Procédures légères
Effet d’un apport en oligosaccharides du lait sur le développement du système immunitaire et du microbiote intestinal des porcelets
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tués à la fois pour analyser leur intestin et parce qu'ils auront consommé un ingrédient interdit en alimentation porcine, 48 porcelets sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent chaque jour pendant treize jours cinq millilitres d'eau enrichie en oligosaccharides, maintenus immobiles jusqu'à cinq minutes, puis subissent une prise de sang à dix-neuf jours, couchés sur le dos. Quatre truies reçoivent une injection d'hormone pour un prélèvement de lait, leurs porcelets étant séparés d'elles quarante minutes avant, et huit porcelets supplémentaires servent à l'entraînement des manipulateurs avant de rester dans l'établissement avec les truies. Le porcelet est retenu comme espèce cible parce que ses troubles digestifs d'élevage sont traités aux antibiotiques, l'objectif final étant de concevoir pour la filière un aliment premier âge enrichi.
Objectifs
Les oligosaccharides du lait sont des composés spécifiques du lait, formés de quelques molécules de sucres simples et présentant une grande diversité de structure. Ils ne sont pas digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par leurs bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils peuvent avoir des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Certaines préparations infantiles sont désormais enrichies en oligosaccharides du lait. Chez les animaux d’élevage, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs, dont les diarrhées, qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de réduire l’usage des médicaments en élevage et d’améliorer le bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise à valider les effets de deux oligosaccharides du lait sur le microbiote intestinal, le système immunitaire intestinal et la santé de ces porcelets. Les porcelets seront allaités normalement par leur mère et recevront la supplémentation par voie orale de 8 à 20 jours d’âge. Les deux oligosaccharides sont choisis sur la base de la littérature scientifique et d’études préalablement menées in vitro.
Bénéfices attendus
Le principal résultat attendu est de valider l'effet bénéfique de deux oligosaccharides du lait sur les porcelets. Nous montrerons in vivo la capacité d'une supplémentation en oligosaccharide à modifier le microbiote et les cellules immunitaires intestinales des porcelets. En outre, nous attendons des effets différents des deux oligosaccharides car ceux-ci diffèrent en structure. Nous montrerions alors pour la première fois l’importance de la structure des oligosaccharides du lait dans le développement de la communauté bactérienne intestinale des porcelets. Pour la filière porcine, nos résultats pourraient conduire à la conception d'un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets notamment au sevrage, une phase critique en élevage.
Procédures
Quarante-huit porcelets recevront 5 ml d’eau enrichie ou non en oligosaccharide par voie orale, quotidiennement pendant 13 jours, et subiront une prise de sang à 19 jours. Huit autres porcelets recevront 5 ml d’eau une fois par jour pendant 3 jours. L’administration de liquide dure 5 minutes au maximum. La prise de sang correspond à 5 minutes de contention maximum dont 2 minutes maximum pour le prélèvement. Quatre truies seront soumises à un prélèvement de lait à 7 et 19 jours de lactation, avec une injection d’hormone (1 fois, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances des 48 porcelets sont liées au traitement quotidien et aux prélèvements. L’administration dans la gueule de 5 ml de liquide n’entraîne pas de douleur mais entraîne un stress lié à la nécessité d’immobiliser les porcelets pendant 5 minutes au maximum. La prise de sang nécessite d’immobiliser les porcelets sur le dos pendant 5 minutes au maximum et elle engendre la douleur d’une piqure. Les 8 autres porcelets subiront le stress de la contention lors de l’administration d’eau. Le prélèvement de lait à la truie nécessite de séparer les porcelets de la truie pendant 40 minutes avant le prélèvement. Il nécessite aussi une injection d’hormone pour induire l’éjection du lait, ce qui engendre la douleur de la piqure à la truie.
Devenir
48 porcelets seront mis à mort afin d'étudier les effets des traitements sur la flore et le système immunitaire de leur intestin et parce qu'ils auront consommé un ingrédient non autorisé en alimentation porcine. 8 autres porcelets n’ayant pas reçu d’oligosaccharides et les 4 truies, tous soumis à une procédure de sévérité légère, poursuivront leur carrière dans l'établissement utilisateur.
Remplacement
En préalable à ce projet, des études in vitro ont été menées pour comparer les effets de plusieurs oligosaccharides du lait sur des bactéries intestinales porcines. Elles nous ont permis de sélectionner deux oligosaccharides efficaces pour stimuler la croissance et l’activité métabolique de certaines bactéries in vitro. Le projet a pour objectif de valider in vivo l’effet bénéfique de ces deux oligosaccharides sur la flore intestinale des porcelets et d’étudier les conséquences sur leur système immunitaire intestinal et leur santé. L’enjeu finalisé est le développement d’un aliment pour porcelet allaité. Ces objectifs nécessitent d’utiliser des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus est de 60. Huit porcelets seront nécessaires pour que les intervenants s’entraînent à la supplémentation orale, à raison de 4 porcelets par binôme d’intervenants répétés sur 3 jours. Les 52 autres animaux sont 4 truies et 48 porcelets. Le nombre de 48 porcelets (16 par lot expérimental) tient compte des pertes potentielles pendant la lactation en élevage (porcelet écrasé par sa mère ou malade). Il garantit d’avoir au final 12 porcelets par lot, nombre suffisant et nécessaire pour identifier des effets. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les modèles statistiques prévus permettront de mettre en évidence des effets significatifs entre les différents traitements s'il y en a, sur les paramètres étudiés au niveau intestinal et sanguin. Dans l’établissement utilisateur, chaque truie met bas en moyenne 16 porcelets nés vivants et en allaite au moins 12 ; 4 truies permettent donc d’étudier 48 porcelets.
Raffinement
Les procédures seront réalisées en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée de contention des porcelets sera limitée à 5 minutes pour l’administration orale des traitements et la prise de sang. La prise de sang sera stoppée au bout de 2 minutes. Les porcelets seront particulièrement surveillés après cette prise de sang. Lors de la séparation des porcelets de la truie avant le prélèvement de lait, les porcelets seront placés dans une caisse laissée à proximité de leur mère afin de réduire le stress des porcelets et des mères. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible du fait des problèmes digestifs fréquemment rencontrés par les porcelets en élevage. Ces problèmes sont traités par des médicaments et peuvent entraîner la mort dans les cas les plus sévères. Une supplémentation en oligosaccharide du lait des aliments premier âge pour porcelets allaités pourrait être une solution préventive à ces problèmes. Le stade choisi pour les porcelets, entre 7 et 20 jours d’âge environ, est la période où commence à s’établir leur microbiote et leur système immunitaire intestinal. C’est donc la période adéquate pour essayer d’augmenter la santé intestinale afin de préparer les porcelets au sevrage qui a lieu entre 3 et 5 semaines en élevage conventionnel. Le stade choisi pour les truies, de 7 à 20 jours de lactation, correspond à la période d’allaitement des porcelets expérimentaux.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles solutions thérapeutiques sur des modèles de lupus chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Prélevées jusqu'à dix fois à la veine de la queue, une fois par œil en rétro-orbitaire, et traitées jusqu'à deux fois par jour pendant un mois par voie orale, 3 000 souris sont utilisées dans des essais de médicaments contre le lupus. 600 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le lupus provoque chez elles une insuffisance rénale progressive et fatale, avec perte de poids, activité réduite, lésions cutanées douloureuses, polyarthrite et inflammation des glandes salivaires, sur trois à quatre mois. Le porteur annonce une grille de cotation quotidienne fondée sur la perte de poids, l'aspect général et le comportement, pour tuer les souris avant que les signes cliniques ne deviennent trop sévères, sans indiquer les seuils retenus.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans des modèles de lupus chez la souris. Le lupus systémique (LS) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par la production d’autoanticorps dirigés contre les propres organes du patient. La maladie affecte de nombreux organes comme la peau, les articulations, le cœur, les reins et les systèmes nerveux et hématologiques. La prévalence au niveau mondiale est de 44 pour 100000, 9 sur 10 étant des femmes. Le traitement du lupus adaptée au risque évolutif individuel et à l’activité de la maladie et fait l’objet d’ajustements en cas d’inflammation persistante. En général ces traitements ciblés contrôlent bien la progression de la maladie chez la majorité des patients. Mais ils peuvent induire des effets secondaires assez problématiques à gérer, parfois toxiques. Il y a environ un tiers de patients pour qui ces traitements sont largement inefficaces ou ont perdu en efficacité ou bien ont conduit à des complications sérieuses comme des infections fongiques. Le LS est une maladie extrêmement hétérogène dans ses manifestations et mécanismes sous-jacents. La recherche pharmaceutique est donc orientée vers le développement de traitements mieux tolérés ou ciblant spécifiquement les catégories de patients sans solution thérapeutique avec pour objectif une rémission durable.
