Procédures légères

Immunodéficientes, donc exposées à une infection par les pathogènes de leur environnement, 213 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une injection intraveineuse sous anesthésie, une injection intrapéritonéale sur animal vigile, une tonte de cinq minutes et quatre séances d'imagerie, pour tester si des nanocargos biomimétiques franchissent la barrière hématoencéphalique. Le porteur signale un inconfort lié à l'inflammation provoquée pour rompre cette barrière. Toutes sont tuées pour prélèvement, sans que l'effectif de 213 soit rattaché à autre chose qu'un logiciel de calcul et une étude pilote qui décidera de la suite.

Objectifs

La barrière hématoencéphalique, qui a la fonction de protéger le cerveau, est un obstacle majeur pour les thérapies des maladies génétiques et infectieuses du système nerveux central. A l’heure actuelle des techniques invasives telles que l’injection de vecteurs viraux directement dans le cerveau sont nécessaires en clinique. Le développement de nouvelles stratégies moins invasives est donc nécessaire. Nous avons développé un système qui permettrait de passer de façon naturelle la barrière hématoencéphalique. En chargeant ce système avec un médicament nous pouvons donc imaginer de pouvoir amener l’agent thérapeutique directement au cerveau en l’injectant directement dans la circulation ce qui rend la méthode moins invasive.

Bénéfices attendus

Proposer une nouvelle approche thérapeutique et non invasive pour traiter les maladies du système nerveux en apportant de façon sûre et efficace le médicament au cerveau.

Procédures

Une injection intraveineuse (moins de 30 secondes), sous anesthésie. Une injection intrapéritonéale (moins de 10 secondes), sur souris vigile. Une tonte du pelage (durée 5 minutes), sur souris anesthésiée. 4 séances d'imagerie (5 minutes maximum), sur souris anesthésiée.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur au site d’injection lors des injections dans la circulation sanguine et en intrapéritonéale. Un inconfort lié à l’inflammation permettant la rupture de la barrière hématoencéphalique peut être ressenti. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Nous souhaitons tester l’efficacité d’un véhicule qui permettrait d’amener un médicament au cerveau une fois injecté dans la circulation sanguine. A l’heure actuelle il n’existe pas de méthodes in vitro permettant de reproduire un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable. Néanmoins la pertinence du choix de notre modèle a été validé par des tests in vitro et l’absence de toxicité du produit a déjà été vérifiée.

Réduction

Dans ce projet nous avons prévu une étude pilote qui permettra d’attester l’efficacité ou non de notre approche. Si les résultats ne sont pas ceux attendus nous n’irons pas plus loin dans ce projet. Le suivi du devenir du véhicule se fera par imagerie non invasive qui permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant un logiciel dédié et un test statistique sera réalisé.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur tout au long du projet.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 7 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.

Placés seuls dans une cage menant à un piège qu'ils déclenchent eux-mêmes, 360 souris et 360 rats sont tués par commotion cérébrale, électrocution ou asphyxie au dioxyde de carbone, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un antidouleur leur est injecté avant le test, précisément parce que le piège peut échouer : mâchoires qui blessent sans tuer, électrisation sans perte de conscience, asphyxie prolongée par échappement trop lent du gaz. Le porteur présente ces essais d'homologation comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, puisqu'ils écartent du marché les pièges les plus lents à faire perdre conscience. Espèces et gabarits sont imposés par la réglementation, souris de 20 à 50 grammes et rats de 200 à 500 grammes, et les animaux non testés parce qu'un piège a été disqualifié sont replacés en élevage.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la régulation des populations de rongeurs sauvages susceptibles d'engendrer des nuisances. La souris domestique, le rat brun et le rat noir sont des rongeurs fréquemment rencontrés dans les milieux urbains et industriels. Bien qu'il n'existe pas d'estimation précise de l'importance de leurs populations, leur prolifération est actuellement une préoccupation mondiale majeure selon l'Organisation Mondiale de la Santé. En effet, leur prolifération incontrôlée peut impacter la production alimentaire, endommager les infrastructures, générer des maladies chez l'Homme et l'animal, et avoir un impact négatif sur la biodiversité. Il existe diverses méthodes pour contrôler ces populations, parmi lesquelles les pièges létaux. Avant leur mise sur le marché, il est demandé de contrôler l'efficacité de ces pièges et leurs impacts sur le bien-être des animaux. Pour cela, une homologation est imposée dans de nombreux pays européens, dont la France. Cette homologation repose sur l'étude scientifique de l'efficacité du piège et du caractère éthique de la mise à mort de l'animal, garantissant ainsi la commercialisation de pièges limitant l'impact sur le bien-être des animaux. Différentes études scientifiques concluent que l’utilisation adéquate de bons pièges est la méthode ayant l’impact le plus faible sur le bien-être animal, comparée à d’autres méthodes comme l’utilisation de poison. Ce projet décrit une méthode permettant de juger si les pièges testés permettent une mise à mort tolérable et acceptable des rongeurs, essentiellement basée sur des critères de rapidité.

Bénéfices attendus

Selon les experts, la mise sur le marché de pièges limitant l'impact négatif sur le bien-être lors de la mise à mort est un avancement d'un point de vue déontologique et éthique. Le bénéfice est de permettre la sélection des pièges les plus satisfaisants d'un point de vue éthique (mise à mort limitant l'impact sur l'animal) et d'écarter les pièges éthiquement inacceptables. Pour les espèces cibles, le bénéfice attendu est la non-homologation de pièges pouvant entraîner des souffrances inutiles. Cette même non-homologation permet à l'utilisateur final d'éviter l'achat de pièges inutiles, ce qui a des conséquences économiques et environnementales (achats, production, gaspillage...). L'utilisation de pièges est considérée comme engendrant moins de souffrances que l'utilisation de poison, qui est la méthode la plus courante de lutte contre les surpopulation de rongeurs . De plus, ces poisons peuvent mener à des empoisonnements secondaires (prédateurs et charognards des rongeurs...) et même à une contamination de l'environnement (contamination de l'eau des égouts). Ainsi, l'homologation officielle des pièges permet aux utilisateurs d'accepter plus facilement l'utilisation de pièges, qui sont en définitive plus éthiques que les poisons, eux-mêmes plus impactants pour l'environnement.

