Procédures légères

1 105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 625 d'entre elles et modéré pour les 480 autres. Les femelles se voient retirer les ovaires pour mimer la ménopause, reçoivent sous la peau une capsule à libération hormonale prolongée, puis subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline de deux heures chacun avec cinq prélèvements de sang à la queue, plus des injections dans la veine caudale et dans le péritoine. Les chirurgies peuvent provoquer des douleurs, une perte de poids et une mobilité réduite pendant quatre jours en moyenne. Les bénéfices annoncés, un levier thérapeutique contre les symptômes de la ménopause et les effets du travail de nuit, restent au conditionnel, et le porteur conclut qu'aucune stratégie ne permet de remplacer le modèle animal pour ce projet.

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de comprendre le lien et les conséquences physiologiques du dialogue entre la signalisation circadienne médiée par le gène REVERB et la signalisation œstrogénique médiée par le gène ERa. Ainsi ce projet va permettre de 1) Déterminer les mécanismes de ce dialogue et de 2) Définir son impact sur le foie. En effet, de nombreuses études notamment chez l’homme, ont montré un lien potentiel entre la signalisation œstrogénique et les rythmes circadiens. Mieux comprendre les interactions entre ces deux signalisations et leurs rôles physiologiques et pathologiques est un enjeu de santé publique car 1) les rythmes circadiens sont fortement perturbés par le style de vie moderne et pourrait ainsi perturber la santé des femmes (fertilité, ménopause) ; 2) les variations hormonales au cours de la vie des femmes comme au moment de la ménopause pourrait réguler les rythmes circadiens et être responsable de certains symptômes liés à la ménopause. Ainsi, mieux comprendre ces interactions dans un modèle murin pourrait à terme permettre de mieux appréhender certaines situations pathologiques chez la femme. Ce projet pourrait ainsi avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. En effet, l'interaction entre la signalisation oestrogénique et les rythmes circadiens représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions cardiovasculaires et métaboliques ainsi que les symptomes climatériques et le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées et les travailleurs de nuit.

Procédures

- Implantation de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme : 10min 1 fois - Ablation des ovaires mimant la ménopause : 15min 1 fois - Test de tolérance au glucose : 3 prélèvements d’une goutte de sang à la queue toutes les 15min puis 2 prélèvements toutes les 30min. (120min 1 fois) - Test de tolérance à l’insuline : 3 prélèvements d’une goutte de sang à la queue toutes les 15min puis 2 prélèvements toutes les 30min (120 minutes 1 fois) - Injection par la veine caudale (1min 1 fois) - Injection intra-péritonéale (30 secondes 2 fois)

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures de ce projet peuvent induire plusieurs types de dommages au animaux. Premièrement, les chirurgies effectuées peuvent induire des douleurs, une perte de poids et réduire la mobilité des souris pendant 4 jours en moyenne. Deuxièmement, plusieurs nuisances vont également induire un stress : contention pour injection ; pesée hebdomadaire ; mise à jeun. Ces effets indésirables seront monitorés afin de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. De même, les rythmes circadiens font intervenir de nombreux tissus dont l'horloge centrale dans l'hypothalamus intégrant le signal jour/nuit ainsi que la prise alimentaire et la régulation circadienne de nombreuses hormones, tous régulant les rythmes circadiens. Ainsi, l'étude des effets physio(patho)logiques circadiens des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons majoritairement des femelles car ce projet concerne la régulation circadienne de la signalisation œstrogénique et les œstrogènes sont majoritairement présent chez les femelles. Des souris mâles seront utilisés de manière ponctuelle afin de comprendre la sexe-spécificité des mécanismes mis en lumière. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs selon les études statistiques antérieures qui ont montré que des groupes de 10 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale sur des paramètres physiologiques alors que des groupes de 5 animaux sont requis pour les études d'expression génique.

