Procédures légères
Analyse du métabolisme dans des modèles précliniques murins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant quatorze jours consécutifs seule en cage calorimétrique. Elles subissent des jeûnes de quatre à quinze heures, deux tests métaboliques comportant jusqu'à six prélèvements sanguins chacun, et deux passages de trois minutes dans un tube de contention. Une partie porte un phénotype dommageable, diabète ou obésité, et le porteur indique que le régime gras peut réduire leur mobilité, les procédures relevant d'un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 720. Le projet ne teste aucun traitement, il met un équipement de phénotypage métabolique et un savoir-faire à disposition d'autres équipes de recherche.
Objectifs
Les maladies inflammatoires métaboliques comme le diabète de type 2 et l'obésité sont souvent associées à des changements dans l’équilibre énergétique de l’organisme. Ce changement consiste en un déséquilibre entre la consommation et la dépense calorique. L’ensemble de ces pathologies sont en progression dans la population, avec pour exemple la prévalence de l’obésité et du diabète de type 2, qui atteindra plus d’1.5 milliard de personnes en 2025. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des modèles précliniques mimant ces maladies humaines afin d’accélérer la recherche autour de la compréhension des mécanismes biologiques induisant ces pathologies et l’identification du potentiel thérapeutique de candidats médicaments. Dans ce cadre, nous disposons d’un équipement automatisé non invasif qui réalise différentes mesures de calorimétrie (consommation hydrique, prise alimentaire, consommation d’oxygène qui permet d’évaluer la dépense énergétique à l’aide de calculs, déplacements). Ce dispositif permet également de modifier les paramètres environnementaux tels que le cycle jour nuit et la température ambiante et il peut être couplé à différents tests métaboliques pour affiner les résultats. L’objectif de ce projet est de mettre à disposition des différentes équipes de recherche, l’équipement et le savoir-faire pour le phénotypage métabolique de ces modèles précliniques, afin d’évaluer le potentiel intérêt de modèles précliniques murins pour l’étude des maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Le savoir-faire technique et scientifique apporté par la plateforme permettra aux équipes de recherche d’analyser le phénotype métabolique de leurs modèles murins d’études précliniques mimant les maladies métaboliques humaines. Ce phénotypage permettra de définir la pertinence des modèles pour l’étude des maladies métaboliques et sera ainsi capitale pour l’obtention de modèles valides. Cette analyse est également une première étape essentielle pour la compréhension des mécanismes biologiques induisant les pathologies et l’identification du potentiel thérapeutique de candidats médicaments.
Procédures
Les animaux seront mis à jeun pour une durée de 4h à 15h en fonction du test effectué. Deux tests métaboliques à 1 semaine d’intervalle seront réalisés incluant une administration de solution suivie de plusieurs prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h au total pour chaque test (6 prélèvements maximum par test, animal vigile, quelques seconde par acte). Les animaux seront en hébergement individuel (animal vigile, 14 jours consécutifs) afin d'évaluer l'énergie dépensée par les animaux. Les animaux seront placés dans un tube de contention (vigile) lui-même inséré dans une machine durant 3 minutes afin de mesurer la composition corporelle de l’animal (pourcentage de gras, de muscules et d'eau) (2 fois).
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés peuvent présenter un phénotype dommageable : ces phénotypes peuvent être associés à un diabète ou une obésite. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. Les challenges métaboliques peuvent également provoquer une sensation de faim suite à la mise à jeun de quelques heures. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. La contention pour les mesures de la composition corporelle ainsi que l'hébergement individuel en cage calorimétrique pourront engendrer un stress.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvements d'organes afin de réaliser des analyses nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques.
Remplacement
La complexité des mécanismes pathophysiologiques impliqués dans les maladies métaboliques ne permet pas leur étude in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
780 animaux pourront être utilisés dans ce projet. Les animaux, étudiés dans ce projet, seront soumis à plusieurs actes techniques afin de réduire le nombre d’individus utilisés. Le nombre total d’animaux a été calculé de telle façon à réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires tout en obtenant des résultats exploitables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Aussi, les animaux qui permettront de s’assurer du bon fonctionnement de l’armoire métabolique lors de la maintenance annuelle seront des animaux provenant des élevages dans nos animaleries qui ne peuvent pas être utilisés dans un autre projet de recherche.
Raffinement
En condition d'hébergement standard, les paramètres environnementaux sont conformes à la réglementation et les animaux sont hébergés autant que possible avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en apportant des soins adaptés. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Des mesures seront mises en place pour assurer le confort des animaux avec un phénotype dommageable. Pour favoriser le rongement, un bâton sera mis dans les cages standards des animaux sous régime spécial. Au cours du projet et pour limiter leur stress, les animaux seront habitués à l'hébergement individuel ainsi qu'à l'hébergement en cage calorimétrique. Dans tous les cas, le fond des cages sera rigide et pas sur grille, les animaux auront toujours de la litière dans leur cage. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal couramment utilisé pour l’étude des pathologies métaboliques. Elle est également un modèle de choix pour la manipulation génétique, ce qui a permis de développer de nombreuses lignées pour répondre aux besoins des chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. Les animaux de ce projet seront étudiés à l’âge adultes entre 8 semaines et 32 semaines. En effet le métabolisme des souris est stabilisé à cet âge et permet d'obtenir des données fiables et représentatives sans les variations associées à la croissance juvénile ou au vieillissement.
Elevage de rongeurs immunodéprimés modèle d’humanisation du foie associé à une caractérisation génétique par prélèvement (Projet multisites : 1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les souris élevées ici sont immunodéprimées et portent une altération du foie qui les tue peu après la naissance, à moins qu'elles ne reçoivent en continu un médicament spécifique. 6 100 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune subissant une biopsie sur animal éveillé pour son génotypage. L'élevage fournit des souris dont le foie peut être humanisé, livrées à des clients académiques et industriels pour leurs essais précliniques. Celles qui portent le génotype attendu partent vers le laboratoire demandeur, les autres sont tuées, faute d'autre usage.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines afin d’obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles sont greffées avec des cellules humaines. Il existe plusieurs types de souris humanisées en fonction des cellules humaines qui sont utilisées et des pathologies étudiées, par exemple, l’utilisation de cellules humaines de foie (hépatocytes humains) permet de générer des souris dont le foie est humanisé, l’utilisation de cellules immunitaires humaines permet de générer des souris dont le système immunitaire est humanisé. Le développement et la production de souris humanisées permet de proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles de souris dont le foie est humanisable sont pertinents, robustes et fiables. Ils permettent d’effectuer les tests précliniques de composés candidats médicaments pour le traitement de pathologies hépatiques mais également d’étudier la toxicologie de composés candidats médicaments pour d’autres pathologies.
Procédures
Les souris au foie humanisable sont immunodéficientes donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé qui sont exempts de microrganismes pathogènes ou opportunistes listés dans un référentiel afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Certaines souris au foie humanisable peuvent aussi un phénotype dommageable de trouble hépatique, inhibé par l’apport de médicament spécifique. Une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre EU1 (prestation de Sciences de la Reproduction : réception d’animaux, prélèvement gamètes…) et sur notre EU2 (Elevage).
