Procédures légères

Les souris utilisées portent une mutation du canal sodique cardiaque qui provoque des arythmies ventriculaires et, après quatre semaines, une forte mortalité. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des expérimentations sur cœur isolé. Chacune passe un électrocardiogramme de cinq minutes sous anesthésie à trois semaines, avec pose d'une bague à l'oreille et prélèvement du bout de la queue pour le génotypage. Le porteur présente la mise à mort à quatre semaines comme une mesure éthique, puisque les souris mutées peuvent au-delà mourir subitement d'arythmie ou développer une insuffisance cardiaque, atteintes qu'il déclare par ailleurs dans des procédures de gravité légère à modérée.

Objectifs

Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations du gène codant le canal sodique cardiaque. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG), marqueur d'une anomalie de l'activité électrique cardiaque, est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative, chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de 8 molécules sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients (souris SQTL). Ces molécules ont été sélectionnées in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal sodique cardiaque, en inhibant le courant sodique anormal induit par la mutation, et des canaux sodiques neuronaux, faiblement exprimés dans les cardiomyocytes mais contribuant au déclenchement des arythmies. En parallèle, les effets indésirables cardiaques potentiels des 8 molécules, en particulier sur la conduction électrique, seront déterminés sur des coeurs isolés de souris contrôles provenant des mêmes portées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'identifier un nouveau traitement de prévention des arythmies associées au SQTL de type 3.

Procédures

Au moment du sevrage, à l'âge de 3 semaines, un électrocardiogramme sera enregistré sous anesthésie générale pendant 5 minutes. A la fin de l'enregistrement, toujours sous anesthésie, l'identification des animaux sera réalisée par bagage d'une oreille et le bout de la queue des souris sera prélevé pour réaliser leur génotypage. Ces deux gestes durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

La mutation du canal sodique conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris SQTL qui conduisent, après l'âge de 4 semaines, à une forte mortalité. Les souris SQTL qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) deviennent adultes mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant la protéine déclenchant l'expression de la mutation sur une partie des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Les autres effets indésirables attendus sont le stress induit par la contention et l'anesthésie des souris par isoflurane pour l'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage, puis pour la mise à mort des animaux, ainsi que la douleur associée à la biopsie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour les expérimentations ex vivo.

Remplacement

Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle ex vivo sur coeur isolé perfusé. Seule cette exploration peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant l'activité électrique cardiaque et en prévenant les arythmies, qui ne peuvent être obtenues sur un modèle cellulaire. Les peptides qui seront testés au cours de ce projet ont été sélectionnés pour leurs effets à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.

Réduction

Un maximum de 14 souris STQL par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable, en particulier parce que toutes les souris ne présentent pas d'arythmie spontanée. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 3-4 souris SQTL par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 12 animaux. Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Un maximum de 10 souris contrôles par molécule nous semble suffisant pour tester les effets cardiaques indésirables potentiels, peu probables selon nos études in vitro, des molécules.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage seront réalisés sous anesthésie. La mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, après 4 semaines à une forte mortalité. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant un gène permettant l'expression de la mutation chez environ 25% des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Des points limites ont cependant été définis dans le cas, peu probable, d'une apparition précoce d'insuffisance cardiaque chez les souris SQTL, ainsi que pour les souris contrôles.

Choix des espèces

La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent tôt, avant l'âge adulte, ce qui est observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, les souris mutées peuvent mourir subitement par arythmie cardiaque ou développer une insuffisance cardiaque.

Tuées à la fin des procédures pour l'analyse de marqueurs biologiques et des vérifications anatomiques, 2 314 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une ou deux interventions chirurgicales de quarante minutes à deux heures sous anesthésie, toutes passent des tests attentionnels et cognitifs, certains quotidiens pendant un mois à raison de trente minutes par jour, et certaines apprennent à porter une fibre d'imagerie fixée sur la tête. Le porteur reconnaît qu'une tâche comportementale est désagréable et stressante, qu'une autre suppose un rationnement alimentaire, et que la fibre contraint les mouvements. Il justifie l'ensemble en indiquant que les études cliniques sont difficilement réalisables sur des personnes autistes, en raison de leur fragilité et de leur incapacité à supporter les contraintes de l'imagerie cérébrale.