Procédures

Un antidouleur est administré préventivement aux animaux avant le test et le test est réalisé lorsque le pic d’efficacité de l’antidouleur est atteint. Ce type d’antidouleur est préconisé pour le contrôle des douleurs intenses. Il est injecté en sous-cutané. Les animaux sont placés individuellement dans une cage menant à un piège létal. L'animal entre librement dans le piège et le déclenche. Suivant le type de piège, celui-ci engendre une commotion cérébrale ou une électrocution ou une asphyxie au gaz carbonique. Dans les 3 cas, la perte de conscience est très rapide et même immédiate pour la commotion cérébrale et l'électrocution. La mise à mort par asphyxie au dioxyde de carbone entraine une perte de conscience après une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Les pièges ont un taux de réussite, impliquant un taux d'échec. Ce critère permet de disqualifier un piège et d'empêcher sa mise sur le marché. Un taux d'échec de 20 % entraîne l’arrêt immédiat du test, même si les 12 animaux dédiés à la procédure n'ont pas été testé. La nuisance majeure est la suivante : le délai entre le déclenchement du piège et la perte de conscience irréversible dépasse les critères d’homologation en termes de temps. Si ce délai dépasse une certaine limite de temps alors l'animal est mis à mort rapidement par un système automatisé d'asphyxie au dioxyde de carbone. D'autres nuisances peuvent être occasionnées et dépendront du type de piège. Les événements suivants peuvent être envisagés: Pour un piège à mâchoires : l’animal peut être blessé sans mortalité, ce qui peut entraîner des nuisances sévères. Pour un piège électrique : l’animal peut être électrisé avec ou sans perte de conscience. Pour un piège au dioxyde de carbone : l’animal peut subir des nuisances dues à un effet irritant du gaz ou à une asphyxie prolongée due à un échappement trop lent du gaz. Dans tous les cas, le test est interrompu et l'animal est immédiatement mis à mort à l'aide d'un appareil automatisé spécifique. Il est important de noter que l’ensemble des nuisances potentielles est lié à l’objectif du piège, qui est la mise à mort de l’animal. Le critère principal de ces procédures est la durée avant la perte irréversible de conscience. Ce critère est encadré par une notion de temps à ne pas dépasser. Ainsi, quelle que soit la nuisance engendrée par le piège, la durée de cette nuisance sera encadrée en terme de temps et sera la plus réduite possible.

Devenir

Lorsque le piège fonctionne comme souhaité, l'animal perd conscience rapidement et sa mise à mort est rapide alors la mise à mort est considéré éthique. Si le piège ne fonctionne pas de manière optimale et que la perte de conscience n'est pas irréversible ou en dehors des délais fixés alors l'animal est mis à mort à l'aide d'un appareil de laboratoire permettant une mise à mort automatisé. Lorsque que le piège échoue à démontrer son efficacité, alors il est possible qu'une partie des animaux dédié à l'étude du piège ne soient pas testé. Alors ces animaux sont replacés en élevage.

Remplacement

L’homologation des pièges prévoit l’utilisation d’animaux car le jugement de l’efficacité dépend en grande partie du comportement animal mais aussi de l’emploi d’un système biologique complexe qui n’est pour le moment pas remplaçable. L’homologation la plus stricte, la législation Suédoise, impose l’utilisation d’animaux, qui est actuellement le seul modèle pour juger concrètement de la bonne efficacité du piège. De plus la réglementation impose que ces produits soient testés sur les espèces cibles, c’est à dire rats et souris. Il y a donc une obligation réglementaire empêchant ce remplacement par d'autre espèces animales. La stratégie de remplacement n’est pour le moment pas réalisable.

Réduction

Une procédure consiste à placer des pièges inactifs dans l'environnement des rongeurs afin de s'assurer que les animaux fréquentent les pièges sans gêne. Cette procédure de « fréquentation du piège » n’entraîne ni mortalité ni contraintes, donc les animaux utilisés ne sont pas mis à mort en fin de procédure. Ils peuvent ainsi être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Comme préconisé par les guides de référence et la législation, chaque test de piège utilise un nombre réduit d’animaux, avec un maximum de 12. Lors du test avec le piège actif, dès que trois répétitions du test échouent, la procédure expérimentale est annulée pour ce piège, quel que soit le nombre total d’animaux testés. Les animaux restants ne sont pas utilisés pour ce piège et sont replacés en élevage.

Raffinement

Avant d’être testés dans cette procédure, les pièges à l’étude ont subi de nombreux tests préliminaires sans animaux (forces de déclenchement, données électriques, concentration en gaz, prototypes, vérification du déclenchement, etc.). Ces tests permettent d'optimiser le fonctionnement et la conception du piège afin qu'il agisse le plus efficacement possible et facilite le passage des animaux sans contraintes ni blessures. L’objectif est d'obtenir un taux de fréquentation élevé et une mise à mort rapide et acceptable. L’une des procédures consiste à vérifier le taux de fréquentation de pièges désactivés. Si le piège n’est pas suffisamment fréquenté, il ne sera pas testé en version armée. Ces procédures expérimentales permettent de vérifier si les pièges testés sont éthiquement valides en permettant une perte de conscience rapide de l’animal. Un antidouleur est administré préventivement aux animaux, dans le cas où le piège testé ne permettrait pas cette perte de conscience rapide.

