Procédures légères
Travaux pratiques sur le modèle « chien »
- Formation professionnelle
Apprendre à piquer et à prélever sur un "gros animal" : 16 chiens sont utilisés à cette fin par des stagiaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque chien subit sur une année scolaire jusqu'à 20 administrations et 5 prises de sang, toujours vigile, les injections étant faites par des apprenants en cours de formation, ce qui peut occasionner des douleurs et des hématomes. Réformés à 3 ans, ils sortent du projet et sont proposés à l'adoption. Le porteur décrit un établissement "très réputé" pour cette formation, répondant à des "demandes fortes des professionnels", et affirme que le chien reste une espèce "indispensable" pour le développement de médicaments.
Objectifs
Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques en tant qu’applicateur de procédures expérimentales sur l’espèce chien. Le but est d’acquérir les techniques de manipulations classiques pour réaliser des administrations et des prélèvements en évitant toute souffrance pour l’animal et en garantissant la sécurité de l’opérateur et de l’animal. En parallèle, avec l’utilisation de l’animalerie pédagogique, les apprenants avec encadrement sont initiés aux différentes techniques de base en matière d’hébergement, élevage , techniques d’anesthésie, soins pré/post opératoires et observations des animaux dans le respect du bien être animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux pratiques font partie intégrante de la formation des techniciens applicateur de procédures utilisant des animaux à des fins scientifiques. L’obtention de leur diplôme ou habilitation leur donne la possibilité de travailler dans le cadre de projets scientifiques sur animaux vivants et permet aux employeurs de bénéficier de techniciens compétents techniquement et opérationnels réglementairement dès leur entrée dans l’entreprise. La méthode d’apprentissage basée sur les règles de bien être animal permet d’acquérir les bons gestes afin de garantir sécurité et respect éthique de l’animal. L’animalerie pédagogique permet aux apprenants d’acquérir d’autres notions importantes tel que le maintien des ces animaux en milieu confiné, l’observation quotidienne, l’élevage, l’hygiène et la prophylaxie. L’acquisition des ces compétences théoriques et pratiques démontre l’importance d’avoir des animaux hébergés dans de bonnes conditions et une approche des règles de bien être facilite leur manipulation. Les entreprises sont à la recherche de personnel formé et autonome rapidement. Notre établissement est très réputé dans la formation de techniciens applicateurs grâce à l'expertise technique de formateurs reconnus depuis de nombreuses années et un outil pédagogique tel que l’animalerie complètement rénovée cette année.
Procédures
Toutes les administrations et prélèvements sont réalisées sur animaux vigiles. Le nombre d’administrations et de prélèvements sanguins pour chaque animal est inférieur à 25 pour une année scolaire. L'animal est soumis à 2 administrations maximum par semaine et la durée d'administration est inférieure à 1 minute. Le nombre d'administrations pour un animal est inférieur à 20. Les prélèvements sanguins sont effectués 1 fois par semaine maximum. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute. Le nombre de prélèvements pour un animal est inférieur à 5.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces séances de travaux pratiques sont faiblement invasives.Les nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en apprentissage. La prise de sang peut également engendrer un hématome au niveau du site de prélèvement. La durée de ces nuisances est de l'ordre de quelques secondes pour les injections et quelques minutes pour l'hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux sont conservés à l'issue de cette procédure Ces animaux sont proposés à l'adoption à l'âge de 3 ans.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau applicateur), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives pour les maîtriser au mieux et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations sans animal ou avec « peluche »). La réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles. Le but étant de permettre aux futurs applicateurs d’acquérir les bons gestes en évitant stress et souffrance aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes. L’organisation des travaux pratiques est planifiée de manière à ne pas utiliser nos animaux plus d’une fois par jour ouvré et ce pendant maximum 1 heure par session pour la procédure d’administrations de substances et maximum 1 fois par semaine pour la procédure de prélèvements sanguins. La quantité d’animaux est calculée en fonction du nombre d’apprenants. Une salle de travaux pratiques peut accueillir jusqu’à 16 postes de travail. Les espèces sont séparées et la session dure au maximum 2 heures. 8 chiens sont nécessaires au maximum pour une session de 2 heures. Cette journée type ne se reproduit pas tous les jours de la semaine. Avec 3 salles de travaux pratiques et pour réduire l’utilisation, la planification des sessions de travaux pratiques est lissée au maximum sur la semaine en utilisant les différentes espèces. Les professeurs utilisent d’autres espèces comme les rongeurs ou le lapin lorsqu’ils sont sur un même créneau horaire. A partir de 3 ans d’âge, les animaux sont réformés et sortent du projet pour être proposé à l’adoption. Toutes les phases de vidéos, démonstrations à vide ou sur mannequins permettent de réduire l’utilisation d’animaux vivants. L’entraînement en amont sous forme de répétitions à vide, vise à acquérir plus rapidement le geste sur animal vivant ce qui permet de réduire son utilisation.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont hébergés en groupe socialement harmonieux de 4 ou 8 individus. Les animaux bénéficient d’un programme d’enrichissement alternatif et évolutif (Exemple: plateforme, balle, altère, litière, fenêtre d’observations, musique...). Les animaux disposent entre 2 heures le weekend et 7 heures les jours ouvrés d'une salle détente de 70m² leur permettant de courir librement et d'évoluer sur des structures en 3 dimensions. Tous les animaux sont entraînés à évoluer dans les salles de travaux pratiques par les apprenants. Régulièrement, les animaux sont introduits dans la salle de cours ou dans le bureau de l’animalerie pour améliorer la future socialisation avant proposition d’adoption. Une attention particulière est portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Les élèves peuvent également proposer des mesures de raffinement observées pendant leur période de stage en entreprise. Après chaque procédure d'administration ou de prélèvement, les apprenants effectuent un acte de renforcement positif (récompense alimentaire, caressing). Tous les animaux sont suivis avant, pendant et après les manipulations avec mise en place d'un suivi clinique avec points limites et utilisation d'analgésiques le cas échéant
Choix des espèces
Le chien est une espèce nécessaire à l’apprentissage du futur technicien applicateur de procédures expérimentales sur animaux. En effet, cette espèce nous permet de former les futurs techniciens à la manipulation, l'élevage et aux techniques sur les gros animaux, qui sont des demandes fortes des professionnels. Le chien reste une espèce indispensable pour le développement de médicaments. Les chiens sont âgés au minimum de 1 an à leur arrivée et sont mis à l'adoption à 3 ans d’âge en fin d’année scolaire.