Objectifs

Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%) entraînant des problèmes importants dans la vie quotidienne, tels que des difficultés à sélectionner les informations sensorielles appropriées. Cela peut conduire à une surcharge cognitive et ou des problèmes de comportement. La coexistence des problèmes attentionnels et de l'autisme est mal comprise. Une meilleure connaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces difficultés pourrait améliorer la prise en charge des personnes concernées en affinant les approches thérapeutiques visant à atténuer ces symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle murin d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.

Procédures

Tous les animaux effectuent les tests comportementaux ayant pour objectif de tester leurs capacités attentionnelles et cognitives. Certaines tests seront réalisés quotidiennement (~30min par jour) pendant 1 mois. D'autres tests seront plus courts (2 séances de 30 min et 15 min sur deux jours). Certains animaux subissent une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie (durée 40 min à 2h). Certaines animaux reçoivent un traitement pharmacologique (non-toxique) sur 1 jour.

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales entrainent un risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids. Une des tâche comportementales est légèrement désagréable et stressante pour l'animal; l'autre necessiterait un rationnement au niveau de la nourriture, qui peut est légèrement stressant pour les animaux. Les animaux seront entraînés à porter une fibre d'imagerie sur leur tête, ce qui peut représenter une contrainte pour le mouvement de l'animal. Le produit injecté pourrait avoir un effet léger sur le comportement de l’animal, sa perception ou son niveau de vigilance ou acrtivité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Le projet se concentre sur l’exploration des changements comportementaux et biologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementales. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro ou in silico. Les études cliniques sont difficilement réalisables en raison de la fragilité de la population concernée et de leur incapacité à supporter les contraintes requises pour l’imagerie cérébrale. De plus, des approches invasives sont nécessaires pour répondre à nos questions scientifiques et ne peuvent pas être réalisées chez une population clinique. Les structures cérébrales ciblées par notre étude sont généralement bien conservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L’utilisation de modèles animaux présentant une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent ni la structure cérébrale ni les capacités comportementales ciblées par les objectifs de notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de manière à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale rigoureuse de notre projet permettra de mettre en place une stratégie de réduction optimale du nombre d’animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Notre étude intègre également plusieurs expériences pilotes, permettant d’évaluer la faisabilité technique de certains aspects du projet ainsi que son raffinement. Les données recueillies seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés, permettant une extraction maximale d’informations et assurant des analyses solides. Notre stratégie expérimentale permet également une analyse précoce des données, étape par étape, dans le but de réduire le nombre d’expériences ou de réévaluer notre approche si cela s’avère pertinent ou possible.

Raffinement

Le bien-être animal est essentiel pour garantir la réussite de notre projet. Nous avons réfléchi à notre projet afin d’intégrer plusieurs mesures de raffinement, notamment : i) Vérification de l’état de l’animal avant et après chaque expérience ou manipulation. ii) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d’une crème ophtalmique et d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle de l’animal ; utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. iii) Application de soins post-opératoires préventifs. iv) Manipulation quotidienne des animaux avant les séances comportementales afin de réduire le niveau de stress. v) Utilisation de techniques de manipulation adaptées pour minimiser le stress lié aux manipulations. vi) Habituation progressive à la salle de comportement. vii) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. viii) Mise en place de mécanismes d’intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de ressources éducatives en bien-être animal et sollicitation d’experts du domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 6 à 8 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.

Pour produire de nouveaux mélanomes chez la souris et y tester des molécules candidates, 4 833 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Des nouveau-nés reçoivent trois jours de suite une injection intra-gastrique d'un agent chimique déclenchant des mutations, d'autres souris reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou intraveineuse, d'autres encore se font implanter un fragment de tumeur sous la peau entre les omoplates, la plaie étant refermée par sutures ou agrafes. Le porteur décrit les tumeurs cutanées primaires comme n'engendrant "aucune douleur estimable" sauf ulcération, et réserve la douleur aux mélanomes métastatiques. Les expérimentations s'arrêtent à l'atteinte d'un point limite évalué par grille de score, la croissance tumorale étant suivie au pied à coulisse, par photographie ou par imagerie.