Choix des espèces

La législation Française impose la constitution d’un dossier nécessitant des tests scientifiques avec des animaux et qui doivent être les animaux ciblés par l’utilisation finale. La législation suédoise, considérée comme la référence Européenne en la matière car plus strict, demande l’utilisation des animaux cibles. Les procédures expérimentales nécessitent d’observer un comportement animal, il est nécessaire d’avoir ce modèle pour s’assurer de s’approcher le plus possible du comportement des animaux sauvages. Pour les mêmes raisons, les tailles et dimensions des animaux sont adaptés à la mise à mort de l’animal et au type de piège. Aussi , les espèces utilisées sont les espèces ciblées par ces pièges, la souris domestique, le rat brun et le rat noir. Les guides de bonnes pratiques suggèrent d’utiliser un mélange d’animaux en fonction de la masse : Pour les souris : 50% de souris pesant entre 20 et 30 g soit de jeunes adultes 50% de souris pesant entre 30 et 50 g soit des souris âgées de plusieurs mois Pour les rats : 50% de rats pesant environ 200 g soit des rats adultes de 2 à 3 mois 50% de rats pesant entre 450 et 500 g soit des rats adultes de grande taille L’obtention d’individus de tailles aussi marqué est parfois difficile, la sélection des individus sera réalisé au mieux et l’utilisation des animaux pourra être repoussée afin de permettre la prise de poids .

Prise de sang sur animal vigile maintenu en contention deux minutes, puis anesthésie par injection pour la moitié d'entre elles : 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris portent une modification génétique reproduisant les dépôts cérébraux observés dans la maladie d'Alzheimer, et arrivent par cohortes de trois, six et neuf mois d'âge pour suivre la progression des lésions. Le porteur affirme que la pathologie n'est modélisable que dans un "organisme complet" et que seule une approche sur un mammifère fournira ces premières données. Les atteintes décrites se limitent au stress de contention et à la douleur de la piqûre, sans un mot sur ce que la neurodégénérescence elle-même inflige aux animaux pendant qu'elle s'installe.

Objectifs

Cette étude s'inscrit dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, une pathologie qui se caractérise par l'apparition de dépôts anormaux dans le cerveau, perturbant le fonctionnement des neurones et entraînant des troubles de la mémoire et du raisonnement. Les mécanismes exacts à l'origine de ces dépôts restent encore mal compris, bien que leur accumulation soit considérée comme un élément clé du développement de la maladie. Pour mieux les étudier, nous utilisons un modèle de souris spécialement conçu pour reproduire certains aspects de cette pathologie. Grâce à ce modèle, nous pourrons analyser en détail l’évolution de ces anomalies cérébrales et mieux comprendre leur impact sur le fonctionnement du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre comment et pourquoi ces dépôts anormaux se forment dans le cerveau et quel impact ils ont sur la destruction progressive des neurones. Grâce à l’utilisation de notre modèle de souris, nous pourrons aussi mieux distinguer le rôle de ces dépôts de celui de l’inflammation, un facteur souvent impliqué dans la maladie. Enfin, les connaissances acquises pourraient aider à mettre au point de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir l’accumulation de ces dépôts et ainsi ouvrir la voie à de futurs traitements.

Procédures

Les animaux seront soumis à une prise de sang sur animal vigile par contension (2 minutes maximum par animal). La moitié des animaux seront anesthésiés par une injection médicamenteuse (1 minute maximum par animal).

Impact sur les animaux

La contension peut induire un leger stress et la prise de sang une légère douleur au niveau de l'aiguille. L'injection de l'anesthésique peut induire une leger stress et une légère douleur au point d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de la procédure afin de collecter et d'analyser différents organes.

Remplacement

Cette étude vise non seulement à approfondir nos connaissances sur la maladie d'Alzheimer, mais aussi à ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre cette pathologie. Celles-ci n'est modélisable que dans un organisme complet, à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques. Par ailleurs, seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Un effectif de 6 animaux par sexe et par condition a été choisi pour visualiser un effet statistiquement significatif et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adaptés

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, permettant une meilleure transposition des résultats vers des applications cliniques. Nous allons recevoir 3 cohortes de 3 âges différents : 3 mois, 6 mois et 9 mois dans le but de suivre la mise en place de la maladie sans laisser les animaux atteindre un stade critique.

Gavées jusqu'à quinze fois un jour sur deux, saignées seize fois par la queue, entraînées sur tapis roulant cinq fois trente minutes par semaine pendant six semaines, les souris subissent aussi la pose d'une pompe osmotique sous la peau, des tests de force et un isolement de 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. 1 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent blesser l'œsophage et réduire la prise alimentaire, que la pompe provoque des douleurs plusieurs jours, que la course cause des blessures aux pattes et qu'une des molécules injectées est toxique pour les cellules du pancréas, avec crampes abdominales. Toutes sont tuées et nécropsiées en fin de procédure, sans qu'aucune soit réutilisée, l'objet étant le rôle d'une protéine dans le diabète de type 2 et la fonte musculaire.

