suit différentes étapes (adhésion, croissance, maturation et dispersion). On estime que 80 % de la biomasse microbienne de notre planète réside sous forme d’un biofilm. Le biofilm protège les bactéries et leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles. Les bactéries du biofilm peuvent résister à la réponse immunitaire de l’hôte et sont beaucoup plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les cellules bactériennes planctoniques (non adhérentes). Ainsi, la présence de biofilm dans les infections est particulièrement redoutée en clinique (ex : prothèse orthopédiques, sondes de ventilation mécanique, cathéters veineux…). Parmi les espèces bactériennes largement retrouvées dans les biofilms figurent les espèces du genre Staphylococcus sp.

Procédures

La mise en place de l’implant coaté ou non en position sous-cutanée chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe en intra-péritonéal (kétamine 50mg/kg + xylazine 10 mg/kg). Les flancs seront rasés puis désinfectés par un cycle Bétadiné. Une incision cutanée de 0.5cm sera réalisée stérilement et l’implant sera inséré dans la poche ainsi constituée. L’infection bactérienne sera effectuée dans un même temps en déposant 50µL de l’inoculum au contact de l’implant dans la poche sous-cutanée. Deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris concernées par la phase 1 du projet seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylzaine 10 mg/kg) avant la mise à mort par dislocation cervicale. Toutes les autres souris seront mises à mort comme précédemment cité sans prélèvement intracardiaque.

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger non connu les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire. Aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une quantification bactérienne.

Remplacement

Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées par des méthodes traditionnelles in vitro. Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement mais ne suffisent pas à déterminer l’efficacité en conditions réelles des traitements en développement. En effet, de nombreux échecs thérapeutiques ont été décrits malgré une bonne sensibilité in vitro du pathogène à la molécule d’intérêt. Ainsi, la mise en place de méthodes d’évaluation préclinique in vivo des agents anti-infectieux dans des systèmes plus complexes constitue un besoin incontestable et est devenue l’une des exigences des sociétés savantes telles que l’EMEA (European Medicines Agency).

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (5 souris pour la phase pilote et 10 souris pour la troisième partie du projet) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne sur l’implant et dans le broyat du tissu environnant par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)). Pour la première partie (étude de la toxicité, le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe).

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées par un mélange de kétamine (50 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg). L’incision cutanée réalisée ne dépassant pas 5mm, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Par ailleurs, il s’agit d’une infection très localisée et en aucun cas une infection systémique n’est anticipée. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance bi quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris Balb/cByJ de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 26-27g

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et dix réutilisées pour la formation de praticiens. Souris immunodéficientes greffées d'un carcinome à cellules de Merkel, elles reçoivent des injections intraveineuses hebdomadaires d'un anticorps-médicament à doses croissantes, avec prélèvements sanguins, pour fixer la dose à retenir avant un essai clinique. Le porteur définit des points limites au pelage "piqué", à une perte de 20% de poids ou à un volume tumoral dépassant 1 cm³. Il présente le modèle murin immunodéficient comme "indispensable" faute d'autre modèle disponible.

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de mettre en place un essai clinique de phase 1 chez l’Homme. Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).

Bénéfices attendus

Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).

Procédures

Les différentes doses préalablement définies (2, 5, 10 et 20 mg/kg) seront injectées une fois par semaine pendant cinq semaines en intra-veineuse (directement dans la veine caudale) sous un volume de 0.2 ml. Les animaux (demi-groupe) auront également un prélèvement de sang en submandibulaire à 6 et 21 jours permettant ainsi que chaque souris ne subisse qu'un seul prélèvement sanguin au cours de l'étude.

Impact sur les animaux

points limites: aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1 cm3 ou apparition d’ulcération