Objectifs

Les mélanocytes, cellules pigmentées de l’épiderme, synthétisent de la mélanine afin de protéger notre organisme des rayonnements ultra-violet (UV) du soleil. Mais quand ces mélanocytes sont endommagés, ils peuvent se transformer en mélanome. Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare mais aussi le plus grave car plus susceptible d'envahir les tissus voisins et de se propager à d'autres parties du corps. La plupart des décès dus au cancer de la peau sont causés par le mélanome. Il existe actuellement deux types de thérapies principales (thérapie ciblée et immunothérapie) dans le traitement contre le mélanome, malheureusement les patients rechutent dans 30-50% des cas en raison du développement de résistance à leur traitement. Des connaissances générées à partir de biopsies de mélanomes humains, de lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de réaliser des tests in silico, in vitro et in cellulo. Notre équipe a identifié des mécanismes qui seraient impliqués dans l’initiation et la progression des mélanomes, ainsi que des molécules ciblant ces mécanismes Néanmoins, malgré des résultats intéressants, il est possible que les modèles cellulaires, même très sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les évènements qui se produisent lors de la transformation des mélanocytes en mélanome ainsi que lors du processus de résistance aux traitements. L'expérimentation dans des modèles de cancer chez la souris est maintenant nécessire pour tester le potentiel thérapeutique de ces molécules. L’objectif général de ce projet est de produire de nouveaux mélanomes murins afin de mieux comprendre ces mécanismes dans l’initiation et la progression tumorale et de tester ces molécules nouvellement identfiiées à potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Il y a encore 20 ans, les patients atteints de mélanome cutanés métastatiques mouraient rapidement après le diagnostic. Grâce à des approches combinées impliquant notamment la génétique, la signalisation cellulaire, ainsi que l’utilisation de modèles murins et de lignées de cellules de mélanomes, il est aujourd’hui possible de traiter un grand nombre de patients atteints de ce cancer. Bien que des progrès considérables aient été réalisés, notamment avec des traitements augmentant la survie à 5 ans, seule une faible proportion des patients bénéficie d’une guérison définitive. Ce succès limité s’explique par l’apparition des résistances d’origine génétique, épigénétique (processus modulant l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN) et cellulaire. Il est donc indispensable de poursuivre ces recherches pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, identifier de nouvelles cibles thérapeutique et développer des approches innovantes permettant d’améliorer durablement le pronostic des patients. La première partie de cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de certaines gènes/protéines dans l’initiation des mélanomes à partir de mélanocytes, mais aussi leur rôle potentiel dans la progression des mélanomes et l’apparition de métastases. La seconde partie de l’étude se concentrera sur l’émergence de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les protéines étudiées dans la première partie de l’étude lors des différents processus, de l’initiation à la progression des mélanomes.

Procédures

Un lot d’animaux sera traité à la naissance par injection intra-gastrique 3 jours consécutifs (J1-J2-J3) par un agent chimique permettant l’expression de mutations spécifiques. Un autre lot d’animaux sera injecté avec de nouvelles molécules (la voie et la fréquence d’injection seront déterminées en fonction de la molécule) afin de déterminer la dose à utiliser en traitement Dans un autre lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutanées ou en intra-veineuse aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente). Pour certains de ces animaux, un suivi par imagerie sera réalisé afin de suivre la croissance tumorale interne. Pour cela, un marqueur sera injecté aux souris puis elles seront endormies par anesthésie gazeuse et placé dans l’imageur. Cela est réalisé une à deux fois par semaine. Dans un autre lot d’animaux, des fragments de tumeurs seront implantés aux souris. Le plan cutané des animaux sera ouvert sous anesthésie gazeuse et analgésie, puis le fragment sera positionné entre les omoplates et le plan cutané sera refermé soit par sutures soit à l’aide d’agrafes. Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiés développeront des mélanomes cutanés pouvant provoquer des irritations. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (douleur légère de courte durée). Suite à l’injection du de traitement, un retard de croissance peut être observé le premier mois de vie qui est compensé très rapidement sans séquelle. Les animaux greffés avec des cellules tumorales/ou des fragments de tumeurs par chirurgie développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de la chirurgie sont celles liées à l’ouverture du plan cutané (douleur de faible intensité). Aucune douleur de l’animal n’est observée lorsque le renouvellement des mélanocytes n’a pas lieu ; les souris deviennent blanches et ne subissent aucun ostracisme de la part de leurs congènères. Les seules douleurs qui sont possibles peuvent avoir lieu lorsque les souris développent des mélanomes métastatiques. Les tumeurs cutanées primaires n’engendrent pas de douleur estimable sauf éventuellement en cas d’ulcérations.