Bénéfices attendus
Les études de ce projet permettront d’évaluer le potentiel thérapeutique de médicament expérimentaux dans le lupus systémique. A court terme elles permettront de faire évoluer le projet de recherche : Un effet thérapeutique en deçà des objectifs conduirait soit à conduire une campagne d’optimisation du principe actif, soit à un arrêt définitif du projet de recherche. Un effet thérapeutique en ligne avec les attentes permettrait d’initier les phases de développement suivantes, c’est-à-dire les études pharmacocinétiques et toxicologiques réglementaires. A plus long terme, ces études permettront d’aider à déterminer les doses qui seront administrées chez les patients et enfin à procurer un traitement efficace et mieux toléré aux personnes souffrant du lupus.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. -Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu'à 1 fois pour jour de 1 à 3 mois. -Mesure de la température corporelle : Durée 15 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale per injection ou gaweusse, via une sonde rectale pour rongeur, pourrait être effectuée pour confirmer une hypothermie. 3 fois par animal. -Prélèvement de sang par voie retro-orbitale au cours de la procédure : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par oeil et par animal. -Prélèvement de sang via la veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Jusqu'à 10 fois par animal. -Prélèvement de sang terminaux par ponction cardiaque : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par animal. Les volumes et lq fréquence des prélèvements seront selon les criètres de la consigne SBEQ en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl. Le volume total prélevé n'exèdera pas 7,5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place, pouvant aller jusqu'à 1 semaine. Administrations des composés à potentiel thérapeutiques. Plusieurs choix possibles : -Par voie orale : Durée 10 secondes sur animal vigile, jusqu'à 2 fois par jour pendant 1 mois. -Par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes sur animal vigile 1 fois par semaine pendant 3 mois. -Par voie sous-cutanée : Durée 10 secondes sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 3 mois en alternant les sites d'injections. -Par voie intraveineuse retro-orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par oeil et par animal, par étude. -Par voie intraveineuse par la veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 2 fois par mois pendant 3 mois. -Par voie in
Impact sur les animaux
Le lupus induit chez la souris une dégradation rapide de son état de santé. Cette dégradation est due principalement au développement d’une insuffisance rénale progressive, à terme fatale pour les animaux.Les souris seront sujettes à une perte de poids progressive, à un état de fatigue se traduisant par une activité réduite, à des douleurs liées aux lésions cutanées, au développement d’une polyarthrite rhumatoïde, à une inflammation des glandes salivaires et des vaisseaux sanguins. L’intensité de ces effets se développera de manière progressive sur une durée maximale de 3 4 mois. Dans le cadre des études de ce projet les souris seront mises à mort avant que les signes cliniques ne deviennent trop sévères. Une grille d’évaluation du lupus et de l’état général des souris sera utilisée pour le suivit des souris au quotidien. Les critères principaux comprendront la perte de poids, l’aspect général, le comportement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts qui feront l'objet d'analyses comme le dosage de biomarqueurs et les concentrations des composés à potentiel thérapeutiques.
Remplacement
Une revue de la littérature montre qu’il n’existe pas à ce jour de systèmes in silico ou in vitro qui permettraient de modéliser l’extrême complexité de la physiopathologie du lupus et d’étudier l’effet de nouveaux traitements. Les systèmes in vitro les plus sophistiqués du moment sont des cultures d’organoïdes qui représentent des versions simplifiées d’organes. Or l’écosystème dont la pharmacodynamie, la pharmacocinétique et le lupus dépendent, intègre de nombreux tissus et organes (vaisseaux, reins, foie, système immunitaire, sang etc.). A ce jour, seule l’utilisation d’un animal peut permettre d’étudier les interactions complexes entre les traitements expérimentaux et ces différents systèmes biologiques. Cependant, les études de ce projet s’appuieront très largement sur les résultats d’études réalisées sur des cellules en culture et autres systèmes in vitro (biochimiques, physiques). Ces phases d’évaluation in vitro évitent d’utiliser l’animal directement et donc réduisent son usage. L’utilisation d’animaux dans ce projet permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements ce qui est une étape indispensable avant l’évaluation sur des volontaires sains, puis sur des patients.
Réduction
Les composés seront préalablement évalués sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire certaines caractéristiques médicamenteuses des composés). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés seront donc éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles animaux de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des analyses de détermination de la taille des groupes expérimentaux. L’effet des composés expérimentaux sera évalué à l’aide de tests statistiques et la procédure d’analyse sera validé par des statisticiens comme il est d’usage dans la recherche pharmaceutique.
Raffinement
Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire et donc sur la sévérité du lupus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. La gravité du lupus sera évaluée grâce à un système de cotation pour permettre d’anticiper les dommages irréversibles de la maladie et mettre à mort les individus impactés et ainsi prévenir des souffrances inutiles.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique a été décrite chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles de lupus chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (exemple : effets de molècules de réfèrences). Adulte : Les données de la littérature indiquent que le lupus peut être induit chez la souris adulte et se manifeste chez des souris mutantes ou transgéniques de 5 à 24 semaines d'âge.
Prélèvements de sang sur poules à statut sanitaire spécifique pour fourniture d’échantillons sanguins
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Prélevées sur le troupeau reproducteur d'un élevage exempt d'organismes pathogènes spécifiques, 1 250 poules subissent chacune une prise de sang unique, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement se fait sur animal vigile, au sinus occipital ou à la veine de l'aile, en cinq minutes au plus, avec un risque d'hématome, d'hémorragie ou de picage. Le sang part vers des laboratoires qui en isolent des globules rouges pour titrer des virus, des cellules immunitaires pour des tests in vitro, ou en tirent du sérum pour faire pousser des bactéries. Le porteur souligne que ces poules ne sont pas élevées uniquement pour fournir du sang et qu'elles retournent toutes au troupeau après le prélèvement.
Objectifs
Dans le cadre de leurs recherches, les scientifiques ont régulièrement besoin de sang de poulet exempt d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS) pour entre autres : isoler des cellules immunitaires comme les leucocytes pour des tests in vitro, iIsoler des globules rouges et réaliser des tests d’hémagglutination pour le titrage de virus ou encore produire du sérum pour réaliser des études de croissance bactérienne. Un maximum de 250 prélèvements sont réalisés par an. Chaque série de prélèvements concerne au maximum 20 individus. Chaque animal n'est concerné que par un prélèvement sanguin sans répétition.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de fournir des échantillons de sang de volailles EOPS nécessaires aux études portant sur la réponse immunitaire (isolement de cellules immunitaires), aux études de certains virus (titration des virus grâce des tests d’hémagglutination) et la production de sérum.
Procédures
Prélèvement de sang sur animaux vigiles. Chaque animal ne sera sujet qu'à un prélèvement de sang sans répétition. La durée du prélèvement n'excède pas 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une réaction suite au prélèvement de sang : hématome, hémorragie, réaction inflammatoire locale, voire un phénomène d’autopicage (si la prise de sang est réalisée à la veine alaire).
Devenir
Les animaux prélevés faisant partie du troupeau reproducteur, tous les animaux sont maintenus dans l’élevage après prélèvement.
Remplacement
L’objet de la demande est la fourniture de sang de volaille à statut EOPS (Exempts d'organismes pathogènes spécifiques) comme échantillon biologique, le recours à l’animal est donc nécessaire.
Réduction
Les prélèvements sont réalisés sur des animaux du troupeau reproducteur de l’élevage EOPS : il s’agit donc d’animaux destinés au renouvellement de l'élevage et à la fourniture d’animaux expérimentaux. De ce fait, les animaux ne sont pas produits et utilisés exclusivement pour la fourniture de sang. De plus, le nombre d’animaux prélevés est adapté au plus juste en fonction du nombre de prélèvements et volume de sang requis.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe et bénéficient d'un enrichissement physique : perchoir, nid et bolduc suspendu dans chaque cage. 5 nids sont à disposition des poules pour la ponte. A l’issue de chaque prélèvement, une attention particulière est portée au comportement des animaux afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Un renforcement positif par récompense alimentaire est envisagé (petits vers secs par exemple). Il n’y a pas de désinfection de la zone de prélèvement (pour éviter toutes projections ou contacts avec les yeux). Il n’y a pas de point de compression au sinus occipital (un léger point de compression est réalisé lorsque le sang est prélevé à la veine allaire). Les aiguilles ont une garde et sont donc adaptées pour un prélèvement au sinus occipital. Les prises de sang seront réalisées par 2 opérateurs auxquels les animaux sont habitués : l’un maintient l’animal par une légère contention et l’autre procède au prélèvement de sang. Qu’une prise de sang ne dure pas plus de 5 minutes et qu’elle est réalisée dans le calme.