Raffinement

L'étude des rythmes circadiens nécessite de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur rythme circadien car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, dans la limite des places disponibles et minimum deux semaines avant le début des procédures, les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une pièce spécifique en cycle inversé (lumière OFF à 10h du matin et ON à 10h du soir) afin de manipuler les animaux pendant leur phase d'éveil quand la lumière est éteinte. Cette inversion du cycle jour/nuit plus adapté à l'expérimentation sur les animaux nocturnes participera au bien-être animal. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes et des gènes de REVERBs. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 6 semaines.

Rendues obèses par douze semaines de régime hyperlipidique pour la moitié d'entre elles, opérées deux heures trente pour l'implantation d'un dispositif d'enregistrement cérébral, laissées quatre semaines à récupérer, puis soumises à sept tests comportementaux en deux semaines : 2 880 souris vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 384 d'entre elles et modéré pour les 2 496 autres. Deux de ces tests provoquent un stress anxieux que le porteur qualifie d'effet qu'on ne peut ni ne veut réduire. Il annonce des logiciels d'intelligence artificielle pour tirer le maximum de données de chaque animal, sans détailler le calcul qui aboutit à 2 880 souris. Elles sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau.

Objectifs

L’obésité, majoritairement conséquente à la surconsommation d’aliments à haute densité énergétique comme le régime hyperlipidique (HL), est un des défis de santé public les plus sérieux du 21ème siècle. En plus d’être un facteur de risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires, le surpoids et l’obésité affectent les fonctions cérébrales et ont été associés à une haute prévalence de troubles anxieux par rapport à la population générale. L’anxiété amplifiant la menace que représente l’obésité, le besoin d’identifier des interventions thérapeutiques appropriées est imminent. Tout comme chez l’humain, les modèles rongeurs d’obésité induite par régime HL présentent des comportements anxieux accrus. De manière intéressante, l’obésité ainsi que les troubles anxieux sont associés dans les études cliniques à un dysfonctionnement du cortex insulaire (ou insula). Cependant, il n’est pas encore clair si le dysfonctionnement de l’insula pourrait contribuer à l’anxiété induite par l’obésité. Nous proposons donc d’évaluer chez la souris l’impact du régime HL sur la fonction de base de l’insula et au cours de comportements anxieux, et de manipuler l’activité de l’insula afin d’atténuer l’anxiété induite par le régime HL.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet comprennent : 1- Compréhension accrue des mécanismes neurobiologiques : L’obésité ainsi que les troubles anxieux sont associées dans les études cliniques à un dysfonctionnement d’une région cérébrale nommée le cortex insulaire (ou insula). Cependant, il n’est pas encore clair si le dysfonctionnement de l’insula pourrait contribuer à l’anxiété induite par l’obésité. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes sous-jacents afin d’améliorer le diagnostic et le traitement de patients obèses anxieux. 2- Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques : L’obésité est un facteur de risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires et de plus affectent les fonctions cérébrales. L’obésité et le surpoids ont été associés à une haute prévalence de troubles anxieux par rapport à la population générale. Ce projet constitue une étape nécessaire pour un meilleur diagnostique et une meilleure prise en charge des patients souffrants d’obésité et d’anxiété. 3- Amélioration des interventions préventives : Mieux comprendre l'impact d'un régime obésogène sur l'anxiété pourrait aider à développer des stratégies de prévention pour réduire l'anxiété chez les patients obèses. 4- Avancées dans les techniques de recherche : Le projet utilisera des techniques de pointe telles que l’imagerie par photométrie, la chémogénétique, le séquençage à haut débit du transcriptome, l’électrophysiologie ex-vivo ce qui pourrait également contribuer à l'avancement des méthodes de recherche en neurobiologie et en psychiatrie.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis à un régime hyperlipidique à 8 semaines et durant 12 semaines. A l’âge adulte (semaine 9), ils subiront une chirurgie d’un maximum de 2h30 suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La totalité des animaux seront ensuite soumis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour. Deux des tests comportementaux induisent spécifiquement un stress lié à l’anxiété, que l’on ne peut/ne veut réduire.