Devenir

Les souris utilisées pour la formation des pratricien seront réutilisés

Remplacement

L’efficacité de l’ADCTIMER a été préalablement démontrée in vitro et in vivo en modèle de xénogreffe murin. L’étude préliminaire in vivo consistait à l’évaluation de l’efficacité des 10 mg/kg suivant le schéma thérapeutique de 3 injections IV, chacune espacée de 15 jours. Cette étude a montré que la dose de 10 mg/kg induit une stabilisation de la croissance tumorale. Dans ces nouvelles études, un nouveau schéma thérapeutique d’une injection toutes les semaines pendant trois semaines (schéma thérapeutique usuellement utilisé en clinique pour un ADC) ainsi que trois nouvelles doses (une dose faible, une dose intermédiaire et une dose forte) seront évaluées. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de la dose optimale permettant à la fois une réponse anti-tumorale franche et une bonne tolérance du produit. Ces éléments, essentiels pour le développement d’un nouveau biomédicament et de son évaluation en phase I, nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immuno-déficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement sera stérilisé. La douleur et l’inconfort pouvant être subit durant ce projet par les animaux sont un maximum réduit. Afin de réduire la douleur pouvant être par l'injection du produit ou du véhicule en intraveineuse, l'utilisation d'une pomade anesthésiante sera systématiquement faite.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris NOD/SCID sont un modèle de référence dans les études de xénogreffe 7 semaines (incluant la semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance) Pour la formation , des souris Balb/c seront alors utilisées comme modèle par soucis de coût par rapport aux souris NOD/SCID mais également parce que ces souris seront plus facilement réutilisées pour des expérimentations.

240 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis pour la plupart réutilisés dans d'autres études. Un émetteur de télémétrie est implanté chirurgicalement dans le corps de chaque animal pour enregistrer, sur le chien conscient, l'effet de candidats médicaments sur le cœur, la respiration et le système nerveux, avec des prélèvements de sang. Le porteur indique que les effets sont le plus souvent réversibles et que les animaux sont réutilisés après vérification de leurs fonctions vitales, une partie pouvant être euthanasiée avec certains produits biologiques ou anticancéreux. Il affirme que ces études de pharmacologie de sécurité sont un préalable réglementaire aux premiers essais chez l'homme et qu'un non-rongeur est exigé par les recommandations ICH.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de permettre l'évaluation des effets de candidats médicaments sur les fonctions vitales de l'organisme (cardiovasculaire, respiratoire et système nerveux central) chez le chien conscient. Ces études dites de pharmacologie de sécurité, sont réalisées dans un cadre réglementaire en accord avec les recommandations ICH S7A, ICH S7B, ICH S6, ICH S9 et ICH M3 (R2). La réalisation de ces études est un préalable aux premiers essais cliniques chez l’homme. Les effets pharmacodynamiques indésirables d'une substance sur les fonctions physiologiques sont évalués en relation avec une exposition à des doses supérieures ou égales aux doses thérapeutiques. Indépendamment de la nature du candidat médicament (nouvelle entité chimique, biologique ou anticancéreux), l’évaluation des fonctions cardiovasculaire et respiratoire chez l’animal conscient nécessite l’utilisation de la télémétrie interne et/ou externe. La télémétrie interne nécessite l’implantation chirurgicale d’un émetteur de télémétrie dans le corps de l’animal. L’émetteur transmet par onde radio les signaux vitaux tels la pression artérielle, l’électrocardiogramme (ECG), la pression ventriculaire gauche, la température, les paramètres de la fonction respiratoire ou les mouvements de l’animal. La télémétrie externe nécessite d’équiper les animaux d’un gilet intégrant des outils de télémétrie externe permettant de transmettre à distance (sans fil) les signaux d’électrocardiogramme, de respiration, de température et dans certains cas de pression artérielle par le biais d’un émetteur miniature implanté dans l’artère fémorale de l’animal. La pression artérielle peut aussi être mesurée sur animal vigile avec un brassard classique ou un système plus sensible tel le système HDO (high definition oscillometry). Dans certains cas la combinaison de la télémétrie interne et externe est nécessaire pour collecter un maximum de données sur les paramètres vitaux. L’enregistrement des paramètres vitaux par le biais de la télémétrie interne et/ou externe est réalisé en continu sans induire de stress aux animaux. La fonction du système nerveux central est réalisée par le biais d’une batterie de tests fonctionnels (FOB) chez des animaux équipés ou non en télémétrie interne et/ou externe.