Effets d’une exposition gestationnelle au PFOS à un niveau représentatif de l’exposition de la femme enceinte sur le rôle du placenta dans la régulation des apports en hormones thyroïdiennes de la mère au foetus
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour le prélèvement de leurs placentas et de leurs fœtus, 68 souris femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un composé perfluoré par l'eau de boisson après un gavage initial, sont pesées deux fois par semaine, subissent jusqu'à deux lavages vaginaux, puis une injection d'hormone thyroïdienne et une prise de sang sous sédation. L'effectif se déduit d'un calcul : six temps de prélèvement, quatre souris par temps, deux groupes, soit 48 femelles gestantes, portées à 68 parce que la mise à la reproduction n'aboutit que dans 70 % des cas. Le porteur écarte l'usage de placentas humains recueillis après un accouchement, au motif qu'ils ne renseigneraient pas sur la formation du placenta.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer si une exposition gestationnelle à un contaminant environnemental à des niveaux représentatifs de l’exposition de la femme enceinte peut altérer la fonction placentaire régulant les apports en hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus. Pour cela, nous caractériserons, conjointement dans les compartiments maternel et fœtaux, l'évolution des concentrations d'une hormone thyroïdienne au cours du temps suite à une administration de cette hormone chez la souris.
Bénéfices attendus
Les composés perfluorés sont très persistants conduisant à une exposition importante des populations humaines. Des études suggèrent un lien entre une exposition pendant la grossesse à ce type de composés et des perturbations des fonctions thyroïdienne et placentaire. Or, un apport adéquat d’hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus régulé par le placenta est critique pour le développement du système nerveux central. Dans ce projet nous testerons l’hypothèse qu’une exposition à un composé perfluoré peut altérer les échanges fœtaux maternels en hormones thyroïdiennes. Le projet devrait fournir des bases scientifiques pour une meilleure en prise en compte de l’exposition des femmes enceinte à ce composé et ainsi contribuer de façon significative à l’analyse du risque pour la santé humaine de ce contaminant.
Procédures
Administration du contaminant : 1 fois, maximum 30 secondes. Pesées bi-hebdomadaires : maximum 1 min/pesée. Lavage vaginal : 2 fois maximum, maximum 2 min/lavage. Administration d'hormone thyroïdienne sous sédation : 1 fois, maximum 3 min. Prise de sang sous sédation : 1 fois, maximum 30 secondes.
Impact sur les animaux
La dose en contaminant administrée aux souris est faible et des données préliminaires indiquent que le traitement n'induit pas d'effet toxique détectable en termes de prise alimentaire, abreuvement, prise de poids, comportement, nombre de foetus. Dans de rares cas, un hématome peut se collecter lors de l'administration de l'hormone thyroïdienne. Le prélèvement de sang présente une nuisance limitée pour les animaux car il sera fait sous anesthésie. Les manipulations de routine (pesées bihebdomadaires) peuvent engendrer un état de stress. Toutefois, si les conditions sont bien contrôlées (phase du cycle lumineux, personnel expérimenté, calme) ; l'habituation des animaux se fait vite sans effet notable.
Devenir
Les femelles seront euthanasiées pour récolte des placentas et des fœtus post-mortem.
Remplacement
Le projet porte sur l’impact d’un contaminant sur la fonction placentaire. Des modèles in vitro existent mais aucun ne permet de rendre compte de la complexicité structurale et fonctionnelle d’un placenta in vivo qui détermine et régule les échanges fœtomaternels. Des placentas humains perfusés collectés lors d’accouchements pourraient être une alternative mais cela ne permettrait de déterminer que les interactions directes entre le contaminant et les facteurs placentaires impliqués dans le transfert des hormones thyroïdiennes. En aucun cas ce modèle ne permettrait d’évaluer des effets sur la formation du placenta. Seul un modèle in vivo permet donc de rendre compte de ce niveau de complexité impliquant deux organismes à part entière (la mère et le fœtus) et une barrière physiologique (le placenta).
Réduction
Afin de bien pouvoir caractériser les échanges fœto-maternels d'une hormone thyroïdienne, il faut pouvoir déterminer les concentrations en cette hormone dans le sang maternel, le placenta et les fœtus à différents temps après l’administration de cette même hormone. Des modèles mathématiques permettent de déterminer que 6 temps de prélèvement et 4 souris par temps sont nécessaires pour pouvoir déterminer si le contaminant étudié a un impact sur les échanges fœto-maternels de l'hormone ciblée, soit 2 groupes (animaux traités ou non avec le contaminant)*6 temps*4 souris = 48 femelles gestantes. De plus, le taux de réussite de mise à la reproduction de la souche de souris étant de l’ordre de 70%, 68 souris seront finalement incluses dans le projet.