Choix des espèces
Les besoins de sang concernent des tests in vitro ou des mises au point de méthode pour des recherches portant sur le modèle volaille. Animaux de production adultes : Les prélèvements sont réalisés sur des animaux adultes afin de pouvoir fournir le volume requis par les scientifiques. C'est également moins préjudiciable pour les animaux car le prélèvement est plus facile (animal de plus grande taille).
Prélèvement de tissu pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour la caractérisation du rôle des phospholipases A2 sécrétées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Deux millimètres de queue coupés en dix secondes sur des souriceaux vigiles, sans anesthésie : 300 souris subissent ce prélèvement dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Celles dont le génotype ne correspond pas à celui recherché sont tuées, les autres partant vers un projet autorisé ou vers le maintien de la lignée, quand elles ne sont pas tuées elles aussi. Le porteur écrit que les méthodes non invasives testées n'ont pas donné de résultats exploitables et qualifie ce projet de "nécessaire". Aucune connaissance n'est produite ici, le prélèvement sert à trier un élevage et à fournir aux laboratoires des lots d'animaux homogènes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale. Dans le cadre de certains projets scientifiques, des lignées d’animaux sont développées et élevées. Pour maintenir ces lignées et fournir des animaux adaptés à ces projets, il est donc important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer des lots expérimentaux homogènes et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasives. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée par notre équipe pour caractériser les souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une sélection des animaux d’intérêt et ainsi une optimisation de la gestion et de l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour les projets scientifiques autorisés.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la douleur lors du prélèvement du tissu.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas donné de résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation dans les projets scientifiques autorisés.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans des projets scientifiques autorisés ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - Seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement entre individus de même génotype).
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui permet de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de poser de nombreuses questions scientifiques en biologie fondamentale, environnementale, santé humaine et animale avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces, dont l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 10 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité distale de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Etude des interactions hôte-microbiote lors d’un challenge nutritionnel chez la souris juvénile
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour un prélèvement d'organes, 466 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Élevées avec une flore intestinale définie ou dépourvues de tout micro-organisme, elles reçoivent pendant cinq semaines un régime appauvri en protéines et en graisses, censé reproduire la sous-nutrition infantile et permettre de suivre l'évolution des bactéries de leur intestin. Le porteur affirme que ce régime n'induit ni sensation de faim ni phénotype délétère et que le projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées. Les effectifs annoncés se recoupent sans être rapportés au total, 180 souris gavées deux fois, 250 saignées juste avant la mise à mort, 160 mesurées sous anesthésie, 90 contenues pour mesurer leur composition corporelle et 36 isolées en cage métabolique.
Objectifs
La période de croissance juvénile, s'étendant de la naissance à la maturation sexuelle, représente une phase cruciale dans la vie des animaux, marquée par des interactions complexes entre l'hôte, sa nutrition et les bactéries de sa flore intestinale (microbiote). La sous-nutrition infantile reste un défi majeur à l'échelle mondiale, et celle-ci conduit à des altérations significatives de la flore intestinale des individus malnutris. Par ailleurs, des travaux de recherche ont démontré qu'une intervention probiotique, consistant en l'administration de micro-organismes vivants en quantités adéquates, peut partiellement atténuer les phénotypes néfastes associés à la sous-nutrition chez un modèle préclinique de rongeur. Notre objectif est d'utiliser divers modèles de souris présentant une flore intestinale définie, composée de bactéries rigoureusement caractérisées, afin d'explorer les interactions entre l'hôte, son microbiote, et les relations au sein de cette dernière au cours de la croissance juvénile dans un contexte de dénutrition. Pour ce faire, nous envisageons d'implanter différentes populations bactériennes dans des souris « stériles », dépourvues de tout micro-organismes et de comparer la dynamique de croissance de ces animaux nourris avec un régime appauvri en protéines et en graisses par rapport à des animaux ayant un régime normal. Dans un second temps, nous souhaitons caractériser l'évolution génétique de ces souches au cours d'un tel challenge nutritionnel. Ces expérimentations visent à approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents permettant à la flore intestinale et à la nutrition d'influer conjointement sur la croissance juvénile des animaux.
Bénéfices attendus
Chez l'homme, 155 millions d'enfants sont aujourd'hui victimes de malnutrition dans le monde et la sous-nutrition chronique au stade juvénile entraîne un retard de croissance sévère et des séquelles physiologiques à long terme qui ne peuvent être corrigées par les stratégies classiques de renutrition. Des études récentes, ont établi que des composants de la flore intestinale peuvent modifier la trajectoire de croissance des animaux. Cependant, malgré les progrès récents dans l'étude des relations complexes entre la nutrition, la croissance et les microbes intestinaux, les mécanismes moléculaires à l'origine de ces bénéfices médiés par la flore bactérienne sur un hôte mammifère restent mal compris. Ici, en utilisant de nouveaux modèles de souris à flore définie, nous nous proposons d’étudier comment les constituants et les activités de la flore intestinale, associés à la nutrition, influencent la croissance juvénile. Au-delà de l'impératif d'améliorer la nutrition mondiale pour prévenir la dénutrition, concevoir des stratégies d'intervention pour remédier à ceux qui souffrent déjà de dénutrition est également un impératif urgent. Ce projet s'attaque à ce problème important et nous pensons que notre travail contribuera à l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'interaction hôte-microbes en relation avec la dénutrition.
Procédures
Dans le cadre de ce projet : - 180 souris seront gavées à l’aide d’une sonde 2 fois à 48h d’intervalle. Ce geste prend une trentaine de seconde. - 268 souris seront soumise à un régime nutritionnel faible en protéines et en graisses pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime normal), ni de phénotype délétère.- Sous anesthésie générale, 160 souris auront leur taille mesurée en début et en fin de procédure sous anesthésie générale ce qui prend moins de 2 minutes et subiront deux prélevement sanguin à 15 jours d’intervalle. Ce prélevement prend de l'ordre d'une minute - 250 souris subiront un prélèvement de sang juste avant la mise à mort. - 304 souris seront pesées chaque semaine pendant 5 semaines au maximum ce qui prend environ une minute - 90 souris subiront une contention de 2 minutes maximum afin de mesurer leur composition corporelle - 36 souris seront placées seules dans une cage adaptée pour mesurer leurs dépenses énergétiques.
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux : Le gavages des animaux ne devrait entrainer qu'un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. La mesure de la taille des animaux à P21 et P56 et les prélèvements sanguinss n'induiront qu'un léger stress lors de l'induction de l'anesthesie. Les pesées induiront un leger stress associé à la contention de l'animal afin de déterminer son identification. La contention pour analyse de la masse corporelle des animaux induira également un stress modéré : le temps de contention associé à la mesure est au maximum de 2 minutes Le stress associé à l'isolement des animaux en cages métaboliques restera modéré et limité au strict necessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes après mise à mort.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de sa flore à l'ingestion de divers régimes alimentaires ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans un contexte de malnutrition. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure, après mise à mort, l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Dans la mesure du possible, les anciens reproducteurs seront utilisés dans le cadre d’autres projets ou mis à mort pour collecter des organes.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, la croissance en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés en début de procédure afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse suivi d’un point de compression jusqu’à l’hémostase complète. Tout au long des expériences, à l’exception des mesures de dépense énergétique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le challenge nutritionnel réalisé a déjà été pratiqué au laboratoire et ne devrait pas apporter de souffrance animale. La contention lors la mesure de la composition corporelle est limitée au strict minimum. L'analyse du métabolisme se fera dans une cage comportant des enrichissements (morceau de bois, tube en plastique) n'interférant pas avec l'analyse.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Pour l’élevage, les animaux doivent être matures sexuellement c’est pourquoi l’inoculation de la flore intestinale des animaux se fait à 8 semaines de manière à pouvoir accoupler les animaux vers 10 semaines. Pour les expériences les animaux utilisés seront suivis tout au long du challenge nutritionnel du sevrage à l'âge de 21 jours jusqu'à l'âge de 56 jours. L'objectif du projet est d'étudier les interactions entre l’hôte et son microbiote pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé de la croissance de l’animal.