Impact sur les animaux
Sans l’apport d’un médicament spécifique, les animaux ayant un foie défaillant dû à une modification génétique meurent très rapidement après leur naissance de lésions hépatiques majeures. Les animaux immunodéficients sont particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état. Par ailleurs, une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés pour une utilisation continue vers le laboratoire demandeur, soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (avant l'atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permet une sélection des propriétés pharmacologiques et qui permet de valider certaines hypothèses et d’obtenir de données préliminaires et complémentaires. Ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe permettant de mimer le foie humain. Il permet de réaliser des études précliniques in vivo de toxicité avant de réaliser des tests chez l’Homme. Les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Ces animaux au foie humanisable étant immunodéficients (système immunitaire affaibli ou rendu non fonctionnel via différentes modifications génétiques), un hébergement standard (litière, enrichissement et congénères) dans un milieu biologiquement sécurisé pour les protéger de la survenue d’infections est réalisé. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Ces animaux seront surveillés quotidiennement. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Les souris au foie humanisable présentant une invalidation génétique particulière ont un foie dysfonctionnel. Cette modification génétique est léthal. Un médicament spécifique permettant le maintien d’un fonctionnement normal de leur foie leur sera administré afin d’assurer leur survie y compris pendant le transport. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux. Le médicament spécifique permettant de contrecarrer le phénotype des animaux au foie humanisable leur sera fourni tout au long du transport soit dans l’aliment soit dans le gel servant d’eau de boisson.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les souris sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elles constituent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des informations pertinentes pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins de nos clients. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de leur gestation.
Rôle du calcium dans le contrôle astroglial des fonctions hypothalamiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
6 354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les unes reçoivent une perfusion de fixateur dans le cœur sous anesthésie, les autres subissent une heure de chirurgie cérébrale pour l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale, une ponction cardiaque ou des privations de boisson. L'objet du travail est le rôle d'une protéine des astrocytes dans la libération de l'ocytocine et de la vasopressine. Le porteur écrit que les tests comportementaux n'induisent pas de nuisance tout en comptant parmi eux la privation d'eau, et justifie l'effectif de 6 354 animaux par sa seule expérience du domaine.
Objectifs
Les interactions entre neurones et astrocytes sont essentielles aux activités cérébrales, en particulier dans les régions telles que l’hypothalamus, fortement liées au flux sanguin et régulant des fonctions physiologiques vitales. Les astrocytes contactent à la fois les vaisseaux et les neurones, pour détecter et intégrer les changements sanguins et des activités neuronales. En réponse, les astrocytes modulent les neurones adjacents. Cependant, les bases moléculaires qui sous-tendent cette régulation restent obscures. Une protéine fortement exprimée dans les astrocytes est peu explorée et nous émettons l'hypothèse que cette protéine participe à la régulation qui contrôlent l'activité des neurones secrétant l'ocytocine et la vasopressine. Ces dernières sont notamment essentielles à la régulation de fonctions vitales telles que le contrôle de la balance hydrique et la lactation. Nous proposons donc d'étudier si les mécanismes moléculaires qui participent au contrôle ces fonctions. Dans ce projet, nous analyserons les conséquences de la délétion de cette protéine sur : (1) La morphologie des astrocytes, l'activité des astrocytes et l'impact sur l'activité des neurones à ocytocine et à vasopressine. (2) La sécrétion d'ocytocine et de vasopressine au niveau de l'hypothalamus. (3) Le comportement maternel et le contrôle de la balance hydrominérale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre par quels mécanismes l'ocytocine et la vasopressine sont libérées par l'hypothalamus et l'hypophyse. Comprendre comment ces hormones sont sécrétées permettra de développer de de nouvelles approches pour stimuler la sécrétion endogène de ces hormones dont nous savons qu'elles sont altérées dans certaines pathologies neurodévelopementales.
Procédures
Une perfusion intracardiaque sous anesthésie sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. La durée de cette procédure est de 30 minutes. Des souris seront sujettes à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour analyser les variations cérébrales d'ocytocine et de vasopressine. La durée de cette procédure est d'une heure. Des souris seront également sujettes à une intervention chirurgicale d'une durée d'une heure visant à l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie afin de pouvoir mesurer l'ocytocine et la vasopressine plasmatique. Certain animaux subiront des tests comportementaux de modulation de la prise de boisson par courte privation et des tests d'évaluation du comportement maternel.
Impact sur les animaux
La contention ainsi que l’injection d’analgésique et d’anesthésique peuvent engendrer un stress chez l’animal. Certains animaux seront soumis à une chirurgie sous-anesthésie avec réveil qui peut engendrer une douleur post-opératoire modérée de quelques heures. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations comportementales (prise de boisson, comportement maternel) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux subiront des test comportementaux qui n'induisent pas de nuisance pour l'animal. La perfusion et la ponction cardiaque sont effectués sous anesthésie profonde et terminale de l'animal, sans réveil.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont mis à mort pour l'analyses de paramètres physiologiques ex vivo.
Remplacement
Le but du projet est de comprendre le rôle d'une protéine exprimée dans les astrocytes. Cette protéine interviendrait dans les interactions entre les neurones et les astrocytes pour la régulation de la sécrétion de l'ocytocine et de la vasopressine qui regissent de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales. Dans ce contexte il est necessaire d'utiliser des animaux et un tissu nerveux intact afin de comprendre les mécanismes qui régulent les fonctions physiologiques et comportementales liés à ces neuropeptides hypothalamiques. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous utilisons le nombre de souris total strictement nécessaire pour chacune des stratégies. Ceci correspond à notre expérience dans le domaine pour assurer la validité statistique des résultats.
Raffinement
Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et postopératoire. Les jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animal), et recevront si besoin un analgésique par voie orale ou en injection sous-cutanée. Une grille de score pour évaluer le bien être des souris sera utilisée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standadisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris (délétion des protéines lysosomales). Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois. A ce stade les animaux ont un cerveau qui a fini son développement et les animaux présentent un comportement d’adulte. D’autre part utiliser des souris à partir de cet âge de 2 mois, permet également de pouvoir comparer nos résultats avec la tranche d'âge pour laquelle la plupart des expériences précédentes ont été conduites.
Evaluation de la toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur (Modification)
- Recherche appliquée
- Cancers
Ce que subit chaque souris dépend du composé testé, de sa voie d'administration et de la durée du traitement, avec jusqu'à quatre administrations par jour pendant huit semaines et deux micro-prélèvements sanguins quotidiens. 6 915 souris sont utilisées, dont 5 425 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, immunodéprimées ou immunocompétentes, porteuses ou non d'une tumeur greffée. La tumeur peut s'ulcérer ou se nécroser, et une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse peut provoquer une paralysie. 725 souris sont réutilisées dans d'autres procédures et les autres tuées, au fil d'un maximum de 80 études sur cinq ans destinées à trier des composés avant des essais d'efficacité menés ailleurs.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer/détecter une éventuelle toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur. Il pourra également permettre d’identifier les cellules immunitaires ou les facteurs solubles impliqués dans celle-ci. Remarque : Des modifications de la durée des traitements, des voies d’administration et du type de molécules administrées nécessitent une modification du projet initial sans ajout d’animaux (diminution du nombre estimé d’animaux). Un maximum de 80 études sera mené sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques agissant sur la cible d'intérêt, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois /jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois/jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s) ; Administration de la solution de resuspension du composé thérapeutique (maximum 1 fois/jour pendant 8 semaines, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (maximum 1 fois /jour pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s), de(s) la molécule(s) déplétante, activatrice/stimulatrice et/ou neutralisante ou de la solution de resuspension du composé. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables liés aux composé thérapeutique, molécule ou à la solution de resuspension : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
A l’exception des animaux pouvant être réutilisés l’ensemble des animaux sont mis à mort lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir une évaluation, statistiquement interprétable, de l’éventuelle toxicité d’un composé thérapeutique et 5 souris maximum par groupe pour celle d’une solution de resuspension, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle, de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale et des signes cliniques observés. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 80 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, mise à mort de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé, la molécule (déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante) et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu'à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Prélèvemenst « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées utiles à l’étude du syndrome de Prader WIlli
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Des souriceaux de sept jours subissent l'ablation de moins d'un millimètre du bout de leur queue, sous pommade anesthésiante, pour que leur génotype soit déterminé. 1 050 souris sont utilisées dans cet élevage de lignées reproduisant le syndrome de Prader-Willi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le titre du projet met le mot "invasifs" entre guillemets, quand le texte reconnaît par ailleurs que jusqu'à 15 % des souriceaux porteurs de la maladie meurent le jour de leur naissance, sans signe avant-coureur. Les animaux dont le génotype intéresse les expériences à venir sont maintenus en vie, les autres tués, sans que la proportion soit indiquée.
