Tests réglementaires

120 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur ponctionne l'artère fémorale pour emboliser les artères du rein et du foie à travers un cathéter, avec des contrôles répétés à deux, sept et vingt-huit jours et sous anesthésie générale, pour tester de nouvelles particules d'embolisation résorbables. Le porteur signale des douleurs rénales possibles et un risque d'insuffisance rénale, qu'il dit prévenir en ne traitant qu'un seul rein. Il présente ces données précliniques comme "nécessaires" à la constitution d'un dossier réglementaire pour un dispositif à haut risque, les porcs étant tués pour prélever les organes embolisés.

Objectifs

Les microsphères d’embolisation sont des particules polymériques synthétiques sphériques et calibrées, d’une taille allant de 100 µm à 1 mm. Elles sont utilisées dans le traitement des tumeurs hypervasculaires telles que les fibromes utérins, les méningiomes ou les tumeurs hépatiques primaires ou secondaires, ainsi que dans les hémorragies. Leur action est principalement mécanique, elles agissent comme agent occlusif vasculaire soit pour couper l’apport vasculaire des tissus en aval dans le cas des tumeurs, soit pour arrêter le saignement dans le cas de l’embolisation d’hémostase. La prochaine génération de microsphères sera dégradable. Le caractère temporaire du produit permettra d’assurer l’élimination et la bonne tolérance de l’implant, de récupérer une perméation des vaisseaux après un certain temps pour éventuellement répéter le traitement, voire de libérer localement des principes actifs chargés dans les microsphères de façon contrôlée en jouant chimiquement sur le temps de dégradation des particules. L’objectif du projet est d’évaluer les effets locaux de nouveaux agents d’embolisation, plus précisément les performances occlusives et la tolérance de ces produits à court et moyen terme. Plusieurs études seront réalisées comparant différentes particules d’embolisation pour leur composition chimique, leur taille, leur caractère dégradables ou non, etc. Ces études sont de 2 types : des études de performances pour vérifier que le produit occlut (les bons vaisseaux, pendant combien de temps…) et des études de tolérance pour vérifier essentiellement la biocompatibilité locale. Le nombre d’études, de groupes par étude ou encore leur ordre n’est pas fixé à l’avance et dépendra des données accumulées par le fabricant des produits ainsi que de ses besoins. A titre d’exemple, l’annexe 1 détaille les études prévues pour un premier projet sur une microsphère calibrée résorbable à court terme. Les produits seront administrés par cathétérisme des artères rénales et hépatiques chez des porcs. Les animaux seront soit mis à mort à la fin de la procédure soit réveillés et suivis pendant 1 mois selon que l’on évalue les performances en aigu ou en chronique des particules.

Bénéfices attendus

Les agents d’embolisation particulaires appartiennent aux dispositifs médicaux de classe III, la classe présentant le risque le plus élevé. Des données précliniques sont donc nécessaires pour la constitution du dossier règlementaire.

Procédures

Les animaux vont subir une ponction percutanée de l'artère fémorale qui permettra l'accès vasculaire et l'embolisation des artères rénales et hépatique à travers un cathéter. Des contrôles angiographiques seront faits ultérieurement après l’embolisation (J2, J7 et J28) par une ponction percutanée de l'artère fémorale pour vérifier, à l'aide d'un produit de contraste, la perméabilité des vaisseaux. Des prélèvements de sang seront effectués par la ponction de la veine jugulaire. Toutes les procédures sont effectuées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les complications per-opératoires sont rares. Elles consistent essentiellement en un spasme artériel qui peut généralement être levé en retirant le cathéter et en attendant quelques minutes. Les complications post-opératoires potentielles consistent en des douleurs rénales. On cherche à prévenir les douleurs par des traitements analgésiques pré et post-opératoires systématiques. On cherche à prévenir l’insuffisance rénale en ne traitant qu’un seul rein, les insuffisances ne survenant habituellement que lorsque >75% du parenchyme rénal est lésé. Ces complications ne sont néanmoins jamais survenues dans l’expérience de l’équipe.

Devenir

Les animaux seront mis a mort pour prelever les organes embolisés (foie et rein) et pour évaluer par examen nécropsiques des eventulles lésions sur les organes à distance. Les paramètres histologiques évalués sur les prélèvements nécropsiques concernent la réaction tissulaire autours des particules.

Remplacement

Un certain nombre de conditions du vivant ne peuvent être modélisées dans des systèmes in vitro : contact avec le sang, déformation des vaisseaux, réaction tissulaire et dégradation des produits, ré-ouverture des vaisseaux, ce qui implique le recours à l’animal vivant.