Etude de l’efficacité de traitements innovants pour traiter le syndrome hématologique radio-induit chez le primate non humain (PNH)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester une molécule censée limiter les dommages de la moelle osseuse après une irradiation de guerre ou d'accident nucléaire, 67 macaques à longue queue sont utilisés, dont 59 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, trente jours d'administration quotidienne, jusqu'à seize ponctions de sang veineux et six ponctions de moelle osseuse en trois mois, chacune sous anesthésie. Le porteur indique qu'environ la moitié des animaux témoins, ceux qui ne reçoivent pas le traitement, devraient atteindre un point limite après des pétéchies, une anémie, des saignements digestifs et une anorexie. Les 59 macaques irradiés seront tués pour constituer une tissuthèque, les 8 autres, qui n'auront reçu que la molécule, pouvant être réutilisés dans d'autres protocoles après avis vétérinaire.
Objectifs
Dans un contexte de guerre nucléaire ou d’accident nucléaire majeur, l’exposition à une forte dose de rayonnement ionisant conduit notamment à des dommages de la moelle osseuse, qui produit les cellules sanguines. Ces atteintes sont parmi les premières causes de mortalité des victimes civiles comme militaires. En dépit des avancées des dernières décennies, le besoin d’une molécule capable de réduire ces effets et de mise en œuvre facilitée dans le contexte d’un afflux de nombreuses victimes demeure. Le but du présent projet est d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule pour 1) réduire la gravité des dommages de la moëlle osseuse et 2) accroitre le taux de survie des victimes. Cette évaluation sera réalisée chez le primate non humain (PNH). En effet, le présent projet est mené en parallèle du développement clinique de cette molécule et il apportera les données d’efficacité qu’il n’est pas possible d’obtenir chez l’humain. Les résultats obtenus seront inclus dans le dossier d’enregistrement. Une étude de pharmacologique préliminaire a déjà été réalisée chez le PNH et ses résultats seront utilisés dans raffiner notre étude. Conformément aux recommandations européennes, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique sera réalisée chez des modèles animaux mâles et femelles. Des molécules dérivées de la nouvelle molécule pourront éventuellement être testées en complément, dans le cadre d’études pilotes. Cette étude comportera 2 phases : • une phase d’efficacité pilote, réalisée étape par étape, sur de petits nombres d’animaux, • si la la phase pilote est concluante, une étude d’efficacité incluant suffisamment d’animaux pour permettre une analyse statistique robuste.
Bénéfices attendus
Valider un nouveau traitement des lésions de la moelle osseuse après une exposition à des radiations, en particulier dans les situations d'urgence où il y a un grand nombre de victimes. L'objectif est de trouver une méthode efficace pour traiter ces lésions le plus rapidement possible et améliorer les chances de guérison des personnes touchées.
Procédures
Irradiation corporelle totale unique sous anesthésie générale Administration quotidienne pendant 30 jours de traitements médicamenteux (médicamenteux (voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse ; durée de chaque traitement : 10 minutes maximum). Une éventuelle implantation d’une chambre d’administration du traitement sous anesthésie générale. Durée de l’intervention 30 minutes. Suites possibles : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 joursPonctions de sang veineux (16 ponctions maximum sur une durée de 3 mois) et de moelle osseuse (6 maximum sur une durée de 3 mois) sous anesthésie générale durant 30 à 45 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Après l’irradiation, les animaux qui ne peuvent reconstituer leur hématopoïèse sont victimes de petits saignements visibles sur la peau sous la forme de pétéchies, conséquence du manque de plaquettes. La perte de sang correspondante provoque une anémie et une fatigue jusqu’à des difficultés de respiration, entre 10 et 20 jours après irradiation. Des troubles gastro-intestinaux tels que nausées, vomissements, diarrhées et saignements digestifs peuvent se produire. Une anorexie résultant en une faible perte de poids est possible, entre 10 et 40 jours après irradiation. Une atteinte des points limite est attendue chez environ la moitié des animaux témoins. L’administration des molécules peut causer un stress.. L’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration du traitement peut induire une réaction locale au site d’incision -gonflement, suintement de la plaie), rarement : une hémorragie et/ou une infection. Les anesthésies peuvent induire une légère perte d’appétit dans les premières heures qui suivent, pouvant causer une déshydratation chez les animaux qui sera surveillée et compensée au besoin.
Devenir
Animaux irradiés : mise à mort pour analyse anatomopathogique et constitution d’une tissuthèque Animaux non irradiés : les animaux ayant reçu uniquement le traitement pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour réaliser ce projet. L’évaluation de l’efficacité d’une molécule pharmacologique capable de réduire la durée et la profondeur l’atteinte de la moelle osseuse radio-induite sévère chez l’humain nécessite une étude de la réponse intégrée à l’échelle de l’organisme entier. D’autant plus qu’en cas d’irradiation corporelle totale où d’autres tissus que le tissu hématopoïétique, notamment le système digestif, sont impliqués. Il est donc nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant les caractéristiques physiologiques et immunologiques les plus proches de l’humain que possible. Le modèle expérimental primate non humain (macaque) répond à ces requis entrant pleinement dans le cadre de l’évaluation d’un traitement d’une « maladie » létale . Il reproduit de plus le caractère intrinsèquement hétérogène des dommages radio-induits observés après irradiations accidentelles, lié notamment à l’atténuation du rayonnement par l’épaisseur corporelle. Ce paramètre est fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle issue des zones relativement sous exposées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire. L’étude préliminaire inclura les animaux de façon échelonnée, pour tirer parti des résultats des cohortes précédentes afin de minimiser le nombre d’animaux inclus. Dans la même optique de réduction, nous réaliserons une phase de preuve de concept avec un nombre réduit d’animaux par groupe (n=4 ou 5), avec des cohortes échelonnées. Cette phase sera considérée un jalon décisif pour la poursuite de l'étude. L’étude permettant une analyse statistique robuste, qui inclut un nombre plus important d’animaux par groupe (n=8), nécessaire pour démontrer l’efficacité de la molécule candidate, utilisée seule ou en combinaison, selon les recommandations des agences réglementaires, ne sera réalisée que si la preuve de concept est concluante. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé pour permettre de mettre en évidence l’efficacité du traitement selon les méthodes statistiques en vigueur.
Raffinement
Les interventions et l’irradiation seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie. Une grille de suivi clinique et biologique, basé sur notre expérience et sur la bibliographie, a été établi. Ce score pourra être adapté si besoin afin de suivre de plus près l’évolution clinique des animaux pour limiter au mieux la souffrance. Les traitements seront réalisés en première intention sur les animaux vigiles après un entrainement comportemental par conditionnement opérant de type click-training, faisant appel à la collaboration des animaux. Après l’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration des traitements,une surveillance accrue sera réalisée pendant 15 jours avec une échographie de contrôle à J15 post implantation. En cas de douleurs, une analgésie sera mise en place. Suivi quotidien : • Suivi de l’état général des animaux vigiles (1x/j minimum, week-end compris). En cas de modification de comportement de l’animal ou de signe de souffrance, un signalement vétérinaire sera effectué. • Les animaux seront scorés chaque jour avec la grille précédemment établie avec les vétérinaires de l’installation. Cette grille a une valeur prédictive quant à la possible dégradation de l’animal. Si un PNH venait à atteindre un score limite, un vétérinaire et le directeur d’étude seront consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. • Si des atteintes inattendues surviennent ou si l’animal démontre une souffrance non anticipée, une analgésie sera mise en place si pertinente et un vétérinaire et le directeur d’étude seront également consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. Suivi lors des prélèvements : En plus du suivi clinique (poids, température), un suivi biologique complémentaire sera réalisé. Ce suivi sera réalisé à une fréquence plus rapprochée au début de l’étude puis progressivement espacée lorsque la période critique sera passée. Transport : les animaux seront transportés vigiles, par paire au minimum. Des jouets, de l’eau et de la nourriture seront à leur disposition. Hébergement : les animaux seront hébergés en accord avec la réglementation et bénéficieront d’un l’enrichissement multimodal : sensoriel, alimentaire, social et ludique (jouets fixes et mobiles).