Impact sur les animaux

Il est important de prendre en compte les potentielles nuisances ou effets indésirables sur les animaux lors de la conduite de ce type de recherche. Certains effets indésirables potentiels sur les animaux pourraient inclure : 1. Faim/soif/malnutrition Les souris soumises à un régime hyperlipidique (HL) développent une obésité, caractérisée par une augmentation significative de la masse corporelle et de la masse adipeuse. Cette modification métabolique peut induire des perturbations de l'homéostasie énergétique, nécessitant une surveillance accrue de leur statut nutritionnel pour éviter les effets délétères associés à la surcharge pondérale. 2. Peur/détresse : Les manipulations peuvent générer une forme de peur ou de détresse chez l'animal, résultant d'une modification de son environnement ou de son interaction avec l'humain. 3. Stress physique/thermique : Les procédures expérimentales elles-mêmes, telles que la manipulation des animaux, les tests comportementaux et les injections de substances, peuvent induire du stress et de la détresse chez les souris de laboratoire. Il est essentiel de concevoir les protocoles expérimentaux de manière à minimiser ces facteurs de stress et à garantir le bien-être des animaux autant que possible. 4. Douleur/lésion/maladie Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. 5. Environnement non adapté/isolement : un isolement après une peut nuire au bien-être de l'animal, entraînant un inconfort physique ou psychologique. Ces effets indésirables doivent être pris en compte et minimisés pour garantir le bien-être des animaux en respectant les principes des 5 libertés.

Devenir

A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement du cerveau.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise uniquement grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous adopterons une approche statistique rigoureuse permettant d'obtenir des résultats fiables avec un minimum d'animaux. Le nombre d'animaux nécessaires a été soigneusement calculé pour garantir la robustesse des résultats tout en limitant leur utilisation. Nous utiliserons également des techniques avancées de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales extraites de nos souris. Des logiciels utilisant l’intelligence artificielle seront employés pour analyser ces comportements et constituer une base de données détaillée. Ces méthodes permettent de tirer le maximum d'informations de chaque animal tout en minimisant leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies en nids de coton afin de limiter le stress dû à l’isolement. La température, l’hygrométrie et le cycle jour/nuit seront régulés dans l’animalerie agréée. Les animaux auront à disposition de la nourriture et de l’eau à volonté. Ils seront surveillés quotidiennement par les animaliers tout au long de leur vie, et bénéficieront d’une surveillance plus particulière par les expérimentateurs en période expérimentale. L’état général des animaux (état du pelage, sociabilité, posture, mobilité, …) sera inspecté. En cas de signe de mal-être, l’animal sera isolé et soigné. Les éventuelles agressions entre congénères seront stoppées par l’isolement de l’agresseur, et la victime sera soignée (désinfection des plaies, aide à la cicatrisation). En l’absence d’amélioration significative de l’état de l’animal, il sera euthanasié dans les 48h. Une médication pré-chirurgicale sera systématique afin d’éviter la souffrance post-opératoire. Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place pour éviter la souffrance tout au long de la vie de l’animal.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Les traitements nutritionnels et l’induction de l’obésité sont faciles à conduire et l’équipe Ferreira dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. De plus, la région cérébrale d’intérêt de notre étude possède la même structure chez la souris que chez l’humain. Notre étude repose sur une procédure unique qui utilise plusieurs techniques génétiques avancées. Pour cela, nous utiliserons différentes lignées transgéniques comme la lignée VGAT afin d’étudier le rôle des interneurones dans l’hyperexcitabilité induite par l’obésité/anxiété ainsi que la lignée 5HT2CR KO afin d’étudier le rôle d’un des récepteurs à la sérotonine. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones et circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées matures. Le régime alimentaire hyperlipidique sera suivi à partir de 8 semaines, et les chirurgies seront réalisées à 16 semaines.