Objectifs

L'obésité est un facteur de risque majeur de diabète de type 2 (DT2) qui représente un fardeau de santé publique et diminue l’espérance de vie en bonne santé. Ces deux pathologies sont également associées à une insulino-résistance et une sarcopénie, i.e. perte progressive de masse et de force musculaire. Nous avons mis en évidence une surexpression marquée d’une protéine d’intérêt. Cette protéine peut s’hétérodimériser avec une autre protéine de la même famille pour former un complexe multi-protéique. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’inflammation et l’immunité. Cependant leur rôle dans la pathogenèse du DT2 reste incertain. Nous émettons l’hypothèse que cette protéine pourrait jouer un rôle causal dans les altérations métaboliques et fonctionnelles du muscle squelettique dans un contexte d’obésité et de vieillissement. L’objectif de ce projet est de : 1) démontrer un rôle causal de notre protéine d’intérêt dans le développement de l’insulino-résistance et de la sarcopénie ; 2) évaluer si l’inhibition de l’action de cette protéine prévient au moins en partie du développement de l’insulino-résistance et/ou de la sarcopénie associée à l’obésité et à l’âge. Ces questions exigent le recours au modèle animal pour se placer dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet visant à étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie promet de générer des bénéfices substantiels tant au niveau scientifique que clinique. En premier lieu, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ces pathologies métaboliques et musculaires, en étudiant spécifiquement le rôle de notre protéine d’intérêt. Une connaissance plus détaillée de l'implication de cette protéine pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, offrant ainsi des perspectives innovantes pour le développement de traitements spécifiques et efficaces. Sur le plan clinique, l'identification de la protéine comme un biomarqueur clé dans l'inflammation chronique associée à l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie pourrait améliorer le diagnostic précoce et la stratification des patients. Les praticiens pourraient ainsi mieux évaluer le risque de complications métaboliques et musculaires chez les patients obèses et ceux présentant une résistance à l'insuline, permettant une intervention préventive plus rapide et personnalisée. De plus, cibler cette protéine dans des approches thérapeutiques pourrait offrir une nouvelle avenue pour réduire l'inflammation et améliorer la sensibilité à l'insuline, atténuant ainsi les effets délétères de ces conditions sur la santé des patients. L'impact potentiel sur la gestion de la sarcopénie est également significatif. En étudiant les mécanismes par lesquels notre protéine d’intérêt contribue à la perte de masse musculaire et à la dysfonction métabolique, ce projet pourrait mener à des stratégies visant à préserver la masse et la fonction musculaire chez les personnes âgées et les patients atteints de maladies chroniques. Cela pourrait améliorer considérablement la qualité de vie et l'autonomie des individus affectés, tout en réduisant les coûts de santé associés aux complications liées à la sarcopénie. En somme, ce projet offre une opportunité de faire progresser notre compréhension des maladies chroniques liées à l'obésité et au vieillissement, tout en ouvrant la voie à des interventions thérapeutiques novatrices et personnalisées pour améliorer la santé et le bien-être des patients.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 15 gavages (1 jour sur 2) et/ou à 7 injections sur 5 jours consécutifs seulement ainsi que 16 prélèvements sanguins à la queue (4 séquences de 7 prélèvements consécutifs). Tous les actes précédemment cités ne durent qu’au maximum 30 secondes chacun. Certains animaux auront une injection unique sous anesthésie générale. D’autres animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale une fois au cours de leur vie pour la pose de mini-pompe osmotique. Certains animaux auront une alimentation enrichie en lipides pendant un maximum de 12 semainesou encore deux tests d’effort et de préhension au maximum. Un nombre limité d’animaux sera entrainé sur tapis roulant 5 fois 30 minutes maximum par semaine pendant 6 semaines consécutives. Certains animaux subiront au maximum deux isolements de 3 minutes pour mesures de composition corporelle et d’autres subiront un isolement pour mesure de dépense énergétique pendant un maximum de 48h. Dans le second établissement utilisateur, un nombre restreint d’animaux subira une injection de traceur radioactif pendant 15 minutes avant mise à mort et l’ensemble des animaux seront mis à mort et nécropsiés.

Impact sur les animaux

Le régime hyperlipidique induit une obésité chez les animaux pouvant créer un inconfort. Le gavage répété peut causer du stress et des blessures oesophagiennes (entrainant une diminution de la prise alimentaire) abolis après arrêt des gavages. La pose d’une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie gazeuse peut provoquer des douleurs quelques jours après l’opération. La surexpression de notre protéine peut entraîner une inflammation associée à l’obésité et engendrer l'aggravation de l'insulino-résistance ainsi qu’une diminution des fonctions musculaires. Les prélèvements répétés de sang lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer du stress et des douleurs légères pendant 120 minutes au maximum. Les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant 2 à 3 minutes seulement. Les tests de force provoquent un stress pendant 120 minutes au maximum. La course provoque un stress pendant 120 minutes au maximum et peut provoquer des blessures légères aux pattes. La mesure de calorimétrie provoque un stress dû à l’isolement visuel et olfactif pendant 48h au maximum. Le transfert adoptif de cellules immunitaires peut provoquer une inflammation de bas grade. L’injection de certaines molécules est cytotoxique pour les cellules pancréatiques et peut engendrer des crampes abdominales.

Devenir

L’ensemble des animaux sont mis à mort de manière réglementaire en fin de procédure et sont nécropsiés pour récolte d’organes et analyses ex vivo. Aucun animal de ce projet ne sera ré-utilisé.

Remplacement

Nous avons effectué des travaux préliminaires sur des modèles in vitro de myotubes humains montrant des effets de notre protéine d’intérêt sur la sensibilité à l’insuline et l’atrophie des myotubes. Le recours au modèle animal est indispensable pour évaluer les effets de cette protéine dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.

Réduction

Des études in vitro sont réalisées en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur les animaux. Des études pilotes permettront d'ajuster le protocole expérimental pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans les études principales ; ces études pilotes permettront aussi de s’assurer de la fiabilité du modèle. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats significatifs sont effectués.

Raffinement

Les animaux auront une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le responsable de la mise en oeuvre sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Lors des actes chirurgicaux ou injections douloureuses des anesthésies gazeuses sont prévues avec utilisation d’antalgiques en périopératoire. Lors des injections de produits provoquant des douleurs nous administrerons des antalgiques en amont. Pour les tests d’exercices physiques les animaux seront préalablement acclimatés et surveillés afin de détecter d’éventuelles blessures aux pattes. Pour les manipulations nécessitant l’isolement des animaux pendant 48 heures maximum, une surveillance accrue sera appliquée lors de leur retour en groupe afin de détecter des comportements agressifs. Nous pourrons alors ajouter des enrichissements dans les cages voire séparer les individus trop agressifs. Pour les animaux spontanément diabétiques nous réaliserons un change de litière plus fréquent et des contrôles de la glycémie. Pour l’expérimentation terminale dans l’établissement n°2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles de souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies métaboliques. Le modèle de souris choisi se prête bien aux phénotypage métabolique en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes moléculaires des maladies et de sa bonne susceptibilité aux régimes obésogènes. De plus, l’utilisation de souris spontanément obèses et diabétiques et leurs contrôles non-diabétique permettent une étude plus fine des mécanismes moléculaires. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 8 semaines. L’intérêt est ici d’étudier l’obésité, son développement et ses complications chez l’individu adulte.

Pour tester des médicaments radioactifs censés à la fois repérer et détruire des tumeurs, 1 536 souris et 256 rats reçoivent deux injections de cellules cancéreuses, puis jusqu'à quatre injections de traceurs ou de traitements. Tous vont être tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, leurs organes étant prélevés pour vérifier au microscope ce que l'imagerie a montré. Ils passent jusqu'à huit sessions d'imagerie sous anesthésie, de 15 à 70 minutes chacune, subissent des prélèvements sanguins et parfois une ablation chirurgicale de la tumeur de vingt minutes, avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie associées. Le protocole se déroule sur deux sites, ce qui impose à ces animaux porteurs de tumeurs un transport d'une heure au maximum, suivi d'une journée de récupération.