Raffinement
L’hébergement des souris par paire devrait permettre de limiter le stress des animaux. Les animaux seront traités par l’eau de boisson de façon à éviter toute intervention de type gavage chronique. Le gavage initial permet quant à lui d’atteindre d’emblée l’état d’équilibre des concentrations et ainsi de réduire la durée de traitement. L'administration d'hormone thyroïdienne et le prélèvement de sang seront fait sous anesthésie. Des points limites ont été déterminés avec différents niveaux d'action (de la surveillance à la mise à mort des animaux). Un enrichissement du milieu est prévu sous forme d’abri inox et morceaux de bois à ronger et mise à disposition de matériel de nidification. Les animaux seront placés en cycle lumineux inversé de façon à ce que les interventions de routines (pesée, changes, vérification du bouchon vaginal) réalisées le matin puissent être faites juste au début de leur période d’activité (fin de phase éclairée). Des pesées bi-hebdomadaires seront réalisées de façon à détecter de façon précoce un trouble général. L'administration d'une hormone marquée différentiable lors des dosages de l'hormone endogène permet de s'affranchir d'une ablation de la thyroïde sur ces animaux.
Choix des espèces
Il existe de grandes différences interspécifiques dans la structure histologique du placenta et sa fonctionnalité. Chez la plupart des primates dont l’humain et les rongeurs, le placenta est « hémochorial » : les villosités placentaires fœtales pénètrent jusque dans les vaisseaux sanguins maternels et sont directement en contact avec le sang. La prolificité de l’espèce permet d’obtenir un grand nombre d’échantillons placentaires et fœtaux pour une seule femelle et ainsi de prendre en compte le sexe du fœtus dans l’analyse des données et de réaliser des tests statistiques paramétriques plus résolutifs. La procédure sera mise en œuvre sur de jeunes adultes au pic de fertilité et ayant achevé leur croissance (10 -12 semaines).
Travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal
- Enseignement supérieur
Rats : 330
Écartés des projets de recherche pour leur génotype ou leur sexe, 330 souris et 330 rats issus de l'élevage de l'établissement vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation continue. Tous seront tués, 220 sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Chaque participant dispose d'un animal sur lequel il pratique des injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire et intraveineuse, un gavage, une anesthésie gazeuse puis pharmacologique et trois types de prélèvements sanguins, avant d'apprendre le prélèvement d'organes et l'autopsie sur le cadavre. Le porteur affirme que la maîtrise de ces gestes passe par un apprentissage sur l'animal et ne peut être remplacée, la formation répondant à une obligation réglementaire de vingt-et-une heures sur six ans.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise en place de travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal afin de les aider à acquérir, entretenir, améliorer et/ou développer des compétences et connaissances professionnelles en accord avec le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
La formation des agents qui manipulent les animaux est très importante et incontournable car permet la réduction du stress et de la souffrance chez les animaux. Des agents bien formés seront plus attentif aussi aux signes de détresse des animaux. Cette formation est en conformation aux exigences réglementaires de formation continue des personnels impliqués dans le domaine de l’utilisation des animaux à des fins scientifiques (21h sur 6 ans).
Procédures
Les animaux seront soumis à : une anesthésie gazeuse (1 fois, 5 min) ; une anesthésie pharmacologique (injection intra-péritonéale ou sous-cutanée, 1 fois, 5 min) ; à une injection sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse et gavage (1 fois, 3 min par injection/gavage) sur animal vigile; à 3 types de prélèvements sanguins sous anesthésie pharmacologique (1 fois, 15 min). L’euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des épisodes de contention des animaux vigiles et d’anesthésie, des administrations (sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse, gavage) et des prélèvements sanguins. Ces différentes manipulations peuvent entrainer un stress chez l’animal. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux de réforme et seront tous euthanasiées à l’issue de période de maintien afin de permettre également aux participants des travaux pratiques d’apprendre les modalités de prélèvement d’organes et d’autopsie pouvant être nécessaire dans le cadre de leur activité professionnel.
Remplacement
Savoir mettre en œuvre les gestes techniques de façon appropriée pour la manipulation des rongeurs, dans le respect de leur bien-être, est fondamental pour le personnel manipulant les animaux. L’acquisition et la maitrise des bonnes pratiques nécessitent un apprentissage sur l’animal, encadré par un formateur pédagogue et expérimenté. L’utilisation d’animaux ne peut pas être remplacée dans ce contexte.
Réduction
Les séances des travaux pratiques seront organisées avec la participation de 10 personnes en présence de 2 formateurs. Chaque participant aura à disposition 1 animal (1 rat lors de la séance rat et 1 souris lors de la séance souris). Les formateurs utiliseront 1 animal (1 souris ou 1 rat selon la séance). Étant donné qu’il s’agit de travaux pratiques dispensés dans le cadre d’une formation continue, il est essentiel que chaque participant puisse mettre en œuvre de manière individuelle les gestes enseignés et de limiter le nombre d’interventions sur chaque animal. Les séances seront dédiées seulement aux souris ou aux rats. Il y aura 2 séances par semestre (4 séances par an) avec l’utilisation en totale de 660 animaux (330 souris et 330 rats) sur 5 ans. Pour ces travaux pratiques, seulement des animaux de réforme de la structure (qui héberge la formation) seront utilisés. Ces animaux, n’ayant subi aucune expérimentation au préalable, sont destinés à l’euthanasie car ne disposant pas des critères d’inclusion pour les projets de recherche (génotype, sexe, etc).