Une perte de poids supérieure à 15 %, un dos voûté, des poils hérissés ou une déshydratation déclenchent la mise à mort. 123 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer l'inflammation de leur colon et de leur intestin. Gavées une fois avec un microbiote humain, sain ou prélevé chez des personnes atteintes de rectocolite hémorragique, elles reçoivent ensuite pendant quatre semaines une alimentation additionnée de microplastiques, une partie recevant en fin d'étude une molécule pro-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant cinq jours. Le porteur attend des signes d'inflammation digestive, une perte de poids et des saignements, et compte extrapoler des données fécales de souris une estimation de l'exposition alimentaire humaine aux microplastiques.

Objectifs

Les humains sont exposés aux Microplastiques (MP) tous les jours. Ces particules (1-5000 μm) sont omniprésentes dans nos aliments, y compris l'eau et les boissons, et l'air. Les MP sont détectés dans les selles humaines de la naissance à l'âge adulte : des études pilotes ont en effet détecté des MP dans le méconium et dans les matières fécales d'adultes sains. Des résultats préliminaires et plusieurs études ont montré que l'ingestion de MP favorise l'inflammation intestinale et le déséquilibre de la flore intestinale chez la souris. La rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie intestinale inflammatoire persistante causée par des facteurs génétiques et environnementaux. Notre hypothèse est que les microplastiques (MP) sont des éléments responsables de la RCH. Les principaux objectifs du projet lié à cette saisine sont : - Évaluer les effets des MP sur l'apparition de l'inflammation (effets sur la réponse immunitaire, la perméabilité intestinale, le microbiote fécal) en tant que déclencheur favorisant la colite sur un modèle de souris colonisées par un microbiote humain sain ou un microbiote issu de patient avec RCH, et qui seront exposées à un régime contenant des MP via l’alimentation. - Etant donné que la fragmentation des MP entraîne la génération de nanoplastiques (NP, d'une taille inférieure à 1 μm), caractériser les MP et des NP dans les matières fécales de souris grâce à des méthodes analytiques. Le modèle de souris à microbiote humanisé à l’avantage d’être plus proche du microbiote humain que les rongeurs conventionnels et donc faciliter l’extrapolation future des résultats de cette étude à l’Homme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet serviront au profit de la santé humaine, afin de mieux comprendre le rôle et l’impact de contaminants environnementaux comme les MP sur l’intestin et le microbiote intestinal. Plus précisément, ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de leur impact sur l'équilibre intestinal notamment dans la rectocolite hémorragique. La caractérisation des MP dans les fèces de souris à microbiote humanisé permettra de comparer les caractéristiques des MP ingérées avec les caractéristiques des MP fécales, et de calculer la proportion de MP ingérées par rapport à celle des MP fécales. En appliquant ce facteur aux données quantifiées dans des échantillons de selles humaines, nous serons en mesure d'estimer les quantités d'exposition alimentaire aux MP dans la population adulte. Ceci est essentiel pour une évaluation précise des risques pour la santé. De plus, les différences que nous identifierons entre les patients atteints de colite ulcéreuse et les sujets sains permettront de mettre en évidence les MP les plus problématiques et donc ceux à bannir en priorité de notre alimentation.

Procédures

Les animaux ne subiront qu’un seul gavage qui ne durera qu’1 min maximum. Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez les souris environ 1 fois par semaine depuis leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude. En fin d'étude, une anesthésie générale (10 minutes) sera réalisée pour prélever du sang (1 prise de sang). Une partie des animaux sera traités en fin d'étude (5 jours) avec une molécule pro-inflammatoire mélangée à l'eau de boisson (pas de gavage) pour s'assurer de l'apparition d'une colite.