Devenir

A la fin de chaque expérience, les souris sont mises à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les connaissances générées à partir des biopsies de mélanomes humains, à partir des lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de tester in silico (modèles informatiques), in vitro et in cellulo (modèles cellulaires) les modifications au niveau des protéines et du fonctionnement des cellules ainsi que le métabolisme de ces cellules. L’utilisation de systèmes plus complexes mimant des stuctures en 3D constituées de cellules (systèmes 3D, sphéroïdes (cellules cultivées en suspension sous forme de sphère) ou peaux reconstituées) nous permet de mieux appréhender l’importance de certaines protéines ou de certaines mutations dans les processus sus-cités. Bien que les modèles cellulaires soient utilisés majoritairement comme paradigme pour étudier ces processus, il est possible que les modèles cellulaires, même sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les événements qui se produisent lors du développement embryonnaire, lors du renouvellement des mélanocytes, lors de la transformation des mélanocytes en mélanome. De plus, la recherche systématique de traitement contre le mélanome a révélé que l’hétérogénéité cellulaire au sein d’un mélanome engendre des résistances génétiques et épigénétiques qui ne sont pas reproductibles in vitro. En conséquence, l’utilisation de modèle physiologique sophistiqué proposé uniquement aujourd’hui le modèle mammifère est obligatoire dans un but cognitif et thérapeutique.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des souris qui présentent un bagage génétique identique et l’ensemble de nos souris mutés le sont pour un gène donné sur un fonds génétique connu. La conséquence est que la variabilité d’individu est réduite, et en conséquence nous avons besoin de moins d’animaux. Nous optimiserons les accouplements en utilisant dès que cela est possible des croisements avec des souris présentant des mutations à l’état homozygote afin de réduire le nombre de souris produites. L’étude ne se fera qu’avec des molécules qui auront été validées in vitro avant tout test sur animaux. Nous utiliserons un suivi d’imagerie longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

En cas de retard de croissance pour les nouveaux-nés génétiquement modifiés, injectés avec des traitements, nous introduirons dans la cage des aliments gélifiés et hyper calorique afin d’augmenter les apports caloriques pour ces petits. Nous raffinerons les mutations en ciblant uniquement les cellules d’intérêt sans affecter les autres cellules de l’organisme. Les souris sont suivies régulièrement afin d’assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point-limite(mise en place d’une grille de score) Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec utilisation d’analgésiques. Nous ajouterons dans la cage post-chirurgie des aliments gélifiés et de petites croquettes dans le fond de la cage afin que la souris n’ait pas à se redresser pour se nourrir et s’hydrater. Les animaux seront suivis trois fois par semaine à quotidiennement. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas d’atteinte d’un point-limite. Nous suivrons le devenir de la tumeur primaire ou des métastases en utilisant régulièrement (en fonction) un pied à coulisse, un appareil photo ou l'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris car il s’agit de l’espèce de choix pour les expériences menées en cancérogénèse et de recherche en thérapeutique du cancer. De plus, la souris est un modèle reconnu pour étudier la robe chez les mammifères. Ce modèle animal nous permet (i) de générer des mutations spécifiques, conditionnelles ou non, dans le lignage mélanocytaire, (ii) de contrôler au mieux le la présence de mutation génétique ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car la variablité entre individus est plus faible. Nouveau-né et adulte, développement de tumeurs chez l’animal adulte @ Nous prendrons des nouveaux-nés lorsque nous les induirons à l’aide d’un agent chimique. L’induction est réalisée à la naissance avant la formation des poils, et les mélanocytes sont sensibles à cet agent chimique. @ Nous suivrons l’apparition des tumeurs au cours du temps chez l’adulte.