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus jeune adulte (2 à 8 ans), qui est notre modèle animal historique, a été retenu pour ce projet car : - Il présente des caractéristiques physiologiques, hématologiques et immunologiques proches de l’humain adulte. - Il permet de plus de par sa taille, son âge (hématopoïese mature non sénescente) et son épaisseur corporelle de reproduire le caractère hétérogène des irradiations accidentelles (gradient de dose et donc de dommage antéro-postérieur significatif) fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle post accidentelle.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavés deux fois par sonde, vingt-quatre heures puis une heure avant d'être tués, 92 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur sérum et leur cœur servent ensuite à mesurer, sur cellules et ex vivo, l'effet protecteur d'extraits de romarin issus de l'agriculture régionale. Une grille de score de 0 à 18 est prévue, la mise à mort étant décidée au-delà de 15, pour une procédure qui se réduit à deux gavages. Le porteur écrit que ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes aux doses choisies, après avoir indiqué que le gavage peut être à l'origine de douleurs modérées ou de stress.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus d'extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), plante issue de l’agriculture régionale, sera intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre but sera d’évaluer les effets protecteurs cellulaires de la prise préventive d'extraits de Romarin. Notre approche est novatrice puisque les extraits ne seront pas disposés directement sur les cellules, mais le seront indirectement : après passage dans l’organisme, via le contact avec le sérum des rats traités par voie orale. Ainsi nos cellules seront mises en contact avec des extraits de Romarin, mais également avec leurs formes métabolisés ayant eux-aussi des propriétés anti-oxydantes. Notre objectif sera d’étudier des effets protecteurs cellulaires de sérum issus de rongeurs ayant eu un traitement oral avec des extraits de Romarin et leurs implications sur le stress oxydant. Nous évaluerons également ex vivo la cardioprotection induite par ces extraits suite à un test mimant l'infartus du myocarde. Ce projet a reçu un financement.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus de Romarin, plante issue de l’agriculture régionale, sera donc intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger les cellules endothéliales ainsi que le cœur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires ne sont pas très nombreuses et sont très attendus pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun deux traitements par voie orale (intervention évaluées à moins de 15 minutes) 24h puis 1h avant le sacrifice. Ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes sur les animaux aux doses choisies.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Néanmoins, toutes ces procédures seront réalisées par des personnels expérimentés. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. Par ailleurs, les prélèvements de sang seront réalisés seulement après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et endothéliales. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules et de leurs extractions sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (gavage avec utilisation d'aiguille en plastique souple), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Au cours de la procédure expérimentale, le bien-être des animaux sera évalué par un personnel formé à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites (cf annexe). Sur la base de cette grille, un score est attribué (de 0 à 18). Si le score est compris entre 5 et 9, l’animal sera alors observé attentivement (deux observations par jour), et une prise en charge antalgique pourra être envisagée. Si le score est compris entre 10 et 14, un soulagement de la souffrance sera systématiquement envisagé (même protocole d’analgésie), l’animal sera surveillé de façon renforcée (plusieurs observations par 1/2 journée afin de s'assurer des effets de l'antalgie), et un second avis pourra être demandé en vue d’une éventuelle euthanasie. Enfin, si le score est compris entre 15 et 18, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences d’ischémie-reperfusion ainsi que nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les rats seront utilisés à un stade mature (12semaines) pour être représentatif d’une population adulte.
Enseignements pratiques : étude de la réponse immunitaire post-vaccinale chez la souris
- Enseignement supérieur
Trois injections d'un vaccin sous la peau, une par semaine pendant trois semaines, puis la mise à mort par dislocation cervicale et la dissection : 115 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, pour un travail pratique d'immunologie. Le porteur indique que l'injection provoque une masse au flanc droit et une inflammation d'environ vingt-quatre heures, sans altération attendue de l'état général. Les compétences visées sont la contention, la préparation du vaccin, l'injection sous la peau, puis le repérage et le prélèvement de la rate et des ganglions. La dislocation cervicale est annoncée comme une connaissance théorique, non pratiquée par les étudiants, et l'effectif est fixé à une souris par binôme.
Objectifs
L’objectif du projet est pédagogique. Ces travaux pratiques d’immunologie couvrent deux objectifs. 1.Les étudiants apprennent à induire une réponse vaccinale chez la souris par injection sous-cutanée. Dans cet objectif ils pourront accroitre leur technique d’expérimentation animale sur la contention et l’injection sous-cutanée. 2. Les étudiants apprennent à disséquer les souris de manière à identifier et prélever les organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de transmettre un savoir théorique et pratique aux étudiants dans le domaine de l’immunologie, de la réponse vaccinale, des techniques biologiques et des bonnes pratiques en expérimentation animale. Voici les compétences en lien avec l’expérimentation animale qui seront acquises par les étudiants à l’issue de ce projet : - Contention des souris - Préparation d’un vaccin et technique d’injection sous-cutanée - Connaissance théorique sur la mise à mort par dislocation cervicale (non pratiquée par l’étudiant) - Connaissance de l’anatomie du système immunitaire chez la souris - Dissection et prélèvement des organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions)
Procédures
Injection sous cutanée du vaccin ou de la solution témoins : 3 injections par animal (1/semaine sur 3 semaines) - Durée de l’injection : 15 secondes
Impact sur les animaux
L’injection du vaccin en sous-cutanée génère une petite masse au niveau du flanc droit qui s’estompe dans les 4 heures qui suivent l’injection. Pour les souris vaccinées, le tampon dans lequel est injecté le vaccin contient une molécule (CpG) qui génère une inflammation sur le site d’injection durant les 24 heures qui suivent l’administration. L’administration du vaccin peut donc provoquer une gêne légère et une douleur légère. Elle ne génère cependant pas de nécrose cutanée. Aucune altération de l’état général n’est attendue.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort au moment de l’analyse de la réponse immunitaire une semaine après la fin de la procédure de vaccination.
Remplacement
L’étude de la réponse immunitaire post-vaccinale est complexe et implique des mécanismes et des interactions cellulaires que l’on ne peut étudier que dans un organisme vivant. En conséquence, l’évaluation d’un vaccin doit être réalisée sur les organismes vivants. Les étudiants de 3° année de BUT-GB-BMB (BUT3) sont destinés à des métiers de techniciens ou d’assistant ingénieurs en biologie et seront amenés à travailler dans des structures académiques ou privés dans les domaines de l’immunologie et/ou de la cancérologie. Ces domaines nécessitent des compétences poussées en expérimentation animale ce qui justifie la formation des étudiants de BUT3 dans ce domaine.
Réduction
Nous limiterons le nombre de souris à une par binôme. C’est un nombre minimum pour garantir l’apprentissage des bons gestes de contention, d’injection sous-cutanée et de dissection. Une analyse statistique sera possible en mettant en commun l’ensemble des données du groupe d’étudiants. Par ailleurs, en utilisant des données disponibles de la littérature scientifique intégrant des données d’expérimentation animale autres que celles obtenues dans le TP (effet sur la croissance des tumeurs, sur la survie des souris, sur des paramètres de la réponse immunitaire), nous pourrons aider les étudiants à interpréter, à critiquer leurs résultats et imaginer des perspectives à leur travail dans le contexte scientifique actuel.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension par les responsables de l’animalerie de l’IUT. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Contrairement à d’autres produits existants, l’adjuvant utilisé n’est pas toxique pour les souris et la solution injectée n’induit pas de douleur à l’animal. Ces modifications de la composition du vaccin ne modifient en rien l’efficacité de celui-ci (données sur cette formulation connues dans la littérature).
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme dans un contexte de vaccination. Des données sur la vaccination chez la souris avec le peptide RIOK1 existe dans la littérature, ce qui permettra d’utiliser ce modèle en tenant compte de la règle des 3R. Les outils d’analyses ex vivo chez la souris sont maitrisés par l’équipe encadrante. Par ailleurs, les outils (anticorps) permettant l’analyse et la déplétion des populations immunitaires sont aussi très nombreux chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Création et maintien de lignées de poisson zèbre pour étudier le rôle de différents gènes impliqués dans un type de mémoire, l’habituation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour créer et entretenir des lignées de poissons zèbres privés de gènes liés à l'habituation, une forme de mémoire, 8 700 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Cent d'entre eux au maximum subissent à deux mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale, seul geste invasif du protocole. Les poissons dépourvus de la double mutation recherchée sont tués aussitôt, les reproducteurs à douze mois pour éviter les signes de vieillissement. Le porteur annonce vouloir démontrer que ces invalidations génétiques n'entraînent aucun mal-être, sans expliquer comment le total de 8 700 individus se rapporte aux cinquante reproducteurs par génération qu'il dit suffisants pour maintenir les lignées.