Réduction

Les normes qui décrivent les tests d’implantation pour les dispositifs médicaux (10993:6) préconisent un minimum de 10 échantillons par type d’implant issus de 3 animaux différents pour prendre en compte la variabilité interindividuelle. On prévoit 4 animaux par type de particules testé au cas où l’un des animaux devrait être exclus de façon précoce. Les évaluations (angiographiques et histologiques) seront répétées dans différents territoires pour chacun des animaux pour diminuer le nombre total d’animaux utilisés

Raffinement

La procédure d’embolisation est réalisée sous anesthésie générale. Des analgésiques et des antibiotiques seront administrés systématiquement au moment des procédures et occasionnellement pendant la période de suivi de 28 jours si l’état de l’animal l’impose. Un protocole de suivi des animaux avec observation quotidienne et des analyses sanguines sont utilisés pour évaluer et réduire au maximum la douleur animale. Les animaux sont logés en cases individuelles avec des cloisons ajourées pour qu’ils puissent se voir et l’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide d’une quantité de paille suffisante pour qu’ils puissent jouer avec.

Choix des espèces

L’utilisation d’un animal de grande taille est imposée par le calibre des particules injectées (>1mm). Le modèle porcin présente des similitudes vasculaires avec l’homme (anatomie générale, calibres des vaisseaux, flux sanguins), permettant de réaliser une embolisation artérielle selon la même procédure et avec le même matériel que chez l’homme. Le modèle d’embolisation de l’artère rénale sur des grands animaux a été largement utilisé pour évaluer la distribution, la durée d’occlusion et reperfusion de différents types d’agents d’embolisation (coils, solutions gélifiantes, particules) . Le modèle d’embolisation de l’artère hépatique a été décrit essentiellement chez le porc avec les mêmes objectifs et permet également d’évaluer la tolérance locale du matériau. En effet, l’irrigation du parenchyme se fait principalement par la veine porte. L’occlusion de la seule artère hépatique par un agent occlusif n’entraîne pas de dommages ischémiques, ce qui permet d’évaluer les modifications tissulaires associées au seul implant. Porc Large White de plus de 25 kg ayant atteint une taille permettant réaliser les procédures de cathétérisme et embolisation avec le même matériel que chez l’homme. Le poids doit être inférieur à 50kg pour des raisons de contraintes d’hébergement.

17 955 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'effectif de loin le plus élevé du lot. Ils reçoivent des injections dans la peau et des applications cutanées répétées de dispositifs médicaux, dont des applications sur le pénis, pour tester leur pouvoir irritant et sensibilisant avant mise sur le marché. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des rougeurs allant jusqu'à la nécrose de la peau, des escarres et une destruction de l'épiderme et du derme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est reconnu pour ces dispositifs et que ces essais sont imposés par la réglementation européenne.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela il existe des tests règlementaires de toxicité qui peuvent évaluer les potentiels risques de réactions allergiques et/ou d’irritation cutanée de ces DM. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer les risques biologiques potentiels de l’utilisation des DM sur la santé humaine. Ceci dans un but de commercialisation des DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

- SMKiso : sur 15 (ou 30 dans le cas d’extraits) animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection IP pour la mise à mort - SMBiso : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort. - MP : au moins 4 applications locales sur le pénis sur au moins 6 animaux, pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Un phénomène de sensibilisation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMKiso : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMBiso : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. Un phénomène d’irritation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. -test MP : peuvent apparaître des érythèmes, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.

Devenir

- SMKiso et SMBiso : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente utlérieurement. Ils sont donc euthanasiés en fin d’essai. - MP : les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour prélèvement des pénis et analyse histologique.

Remplacement

Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances ; on doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. Les tests in vitro permettant d’évaluer la sensibilisation du produit à tester ne sont pas reconnus pour les DM. Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥12.5 ne doit pas être testé et doit être étiqueté comme irritant potentiel. Par ailleurs les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent petre obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation pénienne. L’évaluation du potentiel sensibilisant et irritant des DM est imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché et les industriels ne peuvent se passer de réaliser ces tests.

Réduction

Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai. Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études dans la mesure du possible (3 DM maximum par lot commun pour les SMKiso et SMBiso et autant de DM que nécessaire par lot commun pour les MP).

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le cobaye, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée et d’irritation des tissus péniens. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.

Bénéfices attendus

Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".

Procédures

Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.

Réduction

Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.

Raffinement

Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.

Choix des espèces

Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.