Impact sur les animaux

Le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention. En outre une phase d’entrainement sur 3 souris conventionnelles est prévue en amont afin de s’assurer du geste dans les conditions d’un isolateur. Le gavage sera réalisé sur animaux vigiles (durée quelques secondes) et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des microparticules de plastique sera faite via l’alimentation pendant toute la durée du protocole (soit 4 semaines) après inoculation du microbiote (sauf pour les animaux contrôles). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Les animaux avec un microbiote issus de patients atteints de recto-colite et les animaux traités avec la molécule pro-inflammatoire pourront présenter des signes d’inflammation du système digestif, avec potentiellement une perte de poids pendant la durée du traitement et également avoir des saignements. Cependant, la dose administrée et la durée de cette administration sont tout à fait conforme avec ce qui est fait dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal mais que les opérateurs sauront rapidement repérer les symptômes afin de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

En fin de procédure, les animaux sont mis à mort afin de mesurer de nombreux paramètres d'intensité de l'inflammation colique ou intestinale, afin de démontrer l'intensité de la capacité des micro et nanoplastiques à aggraver l'inflammation. Les organes des animaux conventionnels renforceront l'étude comparative.

Remplacement

A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Concernant les polluants environnementaux, malgré le développement de méthodes in vitro de plus en plus intégratives, il reste nécessaire d'évaluer leurs effets in vivo, afin d'intégrer l'ensemble des processus intervenant dans l'effet d'un polluant ingéré et dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, à savoir la digestion, le microbiote, le système immunitaire muqueux et systémique.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par groupe, à savoir 20 souris (10 mâles et 10 femelles) réparties dans 2 groupes, eux-mêmes subdivisés en 3 sous-groupes soit un total de 20 x 2 x 3 = 120 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante en tenant compte de la variabilité des données liés à l’analyse du microbiote, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. L’impact du sexe souvent négligé dans les études sera là bien pris en compte avec une répartition égale entre mâles et femelles. Pour le nombre de souris conventionnelles, il a été réduit au minimum afin de permettre un entrainement sur le geste technique pour l'ensemble des applicateurs impliqués au projet en condition d’isolateur.

Raffinement

Le transport des animaux axéniques se fera grâce à un transporteur agréé assurant la bonne condition des animaux. A l’arrivée dans nos locaux, les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux (mâles/femelles séparés) et trois pour les souris conventionnelles, dans des cages à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à disposition litière de bois, de hamac pour se cacher et grimper, des tunnels suspendus et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 15%, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet. Les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai. En fin de protocole, les animaux recevrons une anesthésie générale gazeuse afin de prélever le sang et suite à la mise à mort, les organes seront prélevés pour permettre des analyses biologiques. Cette mise à mort se fera en dehors de l’isolateur, dans une pièce isolée loin des autres souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix dans l’étude des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le modèle choisi est très largement publié, en raison de sa simplicité d’administration (dans l’alimentation) de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée (pour étudier le processus inflammatoire et de « récupération »). Concernant l’axénie, il s’agit d’un modèle reconnu pour l’étude du microbiote humain. Enfin la 1ere partie de ce projet (qui ne fait pas l’objet de cette saisine) a porté sur des souris conventionnelles (même race), il s’agit donc d’une continuité dans le modèle animal utilisé. Les souris utilisées auront 5 semaines à l’arrivée puis 8 à 9 semaines lors du début du protocole. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte », ce qui correspond aux besoins du projet, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin touchant majoritairement de jeunes adultes.

Issues d'un élevage interne, réparties en sous-groupes de quinze maintenus vivants deux, quatre, six puis huit mois avant d'être tués, 2 164 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue sept jours après la naissance, puis des injections ou des administrations orales deux fois par semaine pendant huit semaines, suivies d'analyses comportementales. L'objectif déclaré est de tester deux classes de molécules sur un modèle de tauopathie exprimant une protéine tau humaine mutée, en vue de premiers dossiers cliniques. Les souris nées du croisement sans le génotype menant à la tauopathie sont réaffectées à l'étude du devenir des molécules dans l'organisme, ce que le porteur présente comme une réduction du nombre d'animaux mis à mort.