Raffinement
La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, température et hygrométrie adaptées, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal ad libitum ainsi que l'eau par abreuvement automatique. L’enrichissement consiste à placer des nids végétaux et des tunnels en carton dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi. Les animaux seront manipulés par les agents de la structure lors du change des cages afin de les habituer à la manipulation avant les travaux pratiques. Les animaux seront transférés dans la salle des Travaux pratiques le jour de la séance (3h avant le début de la séance). Par semestre, il y aura une séance dédiée aux souris et une dédiée aux rats (afin d’éviter les odeurs et ajouter du stress par la présence de plusieurs espèces pendant la même séance). Pour chaque séance pratique, il y aura un maximum de 10 participants et 2 formateurs expérimentés (1 pour 5 participants) qui veilleront à la bonne réalisation par les étudiants des gestes enseignés. Un animal sera utilisé par stagiaire et par formateur, ce qui évite de multiplier les interventions sur un même animal et permet à chaque participant d’être actif et réaliser les gestes enseignés, objectif de la formation. Pendant certaines travaux pratiques, les animaux seront soumis à l’anesthésie gazeuse et/ou chimique. Pendant l’anesthésie, les animaux seront placés sous tapis chauffants, leur température sera suivie à l'aide d'une sonde rectale ainsi que leur réveil.
Choix des espèces
Les formations proposées concernent la manipulation des rongeurs car les souris et rats constituent près de 75 pour cent des animaux utilisés à des fins scientifiques. Nous utiliserons des rongeurs adultes (à partir de 6 semaines) pour faciliter la manipulation des animaux par les participants à la formation.
Etude des mécanismes de sensibilité et évaluation de l’efficacité d’un traitement combinant le Dasatinib et l’Arsenic Tri-Oxide avec la chimiothérapie conventionnelle dans des modèles précliniques de leucémies humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules leucémiques prélevées chez des patients sont injectées à des souris immunodéficientes, qui développent une leucémie humaine, perdent du poids, voient leur rate grossir et finissent prostrées. 920 souris vont être utilisées, 710 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau sévère, avec des ponctions de moelle osseuse douloureuses au point de piqûre. Toutes sont tuées, le porteur jugeant la mise à mort "indispensable" pour isoler et caractériser les cellules leucémiques après traitement. La chimiothérapie administrée provoque une perte de poids et une anémie, et se trouve décrite dans le même paragraphe comme apportant "une meilleure condition physique" aux souris.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à améliorer la prise en charge des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), cancers du sang agressifs affectant aussi bien les enfants que les adultes. Lorsque ces leucémies résistent à la chimiothérapie classique, les chances de guérison diminuent fortement. Pour mieux comprendre ces résistances et trouver de nouvelles solutions, des modèles de recherche ont été développés à partir de cellules leucémiques prélevées chez des patients. Une particularité de ces cellules est la présence d’anomalies génétiques qui influencent leur comportement face aux traitements. Un premier médicament déjà testé, le Dasatinib, permet de réduire la maladie, mais des cellules cancéreuses survivent et provoquent des rechutes. Pour améliorer l’efficacité du traitement, une autre molécule, l’Arsenic Trioxyde, déjà utilisée pour d’autres types de leucémies, pourrait être une solution prometteuse. Des premiers tests ont montré que la combinaison de ces deux traitements semblait fonctionner. L’objectif est maintenant de mieux comprendre leur action et d’évaluer leur efficacité lorsqu’ils sont associés à la chimiothérapie classique, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques. . Trois objectifs spécifiques sont définis : Objectif 1 : Comprendre la sensibilité aux traitements. Nous testerons l’efficacité de Dasatinib + Arsenic Trioxide dans trois types de LAL et étudierons la cause de leur sensibilité aux traitements. Objectif 2 : Suivre la migration des cellules leucémiques Nous étudierons la capacité des cellules leucémiques humaines porteuses des fusions d’intérêt à migrer dans la moelle osseuse des souris, un aspect crucial pour évaluer la progression de la maladie. Objectif 3 : Evaluer l’efficacité de la combinaison de plusieurs traitements. Nous testerons l'efficacité de la combinaison Dasatinib + Arsenic Trioxide avec la chimiothérapie conventionnelle sur des souris greffées avec les cellules leucémiques d’intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche revêt une importance scientifique et de santé publique considérable. Les avancées récentes de la recherche en génétique ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques avec la mise en lumière de nouveaux gènes mutés impliqués dans les LAL. L'identification d'une nouvelle fusion oncogénique dans la LAL éclaire des aspects inexplorés des mécanismes sous-jacents de cette maladie. Cette découverte nécessite des recherches pour comprendre comment certaines fusions géniques influent sur l'évolution de la maladie et sur la réaction aux traitements, ce qui permettrait de développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées et efficaces. Nos travaux pourraient améliorer la prise en charge des patients en fournissant des informations cruciales sur les mécanismes de sensibilité et en proposant des traitements adaptés à chaque profil de patient. Cela inclut la possibilité de développer des thérapies personnalisées qui prennent en compte les caractéristiques moléculaires spécifiques de chaque tumeur, améliorant ainsi les résultats cliniques et la qualité de vie des patients atteints de LAL.