L'évaluation de candidats médicaments pour des clients extérieurs est ici vendue comme une prestation. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte des tissus. Elles reçoivent des composés pro-inflammatoires, parfois directement dans l'oreille sous anesthésie, puis des candidats médicaments jusqu'à sept jours de suite, avec une mesure de l'audition sous anesthésie générale de deux heures chaque semaine. Le porteur attend des gonflements articulaires, des boiteries, une altération de l'état général à partir du troisième jour et une perte d'audition moyenne, et qualifie le recours aux animaux non-humains d'"indispensable" faute de méthode validée pour reproduire une inflammation systémique. La prestation est adossée à une thèse financée par un contrat industriel, qui doit aboutir à au moins une publication.

Objectifs

Les maladies auto-immunes touchent environ 4% de la population. Ces maladies se produisent lorsque le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres tissus sains. Parmi ces maladies, la polyarthrite rhumatoïde est particulièrement répandue. Elle provoque principalement une inflammation des articulations, mais peut aussi affecter d'autres parties du corps, y compris l'audition. Des études récentes ont montré que les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde ont un risque plus élevé de souffrir de perte auditive que la population générale. Cette perte d'audition peut toucher jusqu'à 40% des patients, ce qui en fait un problème de santé important mais souvent négligé. L'inflammation générale du corps causée par la polyarthrite rhumatoïde pourrait être responsable de ces problèmes auditifs. Elle pourrait affecter les vaisseaux sanguins et le fonctionnement de l'oreille interne. De plus, certains médicaments utilisés pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent avoir des effets négatifs sur l'audition. Pour mieux comprendre ce lien entre inflammation et perte auditive, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Ces modèles permettent d'étudier comment l'inflammation affecte l'oreille et l'audition. Ils montrent que l'inflammation peut endommager les cellules de l'oreille interne responsables de la perception des sons. Comprendre cette relation entre la polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive pourrait aider à améliorer la qualité de vie des patients. Cela pourrait conduire à de meilleurs traitements et à une prise en charge plus complète de la santé des personnes atteintes de maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant les maladies inflammatoires et la perte auditive. Ces connaissances pourraient guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter efficacement ces troubles, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les impacts sur le système de santé. Une thèse CIFRE vient de débuter afin de mettre au point les 2 premiers modèles décrits dans ce projet et pourra aboutir à au moins 1 publication dans un journal international.

Procédures

L'administration de composés à tester ou de produits de référence suivent les bonnes pratiques vétérinaires et sont des gestes nécessitant quelques dizaines de secondes à moins de 5 minutes. Les composés pro-inflammatoires seront administrés 1 à 3 fois dans l'étude, sur animal anesthésié lorsque l'administration est réalisée directement dans l'oreille (phase de 30 minutes maximum), et sur animal vigile lorsqu'il s'agit des autres voies d'administration. Les candidats médicaments seront administrés tous les jours, au maximum pendant 7 jours, directement dans l'oreille (animal anesthésié, au maximum 30 minutes) ou par voie orale (animal vigile) La mesure de l'audition sera réalisée sous anesthésie générale (2 h) 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables incluent des douleurs, des gonflements des articulations pouvant se traduire par des boiteries, des difficultés locomotrices et une altération de l’état général des animaux à partir du 3ème jour après l’injection et le temps de la durée de l’étude. Une perte d’audition moyenne est attendue.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des différents tissus pour analyse histologique requiert l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complémentaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux. Dans ce but, nous envisageons, en collaboration avec notre partenaire, le développement d’organoïdes lymphoïdes (des modèles in vitro de culture cellulaire complexes) pour approfondir l’étude des mécanismes immunitaires liés au processus d’induction d’auto-immunité. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement de maladies inflammatoires Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer l’inflammation systémique Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction d’une inflammation systémique et ces effets sur la perte auditive, afin de développer à terme, des nouvelles thérapies pour traiter ces pertes d’auditions. Ceci nécessite des modèles expérimentaux dotés d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé pour assurer que les résultats soient statistiquement significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En ce qui concerne les modèles de polyarthrite rhumatoïde, le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrite chez la souris et le degré de variabilité expérimentale liée à la magnitude de la réponse immunitaire. En ce qui concerne les autres modèles inflammatoires, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’études publiées dans la bibliographie et le degré de variabilité expérimentale liée à la réponse immunitaire.