Objectifs

Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (= tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, l’efficacité de la thérapie matricielle dans un modèle de tauopathie sera évaluée dans ce projet. De précédents travaux ont déjà montré qu’il était possible de diminuer le développement de la tauopathie en utilisant des mimétiques de certains sucre complexes dans des modèles de tauopathie qui miment certains aspects de la pathologie (modèles cellulaires et de poisson zèbre). Des résultats préliminaires chez la souris, obtenus dans des modèles de tauopathie et dans d’autres modèles de maladie neurodégénératives, ont également permis de montrer la capacité de ces molécules à protéger et régénérer les neurones atteint dans ces pathologies. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans notre modèle souris de tauopathie qui reproduit plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancés…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies auxquelles appartiennent la maladie d'Alzheimer et les démences fronto-temporale. Le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies nécessite d'explorer de nouvelles approches, les anciennes cibles n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de mieux caractériser l'effet de deux nouvelles classes de composés thérapeutiques sur les tauopathies et de définir la localisation cérébrale des meilleurs composés sélectionnés dans les procédures suites à leur administration chez la souris, afin de pouvoir initier les premiers dossiers cliniques.

Procédures

Les animaux subiront une biopsie de la queue 7 jours après leur naissance pour connaitre leur génotype. Les animaux seront pesés et recevrons des traitements deux fois par semaine pendant 8 semaines (injection de solution de molécule ou administration orale de solution de molécule). Ils seront ensuite soumis à la fin des traitements à des analyses comportementales.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont liés à la biopsie de la queue 7 jours après leur naissance, à l’élevage en captivité des animaux, la manipulation répétée des animaux et les injections de composés pendant plusieurs mois : contention pour les changes et les expériences de comportement, injections répétées dans le temps des composés (2 fois / semaines pendant 2 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifiée avec les molécules aux doses utilisés.

Devenir

Les animaux de l’ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.

Remplacement

Réglementairement parlant il n’est pas possible d’aller en clinique (ni même chez le primate non humain) avec uniquement des résultats cellulaires ou in silico. Les modèles de référence pré-clinique pour la tauopathie sont développés dans des espèces rongeur (souris, rat).

Réduction

Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par sous-groupe (n=15) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. L’évolution de la pathologie sera étudiée dans les régions du cerveau touchées dans la maladie d'Alzheimer. Ainsi, chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 15 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2, 4, 6 et 8 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 2 164 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux mis à mort, les animaux générés lors du croisement des lignées parentales ne possédant pas le génotype menant au développement de la tauopathie seront utilisés pour étudier le devenir des molécules chez la souris (concentration des molécules dans les régions touchées dans la maladie après administration de la molécule).

Raffinement

Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : est-ce que son poil est hérissé ? -Sa posture, sa démarche et comportement : est-ce que la souris a le dos voûté ? Léthargie ou réticence à se déplacer ? état défensif ? grattage ou morsure ? -On explore son environnement : absence de toilettage ? redressement sur ses pattes arrière ? diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée ? L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort. En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse. Pour information, les animaux sont utilisés avant l’apparition des phénotypes dommageables (c’est à dire avant l’âge de 8 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifié avec les molécules aux doses maximales utilisées dans le projet.

Choix des espèces

Notre objectif est de valider l’intérêt de la thérapie matricielle dans un modèle mammifère de tauopathie afin de poursuivre le développement de ces molécules jusqu’en clinique. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 8 mois (mise à mort à 2, 4, 6, 8 mois), c'est à dire jusqu'à l'âge ou la tauopathie commence à se développer (2 mois) jusqu'au début de l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris "contrôle" de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Pour les études de pharmacocinétique, nous utiliserons des souris portant un fond génétique proche des souris mutées. Des souris de génotype sauvage générées par le croisement des lignées parentales, seront également utilisées afin de limiter le nombre de souris générées et mises à mort pour l'étude tout en conservant un modèle pertinent. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).