Objectifs

Aujourd'hui, de nombreuses résistances aux traitements conventionnels contre le cancer surviennent. La radiothérapie interne, qui utilise un atome radioactive pour cibler et détruire les cellules tumorales, a récemment montré des résultats impressionnants pour certains types de cancers, comme ceux de la prostate et les cancers neuroendocriniens. Néanmoins, cette nouvelle voie prometteuse est limitée par des phénomènes de résistances et l’apparition d’effets secondaires. Ces défis justifient l'exploration de nouvelles générations de médicaments radiomarqués plus attractifs, capables d’être utilisés en thérapie mais aussi en diagnostic. En combinant ces deux aspects , le radiopharmaceutique a ainsi le potentiel pour : - améliorer le ciblage des cellules tumorales et ainsi limiter les effets indésirables ; - suivre en temps réel les effets de la thérapie pour l’ajuster et ainsi diminuer les phénomènes de résistance . Notre projet vise à développer une nouvelle génération de médicaments radiomarqués qui se lieront spécifiquement à des marqueurs tumoraux via des ligands à base d’anticorps et de peptides. Nous testerons nos ligands sur des modèles tumoraux chez des rongeurs. Nous tirerons partie de l’utilisation combinée de plusieurs types d’imagerie pour affiner la sélection des ligands les plus intéressants pour cette stratégie. Nous souhaitons également étudier l’effet de la combinaison de notre approche de radiothérapie interne avec d’autres modalités thérapeutiques susceptibles de renforcer son action et/ou de minimiser les effets secondaires. Ainsi, nous combinerons l’utilisation de nos radioligands à : - des ultrasons thérapeutiques, permettant de minimiser les effets indésirables sur les tissus sains ; - des nanoparticules radioamplificatrices, pour augmenter l'efficacité de la radiothérapie, tout en minimisant les effets secondaires ; - des immunostimulateurs, pour renforcer la réponse immunitaire contre les tumeurs ; - de la chirurgie, afin de retirer un maximum de tissus tumoraux et d’éliminer les cellules tumorales infiltrantes ne pouvant difficilement être réséquées. Le projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la radiothérapie interne (Site Imagerie) et l’imagerie et un site pour la radiothérapie externe (site IR).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant des biomarqueurs prédictifs de l’efficacité des traitements, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés avec des thérapies comme l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (qui bloquent des mécanismes spécifiques des tumeurs), seuls certains patients en bénéficient pleinement. Plusieurs facteurs influencent l’efficacité des traitements, notamment le type de tumeur, le stade de la maladie, le système immunitaire du patient et des facteurs génétiques. Pour traiter efficacement le plus grand nombre de patients, il est crucial de les regrouper en sous-groupes homogènes afin de prédire quelle thérapie leur conviendra le mieux. Cette stratification améliorée des patients repose sur l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la détection de ces biomarqueurs se fait principalement par des techniques invasives comme l’immunohistochimie sur des biopsies. L’imagerie offre une alternative moins invasive, permettant une évaluation dynamique et quantitative à l'échelle du corps entier. L'objectif de notre projet est de valider des couples biomarqueurs-radioligands (basés sur des anticorps ou des peptides) pour l’imagerie. Cette approche vise à prédire l’efficacité thérapeutique et de proposer un traitement adapté, fournissant ainsi aux oncologues un outil complémentaire aux biopsies pour personnaliser davantage les traitements. Ainsi, ce projet aspire à offrir un outil décisionnel puissant. Cela permettra une meilleure personnalisation des traitements en fonction des caractéristiques spécifiques de chaque patient, améliorant ainsi les résultats et la qualité de vie des patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place d'un modèle tumoral dans ce projet est essentielle pour reproduire les caractéristiques de la maladie et évaluer l'efficacité des nouveaux traitements dans un environnement contrôlé. Pour la mise en place de ce modèle tumoral, des cellules tumorales seront injectées (5 minutes d’intervention, deux injections par animaux). (Site Imagerie) o L’injection des traitements et d’agents d’imagerie radioactifs (pour l’imagerie ), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 4). (Site Imagerie) o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries et de l’application des traitements (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie au cours de l’étude pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). (Site Imagerie et site IR) o Un prélèvement sanguin sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie). (Site Imagerie) o La chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésiant (maximum 20 minutes de chirurgie). (Site Imagerie)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Le développement de la tumeur peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. • L’injection des radioligands ou de médicaments peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Lors du réveil en fin de session d’imagerie, les souris peuvent être désorientées et stressées. • Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines et sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature. • La résection tumorale peut induire une inflammation.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci. Cela permet tout d'abord de valider, à un niveau microscopique, des éléments observés par imagerie à une échelle plus large, tout en approfondissant notre compréhension des mécanismes impliqués, notamment le rôle du système immunitaire et l'identification de différentes populations cellulaires, dont certaines ne peuvent pas être visualisées par imagerie.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires 3D impliquant les lignées testées ensuite comme modèle tumoral chez l’animal afin de déterminer la pertinence des stratégies thérapeutiques et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro permettent d’éviter l’utilisation d’animaux en validant des paramètres qui ne seront plus nécessaires de valider dans le modèle animal. Cependant, le microenvironnement tumoral global avec la complexité immunitaire est difficilement reproductible in vitro et la pharmacocinétique des traitements injectés ne peut être déterminée qu’in vivo.

Réduction

Différentes utilisations de systèmes d’imagerie seront mises en place pour réduire de manière conséquente le nombre d’animaux nécessaires pour l’évaluation thérapeutique en suivant de manière individuelle des paramètres cliniques tels que la taille de la tumeur, l’apparition de métastases mais également l’apparition d’inflammation telle que les colites. Les données obtenues permettront de manière individuelle de définir une biodistribution des biomarqueurs dans une continuité temporelle. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte nos résultats préliminaires et des données publiées concernant l’efficacité thérapeutique attendue (écarts-types et variations observés).