Objectifs
Le poisson zèbre, quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, réagit en changeant de direction. Lorsqu'il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant un type de mémoire connu sous le nom d’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines d'intérêt. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes codant ces protéines d'intérêt seront ciblés et remplacés par un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d'étudier le rôle de ces protéines invalidées sur l'habituation en évitant le prélèvement d'un petit morceau de la nageoire caudale. L’autre objectif sera de montrer que les poissons doublement mutants pour ces gènes ne présentent aucun effet délétère indésirable et donc que l'invalidation de ces gènes n'entraine aucun mal-être chez l'animal alors même qu'ils ont des problèmes d'habituation.
Bénéfices attendus
Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'Homme nous montrent l'importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines qui nous intéressent mais aussi d'éviter de recourir à une biopsie de la nageoire caudale. La création de poissons doublement mutants nous permet de montrer que le bien-être des poissons mutants générés n'est pas impacté.
Procédures
Seuls 100 poissons âgés de 2 mois issus de la génération 3, subiront le prélèvement d'une partie infime de leur nageoire caudale, sous anesthésie générale, afin de ne garder que les individus porteurs des doubles mutations. Le temps total de réalisation de la biopsie sera de moins de 2 min et il s’agit là du seul geste invasif qu’auront à subir ces poissons-zèbres au cours de leur vie.
Impact sur les animaux
Pour l'ensemble des animaux de ce projet (génération et élevage d'individus mutants), il sera évalué en continu si les mutations ainsi créées engendrent des souffrances chez l'animal. Les poissons dés la 2e génération seront issus d'un croisement entre un poisson sélectionné pour sa fluorescence dans les neurones à l'état larvaire avec un poisson de type "sauvage" ne présentatnt pas de fluorescence. Les poissons sélectionnés pour mener le projet le seront sur la base de la présence de fluorescence dans les neurones à l'état larvaire. La réalisation d'une biopsie de la nageoire caudale, effectuée sous anesthésie générale, à l'âge de 2 mois pour certains animaux (100 maximum) peut entrainer des nuisances légères comme un réveil trop long ou une reprise de nage inhabituelle, des lésions suite à la biopsie ou la non repousse de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Les nuisances ou effets indésirables sont extrêmement rares avec ce protocole établi et utilisé en routine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l'apparition de signes de vieillissement et donc d'impacter le bien-être des animaux. Les animaux ne présentant pas d'intérêt sur le plan génétique (absence de double mutations) seront mis à mort directement.
Remplacement
L'étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique nécessairement l'utilisation de modèles animaux vivants. En effet, la complexité des connexions neuronales ne peut-être reproduit in vitro. Le poisson zèbre représente le modèle le plus simple de cerveau nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés sachant que le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités importantes avec celui de l'Homme.
Réduction
Une sélection des embryons âgés de moins de 5 jours présentant une fluorescence appropriée dans les neurones permettra de réduire drastiquement le nombre d'individus à élever au delà de 5 jours de développement en ne gardant uniquement que les poissons d'intérêt. Un nombre minimum d'individus est élevé pour maintenir la lignée (50 par génération) et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement réalisés avant 5 jours de développement et donc hors champ réglementaire. Pour le maintien des lignées, une nouvelle génération est réalisée tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre total de générations et donc d'individus. Pour l'étude de l'existence de nuisances chez les double mutants, seul le nombre minimum d'animaux nécessaires au maintien des lignées (soit 100 maximum) subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale.
Raffinement
D'après notre expérience précédente, il n'est pas attendu d'effets délétères indésirables chez les poissons-zèbres générés et conservés. Le prélèvement d'un petit morceau de la nageoire caudale sera le seul geste invasif fait sous anesthésie générale sur 100 animaux maximum et une seule fois dans leur vie.A la suite de la réalisation d'un prélèvement de la nageoire caudale, les poissons sont maintenus deux par deux dans un bac, avec un séparateur entre les deux, pour une durée maximale de 24h, afin d'éviter le stress de l'isolement. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière des individus tout au long du projet pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt de souffrances bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Choix des espèces
Les gènes de l'Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fécondation externe, avec des pontes de plus de 100 œufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d'autres modèles tels que la souris et ainsi d'obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence optique des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux en développement, ce qui permet de relier les événements dans les neurones avec le comportement d'apprentissage de l'animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettront de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement/apprentissage (hors cadre réglementaire). Aussi, les reproducteurs seront gardés jusqu'à 12 mois et avant l'apparition de signes de vieilliesse. Pour les individus subissant une biopsie de la nageoire caudale, celle-ci sera réalisée à 2 mois de développement de l'individu. Cet âge permet d'avoir un individu de taille conséquente, de réduire la taille du fragment prélevé et donc la gêne engendrée par cet acte et une régénération optimale de la nageoire ainsi amputée.
Étude de la livraison au cerveau de deux composés utilisés comme traitement thérapeutique potentiel contre la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans la veine de la queue en état vigile, dans une boîte de contention, 85 souris reçoivent une dose unique d'un composé, tandis que 25 autres, porteuses d'un cathéter dans la veine jugulaire, en reçoivent matin et soir pendant quatre jours. Ces 110 souris subissent des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, avec un risque de lésions et d'inflammation au point d'injection. L'objet est de vérifier si deux composés bloquant l'action d'un peptide franchissent la barrière entre le sang et le cerveau, étape que le porteur qualifie d'"impérative" avant d'envisager un usage contre la maladie d'Alzheimer. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, foie, reins et sang, et y doser le composé.
Objectifs
L'objectif de cette étude est de faire une première analyse préclinique pour optimiser la livraison de composés thérapeutiques dans le cerveau chez la souris. Deux composés ont été sélectionnés en amont comme bloquant l'action d'un peptide sécrété naturellement dans le cerveau en condition physiologique. Une étude scientifique a montré un impact direct de ce peptide sur la régulation de l'activité des synapses (points de connexion entre les neurones). De plus, des données obtenues par l'équipe montrent qu'une augmentation anormale des niveaux de ce peptide dans le cerveau de patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourrait contribuer à la perte d'activité des synapses et de la mémoire, symptômes typiques de cette maladie. Enfin, il est possible que ce peptide soit impliqué dans d'autres maladies neurologiques comme la schizophrénie. Afin de prévenir cette action néfaste, nous avons criblé une banque de composés afin de bloquer son action à la synapse. Il est impératif aujourd'hui d'évaluer la capacité de ces composés à entrer dans le cerveau pour confirmer leur potentiel thérapeutique. Ce projet s'engagera à répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Déterminer si ces composés parviennent à traverser la barrière hémato-encéphalique avec succès. 2. Définir les doses et les temps de stabilité de ces composés après injection. 3. Analyser la dose et le temps de stabilité pour un traitement chronique (jusqu'à un maximum de 4 jours).
Bénéfices attendus
Dans le monde, on estime qu'il y a environ 50 millions de personnes atteintes de démence, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante. Cette maladie impacte un tiers des personnes de plus de 80 ans. Ces chiffres sont cependant en augmentation en raison du vieillissement de la population. Il n'y a pour l'instant aucune solution thérapeutique permettant de soigner ces patients. Trouver de nouvelles solutions thérapeutiques est donc une priorité absolue de santé publique. Notre groupe se concentre sur un nouveau peptide associé à la maladie d'Alzheimer, mais aussi possiblement à d'autres maladies neurologiques (schizophrénie…), comme nouvelle cible thérapeutique. Les analyses de pharmacocinétique prévues dans ce projet vont être essentielles pour confirmer la livraison au cerveau des composés bloquant l'action du peptide étudié, et donc renforcer leur potentiel thérapeutique. Ces données précliniques seront précieuses en vue d'une application thérapeutique future chez l'homme.
Procédures
Des souris vigiles seront soumises à une seule administration aiguë d'un composé par injection intraveineuse au niveau de la queue (85 souris, 5 minutes de manipulation). Un autre groupe de 25 souris avec un cathéter placé au niveau de la veine jugulaire sera soumis à l'administration du composé le matin et le soir via le cathéter sur un maximum de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection en intraveineuse à la veine caudale de la queue dans une boite à contention ce qui peut entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Une nuisance légère dûe à la contention de l'animal lors des injections via le cathéter est attendue.