Objectifs
Le syndrome de Prader Willi (SPW) est une maladie génétique rare sans traitement curatif. Cette maladie est caractérisé par un manque de tonus à la naissance suivi d'un retard de crosisance dans le jeune âge et, en parallèle, vers l'âge de deux ou trois ans, l'installation d'une faim permanente et incontrôlable qui peut conduire au fil des années à une obésité extrême et fatale. Nos travaux préliminaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique capable de corriger l’absence d’expression de certains de ces gènes en lignée cellulaire, néanmoins ces modèles ne permettent pas de savoir si le traitement serait efficace sur un organisme. Plusieurs modèles de la maladie existent chez la souris. Ainsi, l’objectif général du projet scientifique est d’analyser le potentiel thérapeutique de ce traitement sur plusieurs modèles de souris et à différents stades de développement, y compris à un stade précoce nécessitant de caractériser génétiquement les animaux par une méthode invasive (prélèvement de bout de queue). Ainsi, l'objectif précis de ce projet est de mettre en place les conditions et les gestes associés à la production de souris dans le contexte d'essais de thérapie de la maladie de Prader Willi.
Bénéfices attendus
Les différents projets que nous souhaitons réaliser permettrons de tester la capacité de la thérapie à soigner des individus traités dès la naissance ou traités à des stades plus tardifs, afin de tester la possibilité de soigner des patients déjà adultes. Concernant un traitement précoce après la naissance des animaux, le prélèvement de tissu une semaine après la naissance va permettre de caractériser génétiquement les nouveau-nés malades ou sains, et ainsi optimiser leur intégration dans les différents groupes expérimentaux.
Procédures
Il s'agit d'un seul prélèvement de bout de queue (
Impact sur les animaux
Une douleur et un stress pourraient être associés au prélevement d'un bout de queue (
Devenir
Les animaux utiles pour constituer les groupes expérimentaux (animaux porteurs de la maladie ou contrôles, traités avec le médicament ou avec un traitement contrôle) seront maintenus en vie en utilisation continue, les autres seront mis à mort.
Remplacement
le syndrome de Prader Willi (SPW) est une maladie spécifique des mammifères et ne peut être modélisée par des animaux non-mammifères. Des études préalables sur cultures cellulaires mammifères ont permis de développer un traitement contre le SPW. Il convient maintenant de l’administrer sur un modèle animal chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal.
Réduction
Uniquement le nombre d'animaux requis pour les projets scientifiques autorisés seront produits et, si nécessaire, subiront un prélèvement de tissu. Des schémas d'accouplements visant à limiter le nombre d'animaux générés seront scrupuleusement suivis.
Raffinement
Le prélèvement d'un bout de queue sera réalisé par du personnel expérimenté selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée en vue de limiter le stress et la douleur. Auparavant, l'anesthésie locale du bout de queue sera obtenue par l'application d'une pommade. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation seront réalisés dans les jours suivant le prélèvement. Les animaux seront surveillés tous les jours pour vérifier l'absences de points limites. Le change des cages sera décalé de trois jours après la mise bas afin de ne pas nuire à la relation mère-petits. Pour limiter le stress, le nid maternel sera conservé pendant le change.
Choix des espèces
Les lignées de souris SPW sont les seuls modèles mammifères permettant d'étudier le développement de la maladie humaine. Le prélèvement d'un bout de queue se fera au 7ième jour après la naissance. Les animaux porteurs de la maladie seront utilisés entre leur jour de niassance et le stade adulte, selon les projets sceintifiques autorisés.
Inhibition de la recombinaison homologue sur la progression tumorale chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et vit dans une animalerie séparée, avant d'être transportée vers celle où se déroulent les expériences. 1 404 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec greffe de cellules tumorales, quinze anesthésies générales et onze injections par animal. Le projet est déclaré deux fois, une fiche par établissement, chacune annonçant 1 404 souris pour tester un agent pharmacologique censé renforcer l'action antitumorale de certaines cellules immunitaires. Toutes sont tuées à la fin, pour permettre les prélèvements.
Objectifs
Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes
Impact sur les animaux
- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.
Réduction
Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
La chicorée fourragère (Cichorium intybus, var. Puna II) comme alicament pour la gestion des cyathostomes chez le cheval
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
Pour mesurer si la chicorée fourragère réduit l'infestation des chevaux par de petits vers intestinaux, 30 jeunes équidés sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Vingt-deux d'entre eux subissent six prises de sang et six mesures de température rectale en 32 jours. D'autres passent trois périodes en boxes individuels, équipés de sacs à fèces vidés toutes les trois heures, avec pesées et mesure des quantités bues. Les retombées annoncées visent d'abord les éleveurs, coûts vétérinaires, valeur alimentaire du fourrage et consommation d'eau, et aucun cheval n'est tué, les mâles partant à l'adoption parce que la structure ne les garde pas au-delà de trois ans, les femelles restant disponibles pour de futures expériences.
Objectifs
Parmi les parasites gastro-intestinaux infestant les chevaux au pâturage, les cyathostomes (ou petits strongles) sont très fréquents et affectent toutes les catégories d'équidés, les jeunes animaux étant toutefois les plus sensibles. Ils sont responsables de retards de croissance, de diarrhées et l’émergence en masse de stades larvaires préalablement en dormance dans la muqueuse colique (cyathostomose larvaire) constitue la principale cause de décès d’origine parasitaire chez le jeune cheval. Les multiples rapports faisant état d’une efficacité diminuée des anthelminthiques de synthèse pour contrôler les cyathostomes conduisent au développement de stratégies alternatives. Dans ce cadre, des recherches récentes visant à identifier des plantes présentant des propriétés antiparasitaires vis à vis des cyathostomes ont rapporté des résultats encourageants chez de jeunes chevaux pâturant de la chicorée fourragère (Cichorium intybus, cv. Puna II). Ainsi, une réduction de 85% de l’excrétion d’œufs de cyathostomes a été mesurée chez ces individus, comparativement à leurs homologues pâturant une prairie permanente pendant la même durée (45j). Le développement larvaire des œufs qu’ils excrétaient a également été réduit d’un tiers. L’effet anthelminthique de la chicorée pourrait résulter d’un effet direct de composés présents dans ses feuilles (sesquiterpènes lactones, SL) sur les parasites et/ou d’un effet indirect induit par des modifications de l'écosystème intestinal, en particulier de la composition du microbiote. Une première investigation in vitro du rôle des SL a montré qu’ils réduisaient le développement larvaire mais que leur effet semblait limité en regard de l'amplitude de l'effet observé in vivo. Le premier objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d'action de la chicorée cv. Puna II sur les petits strongles afin de favoriser son efficacité et d’anticiper le potentiel développement de résistance des parasites. En particulier, il s’agit d’analyser comment la consommation de chicorée par des poulains parasités module les interactions en jeu entre le microbiote intestinal et les communautés de cyathostomes. Le second objectif de ce projet est d’acquérir de premières références sur la valeur alimentaire de la chicorée chez le cheval en vue de son utilisation comme alicament.