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions limitées dans le temps : 1. Une injection unique des cellules leucémiques sera effectuée sous anesthésie. Cette procédure est rapide et ne dure que quelques secondes. 2. Selon les protocoles, certaines souris recevront entre 1 à 4 traitements administrés en moins d’une minute, soit sous anesthésie, soit lorsqu’elles sont éveillées. 3. Trois prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et après analgésie. Cette procédure durera moins de cinq minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires nous permet de prévoir des nuisances pour les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : • L'injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous anesthésie, ce qui minimise le stress opératoire pour l'animal. Le stress principal est lié à la contention avant anesthésie.. Cependant, une douleur peut être provoquée par la piqûre au site d'injection, similaire à ce que ressentent les patients traités par certaines chimiothérapies. • L'expansion des cellules leucémiques humaines dans le modèle murin entraîne à long terme une perte de poids de l'animal et une augmentation de la taille de la rate. À un stade avancé, nous observons parfois une prostration ou un manque de mobilité de l'animal. • La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids et peut entrainer une anémie, due aux effets adverses des agents utilisés. Cette chimiothérapie qui réduit le nombre de cellules leucémiques apporte une meilleure condition physique aux souris chez lesquelles les leucémies se sont amplifiées. • Le prélèvement de moelle osseuse et de sang en tant que procédures invasives dans nos protocoles, peut provoquer une douleur au niveau du site de ponction.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés. L'euthanasie est indispensable pour isoler, caractériser et étudier les cellules leucémiques présentes après les différents traitements ou à différents temps après injection et donc mesurer l’efficacité des thérapeutiques appliquées.
Remplacement
Dans ce projet de recherche, nous avons besoin d'utiliser des modèles animaux, en particulier des souris, pour étudier la leucémie. Ces modèles sont essentiels car ils reproduisent de manière précise comment cette maladie se développe. Bien que nous ayons des méthodes de culture pour certaines expériences, elles ne peuvent pas recréer toutes les étapes complexes de la leucémie qui se produisent dans la moelle osseuse et d'autres organes du corps. Ces modèles animaux ne peuvent pas être remplacés par des systèmes de culture cellulaire en laboratoire pour étudier comment la leucémie se développe. Ils sont complémentaires et indispensables pour notre recherche. En parallèle, les expériences réalisées en laboratoire ne peuvent pas reproduire de manière exacte les réponses variées que l'on observe dans le corps humain, ce qui est crucial pour évaluer les effets de potentiels traitements, chez les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique. En résumé, bien que les cultures cellulaires soient utiles pour certaines expériences, elles ne peuvent pas remplacer les modèles animaux nécessaires pour comprendre et traiter la leucémie de manière efficace. Ces souris sont essentielles pour ce projet car elles nous offrent une méthode précise et fidèle pour tester de nouveaux traitements dans un environnement qui ressemble à celui des humains.
Réduction
Chaque patient réagit différemment à la chimiothérapie. Nous avons observé cette variabilité de réponse à travers nos modèles de xénogreffes. Il est donc judicieux d'utiliser 3 à 4 échantillons de cellules leucémiques de patients par type de leucémie aiguë lymphoblastique. Par ailleurs, les concentrations des médicaments à utiliser sont déjà établies dans la littérature et dans le laboratoire : leur efficacité est confirmée par des résultats précédents du laboratoire. Il n'est donc pas nécessaire de faire des ajustements qui exigeraient plus d'animaux dans cette étude. Le nombre minimum d'animaux requis pour atteindre chaque objectif avec une puissance statistique adéquate a été déterminé à l'aide d’un logiciel spécifique.
Raffinement
Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter les souffrances, douleurs et angoisses inutiles, avec des points limites définis à cet effet. Afin d'éviter toute douleur, souffrance et angoisse liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de la moelle osseuse afin de prévenir les douleurs pouvant survenir après l'intervention. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Nous utilisons en laboratoire des souris adultes immunodéficientes depuis de nombreuses années, car elles ne rejettent pas les greffes de cellules humaines. Ce modèle est particulièrement pertinent pour étudier les cancers du sang, car il reproduit fidèlement l'expansion des cellules leucémiques observée chez les patients. Les cellules cancéreuses provenant de patients interagissent avec tous les éléments cellulaires et moléculaires de la souris, de la même façon qu’elles interagissent dans l'organisme humain. Ce modèle nous permet également d'explorer une question cruciale liée à la diversité inter-individus face à une même maladie. En effet, le terme "leucémie" regroupe plusieurs sous-types, chacun présentant des variations qui influencent la réponse au traitement. Contrairement à des modèles murins où seule une leucémie murine se développe, notre approche de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d'aborder cette diversité inter-patients. Ainsi, ce modèle devient une référence préclinique pour étudier la maladie humaine dans un contexte murin bien établi et documenté dans la littérature spécialisée.