Devenir
À la fin du traitement, nous procéderons à la mise à mort de l'animal et au prélèvement de ses organes (le cerveau, le foie, les reins, le sang) afin d'évaluer la concentration des composés injectés ainsi que ses caractéristiques pharmacocinétiques et sa capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Pour compléter les études in vitro et ex vivo précédemment réalisées dans notre laboratoire sur des neurones de souris, il est désormais nécessaire d'utiliser ce même modèle comme modèle animal. En effet, la souris est idéalement adaptée pour des analyses de pharmacocinétique, notamment pour une livraison dans le cerveau avec une barrière hématoencéphalique intacte. Malheureusement, pour ce type d'analyse pharmacocinétique, il est impossible de recourir à des méthodes alternatives pour remplacer l'utilisation d'animaux ou pour opter pour des animaux moins sensibles. Bien qu'il existe des modèles ex vivo dédiés à l'étude du passage de la barrière hémato-encephalique, ce type d'analyse de pharmacocinétique chez l'animal vivant est nécessaire comme pré-requis avant transfert de l'utilisation de ces composées chez l'homme. Cette étude chez la souris est donc capitale pour fournir les données essentielles in vivo en vue d'une application thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous nous baserons sur des études pilotes précédemment menées ex-vivo. Ces expériences, déjà réalisées dans notre laboratoire, ont permis d'identifier une dose optimale à administrer de manière directe et aiguë sur des neurones en culture et des tranches de cerveau de souris ex vivo. Nous sommes toutefois conscients que passer d'un modèle ex vivo, avec une administration directe sur le tissu et en aigu, à une étude in vivo présente des différences significatives. C'est pourquoi le calcul final des doses sera recalibré si besoin de façon à ce que le niveau de concentration passant du flux sanguin au cerveau soit comparable à celui obtenu lors des expériences ex vivo. Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons essentiellement des mâles pour la première partie de l'étude pharmacocinétique. Après identification des doses et temps optimaux en injection aigue et chronique, nous validerons ces points aussi chez la femelle. Aussi, c'est dans l'optique de reduction d'animaux que nous séparons ce projet en 2 procédures, en espérant ne devoir utiliser que la procédure 1 si la stabilité des composés lors de livraison in vivo en aigu le permet. Enfin, nous avons regroupé les groupes 'contrôle' pour les mâles pour les deux procédures afin de minimiser le nombres d'animaux utilisés et nous avons estimé avec l'outil statistique prédictif g-power le nombre de souris nécessaire par groupe (5 souris) pour obtenir une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses d'effets des composés obtenus ex vivo.
Raffinement
Nous nous sommes assurés de la non toxicité des composés à injecter en amont de cette étude. En effet, les études préliminaires réalisées in vitro et ex-vivo avec les composés à l'étude n'ont montré aucune toxicité sur des neurones en culture ou sur des tranches de cerveau, même après application à forte dose et à temps long (24h). D'autres composés de même profile (même famille de molécules) ont déjà été utilisés in vivo montrant qu'ils ne présentent pas d'effets secondaires notoires. Nous accorderons une attention particulière aux conditions d'hébergement, en plaçant les animaux 5 par cage. Ils auront accès à l'eau et nourriture, dans un environnement enrichi où la temperature et l'hydrometrie sont controlées. Un suivi régulier sera assuré par des opérateurs formés, et les animaux seront surveillés de manière à permettre, le cas échéant, la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés. Si les données obtenues montrent que la souris devra subir des injections répétées pour obtenir un niveau suffisant des composés dans le cerveau, nous avons aussi proposé une livraison du composé sur plusieurs jours via un cathéter inséré dans la veine jugulaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que toutes nos données ex-vivo ont été obtenues sur des neurones de souris. Cela permettra de calibrer du mieux possible les doses à utiliser in vivo. La souris possède un système vaculaire, une barrière hémato-encéphalique et un cerveau avec des propriétés très similaires à celles décrites chez l'humain. Nos données de pharmacocinétiques obtenues dans ce modèle seront donc très pertinentes comme pré-requis pour pouvoir ensuite transferer l'utilistation des composés chez l'homme. Pour réaliser notre étude, nous utiliserons des souris adultes d'environ 8 semaines (environ 24-28g chacune). L’utilisation des composés pourrait être à terme envisagée pour d’autres maladies liées à la dysfonction des synapses, notamment aussi des pathologies présentes chez le jeune adulte, en plus d'une utilisation potentielle pour la maladie d'Alzheimer. La barrière hémato-encéphalique étant moins poreuse chez le jeune adulte que chez les sujets âgés, il est préférable d’obtenir ces données de pharmacocinétique chez le jeune adulte comme passage ‘à minima’ des composés.
Humanisation des souris MISTRG
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées par construction génétique de l'essentiel de leur système immunitaire, 18 souris MISTRG reçoivent un système sanguin humain puis des cellules leucémiques humaines, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. L'injection dans le foie a lieu à deux jours de vie, suivie d'une injection lente dans la veine de la queue à douze semaines, de cinq injections abdominales hebdomadaires, de cinq anesthésies pour imagerie de trente minutes, de deux prises de sang et d'un prélèvement de moelle osseuse dans le fémur. Le porteur décrit une diminution d'activité, une perte de poids et l'apparition possible de tumeurs dans l'abdomen. Aucun animal n'est gardé au-delà de seize semaines de vie, les tests étant arrêtés avant que la leucémie ne tue les souris elle-même.
Objectifs
Notre laboratoire a obtenu une lignée de souris transgénique appelée MISTRG, qui ne rejette pas les cellules sanguines humaines du fait de sa déficience profonde du système immunitaire : les cellules sanguines humaines prolifèrent et survivent longtemps selon une reconstitution équilibrée qui imite parfaitement le sang humain, issu de donneur sain ou de patients. L’idée est de recréer un environnement humain dans la souris, où des cellules cancéreuses du sang (leucémiques) peuvent se développer, de façon à pouvoir étudier en situation physiologique. Ce modèle, une fois mis au point, nous servira à évaluer l’efficacité pré-clinique de nouvelles thérapies appelées immunothérapies. Toutes nos futures études seront basées sur les résultats de ce projet de mise au point. Nous souhaitons donc mettre au point cette humanisation de la souris avec l’injection d’un système sanguin humain et l’adjonction d’un cancer du sang.
Bénéfices attendus
Les cancers du sang échappent au contrôle du système immunitaire par divers mécanismes, dans un environnement qui comprend de nombreuses cellules : des cellules leucémiques, des cellules de l’immunité, du tissu osseux, des vaisseaux sanguins qui est très difficile à reproduire in vitro. Seules des souris génétiquement modifiées pour imiter le fonctionnement humain peuvent reproduire ces interactions complexes. Ce projet a pour but de créer un modèle pré-clinique de cancer du sang humain pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques ou cellulaires mis au point au laboratoire et aussi mieux comprendre les mécanismes de résistance des cancers du sang. Ce modèle permettra de proposer des pistes pour de futurs traitements plus efficaces. Ces avancées sont cruciales pour développer des traitements sur mesure et améliorer les soins pour les patients.
Procédures
-Une injection rapide (1min) dans le foie chez les souriceaux de 2 jours d’âge -Une injection lente dans la veine de la queue à 12 semaines d’âge (5 à 10 min) - 5 injections rapides dans l’abdomen (une fois par semaine entre 12 et 16 semaines d’âge, 1min) et 5 anesthésies pour réaliser une imagerie d’une durée maximale de 30 minutes par anésthésie - 2 prélèvements de sang à 8 et 12 semaines d’âge de durée (1min) -Un prélèvement de moelle osseuse dans le fémur sous anesthésie à 8 semaines d’âge (2 min)
Impact sur les animaux
- douleur légère de courte durée due à la piqûre d'aiguille pour l’injection et le prélèvement. - diminution de l’activité, perte de poids, et possible développement de petites tumeurs intra-abdominales dans les trois premières semaines chez les souris recevant l'administration de cellules tumorales.
Devenir
Les souris MISTRG étant partiellement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 16 semaines de vie, ni en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons nos expériences sans expérimentation animal en laboratoire pour tester les cellules humaines . Cependant, jusqu’à présent, nous n’avons pas réussi à recréer un modèle ne nécessitant pas d’expérimentation animal avec un environnement similaire à celui de la moelle osseuse humaine. Pour prouver l’efficacité de nos cellules, nous devons donc utiliser un modèle murin. De plus, les modèles sans animaux actuels pour étudier l’environnement des tumeurs humaines concernent uniquement les tumeurs solides, et non les cancers du sang comme les leucémies étudiées ici.