Bénéfices attendus
À l'issue de ce projet, nous serons en mesure de mieux comprendre les effets de la consommation de chicorée (cv. Puna II) sur l'écosystème némabiome – microbiote chez le jeune cheval, en particulier comment la stabilité de ce système complexe est maintenue et régulée. Ce résultat complétera notre démonstration précédente de l’existence d'un effet anthelminthique direct, mais d’intensité limitée, exercé par les SL de la chicorée sur les cyathostomes. Nous aurons également quantifié les différences de sensibilité des espèces de cyathostomes aux propriétés anthelminthiques de la chicorée, ce qui permettra d'anticiper un potentiel développement de résistances chez ces parasites. Nos résultats contribueront à guider et faire évoluer les stratégies de traitement dans les milieux vétérinaires. En parallèle, les références originales que nous obtiendrons sur l’ingestibilité et la digestibilité de la chicorée chez le jeune cheval permettront d’éclairer les éleveurs sur les bénéfices nutritionnels associés à la consommation de cette plante soit seule, soit en association en proportion égale avec du ray-grass anglais. Nous fournirons également des connaissances sur l’intérêt potentiel de l’inclusion de chicorée fourragère dans la ration du cheval pour limiter la consommation d’eau d’abreuvement.
Procédures
Au cours de l’essai visant à analyser l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte, des prises de sang et des mesures de température rectale seront effectuées à six reprises sur chacun des 22 individus (J0, J7, J14, J20, J26 et J32). Au cours de trois journées (J8, J19 et J25), cinq individus du lot « chicorée » et cinq individus du lot témoin seront équipés de colliers de mesure de l'activité adaptés aux chevaux permettant d’enregistrer leur durée d’alimentation journalière. Dans le cadre de l’essai en carré latin, les quantités ingérées individuelles des trois régimes de fourrages seront mesurées tous les jours par différence entre les quantités de fourrages offerts et refusés et ce pendant toute la durée de l’essai (57j). Les quantités individuelles d’eau bue seront mesurées par différence entre les quantités offertes et refusées pendant les 5j de mesures de chacune des 3 périodes. Les fèces émis par les animaux entre 8h et 17h pendant les 3 périodes de 5j de mesures seront récoltés dans des sacs à fèces qui seront vidés de leur contenu toutes les 3h. Ces fèces récoltés sur les animaux contribueront au calcul de la production fécale journalière avec les fèces ramassées au sol et serviront à la constitution d’échantillons qui seront analyses pour leur composition chimique. Les animaux seront pesés 48h après le début de chacune des 3 phases d’habituation aux régimes (ie. tous les 19j) et en fin d’essai.
Impact sur les animaux
L’inocuité de la chicorée cv. Puna II chez le jeune cheval a été vérifiée au cours d'une précédente étude dans laquelle les animaux ont pâturé un couvert pur de chicorée pendant 45j. Au cours de l’étude destinée à analyser les effets de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte, une prise de sang et une mesure de la température rectale seront réalisées sur les 22 animaux tous les 6 à 7j pendant 32j (6 mesures individuelles au total : J0, J7, J14, J20, J26 et J32). Ces mesures seront effectuées par le personnel de l’EU formé (Habilitation à l’Expérimentation Animale de niveau 2 pour les personnels amenés à réaliser les prélèvements biologiques), expérimenté et connu par les animaux. La contention s’effectuera après la pesée dans la bascule, où les animaux ont l’habitude d’être pesés et manipulés. La douleur et le stress de faible intensité potentiellement générés par ces manipulations classiques d’élevage seront de courte durée (i.e. limités à la durée de la mesure). Le personnel réalisant ces actes est formé à la détection de signes d’inconfort et dispose d’une grille d’évaluation lui permettant de décider de la nécessité éventuelle de stopper la procédure.
Devenir
Dans le fonctionnement global du site expérimental, les animaux mâles ne restent sur la structure que jusqu’à l’âge de 3 ans au maximum. Ils seront donc placés à l’adoption directement après les procédures ou dans les quelques mois qui suivront. La plupart des femelles seront conservées pour le renouvellement du troupeau et seront donc amenées à être réutilisées dans le futur. En effet, Les procédures mises en œuvre n’impactent pas la réutilisation des animaux à des fins expérimentales.
Remplacement
Afin de préciser le potentiel d’utilisation de la chicorée (cv. Puna II) comme fourrage alicament pour limiter l’infestation des chevaux par les cyathostomes, il est nécessaire de se placer dans des conditions in vivo les plus proches possibles de celles de l’élevage. En particulier, nous avons besoin de mesurer les effets de la consommation de chicorée par les chevaux sur le microbiote intestinal, la communauté de cyathostomes (excrétion d’œufs et développement de ces œufs en larves infestantes) et leurs interactions. Nous devons mesurer l’ingestibilité (ingestion volontaire) de ce fourrage (offert seul ou en mélange avec des graminées) par de jeunes chevaux, d’une part et sa digestibilité in vivo qui constitue la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages chez les herbivores, d’autre part. Dans le cas des équins, une méthode alternative d’estimation de la digestibilité de la matière sèche in vitro a été développée à partir de mesures réalisées chez des animaux nourris avec des fourrages verts de graminées et de prairies naturelles (méthode pepsine cellulase). Toutefois, cette méthode n’a pas été validée dans le cadre d’une alimentation comprenant de la chicorée fourragère. Les mesures de digestibilité in vivo que nous effectuerons pour ce projet seront couplées à des mesures de dégradabilité de la matière sèche des différents régimes par la méthode pepsine-cellulase in vitro.
Réduction
Le nombre d’individus inclus dans l’analyse des effets de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte (n=11 dans chacun des lots « chicorée » et « témoin ») a été limité pour des considérations éthiques et de faisabilité expérimentale, tout en respectant un nombre minimal permettant d’atteindre une puissance statistique suffisante (cf. 3.4.10). Nous nous sommes en particulier appuyés sur une étude de 2023 utilisant le modèle d’interaction microbiote-némabiome chez le jeune cheval et qui a obtenu des effets significatifs avec 10 individus par lot. Les OPG et le développement larvaire seront analysés à l’aide d’un modèle mixte avec le régime, la date et l’interaction régime × date en effets fixes, et l’individu en effet aléatoire. L’analyse des différences de composition du microbiote entre lots s’appuiera sur différentes procédures (ANOSIM, random forest) décrites dans l'étude de 2023 sur laquelle nous nous sommes appuyés pour constituer les lots. Les relations causales entre les genres de microbiote fécal et le némabiome seront déduites en utilisant la procédure multi-spatiale Convergent Cross-Mapping. Le nombre d’animaux utilisés pour caractériser la valeur alimentaire de la chicorée chez le jeune cheval dans notre carré latin (n=6) a été choisi dans l’objectif de disposer d’analyses statistiques fiables des paramètres d’ingestibilité et de digestibilité. La variabilité inter-individuelle d’ingestibilité et de digestibilité n’est pas connue dans le cas de régimes de fourrages verts incluant de la chicorée. Toutefois, le nombre d’animaux choisi pour notre essai est cohérent avec celui utilisé dans des études précédentes ayant mis en évidence des différences d’ingestibilité (e.g. carré latin 4×4 avec 4 individus) et de digestibilité (e.g. carré latin 4×4 avec 4 individus ; carré latin 6×4 avec 6 individus) entre différents fourrages conservés. Deux individus supplémentaires seront inclus pour un éventuel remplacement d’individus expérimentaux et ainsi éviter d'avoir à reconduire l'essai. Les données d'ingestibilité et de digestibilité seront analysées avec un modèle mixte incluant le régime, la période et l'interaction régime × période en effets fixes et l'animal en effet aléatoire.