Raffinement

Les injections de cellules tumorales et de produits d’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Leur suivi régulier assurera de mettre en place des réponses adaptées devant tout signe de souffrance. Des points limites ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance. Le suivi régulier du poids des animaux favorise leurs interactions régulières avec le personnel et limite ainsi le stress durant les sessions d’imagerie. Pour le transport des animaux entre les deux sites, d’une durée maximale d’une heure, il sera réalisé suite à l’accord vétérinaire donné en fonction des statuts sanitaires et réalisé dans des cages de transport avec de l’eau en gelée et la nourriture en gelée dans un véhicule climatisé. Une journée de récupération entre chaque lieu de transport est prévue.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des animaux de choix pour la mise en place de modèles tumoraux, pour les lignées cellulaires tumorales qui sont utilisées dans ce projet. Leur taille est adaptée pour la manipulation et l’imagerie de tout le corps. Les études seront menées soit sur des rongeurs immunodéficients afin d’évaluer l’impact du traitement sur des cellules humaines, soit sur des modèles de rongeurs immunocompétents pour analyser son effet sur des cellules tumorales de rongeurs dans un contexte immunitaire préservé. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade de jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines), une tranche d’âge représentative des cancers chez les patients adultes. Cela nous permettra de mieux simuler les conditions cliniques et de développer des thérapies qui pourront être rapidement appliquées en clinique pour offrir de meilleures options de soins aux patients.

Porteuses par construction du syndrome de Noonan, ces souris présentent un retard de croissance, des dysmorphies du crâne, des troubles cardiaques et une survie limitée à une dizaine de mois. 4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une biopsie de l'oreille à huit jours permet le génotypage, puis viennent deux injections par semaine à partir de six semaines, un prélèvement sanguin et vingt minutes de mesure de pression artérielle toutes les quatre semaines, et quatre échographies cardiaques sous anesthésie. Une perte de plus de 20 % du poids maximal ou une diarrhée de plus de quatre jours déclenche la mise à mort, la douleur étant évaluée sur une grille d'expressions faciales.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité de recherches précédentes portant sur des approches innovantes pour traiter certaines maladies génétiques rares. Le syndrome de Noonan est une maladie héréditaire qui se manifeste dès la naissance par des traits du visage particuliers, une petite taille, des malformations cardiaques et un retard du développement. Il existe une forme apparentée de ce syndrome, caractérisée par des taches pigmentaires sur la peau et un épaississement du muscle cardiaque. Ces maladies sont liées à des anomalies du fonctionnement cellulaire, qui perturbent la croissance et le développement de l’organisme. À ce jour, il n'existe pas de traitement spécifique pour ces troubles. Nous souhaitons explorer une piste thérapeutique originale fondée sur la stimulation des mécanismes naturels de protection et de renouvellement des cellules. Ces mécanismes permettent notamment de préserver l’équilibre interne des cellules et de limiter les effets du vieillissement prématuré ou des défauts liés à la maladie. Le but de notre projet est de tester, dans un modèle animal adapté, si l’activation de ces processus naturels permet de réduire les signes cliniques associés à la maladie. Pour cela, nous utiliserons différentes méthodes, comme l’administration de substances actives ou la stimulation des défenses internes, et nous observerons leur effet sur la croissance, le fonctionnement du cœur et l’état général des animaux. À terme, ce projet pourrait déboucher sur de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par ce syndrome.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de valider, dans plusieurs modèles précliniques, une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant les mécanismes moléculaires du syndrome de Noonan (SN) et de ses variantes. Le syndrome de Noonan, une maladie génétique autosomique dominante, touche environ 1 naissance sur 1 000 à 2 500 et se caractérise par des malformations cardiaques, un retard de croissance, des anomalies crâniofaciales et des complications hématologiques et lymphatiques. Une thérapie capable de corriger ces altérations pourrait améliorer la qualité de vie des patients, prolonger leur espérance de vie et réduire les complications graves associées à cette pathologie. En validant cette approche, ce projet pourrait non seulement transformer la prise en charge des patients atteints de SN, mais aussi ouvrir des perspectives pour le traitement d’autres pathologies similaires.

Procédures

Les souris seront tout d'abord soumises à une biopsie de l’oreille réalisée à l’âge de huit jours, en conditions stériles, pour permettre leur génotypage. Cette intervention rapide durera quelques secondes par animal vigile. À partir de l’âge de six semaines, les animaux recevront des injections sur animal vigile deux fois par semaine. Chaque injection durera environ cinq secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés toutes les quatre semaines sur animal vigile, sous contention manuelle brève. Chaque prélèvement durera environ dix secondes. Les animaux vigiles seront également soumis à des mesures de la pression artérielle toutes les quatre semaines, à l’aide d’un système non invasif utilisant un brassard de queue. Chaque session de mesure durera environ vingt minutes par animal. Enfin, 4 échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie légère générale afin d’évaluer la morphologie et la fonction cardiaque. Chaque séance d’échographie durera environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’élevage, les animaux seront soumis à une biopsie de l’oreille à l’âge de 8 jours dans le cadre du génotypage. Cette procédure, bien que brève, peut provoquer une douleur transitoire ainsi qu’un stress modéré lié à la contention. Les animaux transgéniques porteurs d’un syndrome de Noonan présentent un phénotype clinique progressif, qui peut entraîner un certain inconfort au fil du temps, notamment des anomalies de croissance, des troubles cardiaques et une altération de l’état général. Ces animaux restent globalement en bonne santé jusqu’à 10 mois. À partir de l’âge de 6 semaines, les souris sont soumises à différentes manipulations expérimentales répétées, susceptibles d’occasionner du stress ou une douleur transitoire. Les injections intrapéritonéales bihebdomadaires peuvent induire une douleur brève au point d’injection. Les prélèvements sanguins réalisés sur animal vigile sont générateurs de stress, avec un risque modéré d’hématome ou d’inflammation locale. Les mesures de pression artérielle, bien que non invasives, nécessitent une contention prolongée dans un environnement spécifique, ce qui peut engendrer un stress. Enfin, les échocardiographies réalisées sous anesthésie légère exposent les animaux à un inconfort temporaire lié à la contention, à la tonte et à la procédure elle-même.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Les études in vivo chez la souris sont indispensables pour étudier les mécanismes systémiques complexes impliqués dans le syndrome de Noonan et ses variantes. Cette pathologie affecte simultanément plusieurs organes (cœur, système squelettique, système immunitaire), et repose sur des interactions dynamiques entre différents tissus et compartiments physiologiques. Ces interactions ne peuvent être correctement modélisées ni reproduites dans des systèmes in vitro, même complexes, comme les cultures organotypiques ou les organoïdes. À ce jour, aucun modèle cellulaire, informatique ou ex vivo ne permet d’évaluer les effets systémiques, chroniques et multifactoriels des traitements envisagés dans ce projet.