Raffinement

Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique aux rongeurs mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment (gel Diet) sera mis sur le sol des cages après l’administration des composés si nécessaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15 minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet. Le choix de la souche est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer les modèles inflammatoires d’intérêt. Ces souches de souris sont aussi adaptées pour le suivi des mesures de leurs capacités auditives. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte.

3 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, des injections intrapéritonéales et intraveineuses de traitements, puis deux mesures de tumeur par semaine au pied à coulisse. Le porteur annonce une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, l'objectif restant de comprendre comment un type de macrophage récemment décrit participe aux défenses contre le cancer du sein. Sur le remplacement, il affirme que la complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires rend l'expérimentation animale "indispensable", après des modélisations informatiques et des cultures cellulaires menées en amont.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à se défendre. On en trouve en grande quantité dans les tumeurs. Notre équipe a découvert un nouveau type de macrophages dans les cancers du sein. Au début du cancer du sein, ces macrophages aident d'autres cellules de notre système de défense (les lymphocytes) à détruire les cellules cancéreuses. Mais si la tumeur continue de se développer, les macrophages peuvent arrêter de fonctionner correctement, ce qui rend nos défenses moins capable de combattre la tumeur. Nos buts sont : 1. Comprendre comment ces macrophages aident à combattre le cancer. 2. Étudier ce qui les empêche de bien fonctionner.

Bénéfices attendus

Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à combattre le cancer. Les scientifiques les voient comme des cibles importantes pour les traitements contre le cancer. Notre projet vise à comprendre comment ces cellules aident à lutter contre le cancer pour trouver de meilleurs traitements.

Procédures

1- biopsie de la queue (5 secondes/souris). 2- Injection sous-cutanée de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (5 secondes/souris). 3- Injection intrapéritoneale de différents traitements (5 secondes/souris). 4- Injection intraveineuse de différents traitements (5 secondes/souris). 5- Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse 2 fois par semaines (20 secondes/souris)

Impact sur les animaux

- biopsie au niveau de la queue induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - injection intrapéritonéale de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Injection intraveineuse de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Anesthésie générale lors de la greffe de tumeur entraînerant un léger stress de courte durée. - Injection sous-cutanée de tumeurs entraînerant une douleur légère de courte durée. - La croissance des tumeurs entraînerant une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque expériences pour analyser les tissus cancéreux et pour analyser les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à l'issue de leur période reproductive.

Remplacement

La complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires ne peut être modélisée de manière complète in vitro, rendant l’expérimentation animale indispensable. Toutefois, des modélisations informatiques et des cultures cellulaires ont été réalisées en amont afin de limiter autant que possible l’usage d’animaux.

Réduction

Nous utilisons des tests statistiques adaptés pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour mener à bien ce projet tout en assurant des résultats interprétables. Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques sur chaque animal permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences.

Raffinement

Afin de minimiser l'impact des procédures sur le bien-être animal, nous anesthésions les souris dans tous les protocoles incluant des injections susceptibles de causer des douleurs. Nous réalisons une surveillance rapprochée des animaux et nous avons établis des points limites adaptés pour réduire leur souffrance. Des points limites intermédiaires sont aussi mis en place lorsque les animaux présentent des premiers signes de douleur ou de détresse: nous placerons si nécessaire de la nourriture gélifiée dans les cages. Enfin si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour la recherche en immunologie et en thérapeutique du cancer. Sa grande homologie avec l’humain permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes pour étudier un système immunitaire mature et une croissance tumorale adaptée.

Tuées pour le prélèvement de leurs organes, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les atteintes viennent de la lignée elle-même : presque tous les mâles reproducteurs présentent des déformations de la queue, environ 44 % une asymétrie des organes et environ 50 % des malformations cardiaques, que le porteur qualifie de sans impact sur leur physiologie et leur comportement. Aucun acte n'est pratiqué sur l'animal vivant, les embryons et les fœtus étant analysés à des stades successifs pour situer l'origine de ces malformations. Le porteur indique bâtir son projet autour de gastruloïdes cultivés in vitro, et conclut malgré tout que le recours au modèle vivant lui est "indispensable" pour caractériser les défauts anatomiques.