Etude préclinique pour tester l’effet de 2 molécules sur le phénotype cardiaque des souris Chchd10S59L/+
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique et reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant seize semaines, avec deux échographies cardiaques sous anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes et deux prélèvements sanguins. Le porteur teste deux molécules déjà utilisées chez l'être humain dans d'autres maladies et renvoie l'effet sur les troubles neurologiques à une étude ultérieure. Un amendement ajoute soixante souris au protocole, "suite à un problème lors de la première tentative de réalisation", dans un projet qui présente par ailleurs son effectif comme réduit au minimum.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système neuromusculaire et entraine la mort par insuffisance respiratoire dans les 3 à 5 ans suivant l'apparition des symptômes. L'une des causes probable de cette maladie est une mutation génétique modifiant une protéine. Pour comprendre le rôle de cette protéine, une souris portant la même mutation a été générée. Ces souris présentent des déficits similaires à la maladie humaine, notamment au niveau cardiaque. A ce jour, il n’existe aucun traitement efficace contre la SLA. Le but de cette étude est de tester deux molécules déjà utilisée chez l'Homme dans d'autres pathologies. Leur mécanisme d'action pourrait en effet lutter contre les effets de la mutation de cette protéine. Nous réaliserons ainsi un traitement de 8 à 24 semaines d’âge pour tester l'effet des 2 molécules sur les symptômes cardiaques des souris. Pour cela, nous effectuerons des échographies cardiaques et un suivi du poids des animaux durant l'ensemble de la durée du traitement. Des analyses sanguines seront aussi effectuées. L’effet du traitement sur le l'aspect neurologique qui apparait plus tardivement, fera l’objet d’une autre étude.
Bénéfices attendus
Aucun traitement n’étant disponible à ce jour pour agir contre la SLA, il est primordial de mieux comprendre cette pathologie, et notamment les mécanismes responsables de la mort des neurones moteurs, dans l’optique à plus long terme de développer des recherches à visée thérapeutique. La réalisation de cette étude préclinique sur un modèle murin est indispensable pour savoir s'il est possible d'améliorer les maladies des motoneurones en général mais aussi les troubles cardiaques et musculaires développés par ces animaux. Une meilleure connaissance du modèle sera aussi obtenue avec des tests permettant de déterminer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique de ces animaux, permettant une possible modélisation de l'aspect neurologique des pathologies modélisées
Procédures
2 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. Une injections intrapéritonéales par jour pendant maximum 16 semaines. 2 évaluations cardiaques réalisées par imagerie avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. un autre lot d'animaux aura uniquement une injection intraveineuse et un prélévement sanguin, sous anesthésie. Ces deux gestes ne durent que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une anesthésie gazeuse lors des échographies cardiaques induisant un stress léger ainsi que des prélévements sanguins induisant une légère douleur. Les injections journalières par contention induiront un stress modéré.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences ont été réalisées précédemment sur des cellules de patients porteurs de mutations de ce gène d'intéret. Ces expériences ont montré que les troubles cliniques de SLA chez l’homme n’étaient pas limités au système nerveux central et que d’autres tissus, tels que les muscles, étaient affectés. Il n'est malheureusement pas possible de tester des traitements sur ces cellules musculaires en culture pour mettre en évidence une restauration de la fonction cardiaque. Seul un modèle animal permettra d’appréhender tous ces aspects : effets de la mutation d’intérêt dans différents tissus et à différents âges. Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 15 animaux, cet effectif étant suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). Nous souhaitons donc employer un total de 60 souris pour ce protocole, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou suite à un traitement. Par ailleurs, nous utiliserons également 48 animaux produits dans la fécondation in vitro permettant la création de la cohorte expérimentale. Ces derniers permettront de mieux connaitre la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique afin d'envisager ensuite une analyse de l'effet thérapeutique des molécules sur les troubles neurologiques existants à un stade plus tardif. Amendement 1: Un deuxième groupe de 60 souris devra être employé suite à un problème lors de la première tentative de réalisation du protocole.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour cette étude préclinique. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux seront des souris âgées de 8 semaines au début du protocole, afin de travailler sur un modèle adulte où la fonction cardiaque est développée mais avant l’apparition de l’altération du phénotype afin d’agir de façon précoce avec le traitement avec les deux molécules.
Evaluation de l’effet d’une eau aux propriétés oxydo-réductrices modifiées sur l’inflammation gastrointestinale chez le cheval
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
Pour vérifier si une eau de boisson modifiée par une réaction chimique réduit l'inflammation gastro-intestinale, 12 chevaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent neuf prélèvements sanguins hebdomadaires, deux fouilles rectales et deux intubations naso-gastriques sous tranquillisant, chaque examen étant précédé d'une mise à jeun de quinze à vingt heures, eau retirée une heure avant. Le porteur reconnaît qu'aucune étude scientifique n'a objectivé les améliorations rapportées jusqu'ici avec cette eau. Aucun dommage n'étant attendu, les chevaux ne sont pas tués et pourront être réutilisés dans d'autres études.
Objectifs
Les inflammations gastro-intestinales sont très fréquentes chez les chevaux. Ainsi, pour l’estomac on ressence jusqu’à 70% de gastrites chez les chevaux sans activité physique. La prévalence spécifique des inflammations du colon sont moins documentées chez le cheval mais ces conséquences peuvent être très importantes car elles sont souvent associées à des diarrhées aigües et à une déshydratation rapide. Une amélioration de la condition des chevaux présentant des symptômes liés à ces inflammations a été observée avec la consommation par les chevaux d’une eau de boisson modifiée par une réaction chimique. Cependant, aucune étude scientifique n’a encore objectivé ces améliorations. L’objectif de ce projet est donc de décrire l’impact de l’administration de cette eau de boisson modifiée par une réaction chimiquesur l’inflammation gastrointestinale chez le cheval.