Réduction

Ce projet implique l’utilisation d’un maximum de 4800 souris, réparties entre les phases d’élevage, de traitement expérimental et d’analyses biologiques. Le nombre d’animaux a été rigoureusement estimé à l’aide d’un calcul de puissance statistique, afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables tout en limitant au strict nécessaire le recours aux animaux. Les expériences seront organisées de manière à regrouper les groupes témoins, et chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (immunologiques, histologiques, moléculaires, métaboliques), permettant ainsi d’extraire un maximum de données de chaque individu. Certaines analyses seront également réalisées en collaboration avec d’autres équipes, ce qui contribuera à réduire globalement le nombre d’animaux utilisés. Enfin, des tests statistiques appropriés seront réalisés afin d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats obtenus dans les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires et seront adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès ad libitum à une alimentation standard et à de l’eau. L’environnement sera enrichi (coton de nidification, objets manipulables) pour favoriser l’exploration et limiter le stress. Une surveillance quotidienne permettra de détecter précocement tout signe de mal-être : yeux mi-clos, baisse d’activité, altération du pelage, posture anormale, respiration difficile, comportements stéréotypés. La douleur sera évaluée notamment à l’aide de la grille de score reconnue basée sur les expressions faciales des animaux, outil validé de reconnaissance faciale. Le poids sera contrôlé au moins une fois par semaine. Une perte supérieure à vingt pour cent du poids maximal ou une diarrhée persistante pendant plus de quatre jours sera considérée comme un point limite. Les sites d’injection seront régulièrement inspectés pour détecter toute inflammation ou infection; des soins locaux seront administrés si nécessaire (antiseptique). Les signes de douleur justifieront l’administration d’un traitement analgésique adapté au cas par cas. En cas de faiblesse ou de réduction de la prise alimentaire, un gel nutritionnel sera ajouté dans la cage. Toutes les manipulations seront réalisées par un personnel qualifié, formé aux bonnes pratiques. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie ou analgésie lorsqu’elles sont indiquées (échocardiographie, gestes potentiellement douloureux). Des lampes chauffantes seront utilisées pendant l’anesthésie et la phase de réveil pour maintenir la température corporelle. En cas de comportement agressif, les mâles seront hébergés individuellement afin de prévenir les blessures, qui seront immédiatement soignées. Des ajustements seront effectués en temps réel si une souffrance imprévue est observée. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale, en veillant à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental s’explique par des raisons scientifiques et pratiques. La souris est largement utilisée en recherche, offrant une expertise étendue en élevage, techniques expérimentales et suivi vétérinaire. Les lignées transgéniques disponibles permettent d’étudier des modèles spécifiques, comme les souris développant un syndrome de Noonan, présentant un phénotype clinique similaire à celui des patients humains. Ces souris affichent un retard de croissance (taille réduite, masse corporelle moindre), des anomalies corporelles (dysmorphies du crâne et traits du visage, cou court) et des troubles cardiaques. Ces caractéristiques reproduisent fidèlement les manifestations humaines, rendant ce modèle particulièrement pertinent pour l’étude des pathologies liées. Bien que leur viabilité soit réduite pendant la gestation, ces souris survivent généralement jusqu’à 10 mois, permettant des études approfondies tout en maintenant leur état de santé global. Les animaux sont génotypés à l'âge de huit jours. Cette procédure précoce permet de sélectionner les animaux pertinents tout en minimisant le stress. Les souris sont ensuite élevées jusqu’à sept semaines, âge correspondant à un stade de développement physiologique complet. À partir de cet âge, elles sont incluses dans les protocoles expérimentaux.

Nés de dix femelles reproductrices elles aussi privées de vitamine C, 480 souriceaux subissent une carence en ascorbate de leur naissance à leur mise à mort, qui peut freiner leur croissance et provoquer une ataxie. Au total 2 341 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après deux mises à jeun de six heures, elles sont infectées par Shigella par voie rectale ou orale, ce qui peut provoquer sur 48 heures une diarrhée sanglante, une inflammation de l'anus et une perte de poids, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Les souriceaux dont le génotype ne correspond pas à celui attendu sont tués d'emblée, en dehors de toute expérience.