Objectifs

Les anomalies de notre gène d'intérêt sont associées à des anomalies du développement embryonnaire avec une asymétrie des organes. Les souris déficientes pour ce gène présentent des défauts similaires à ceux des patients et dans certains cas des défauts cardiaques particuliers. Le but du projet est de comprendre le role de ce gène au cours du développement cardiaque et particulièrement l’impact de sa perte dans l’apparition des défauts cardiaques. Le premier objectif est d’analyser l’anatomie cardiaque des embryons de souris déficientes dans ce gène afin de caractériser précisément le phénotype clinique. Le second objectif est d’identifier le stade et l’origine de ces malformations au cours du développement cardiaque précoce en analysant (moléculairement, cellulairement et anatomiquement) les embryons de façon temporelle en complément des études qui seront effectuées sur un modèle in vitro.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet d’améliorer nos connaissances sur l’origine physiopathologique des malformations cardiaques liées à la perte de fonction du gène afin de mieux appréhender l’importance de ce gène au cours du développement cardiaque, notamment lors du déploiement des différentes cellules progénitrices cardiaques. A plus long terme, les résultats issus du projet permettront d’améliorer nos connaisances, le diagnostique et la prise en charge des patients atteints de défauts cardiaques.

Procédures

Aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux en dehors de prélèvements d'organes en post mortem.

Impact sur les animaux

Chez les mâles reproducteurs, certains individus présentant des déformations de la queue (presque 100%), une asymétrie des organes (~44%), des malformations cardiaques (~50%) ainsi que variablement des malformations du cerveau sans impact sur la physiologie et le comportement des animaux. La sévérité et l’impact de ces défauts peuvent être variables. Chez les fœtus, nous nous attendons à des phénotypes proches de ceux rencontrés chez les mâles reproducteurs.

Devenir

A l'issue du projet, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Le point central du projet consiste à utiliser le modèle in vitro appelé « gastruloïde » qui mime les premières étapes du développement embryonnaire, afin de répondre au maximum aux questions biologiques à l’échelle moléculaire et cellulaire pouvant être adressées par un modèle simplifié en culture. Les gastruloïdes sont issus de l’aggrégat de cellules souches murines qui seront dérivées de souris controles ou mutantes. Malheureusement, les défauts physiopathologiques et anatomiques ne peuvent pas être modélisés avec les modèles in vitro. D’autant plus que la morphogénèse du cœur est étroitement liée à celles des autres organes et dépend de facteurs physiologiques. Ainsi, l’utilisation de modèle in vivo nous est indispensable pour la caractérisation des défauts et la validation des données qui seront obtenues in vitro.

Réduction

Pour le maintien de la colonie, un nombre minimal de souris mâles sera généré. Dans un but de réduction, ces mêmes mâles serviront à la deuxième procédure afin de générer des embryons qui seront étudiés par une approche séquentielle aux différents stades du développement embryonnaires, avant la naissance.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La structure en charge du bien-être animal (SBEA)sera sollicitée pour des conseils pour limiter ces situations d’hébergement isolé. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). Les individus mâles que nous allons générer pour le projet peuvent présenter des phénotypes connus et plus ou moins dommageables. Nous allons donc procéder à des observations quotidiennes très méticuleuses des animaux dès leur naissance, en utilisant une méthode de scoring pour évaluer les aspects physiques et comportementaux, de façon à identifier le plus tôt possible l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. Seuls les mâles présentant le moins d’effets indésirables et sans aucuns signes de détresse et de souffrance seront maintenus pour le projet.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques Afin de réaliser une analyse précise des défauts nous utiliserons les stades embryonnaires qui correspondent aux stades précoces du développement cardiaque lorsque les premiers progéniteurs sont déployés et lors de la mise en place des axes de symétrie embryonnaire. Les stades plus tardifs seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la progression des malformations cardiaque lors de l’embryogénèse des 4 chambres et des gros vaisseaux. Enfin le stade fœtal sera utilisé afin de caractériser les défauts morphologiques lorsque le cœur est complétement formé. Les mâles reproducteurs seront utilisés comme reproducteurs entre 8 semaines et 8 mois.