Bénéfices attendus
Les ulcères gastriques et l’inflammation du gros intestin du cheval touchant un très grand nombre de chevaux, ce projet pourrait permettre de proposer une solution alternative à la guérison de ces pathologies.
Procédures
Au cours du projet, les chevaux seront soumis à neuf prélèvements de sang séparés chacun d'une semaine et à deux prélèvements de fèces séparés de quatre semaines. Ces prélèvements seront réalisés sur animal vigile et ne dureront que quelques minutes. Les chevaux seront aussi soumis à deux intubation naso-gastriques séparées de quatre semaines. Ces intubations seront réalisées sur animal tranquilisé. Les chevaux seront mis à jeun la nuit précédente (environ 15h) par la pose d’un panier de mise à jeun alimentaire et l’eau sera retirée une heure avant les prélèvements qui auront lieu le matin.
Impact sur les animaux
La fouille rectale peut entrainer une gêne passagère qui cesse au moment du retrait du bras du manipulateur. De même, une gêne passagère peut être éprouvée au moment de la ponction dans la veine jugulaire, mais celle-ci ne devrait pas durer plus de quelques minutes. Les chevaux sont mis à jeun la nuit précédant les observation et biopsies des muqueuses gastriques, soit pendant une période de 15 à 20h (bien inférieure aux 48h de mise à jeun préscrites par les vétérinaire dans leur pratique) par la pose d’un panier de mise à jeun alimentaire et l’eau est retirée une heure avant les prélèvements qui ont lieu le matin. Cette mise à jeun se fait durant la nuit afin de moins perturber les chevaux dont l’activité alimentaire est généralement réduite pendant cette période nocturne. Les observations sont réalisées grâce à une intubation naso-gastrique. Ce geste fréquemment utilisé sur le terrain peut entrainer une gêne légère au moment de l’introduction de la sonde dans le nez du cheval qui ne dure que quelques minutes puisqu’elle cesse une fois la sonde introduite dans l’œsophage.
Devenir
Il n'est pas attendu de dommage pour les animaux impliqués dans ce projet et le produit testé n'a pas d'effet rémanent. Les chevaux pourront donc être réutilisés sans effet cumulatif.
Remplacement
Le projet doit obligatoirement être conduit avec des animaux vivant, car il n'existe pas de modèle permettant mimer l'effet de l'alimentation sur l'inflammation gastro-intestinale chez le cheval.
Réduction
Les chevaux seront conduits en conditions contrôlées et uniformes afin de minimiser les variations liées à l'environnement. Une étude statistique à partir des résultats d'une précédente étude a permis de déterminer le plus petit nombre d'animaux à inclure dans chaque groupe tout en assurant la fiabilité des résultats. Une analyse statistique sera appliquée sur les résultats obtenus.
Raffinement
Tous les prélèvements ont lieu dans un travail (semblable à une barre d’échographie/insémination) adapté à la contention des chevaux pour éviter tout risque de blessure. De plus pour les prélèvements de fèces, la main du manipulateur est enduite de gel afin de diminuer les frottements lors de l’introduction dans l’ampoule rectale. Afin de réduire le stress lors des observations et prélèvements gastriques, un tranquillisant est administré par injection intra-veineuse. L’endoscope utilisé est spécialement destiné à une utilisation en équine ce qui permet d’atteindre l’estomac tout en laissant une partie assez longue à l’extérieur pour suivre les mouvements éventuels de la tête du cheval sans le contraindre. Son extrémité est également recouverte de gel pour faciliter son passage. De plus, les chevaux ont été entrainé en amont du projet à rentrer et rester dans le travail et à accepter dans le calme les prélèvements réalisés. Les chevaux étant des animaux grégaires, ils sont sortis tous les jours au paddock en groupe. Ceci permet de respecter leur bien-être. Ils sont hébergés dans des boxes séparés par des barreaux leur permettant de se voir et de se sentir, avec une litière de paille qui leur apporte confort et permet de diminuer l’ennuie, car les chevaux peuvent fouiller dans celle-ci. De plus, au quotidien, le personnel animalier observe le comportement de chaque cheval matin et soir au moment de la distribution des repas afin de repérer les signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les chevaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai.
Choix des espèces
L'essai doit nécessairement être conduit avec des chevaux car il s'agit de l'espèce cible du produit étudié et la relation digestion/inflammation est spécifique à chaque espèce. Les chevaux utilisés sont adultes (entre 8 et 12 ans) car c'est le stade physiologique ciblé par l'étude.