Raffinement
Les animaux seront nourris avec des fourrages verts en quantité et en qualité non limitantes et recevront de l’eau à volonté. L’inocuité de la chicorée cv. Puna II chez le jeune cheval a été montrée précédemment. Les animaux seront conduits soit (i) au pâturage (essai analysant l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions entre microbiote et communautés de cyathostomes), soit (ii) en boxes individuels conçus pour l’espèce garantissant contacts visuels et sonores et avec sortie quotidienne dans un paddock pour les besoins d’exercice et d’interactions sociales (essai visant à fournir des références sur la valeur alimentaire de la chicorée chez le cheval). La durée des essais sera réduite au minimum, de même que le nombre de prélèvements. Les manipulations sur les chevaux seront réalisées par le personnel de l’EU habilité (Habilitation à l’Expérimentation Animale de niveau 2), habitué aux mesures et connu des animaux. Elles auront lieu dans la bascule qui constitue un environnement sécurisé auquel les chevaux sont habitués. Les volumes prélevés sur animaux (prises de sang) respecteront les obligations réglementaires. Les animaux seront habitués aux nouvelles manipulations graduellement lors de séquences courtes réparties sur plusieurs semaines (e.g. port de sacs à fèces pour les mesures de digestibilité). Une grille d’évaluation d’inconfort sera utilisée pour décider d’un temps de pause lors des manipulations ou d’un arrêt total. Le personnel de l’EU contrôlera individuellement l’état des animaux au minimum deux fois par jour pour s’assurer de l’absence d’atteinte, de boiterie ou de comportement anormal (e.g. abattement, agitation, activité alimentaire anormale). En cas de besoin, les agents de l’EU promulgueront les soins adaptés à l’animal en s’appuyant sur les recommandations du Bilan sanitaire d’élevage de l’EU et y consigneront leurs actes. Si les anomalies constatées sur l’animal ne rentrent pas dans le cadre du Bilan sanitaire d’élevage, le personnel de l’EU fera appel au vétérinaire référent de l’EU. Les animaux seront pesés au minimum tous les 19j. Un animal pourra être exclu de l’essai sur avis du vétérinaire ou en cas de refus de s’alimenter, de perte de poids supérieure à 10% entre deux pesées consécutives, de fèces liquides pendant plus de 24h ou de comportement inadapté susceptible d’engendrer des blessures.
Choix des espèces
Notre projet a trait au développement de nouvelles stratégies de contrôle des cyathostomes infestant les chevaux. Ces parasites affectent la santé des animaux et engendrent des coûts économiques dûs aux traitements, aux actes vétérinaires, voire à la perte d’animaux. Les coûts associés au volet sub-clinique de la maladie sont liés à la diminution de l’efficacité alimentaire et des performances animales. Les preuves du développement de résistances des cyathostomes aux anthelminthiques de synthèse abondent à l’échelle mondiale et les molécules encore actives ont des effets toxiques sur l’environnement. Suite à des travaux récents rapportant des résultats encourageants quant à l’activité anthelminthique de la chicorée fourragère Puna II sur les cyathostomes, notre projet vise à (i) préciser les mécanismes d’action impliqués, en particulier le rôle du microbiote digestif et à (ii) fournir des références sur la valeur alimentaire de cette plante chez le cheval en vue de son utilisation comme alicament. Dans une étude précédente, les lots « chicorée » et « témoin» comportaient chacun 10 individus. Considérant le coefficient d de Cohen minimal obtenu (-1.53 ; régime × date J16), une puissance de 80 % (standard) et un risque α de 5 %, un effectif minimum de 8 individus parait nécessaire pour mettre en évidence l’activité antiparasitaire de la chicorée. Dans la présente étude qui analysera l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome, nous souhaitons mobiliser 11 chevaux par lot. Ce choix repose sur une récente publication utilisant le modèle d’interaction microbiote-némabiome chez le cheval qui a obtenu des effets significatifs avec 10 individus par lot. En incluant 11 individus, nous considérons la variabilité biologique et réduisons le risque de biais lié à des échantillons trop restreints. Le nombre d’individus utilisés pour mesurer la valeur alimentaire de la chicorée dans notre essai en carré latin (n=6) a été choisi dans l’objectif de disposer d’analyses statistiques fiables des paramètres d’ingestibilité et de digestibilité. La variabilité inter-individuelle d’ingestibilité et de digestibilité n’est pas connue dans le cas de régimes de fourrages verts incluant de la chicorée. Toutefois, le nombre d’animaux est cohérent avec celui utilisé dans des études révélant des différences d’ingestibilité et de digestibilité sur des fourrages secs.
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 1/2) – Modification
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées quotidiennement avec un retardateur de flamme pendant les 42 jours de leur gestation et de leur allaitement, douze rates mettent bas des portées dont les ratons surnuméraires sont déplacés vers d'autres portées ou tués. Les jeunes passent ensuite quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, destinés à repérer ceux qui présentent le phénotype autistique recherché. Les rats retenus subissent quatre séances d'imagerie cérébrale sous six anesthésies, pour mettre au point une mesure du métabolisme et de l'inflammation du cerveau. 148 rats sont utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 37 ayant été ajoutés après l'échec des premières gestations. Seuls 16 resteront en vie, réaffectés à d'autres projets ou "placés en retraite".
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet a pour objectif à court terme de valider une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin d’à plus long terme mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). L’EU1 sera en charge de la mise en place du modèle et l’EU2 de l’imagerie cérébrale. Un problème expérimental au cours du déroulement du projet nécessite l'ajout de 37 animaux par rapport à la demande initiale.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids (EU1). Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie (EU1). Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point (EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA, d'une durée de quelques secondes, entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée (quelques secondes). Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (au nombre de 4, d'une durée de moins de 30 min chacun) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Douze femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 120) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 16 rats (8 femelles et 8 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie. Les première femelles n’ont pas permis d’obtenir des descendants pour réaliser les analyses d’imagerie. Trois femelles gestantes ainsi que de leurs descendants, c’est-à-dire 30 jeunes, seront donc ajoutées à ce projet afin de pouvoir obtenir le nombre final d’animaux nécessaire pour l’imagerie. Par ailleurs, en raison du décalage dans la réalisation des tests, les animaux nécessaires au test de sociabilité ne correspondront plus à l'âge idéal pour réaliser ce test, nécessitant l'ajout de 4 rats adultes. Au final, en sus des 111 déjà demandés et approuvés, nous souhaiterions ajoutés 37 animaux, soit un nouveau total de 148 animaux.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.
Inhibition de la recombinaison homologue sur la progression tumorale chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir quinze anesthésies générales, onze injections dont celles des cellules tumorales et un rasage du flanc droit, la tumeur greffée pouvant devenir douloureuse en grandissant. L'objectif immédiat reste de vérifier chez la souris un effet déjà observé en culture cellulaire, le bénéfice pour les malades étant renvoyé à la validation "à terme" de l'intérêt clinique d'un agent pharmacologique. Le porteur présente l'espèce comme "le modèle de choix et de référence", au motif que le développement tumoral et la réponse immunitaire y seraient proches de ceux de l'être humain.
Objectifs
Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes
Impact sur les animaux
- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.