Bénéfices attendus

Le projet est mis en œuvre dans un cadre réglementaire. Il permet l’évaluation des effets de candidats médicaments sur les fonctions vitales de l’organisme (Cardiovasculaire, Respiratoire et Système Nerveux Central) à des doses thérapeutiques ou supérieures conformément aux recommandations ICH S7A ICH S7B, S6, S9 et M3 (R2). Il s'agit d'un préalable à l’initiation des essais cliniques. Pour cela des études de pharmacologie de sécurité sont réalisées sur l’animal conscient dans le cadre du développement préclinique de candidats médicaments conformément aux recommandations ICH S7A ICH S7B, S6, S9 et M3 (R2). La réalisation de ces études est indispensable avant d’envisager la première administration chez l’homme. Ces études permettent de réduire au maximum le risque encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration d’un candidat médicament au cours des premiers essais cliniques chez l’homme. En effet, bien avant la première administration chez l'homme, ces études peuvent renseigner sur : - les propriétés pharmacologiques d'un candidat médicament (pharmacologie primaire et/ou secondaire), - les effets pharmacodynamiques indésirables du candidat médicament, - les effets toxicologiques précoces du candidat médicament, - les doses appropriées à utiliser chez l'homme en recherche clinique. A l’issue de ces études et en focntion des résultats de ces investigations, le projet du développement du candidat médicament peut être soit réorienté soit stoppé sans jamais parvenir aux volontaires sains.

Procédures

A l'exception d'un prélèvement sanguin unique réalisé avant l'inclusion des animaux dans l'étude et dans le but d'évaluer les paramètres hémato-biochimiques, des prélèvements sanguins ayant pour but de définir la Pharmacocinétique/Pharmacodynamie (PK/PD) peuvent être considérés. Pour réduire les perturbations des signaux de télémétrie, un nombre limité de prélèvements sanguins peut être effectué. Généralement ce nombre ne dépasse pas 3 ou 4 prélèvements sur 24 heures. Dans d'autres cas, une véritable cinétique peut être réalisée avec approximativement 8 prélèvements sanguins sur 24 heures. Dans ce cas, ces prélèvements sont réalisés après la phase de télémétrie sur les mêmes animaux en respectant le même ordre de traitement ainsi que la même période de washout entre chaque traitement. Dans tous les cas, la fréquence et le volume des prélèvements sont toujours conformes aux recommandations décrites dans le document suivant: ‘A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes’ Diehl & al. JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY J. Appl. Toxicol. 21, 15–23 (2001). En télémétrie, les animaux peuvent être soumis à l'implantation chirurgicales d'émetteurs de télémétrie. En fonction du type de l'émetteur, ce dernier est placé dans la cavité abdominale, entre couche musculaire de l'abdomen ou de la cuisse ou sous la peau de l'animal. Deux électrodes sont placées sous la peau de l'animal en position DII pour l'enregistrement de l'électrocardiogramme. Si nécessaire, un cathéter est placé dans l'artère fémorale ou sous le diaphragme pour la mesure de la pression artérielle et de la fonction respiratoire, respectivement. Les animaux sont hébergés en groupe, à l’exception des périodes d’enregistrements télémétriques qui peuvent s’étalées de 6 à 26 heures. Dans certaines configurations, les enregistrements télémétriques peuvent être réalisés en groupe.

Impact sur les animaux

Les paramètres sensibles enregistrés dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (entre autres, pression artérielle et fréquence cardiaque), exigent une attention très particulière aux conditions de santé des animaux. L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter un inconfort/souffrance prolongé. Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptée. Pour réduire au minimum tout comportement induit par le stress, et afin de stimuler l’activité physique des animaux et de développer leurs capacités d’adaptation, un programme d’enrichissement (renforcement positif, jouets, musique) est systématiquement appliqué pour le chien. De plus, pendant l'enregistrement de télémétrie et compte tenu de la sensibilité des signaux de télémétrie au bruit et aux nuisances liés à l'entrée en salle de télémétrie, aucune intervention dans la salle d'enregistrement n'est permise en dehors du traitement des animaux, de la distribution de la nourriture et dans certains cas le changement de batterie des outils de télémétrie externe. Les animaux utilisés dans le cadre de pharmacologie de sécurité sont le plus souvent réutilisés. Ces animaux sont donc habitués aux conditions de déroulement de ces études. De plus, en fonction de l'étude et de la technique de télémétrie utilisée, les animaux sont hébergés pendant les enregistrements télémétriques soit en groupe d'au moins deux animaux, soit individuellement avec un contact visuel entre eux.