Les souris utilisées portent une mutation du canal sodique cardiaque qui provoque des arythmies ventriculaires et, après quatre semaines, une forte mortalité. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des expérimentations sur cœur isolé. Chacune passe un électrocardiogramme de cinq minutes sous anesthésie à trois semaines, avec pose d'une bague à l'oreille et prélèvement du bout de la queue pour le génotypage. Le porteur présente la mise à mort à quatre semaines comme une mesure éthique, puisque les souris mutées peuvent au-delà mourir subitement d'arythmie ou développer une insuffisance cardiaque, atteintes qu'il déclare par ailleurs dans des procédures de gravité légère à modérée.

Objectifs

Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations du gène codant le canal sodique cardiaque. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG), marqueur d'une anomalie de l'activité électrique cardiaque, est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative, chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de 8 molécules sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients (souris SQTL). Ces molécules ont été sélectionnées in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal sodique cardiaque, en inhibant le courant sodique anormal induit par la mutation, et des canaux sodiques neuronaux, faiblement exprimés dans les cardiomyocytes mais contribuant au déclenchement des arythmies. En parallèle, les effets indésirables cardiaques potentiels des 8 molécules, en particulier sur la conduction électrique, seront déterminés sur des coeurs isolés de souris contrôles provenant des mêmes portées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'identifier un nouveau traitement de prévention des arythmies associées au SQTL de type 3.

Procédures

Au moment du sevrage, à l'âge de 3 semaines, un électrocardiogramme sera enregistré sous anesthésie générale pendant 5 minutes. A la fin de l'enregistrement, toujours sous anesthésie, l'identification des animaux sera réalisée par bagage d'une oreille et le bout de la queue des souris sera prélevé pour réaliser leur génotypage. Ces deux gestes durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

La mutation du canal sodique conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris SQTL qui conduisent, après l'âge de 4 semaines, à une forte mortalité. Les souris SQTL qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) deviennent adultes mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant la protéine déclenchant l'expression de la mutation sur une partie des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Les autres effets indésirables attendus sont le stress induit par la contention et l'anesthésie des souris par isoflurane pour l'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage, puis pour la mise à mort des animaux, ainsi que la douleur associée à la biopsie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour les expérimentations ex vivo.

Remplacement

Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle ex vivo sur coeur isolé perfusé. Seule cette exploration peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant l'activité électrique cardiaque et en prévenant les arythmies, qui ne peuvent être obtenues sur un modèle cellulaire. Les peptides qui seront testés au cours de ce projet ont été sélectionnés pour leurs effets à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.

Réduction

Un maximum de 14 souris STQL par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable, en particulier parce que toutes les souris ne présentent pas d'arythmie spontanée. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 3-4 souris SQTL par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 12 animaux. Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Un maximum de 10 souris contrôles par molécule nous semble suffisant pour tester les effets cardiaques indésirables potentiels, peu probables selon nos études in vitro, des molécules.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage seront réalisés sous anesthésie. La mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, après 4 semaines à une forte mortalité. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant un gène permettant l'expression de la mutation chez environ 25% des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Des points limites ont cependant été définis dans le cas, peu probable, d'une apparition précoce d'insuffisance cardiaque chez les souris SQTL, ainsi que pour les souris contrôles.

Choix des espèces

La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent tôt, avant l'âge adulte, ce qui est observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, les souris mutées peuvent mourir subitement par arythmie cardiaque ou développer une insuffisance cardiaque.