Réduction
Nous avons réuni des expériences en utilisant les souris humanisées pour l’expérimentation de la transplantation de cellules leucémique. Nous avons réduit au minimum notre nombre de souris par groupe en le déterminant par une approche statistique.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation de leur état clinique sera utilisé. Des points limites sont mis en place. Nous aurons recours à de l'anesthésie, ainsi qu'à de l'analgésie en cas de douleur. Nous avons mit en place des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris, car c’est la seule espèce qui permet de réaliser ce type d’étude. Cela est notamment possible grâce à la capacité de modifier son patrimoine génétique de façon précise et répétée. C’est grâce à cette méthode que la souris MISTRG a pu être obtenue. La souris MISTRG est un modèle qui imite le fonctionnement humain grâce à sa capacité à développer des cellules du sang après humanisation. Elle est reconnue comme le meilleur modèle pour étudier les cellules humaines cancéreuses du sang. Avec ce modèle, nous pouvons examiner l’environnement des leucémies et tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme les thérapies cellulaires. Les expériences se font entre la naissance et 16 semaines de vie des souris. Nous arrêtons les tests avant que la leucémie ne se développe complètement et n’induise de mortalité.
Exploration des modèles de neuropathologies par des tests comportementaux dans le but de caractériser le phénotype des lignées murines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
9 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, au sein d'un service d'animalerie qui met des batteries de tests comportementaux à la disposition des équipes de neurosciences. Les souriceaux subissent une biopsie de la queue entre trois et six jours de vie, les adultes une restriction alimentaire de quinze jours destinée à les motiver, puis jusqu'à huit tests de locomotion, huit tests d'anxiété et de sociabilité et sept tests cognitifs étalés sur onze semaines. Certaines lignées présentent des convulsions, des troubles moteurs qui compliquent l'accès à l'eau et à la nourriture, ou un retard de croissance, et le porteur présente ce phénotypage comme un moyen de fixer des points limites plus précoces et d'"assurer le bien-être animal". 3 264 animaux passent ensuite en utilisation continue vers d'autres projets autorisés, une partie rejoint les élevages, les autres sont tuées.
Objectifs
L’objectif du projet est de proposer par un service d’animalerie dédié un ensemble de tests (et protocoles) comportementaux mis à la disposition des équipes de recherche qui étudient les neurosciences. Le but est d’explorer des modèles de souris ayant des neuropathologiques qui miment un ensemble de maladies ou de troubles affectant le système nerveux, notamment le cerveau, la moelle épinière et les nerfs périphériques et de caractériser une altération de la santé de l’animal (phénotype dommageable). La meilleure connaissance de ces nouveaux modèles permettra dans le cas d’un phénotype dommageable de déterminer des points limites précoces afin d’améliorer le bien-être animal. L’ensemble des tests couvrent tous les âges (présevrage, juvénile, adulte et sénior) selon des protocoles classiques et modulables et selon les modèles pour s’adapter aux observations préliminaires qui ont conduit à la demande d’exploration comportementale par le chercheur.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance du phénotype des animaux permet de déterminer des points limites plus précoces, permet d’assurer le bien-être animal, de faire progresser les connaissances neuropathologiques des modèles générés par les chercheurs afin d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Dans le cadre du projet, différentes interventions sont réalisées : Interventions sur des animaux vigiles (conscients) : 1. Biopsie de queue : Réalisée sur des souriceaux âgés de 3 à 6 jours, cette intervention rapide (moins d’une minute) permet d’analyser leur patrimoine génétique afin de confirmer leur génotype. 2. Restriction alimentaire : Chez les souris adultes, une restriction modérée peut être appliquée pendant 15 jours afin de stimuler leur motivation lors de certains tests comportementaux. 3. Tests comportementaux : Divers tests sont menés pour évaluer l’activité motrice, la sociabilité, l’anxiété ou les capacités d’apprentissage. 4. Tests de locomotion : Très brefs (moins de 5 minutes), ils peuvent être réalisés deux fois par jour pendant 4 jours consécutifs, soit jusqu’à 8 tests sur 2 semaines. 5. Tests d’anxiété et d’interaction sociale : Ils durent entre 10 et 40 minutes, avec un jour de repos entre chaque session, pour un maximum de 8 tests répartis sur 3 semaines. 6. Tests cognitifs : Ils comportent entre 1 et 8 essais par jour, pendant 1 à 15 jours, dans une limite de 7 tests répartis sur 11 semaines. 7. Phénotypes dommageables : Certaines souris, en raison de modifications génétiques, peuvent présenter des troubles moteurs, des convulsions ou un retard de croissance. 8. Prélèvements sanguins : Deux prélèvements sont réalisés sur des animaux adultes vigiles, espacés de deux semaines, chacun durant moins d’une minute, afin d’analyser certains paramètres biologiques. 9. Évaluation globale : Des observations régulières de l’état physique et du comportement sont effectuées pour détecter précocement tout signe de malaise ou de maladie. 10. Interventions sous anesthésie – Chirurgie terminale : Une intervention courte (environ 5 minutes) est pratiquée sous anesthésie générale avec analgésie, sans réveil de l’animal (chez des juvéniles ou adultes).
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Lors des tests comportementaux un léger stress peut être induit par la découverte d’un nouvel environnement. La séparation maternelle, peut également induire un stress chez les nouveau-nés et un abandon de la progéniture par la mère. La restriction alimentaire provoquera une sensation de faim et une perte de poids de l’animal. Le test de comportement interaction sociale peut induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’anesthésie peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. Les modèles de neuropathologies sont susceptibles de ressentir des douleurs allant de légères à sévères. En cas de crises d’épilepsie à un stade élevé, une fatigue, une atonie et une perte de poids peuvent également se manifester. Les troubles moteurs entraînent des difficultés de mouvement, rendant l'accès à l'eau et à la nourriture plus compliqué. Le retard de croissance affecte le développement des animaux, ce qui se traduit par un sevrage plus tardif. L’hébergement individuel peut induire un stress social
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue (N 3264) pour d’autres projets autorisés. Les souris dédiées aux tests de comportement seront euthanasiées pour réaliser des analyses histologiques. Les souris non utilisées pour des objectifs scientifiques seront pour une partie utilisée pour le maintien des élevages et pour une seconde partie euthanasiée.
Remplacement
Nos projets en neurosciences reposent sur des approches in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires dans un environnement contrôlé. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour analyser les interactions neuronales complexes, explorer les dynamiques cérébrales et valider les résultats in vitro dans un organisme vivant. Les alternatives aux modèles animaux, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes cérébraux et les simulations informatiques, ont progressé ces dernières années. Ces méthodes permettent d'approfondir la compréhension des mécanismes neuronaux tout en évitant les contraintes éthiques. Les cultures en 2D et les organoïdes en 3D reproduisent certains aspects du développement neuronal, mais ne peuvent reproduire la complexité fonctionnelle et structurelle du cerveau. Malgré leurs avancées, ces alternatives présentent des limites. Les organoïdes manquent de vascularisation et d’interactions avec les systèmes immunitaire et circulatoire, tandis que les simulations informatiques, bien qu'efficaces, ne remplacent pas les connaissances acquises par l’expérimentation biologique. Ainsi, bien que les approches in vitro et informatiques réduisent l'utilisation des animaux, elles ne peuvent totalement s’y substituer.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 9000
Raffinement
Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. L'acclimatation des animaux à l'expérimentateur sera effectuée à raison de 10 minutes par jour sur une période de 5 jours Pour limiter le stress des femelles allaitantes et un éventuel rejet de leurs progénitures après manipulations, les mains gantées des expérimentateurs sont imprégnées de l’odeur de la sciure de la cage avant de manipuler les petits. Les animaux subissant une restriction alimentaire, seront sortis du protocole en cas d’une perte de poids supérieure à 15 pour cent de leur poids initial et remis dans une cage d’hébergement avec à disposition un aliment enrichi . L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Le raffinement des phénotypes dommageables repose sur une surveillance précoce des nuisances et l’adoption d’un hébergement adapté, avec enrichissements et manipulations douces pour certaines lignées. L’évaluation du bien-être est non invasive, basée sur des paramètres zootechniques et physiologiques. En cas de détection d’un phénotype dommageable, une prise en charge immédiate est effectuée. Les enrichissements sont ajustés au type d’animaux et les points limites définis tôt. La chirurgie est réalisée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, en utilisant des agents anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et réglementaires dans une pièce isolée du reste des autres souris.
Choix des espèces
Les équipes de recherche utilisent le modèle souris, essentiel pour les études en neurosciences en raison de sa similarité génétique avec l'homme. Les chercheurs demandant des phénotypages se concentrent sur ce modèle, qui permet d'étudier les mécanismes génétiques sous-jacents à des maladies, notamment neurodégénératives et psychiatriques. Selon les premières observations faites, les animaux pourront être utilisé dès la naissance, ou à partir du sevrage, ou à l’âge adulte.