Devenir

Les animaux impliqués dans les études de télémétrie en pharmacologie de sécurité sont le plus souvent ré-utilisés dans plusieurs études. Ceci est d'autant plus possible que les effets pharmacodynamiques adverses sont dans la plupart des cas complétement réversibles. C'est le cas des investigations impliquants des nouvelles entités chimiques et parfois biologiques ou anti-cancéreux. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leurs lieu d'hébergement habituel et pourront être impliqués dans une autre étude après vérification préalable de la fonction cardiovasculaire (paramètres cardiovasculaires : pression artérielle, fréquence cardiaque et électrocardiogramme), de la fonction rénale et hépatique (analyses hémato-biochimiques et coagulation). Dans d'autres cas, et notamment avec certains produits biologiques ou anti-cancéreux, les animaux peuvent être euthanasiés suivant les procédures en vigueur. Il en est de même pour les animaux dont la durée de vie de l'émetteur implanté arrive à échéance.

Remplacement

L’identification et l’évaluation des propriétés pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments sur des fonctions complexes de l’organisme impliquant des interactions multiples entres ces fonctions exigent le recours à l’utilisation des animaux de laboratoire et ne peuvent faire l’objet d’études in vitro, comme les cellules isolées, les préparations multicellulaires ou organes isolés.

Réduction

Compte tenu de la sensibilité des techniques d'investigation utilisées et notemment grace à l'utilisation de la télémétrie, un nombre limité d'animaux est utilisé dans ce projet reglementaire. Ce nombre réduit d'animaux est utilisé sans que cela nuise à la fiabilité ou la qualité des résultats. Une reflexion biostatisique est réalisée en amant dans le cadre de la rédaction préalable du plan d'étude avant toute implication de l'animal. Cette reflexion biostatistique garentie à l'avance la fiabilité des données escomptées et évite toute possibilité de répétition de l'étude.

Raffinement

L'utilisation de la télémétrie a permis d'améliorer considérablement l'approche expérimentale, la fiabilité et la qualité des données. Certains paramètres enregistrés comme la fréquence cardiaque renseignent à distance du niveau de stress qui peut être ressenti par l'animal au cours de l'étude. Une attention particulière est donnée à la réduction du niveau de stress des animaux car le stress peut à lui seul avoir un effet néfaste sur le déroulement de l'étude ainsi que la qualité des résultats obtenues. D'importantes actions sont mises en œuvre pour réduire ou supprimer le stress, soulager la douleur ou la détresse et améliorer ainsi le bien-être: En amont de la phase expérimentale, - habituer les animaux aux conditions de déroulement des études avant le démarrage de l'expérimentation, - améliorer les conditions d'hébergements des animaux en utilisant un programme d'enrichissement très diversifié, - utilisation d'un fond sonore de musique, - utiliser parfois des outils de surveillance vidéo qui renseignent à distance sur le comportement des animaux, - les points limites spécifiques sont indiqués dans le plan d'étude. Pendant la phase expérimentale : - afficher une pancarte alertant du déroulement des enregistrements télémétriques afin de réduire les nuisances sonores, - une attention particulière est donnée aux images vidéo et/ou aux paramètres cardiovasculaires et notamment la fréquence cardiaque et le niveau de pression artérielle enregistrés par vidéo à l'extérieur du lieu d'hébergement des animaux. - une attention particulière est donnée aux points limites définis dans le plan d'étude après traitement, - un vétérinaire est disponible pour intervenir à tout moment en cas de problème avec un animal.

Choix des espèces

A côté des rongeurs, l’utilisation des non-rongeurs est une exigence réglementaire (ICH M3) et le choix de l’espèce non rongeur est généralement dépendant de la fonction à évaluer, de l’indication thérapeutique et de considérations métaboliques, pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Ce choix portera toujours sur l’espèce ayant la plus grande similitude en termes d’exposition/pharmacodynamie avec l’homme. Pour les études de pharmacologie de sécurité autonomes, ce choix est toujours dicté par celui appliqué au préalable dans les études de toxicologie réglementaire. De plus, le chien possède un système cardiovasculaire et respiratoire proche de l’homme. Pour l’évaluation des effets sur le système nerveux central, le chien qui est souvent utilisé. Pour les études de pharmacologie de sécurité l’âge minimal chez le chien est d'environ 6 mois. Ces animaux peuvent être utilisés dans le cadre de plusieurs études, par conséquent l’âge des animaux peut être plus important que dans les études de toxicologie réglementaire utilisant le plus souvant des jeunes adultes.