Objectifs

Les diarrhées associées à des infections bactériennes se caractérisent par une gastro-entérite. Elles se transmettent par voie féco-orale, notamment dans les pays en voie de développement ou chez les voyageurs. Chaque année, elles tuent plusieurs millions de personnes, essentiellement des enfants de moins de 5 ans. La shigellose, causée par la bactérie Shigella, est responsable d’une vaste majorité de ces cas. Il n’existe à l’heure actuelle aucun vaccin commercialisé protégeant de ses infections, mais de nombreuses approches sont en cours d’étude. En effet, l’absence d’un modèle animal d’infection pertinent ne permet pas d’évaluer leur efficacité. Nous évaluons actuellement l’impact de la carence en ascorbate (plus communément appelé vitaine C) sur la sévérité de l’infection par Shigella, en utilisant des souris génétiquement modifiées ne synthétisant pas la vitamine C, à la différence des souris sauvages. Nos résultats indiquent une augmentation de l’invasion de la muqueuse colique par Shigella en carence d’ascorbate, mais les animaux récupèrent de l’infection au bout de 48h. Récemment une équipe américaine a mis en évidence qu’une mutation sur un autre gène augmentait la sensibilité des souris à l’infection par Shigella. Dans ce modèle, les infections sont plus marquées que chez les souris sauvages, toutefois, l’infection est également transitoire. Dans le cadre de ce projet, nous confirmerons ces résultats avec ce même modèle de souris génétiquement modifiées et généreront une nouvelle lignée murine combinant les deux mutations afin d’évaluer si une aggravation des symptômes de shigellose est observée. La virulence de Shigella a été étudiée depuis de nombreuses années dans divers modèles animaux qui, même imparfaits ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la virulence de ce pathogène. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet de récapituler l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Notre nouveau modèle de souris doublement muté pourrait permettre de suivre les étapes précoces et tardives des infections par Shigella. L’objectif de ce projet est de caractériser et valider ce nouveau modèle murin dans le cadre d’une infection par Shigella via la voie intrarectale et per os et éventuellement le valider pour l'évaluation de l’efficacité de candidats vaccins actuellement en phase de développement.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun vaccin commercialisé protégeant des infections par Shigella, responsable de la mort de plusieurs millions de personnes chaque année. Ceci s’expliquant notamment par l’absence d’un modèle animal pertinent d’infection permettant non seulement de récapituler la shigellose humaine dans son entièreté et ainsi de suivre les différentes étapes précoces et tardives de l’infection, mais de fait d’évaluer l’efficacité de vaccin candidat. Dans notre projet, la validation d’un nouveau modèle murin, doublement muté, constituerait une avancée majeure dans la compréhension des différents mécanismes mis en place de la virulence de Shigella ; mais proposerait aussi une nouvelle voie d’évaluation de candidats vaccin actuellement en phase de développement.

Procédures

480 animaux générés ainsi que les 10 femelles reproductrices subiront de leur naissance à leur mise à mort (3 ou 4 semaines d’âge selon le groupe) une carence modérée en ascorbate via une dose sous-optimale d’ascorbate dans l’eau de boisson . Les animaux générés seront soumis à un génotypage sur une biopsie de queue. Tous les animaux subiront avant l’infection par Shigella ou le véhicule deux mises à jeun. La première durera 6h et la seconde 6h. Tous les animaux subiront les actes suivants : Contention et préhension; les gavage et injection sur animal vigile seront d'une durée inférieure à 1 minute; L'injection sous anesthésie gazeuse s'executera pendant une durée de 2 minutes maximum. Enfin, chaque animal se vera prélever un volume sanguin terminal sous anesthésie. Ce prélèvement se fera sur une durée inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

En relation avec la phase d’induction de carence modérée, des précédentes études ont montré que celle-ci avait un impact sur le développement de l’animal au niveau phénotypique (petite taille) et pouvait induite des symptômes liés au scorbut comme un phénomène d'ataxie. La biopsie de queue pour génotypage peut entrainer un stress ainsi qu'un léger inconfort chez les animaux. La mise à jeun provoquer chez ces derniers un stress et une légère perte de poids. Suite à l’infection par la bactérie Shigella, les points suivants pourraient être observés sur 48h (basé sur les précédents travaux réalisés) : - perte de poids - présence de diarrhée sanguinolente - inflammation de l’anus - présence de mucus sur l’anus - vivacité générale de l’animal altérée. Lors des procédures de gavage, il pourrait être observé une dyspnée secondaire à une fausse route induite par l'acte.

Devenir

Pour ce projet, les animaux ayant un génotype non attendu seront mis à mort ainsi que ceux à des fins de prélèvements post mortem.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo d’un nouveau modèle faisant suite à d’autres validations réalisées également in vivo mais qui jusqu’à aujourd’hui n’ont pas permis de récapituler totalement l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Il s’inscrit dans une continuité de compréhension des mécanismes de la virulence de ce pathogène et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens alternatifs que l'animal vivant. De plus, l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. Enfin, les modèles cellulaires d’infection de Shigella ne rendent pas compte de la modulation des mécanismes de virulence de ces pathogènes dans le contexte inflammatoire et ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable.

Réduction

Pour ce projet d’une durée de 5 ans, chaque procédure a été revue avec un biostatisticien afin d'établir le nombre d'animaux minimum nécessaire et suffisant pour atteindre l’objectif fixé de manière fiable statistiquement et robuste. Cet effectif repose également sur notre connaissance du modèle et basé sur les résultats de précédents travaux. Enfin, l’utilisation des deux sexes permet la genèse de moins d’animaux pour atteindre l’effectif total, participant au principe des 3R.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées de façon optimale pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour se faire, des critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse ont été définis, mis en place et seront pris en compte via des grilles de scoring. Ils seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (matériel de nidification à base de coton compressé et de frisure de papier, barreau à ronger, tunnel transparent de manipulation), et disposeront de nourriture et d’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Dans le cadre des infections par injection, les animaux seront préalablement anesthésiés afin de palier à tout stress. De même, tout acte de prélèvement sanguin terminal se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le cobaye et la souris sont les seuls modèles animaux permettant d’étudier la virulence de Shigella. Or, le cobaye ne permet pas de tester ni des infections prolongées ni des candidats vaccin. En effet ce test nécessite une immunisation des animaux pendant 8 semaines, âge auquel les cobayes ont atteint l’âge adulte et ne sont plus sensibles à l’infection. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable. L’ensemble des données dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. Etant une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, une analyse comparative et critique des résultats obtenus pourront être faites. Pour ce projet, les animaux seront utilisés dès la naissance. En effet, une infection par Shigella est plus efficace chez des souriceaux jeunes (environ 3 semaines). Utiliser les animaux à leur naissance permettra l’induction d'une carence modérée en ascorbate avant infection à l'âge de 3 semaines. De plus, d'un point de vue clinique, l'infection par Shigella touche majoritairement des enfants de moins de 5 ans. L'utilisation de souriceaux nous permettra ainsi d'être le plus représentatif possible. AVENANT : En se basant sur les résultats obtenus lors de précédents travaux sur la même thématique, les animaux seront infectés à 5 semaines d'âge, permettant une conciliation entre carence établie et sensibilité à l'infection tout en restant représentatif du jeune enfant.