Réduction
Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
Caractérisation de nouveaux acteurs présents dans la cellule pouvant être utilisés dans la mise en place de stratégies thérapeutiques innovantes pour le traitement de maladies du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les cellules greffées proviennent de fœtus prélevés sur des femelles gestantes mises à mort trois à quatre jours avant la mise-bas. 1650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les receveuses, souvent des nouveau-nés de deux à quatre jours séparés de leur mère, sont irradiées éveillées pendant une à quatre minutes pour détruire leurs cellules immunitaires, puis reçoivent les cellules greffées et subissent jusqu'à vingt-quatre prises de sang dans la veine de la joue, sans anesthésie. Sur la réduction, le porteur se borne à écrire qu'il a utilisé "le minimum nécessaire et suffisant", sans avancer ni calcul ni effectif par groupe pour justifier ces 1650 souris.
Objectifs
Le système immunitaire est un ensemble des mécanismes de défense qui permet de lutter contre des agents pathogènes (virus, bactéries cellules cancéreuses). Néanmoins dans le cas de cancers ces mécanismes n’arrivent plus à jouer leur rôle de défense et sont débordés par la multiplication rapide de ces cellules. Les mécanismes qui régulent la production des différentes cellules du système immunitaire restent mal connus, mais il a été montré que dans les cancers du sang (leucémies) les cellules du système immunitaire avaient de fréquentes modifications. Ces modifications semblent avoir un impact majeur sur l’activité des cellules immunitaires dans des conditions naturelles (sans pathologie) et dans des conditions de maladie (pathologie) Ces fréquentes modifications sont observées sur des éléments appelés « protéines ». Les protéines sont des molécules qui agissent dans le développement des cellules de l’organisme. Il existe de nombreuses protéines dans l’organisme et leur production est différente en fonction de la cellule. La protéine Ets-1 est l’une des protéines essentielles pour le développement normal de différentes populations de cellules du système immunitaire. Elle joue également un rôle dans le développement anormal des cellules sanguines dans le cadre de pathologies telles que les leucémies. Notre projet de recherche vise donc à comprendre plus précisément le rôle de cette protéine dans le développement normal mais également lors de la production des cellules tumorales. Il permettra de caractériser les processus qui contrôlent la mise en place du système immunitaire et de définir de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies du système immunitaire et en particulier dans les leucémies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser les processus qui contrôlent la mise en place du système immunitaire en présence ou en absence de notre protéine d’intérêt et de mettre en évidence les acteurs moléculaires qui sont influencés par son activité au cours du développement des cellules immunitaires. Ces nouveaux acteurs moléculaires pourront ensuite être des candidats intéressants pour le développement de nouvelles thérapies dans les maladies du système immunitaire et en particulier dans les leucémies.
Procédures
La première partie du projet consiste à obtenir les cellules utilisées pour la mise en place du modèle d'étude. Pour cela, nous réalisons des croisements entre nos lignées de souris génétiquement modifiées (n'exprimant pas la molécule Ets-1). Afin d'éviter la mort quelques jours après la naissance des souris d'intérêt, nous euthanasions les femelles gestantes (3 à 4 jours avant la mise-bas) afin de pouvoir récupérer les fœtus et le foie. Les cellules souches hématopoïétiques (cellules qui vont se développer pour générer l'ensemble des cellules du système immunitaire) sont obtenues à partir de ces foies fœtaux et injectées à des souris receveuses afin de s'y multiplier. Avant l'étape d'injection, les souris receveuses subissent une étape d'irradiation qui consiste à détruire les cellules immunitaires déjà présentes dans la souris afin de faciliter la prolifération des cellules injectées (réalisée sur souris éveillées, durée entre 1min30 et 4 min). L’administration (10s) des cellules, faite moins de 24h après l'étape d'irradiation, est non douloureuse et est réalisée sur souris éveillées. Des prélèvements de sang (au maximum 24 sur la durée totale de l'expérience) sont réalisées au plus toutes les 2 semaines (au niveau de la veine de la joue, sans anesthésie; durée: 30 s). Le premier prélèvement a lieu 3 semaines post-injection pour les expériences faites sur les souris nouveau-nés et 4 semaines post-injection pour les expériences réalisées sur les adultes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont un stress et un inconfort ressentis au cours de l’étape d'irradiation avec le changement d’environnement de l’animal (changement de cage et transport dans la pièce pour l'irradiation), pendant l’injection des cellules et les prélèvements sanguins. Un stress supplémentaire est ajouté aux animaux (mère et nouveau-nés) lors de leurs séparations pour l’étape de conditionnement et des injections. L'étape d'irradiation peut également entrainer des diarrhées et une déshydratation. En cas, d'absence de prise de greffe des cellules injectées, la mort de l'animal est possible.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure, les organes du système immunitaire seront prélevés (moelle osseuse, thymus, rate, ganglions mésentériques) en vue de la réalisation analyse génétique.
Remplacement
Nous avons réalisé le maximum de tests in vitro. En effet, le développement de nouvelles techniques d’analyses génétiques ainsi que la bibliographie nous permettent aujourd’hui de faire une présélection des potentiels acteurs moléculaires qui pourraient influencer le développement des cellules immunitaire. Ils sont alors testés in vitro (sur des cellules que nous cultivons en dehors de l’animal) et seulement ceux qui auront prouvé une efficacité seront testés sur l’animal. Le modèle animal reste nécessaire afin d'analyser ces processus complexes de développement cellulaire dans un système naturel qui tient compte de l’environnement dans lequel ces cellules se développent.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour la validité scientifique de notre étude.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, un suivi quotidien des animaux est réalisé en s’attachant tout particulièrement au comportement des souris (apparence, posture, toilettage). Nous réaliserons une fois par semaine un suivi clinique à l'aide d'une grille de score, permettant la mise en place de points limites. Nous nous attacherons à faire une surveillance accrue au cours de la première semaine de la procédure afin de s’assurer que les mères acceptent bien le retour des nouveau-nés dans le nid après leur manipulation. Les injections et prélèvements sanguins réalisé par un personnel compétent, ne sont pas douloureux et ne nécessitent pas d’administration anesthésie/analgésie. Tout au long de la procédure, les souris seront hébergées dans des cages avec un enrichissement adapté (buchette en bois ainsi que du coton pour le nid). Elles auront accès à la nourriture et à l'eau de boisson en continu. En cas d'altération du comportement des animaux des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent y accéder plus facilement. Si aucune amélioration n'est observée, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique et le comportement sont bien connus. L'évaluation du bien-être et de la possible douleur chez la souris peut être réalisée facilement (en observant certains critères) ce qui permet une prise en charge adaptée. Les cellules d’intérêt sont recueillies sur des embryons de souris à 17,5 jours de développement in utéro. Pour le reste du projet nous privilégierons l’utilisation de souris nouveau-nés âgées de 2 à 4 jours. Cette utilisation a pour principal avantage de pouvoir étudier les animaux plus précocement (à partir de 3 semaines post-greffe) et le développement du système immunitaire à partir des cellules injectées est de meilleure qualité ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, dans le cas où il serait difficile de faire coïncider l'obtention de foie fœtal, la modification de ces cellules in vitro et la disponibilité de souris receveuses âgées de 2 à 4 jours, nous utiliserons des souris adultes pour les expériences de greffe.