Tuées à la fin des procédures pour l'analyse de marqueurs biologiques et des vérifications anatomiques, 2 314 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une ou deux interventions chirurgicales de quarante minutes à deux heures sous anesthésie, toutes passent des tests attentionnels et cognitifs, certains quotidiens pendant un mois à raison de trente minutes par jour, et certaines apprennent à porter une fibre d'imagerie fixée sur la tête. Le porteur reconnaît qu'une tâche comportementale est désagréable et stressante, qu'une autre suppose un rationnement alimentaire, et que la fibre contraint les mouvements. Il justifie l'ensemble en indiquant que les études cliniques sont difficilement réalisables sur des personnes autistes, en raison de leur fragilité et de leur incapacité à supporter les contraintes de l'imagerie cérébrale.

Objectifs

Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%) entraînant des problèmes importants dans la vie quotidienne, tels que des difficultés à sélectionner les informations sensorielles appropriées. Cela peut conduire à une surcharge cognitive et ou des problèmes de comportement. La coexistence des problèmes attentionnels et de l'autisme est mal comprise. Une meilleure connaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces difficultés pourrait améliorer la prise en charge des personnes concernées en affinant les approches thérapeutiques visant à atténuer ces symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle murin d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.

Procédures

Tous les animaux effectuent les tests comportementaux ayant pour objectif de tester leurs capacités attentionnelles et cognitives. Certaines tests seront réalisés quotidiennement (~30min par jour) pendant 1 mois. D'autres tests seront plus courts (2 séances de 30 min et 15 min sur deux jours). Certains animaux subissent une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie (durée 40 min à 2h). Certaines animaux reçoivent un traitement pharmacologique (non-toxique) sur 1 jour.

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales entrainent un risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids. Une des tâche comportementales est légèrement désagréable et stressante pour l'animal; l'autre necessiterait un rationnement au niveau de la nourriture, qui peut est légèrement stressant pour les animaux. Les animaux seront entraînés à porter une fibre d'imagerie sur leur tête, ce qui peut représenter une contrainte pour le mouvement de l'animal. Le produit injecté pourrait avoir un effet léger sur le comportement de l’animal, sa perception ou son niveau de vigilance ou acrtivité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Le projet se concentre sur l’exploration des changements comportementaux et biologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementales. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro ou in silico. Les études cliniques sont difficilement réalisables en raison de la fragilité de la population concernée et de leur incapacité à supporter les contraintes requises pour l’imagerie cérébrale. De plus, des approches invasives sont nécessaires pour répondre à nos questions scientifiques et ne peuvent pas être réalisées chez une population clinique. Les structures cérébrales ciblées par notre étude sont généralement bien conservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L’utilisation de modèles animaux présentant une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent ni la structure cérébrale ni les capacités comportementales ciblées par les objectifs de notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de manière à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale rigoureuse de notre projet permettra de mettre en place une stratégie de réduction optimale du nombre d’animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Notre étude intègre également plusieurs expériences pilotes, permettant d’évaluer la faisabilité technique de certains aspects du projet ainsi que son raffinement. Les données recueillies seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés, permettant une extraction maximale d’informations et assurant des analyses solides. Notre stratégie expérimentale permet également une analyse précoce des données, étape par étape, dans le but de réduire le nombre d’expériences ou de réévaluer notre approche si cela s’avère pertinent ou possible.

Raffinement

Le bien-être animal est essentiel pour garantir la réussite de notre projet. Nous avons réfléchi à notre projet afin d’intégrer plusieurs mesures de raffinement, notamment : i) Vérification de l’état de l’animal avant et après chaque expérience ou manipulation. ii) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d’une crème ophtalmique et d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle de l’animal ; utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. iii) Application de soins post-opératoires préventifs. iv) Manipulation quotidienne des animaux avant les séances comportementales afin de réduire le niveau de stress. v) Utilisation de techniques de manipulation adaptées pour minimiser le stress lié aux manipulations. vi) Habituation progressive à la salle de comportement. vii) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. viii) Mise en place de mécanismes d’intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de ressources éducatives en bien-être animal et sollicitation d’experts du domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 6 à 8 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.