Travaux pratiques de physiologie dans le cadre de la 2ème année de Licence Nutition Pharmacologie
- Enseignement supérieur
Opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil pour 350 d'entre eux, 525 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques de licence, les autres relevant de procédures d'un niveau de souffrance léger ou modéré. Les étudiants mesurent le volume sanguin au bleu Evans, prélèvent des utérus pour observer les contractions, étudient le transport du glucose dans l'intestin grêle, suivent des rats rendus hypothyroïdiens par traitement chimique pendant huit semaines, d'autres rendus diabétiques par une alimentation grasse, et des mâles castrés dont ils constatent huit semaines plus tard l'involution de la prostate et de l'épididyme. Le porteur affirme que le traitement de la thyroïde et le régime gras "n'induisent pas de phénotypes particuliers de nature à nuire aux animaux". Il écarte les organoïdes et les cellules souches en partie pour une raison budgétaire, les jugeant "inabordables avec nos budgets enseignement".
Objectifs
Les travaux pratiques concernent deux Unités d’Enseignement : une unité de « physiologie » et une unité de « Nutrition ». Dans ces enseignements, les étudiants sont amenés à : - (unité 1) Déterminer le volume sanguin du rat par la méthode de dilution du bleu Evans et de mettre en évidence le phénomène de clairance. Mettre en évidence le transport actif du glucose au niveau des cellules épithéliales de l'intestin grêle de rat. Caractériser les contractions utérines et mettre en évidence la localisation de l’ocytocine et son mode d’action. Dans l'unité 2, trois séances de travaux pratiques : _ Suivre des rats thyroïdectomisés par traitement chimique, effet sur la croissance et sur le métabolisme (consommation d’oxygène) et analyses statistiques ; _ Suivre des rats mâles castrés, mise en évidence de l’involution des organes androgéno dépendants (épididyme, prostate, …) et analyses statistiques _ Mesurer la diurèse, la consommation hydrique et la glycémie de rats diabétiques de type II, induis par une alimentation riche. Cette formation accueille en moyenne 140 étudiants (70 LAS2 et 70 L2) par an donc environs 700 sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Illustration et compréhension des grands concepts physiologiques abordés en cours. Compétences pratiques autour de la paillasse de laboratoire (aseptise du champ opératoire, bonnes pratiques de chirurgie, peser une poudre avec une balance de précision, importance de l’osmolarité des solvants, faire la différence entre un rat et une souris (un écran ne leur apprend pas à faire la différence...), apprendre les bons gestes de manipulation des animaux, observer une chirurgie, les points de suture…)
Procédures
Unité d’enseignement 1 -rats pour le Travail Pratique de mesure du volume sanguin (procédure sans réveil) 30minutes de chirurgie - rates pour le Travail Pratique d’endocrinologie (contraction utérus, procédure de prélèvement de l’utérus sans réveil). -rats pour le transport de glucose (procédure sans réveil) une heure d’intervention. Unité d’enseignement 2 - rats pour la thyroïdectomie chimique (procédure de prélèvement de matériels biologique sans réveil) 8 semaines de PTU et 30 minutes de prélèvements avec l’anesthésie - rats pour le diabète de type 2 (procédure de prélèvement de matériels biologique sans réveil) 8 semaines de nourriture HFD puis 30mins de mesures de consommations de production O2 et CO2 et les prélèvements -rats pour le modèle de castration (procédure légère, administration d’un anti inflammatoire immédiatement après la chirurgie puis 12 et 24 h après), puis 8 semaines après procédure de prélèvement de matériels biologique sans réveil - rats témoin (procédure de prélèvement de matériels biologique sans réveil) 30 minutes de prélèvements avec l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Seuls les rats ayant subi une castration sont susceptibles de subir des nuisances les premiers jours post-opératoires, mais ils seront suivis et traités pour supprimer ses nuisances. Le traitement chimique pour la tyroïde et le régime gras n'induisent pas de phénotypes particuliers de nature à nuire aux animaux. Les grandes fonctions physiologiques (reproduction, respiration, homéostasie intérieure, circulation) sont conservées même si elles sont légèrement modifiées (prise de poids, réduction de la consommation d’o2, hyperglycémie…) les animaux seront suivis tous les jours.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés afin de prélever le matériel biologique (organes, sang, urine) nécessaire au déroulé des travaux pratiques. Ces prélèvements permettront de comparer le poids des organes entre les témoins et les animaux expérimentaux, d'analyser la composition biochimique du plasma et des urines (dosage de glucose, acides gras, enzymes).
Remplacement
Ces travaux pratiques de physiologie sur différents modèles animaux, sont nécessaires pour appréhender les mécanismes intégrés sous-tendant la physiologie et pour évaluer la pertinence de traitements pharmacologiques chez l’Homme, vus en cours. Il n’existe pas de méthodes alternatives pour la physiologie (la culture cellulaire, les Cellules souches pluripotentes induites, les organoïdes, qui nécessitent des mois de différenciations multiples à partir de cellules souches Humaines et qui ne présentent pas de connexions synaptiques complètes ou même de réseaux sanguins et nécessitent du matériel de culture 3D de pointe (inabordables avec nos budgets enseignement), ne sont pas des modèles expérimentaux utiles pour la physiologie. Nous utilisons cependant pour d’autres travaux pratiques dans ces unités d'enseignement des travaux pratiques virtuels types labstation (Électroencéphalogramme, Explorations fonctionnelles respiratoires, électrocardiogramme, Potentiel d’action…) qui sont complémentaires.
Réduction
La mise en commun des résultats de plusieurs groupes de Travaux pratiques permet de minimiser la taille des échantillons par groupe d'étudiants. Les données obtenues dans chaque groupe d'étudiants seront regroupées pour l’ensemble de la promotion, ce qui leur permet, malgré tout, d'utiliser des tests statistiques classiques pour analyser les données. Dans ce nombre sont compris les 10% de perte potentiel lors de la chirurgie (castration) ou pour les travaux pratiques de mesure du volume sanguin (perte possible pendant les prélèvements mais très rare). De plus, dans une optique de réduction des animaux, plusieurs tests et prélèvements seront effectués sur le même groupe de rats témoins. Afin de faciliter l’observation des différents gestes techniques sur les animaux nous avons acquis une caméra vidéo spécifique, ainsi nous pouvons avoir des groupes d'étudiants plus importants pour les travaux pratiques, ce qui réduit le nombre de groupes et donc d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupe avec un nombre de n dépendant de la surface des cages, conformément à la législation. Un suivi permanant avec rotations du personnel les vacances et les weekends pour assurer notamment un accès ad-libitum à l’eau et la nourriture. Une attention particulière sera portée après la chirurgie des animaux. Les animaux opérés le jour même ne sont pas séparés les uns des autres mais gardés en groupe dans la même cage (ainsi ils se réveillent en même temps et ne reste pas seul la nuit). Les opérations cessent en début d’après-midi pour avoir un suivi des animaux dès leur réveil. Les animaux opérés sont stabulés dans une zone avec une chaleur plus importante (lampe) le temps de leur réveil.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de choix reconnue internationalement pour l’étude de la physiopathologie et la pharmacologie. Les rongeurs sont choisis car leurs grandes fonctions, bien que différentes, sont assez proche de celles de l’Homme. De plus, les rats présentent des avantages par rapport aux souris au niveau technique (taille plus grande : pour les canulations, la taille de l'utérus, la quantité de matériel prélevée permettant les analyses biochimiques, la consommation d’o2 est trop faibles chez les souris pour la détecter avec notre matériel de TP). Les modèles utilisés ont déjà été validés dans la littérature et au laboratoire. Rats adultes (200-300 g) pour les procédures 1,2 et 3. Les rats adultes sont plus faciles à manipuler pour les canulations ou pour la surface d'intestin disponible. Pour les procédures 4.5.6 et 7 des rats juvéniles en croissance (75-100 g) que nous allons suivre pendant 2 mois, pour observer justement l'impact des différents traitements sur la croissance des rats.
Caractérisation du rôle du plasmalogène dans la colonisation intestinale de la bactérie Veillonella parvula.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Comprendre comment une bactérie intestinale résiste au stress oxydatif mobilise 216 souris, dont des souriceaux de deux à trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent la bactérie par gavage et par voie rectale une à trois fois, subissent des prélèvements de fèces et un écouvillon buccal deux à trois fois par semaine pendant toute l'expérience, deux prises de sang en quinze jours et, pour certaines, des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant une à deux semaines. Le porteur affirme que l'administration de la bactérie n'a "pas d'effet négatif visible", tout en reconnaissant que les sondes peuvent irriter l'œsophage ou le rectum. Toutes sont tuées à la fin pour prélèvement d'organes, le porteur écartant les organoïdes intestinaux au motif qu'ils ne reproduisent ni l'absence d'oxygène ni les interactions avec l'hôte.
Objectifs
La bactérie d’intérêt est une bactérie commensale, anaérobie, qui est présente dans la cavité buccale et le tractus intestinal chez l’humain. D’après les données de la littérature, elle colonise l’hôte dès la petite enfance et persiste tout au long de la vie. Cependant à ce jour, les facteurs qui permettent à certaines bactéries de s’établir dans le microbiote n’ont été que très peu étudiés. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la résistance au stress oxydatif dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser et à survivre dans la cavité buccale et le tractus intestinal de la souris. Nos travaux in vitro ont mis en évidence le rôle crucial de certains lipides membranaires, les plasmalogènes, dans la résistance au stress oxydatif chez la bactérie d’intérêt. Nous voulons maintenant étudier l’impact des plasmalogènes dans les conditions de vie physiologiques de cette bactérie. Afin de répondre à cet objectif, le projet comportera 4 expériences - Procédure 1 : Comparaison de la colonisation de la souche sauvage et de la souche mutée pour le gène d’intérêt chez des souris adultes sans germe et à flore conrôlée par voie orale et rectale. - Procédure 2 : Test du rôle du plasmalogène dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser dans un écosystème à fortes compétitions. La capacité de colonisation de la souche sauvage et de la souche mutée de la bactérie d’intérêt sera comparée chez des souris conventionnelles après administration orale et rectale. Une étude pilote sera menée afin de savoir si un pré-traitement antibiotique est nécessaire. - Procédure 3 : Etude du rôle du gène d’intérêt dans la primo-colonisation de la bactérie d’intérêt chez des souris souriceaux à flore contrôlée et conventionnelle. Les capacités de colonisation de la souche sauvage et de la souche de la bactérie d’intérêt mutée seront comparées chez des souriceaux âgés de 2 semaines. - Procédure 4 : Test du rôle du gène d’intérêt dans la colonisation par transmission verticale chez les souriceaux à flore conventionnelle. Nous comparerons la transmission des deux souches de la la bactérie d’intérêt depuis des souris parentales vers leurs descendances. Les gène sd’intérêts sont présents chez de nombreuses bactéries intestinales appartenant à différents groupes, ainsi nos résultats fourniront des informations fondamentales au-delà de la bactérie d’intérêt.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l’importance des lipides membranaires dans la résistance au stress oxydatif lors de la colonisation des bactéries commensales. Au-delà du seul cas de la bactérie d’intérêt, ces résultats ont un intérêt plus large car ces lipides sont présents chez un grand nombre de bactéries. A ce jour, nous connaissons très mal les facteurs essentiels à la colonisation des bactéries dans l’intestin et à leur persistance, en particulier pendant la primo-colonisation dans l’enfance. Ce sont des informations importantes car nous savons que le microbiote joue un rôle clef dans cette période de maturation des fonctions intestinales et immunitaires. De plus, ce projet amènera des connaissances spécifiques sur la bactérie d’intérêt, qui est corrélée dans différentes publications avec un moindre développement des allergies dans l’enfance et à des effets anti-inflammatoires dans certains pathologies. Le projet apportera des connaissances essentielles sur la résistance au stress lors des épisodes inflammatoires et permettra de mieux comprendre pourquoi certaines bactéries bénéfiques sont perdues. Ces connaissances sont nécessaires à moyen terme pour comprendre comment restaurer certaines bactéries dans le cadre de maladies inflammatoires. A plus long terme, le projet vise à contribuer au développement d’approches thérapeutiques de modulation ou de restauration du microbiote intestinal.
Procédures
Gavage et administration rectale (quelques minutes sur chaque souris, une à trois fois au cours de l’expérience) Prélèvement de fèces et d’un écouvillon buccal (quelques secondes, 2 à 3 fois par semaine sur chaque animal, pendant toute la durée de l’expérience) Le prélèvement de sang prend environ 1 minute et sera répété 2 fois en l’espace de 2 semaines. Administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 1à 2 semaines.
Impact sur les animaux
Nos données préliminaires montrent que l’administration de la bactérie d’intérêt chez les souris n’a pas d’effet négatif visible sur les animaux : pas de perte de poids ni d’augmentation du stress des animaux, pas d’inflammation au-delà des effets induits par la contention et les administrations orales ou rectales. Les administrations orales et rectales, peuvent causer des irritations de l’œsophage ou du rectum dues à la sonde. Ces irritations seront réduites grâce à l’usage de sonde souple de taille adaptée. D’après notre expérience, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson n’engendre pas chez les animaux de gêne perceptible.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de prélever les organes, du sang et tissus d’intérêt et d’effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la résistance au stress oxydatif dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser et survivre dans la cavité buccale et le tractus intestinal de la souris. Nos travaux in vitro ont mis en évidence le rôle crucial de certains lipides membranaires, les plasmalogènes, dans la résistance au stress oxydatif de la bactérie d’intérêt ce qui a permis de réduire ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet. Nous voulons maintenant étudier l’impact d’autres molécules dans les conditions physiologiques de cette bactérie. L’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour démontrer le rôle d’un gène dans la colonisation intestinale car malgré l’existence de modèles cellulaires in vitro comme les d’organoïdes intestinaux, ceux-ci ne reproduisent pas l’environnement intestinal. La plupart des modèles ne permettent pas de reproduire l’absence d’oxygène. De plus ces modèles ne permettent pas d’étudier les interactions de notre bactérie d’intérêt avec l’hôte et avec les autres bactéries. Enfin, il n’existe pas à ce jour de méthode permettant d’analyser le processus de colonisation intestinale. La souris est un modèle adapté car l’environnement intestinal et la composition du microbiote sont assez similaires à l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide de statisticiens et il est le minimum nécessaire et suffisant pour déterminer si les différentes souches ont des capacités de colonisation différentes dans nos différents modèles. D’après nos résultats préliminaires, nous ne nous attendons pas à ce qu’il existe un biais lié au sexe. Nous suivrons les animaux de manière longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, à la fin du premier réplicat les résultats seront analysés et nous n’entreprendrons le second réplicat expérimental que si cela est justifié par des nécessités statistiques. Nous ré-utiliserons certains animaux de notre expérience pilote à des fins de reproduction, nécessaire à l’expérience visant à vérifier la transmission verticale de la bactérie. Les autres animaux ne pourront être réutilisés car nous devrons précéder au prélèvement du tractus intestinal.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson chez ne provoque pas de nuisances chez animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour étudier les relations hôte-microbiote car l’environnement intestinal murin et la composition du microbiote sont assez similaires à l’humain. Les animaux utilisés seront des souriceaux de 3 semaines, avant que le microbiote n’ait fini sa maturation afin d’évaluer la colonisation de la bactérie pendant la période juvénile, et des adultes de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux avec un microbiote stabilisé et d’étudier la colonisation chez l’adulte.