Contribution de la dystrophine dans différents domaines musculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une échelle de douleur à quatre niveaux encadre le protocole, le niveau 3 correspondant à une paralysie des membres, qui déclenche un analgésique plus puissant puis la mise à mort si nécessaire. 454 souris mâles porteuses de la dystrophie de Duchenne vont être utilisées, 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un virus vecteur par voie intramusculaire à six semaines, dans l'abdomen à deux à quatre jours de vie, ou dans le sinus rétro-orbitaire à dix-sept mois, et la mesure de la force contractile se fait sous anesthésie par huit stimulations successives, sans réveil. Le porteur écrit collecter les biopsies musculaires de tous les animaux et ne prévoir ni réutilisation ni adoption.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie dégénérative grave et progressive causée par des mutations du gène DMD codant pour la protéine dystrophine. Malgré des efforts considérables, la DMD reste incurable et de nombreuses questions fondamentales sur ses mécanismes pathologiques restent en suspens. Une question particulièrement importante est de savoir quelle partie du muscle la dystrophine (perdue dans la DMD) est fonctionnellement importante pour prévenir le développement de la DMD. La dystrophine est une protéine structurelle clé qui aide à maintenir l'intégrité des fibres musculaires pendant la contraction. Il y a trois décennies déjà, il a été reconnu qu’elle est plus fortement exprimée à la jonction neuromusculaire (JNM) et à la jonction myotendineuse (JMT), que dans le reste de la myofibre. Ces sites sont essentiels à la fonction musculaire : la JNM est l'endroit où les impulsions nerveuses déclenchent la contraction musculaire, et la JMT est l'endroit où les fibres musculaires se connectent aux tendons, dissipant ainsi la force de contraction. L'accumulation de preuves commence à suggérer que la dystrophine pourrait être plus importante dans certaines zones musculaires que d'autres. Par exemple, des études récentes sur l'expression génétique ont révélé que le gène responsable de la pathologie est plus fortement exprimé dans la JMT. De plus, une étude de thérapie génique à faible dose a suggéré que la restauration de ce gène dans la JMT pourrait être suffisante. En outre, des perturbations de la JMT et de la JNM ont été signalées chez les souris mutantes pour ce gène avant le début de la nécrose. Compte tenu de ces observations, il devient de plus en plus essentiel de comprendre les contributions fonctionnelles de la dystrophine dans les différents domaines musculaires. Cependant, cette question est difficile à étudier avec les constructions génétiques conventionnels chez la souris car ils n'ont pas de spécificité spatiale. Nous avons donc développé de nouvelles constructions génétiques permettant de manipuler uniquement les noyaux de la JNM ou de la JMT. L'objectif de notre projet est maintenant de répondre à cette question en utilisant notre approche unique. De plus cette nouvelle approche pourrait donner lieu à une thérapie génique plus ciblée et donc potentiellement avec moins d’effets secondaires.
Bénéfices attendus
La réponse à la question de notre projet de recherche devrait avoir un impact significatif sur la façon dont nous comprenons la DMD et sur l'élaboration de meilleures stratégies thérapeutiques. Cependant, les outils précédemment disponibles dans le domaine musculaire ne peuvent pas être utilisés car ils n'ont pas de précision spatiale à l'intérieur des cellules musculaires. En revanche, les outils que nous avons développés permettent de manipuler la dystrophine uniquement dans des zones précises de la cellule musculaire et donc d’aller plus loin dans la compréhension du fonctionnement de la pathologie et de sa prise en charge.
Procédures
1. Injection intramusculaire d’AAV (Virus Adéno Associé) sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les jeunes adultes de 6 semaines, injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et injection d’AAV dans le sinus retro-orbitale sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les animaux âgés de 17 mois. 2. Prélèvement de sang au sinus retro-orbital sera immédiatement suivi de la mesure de la force contractile sous la même anesthésie générale (sans réveil). Le prélèvement ne durera qu’une minute. 3. Mesure de la force contractile in situ (sans réveil) : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation et les souris encore sous anesthésie seront mises à mort.
Impact sur les animaux
La souris que nous utiliserons dans ce projet est un modèle animal largement utilisé pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. En tant que telles, ces souris sont atteintes de dystrophie, elles présentent un phénotype de faiblesse de sévérité légère musculaire à partir de l’âge de 4 mois, qui n’est pas encore visible d’un point de vue physique ou comportemental, puis une fibrose et des faiblesses évidentes au niveau des muscles du diaphragme et du cœur de sévérité modérée aux alentours de 17 à 22 mois pouvant entraîner des difficultés pour se déplacer et donc se nourrir et s’abreuver. Bien que nous générions de nouvelles lignées en croisant les souris atteintes de DMD avec d’autres lignées, ces autres lignées elles-mêmes n'ont pas de phénotype. Par conséquent, le phénotype des nouvelles lignées est équivalent à celui des souris atteintes de DMD. Nous espérons supprimer ou atténuer les symptômes chez ces souris mutantes injectées avec notre AAV (Virus Adéno-Associé), en restaurant la présence d’une protéine dystrophine courte et donc passer d’une sévérité modérée à une sévérité légère pour les animaux âgés et de légère à pas de phénotype visible pour les jeunes animaux et les adultes de moins de 4 mois. Les jeunes animaux qui seront injectés avec des AAV ayant pour but de muter la dystrophine devraient voir apparaître un phénotype semblable aux souris présentant la DMD et donc passer de «pas de phénotype » à un phénotype de sévérité légère. Nous utiliserons également différentes techniques d'injection à différents âges : l’injection intraveineuse dans le sinus retro-orbital, l’injection intra-musculaires, le prélèvement de sang dans le sinus retro-orbital. L’injection intraveineuse et le prélèvement de sang ne seront réalisés qu’une seule fois par animal sous anesthésie. Il s’agit de techniques fiables qui n’induisent pas d’effets indésirables. L’injection intramusculaire qui sera aussi réalisée sous anesthésie provoque une douleur musculaire passagère due à l’introduction de l’aiguille qui endommage les fibres musculaires. Les animaux seront aussi soumis à la mesure de la force de contraction musculaire sous anesthésie finale.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de différencier les cellules musculaires in vitro, ces cellules ne contiennent pas de domaines musculaires (JNM et JMT) et sont toujours immatures. Par conséquent, de nombreux aspects de la DMD ne peuvent pas être modélisés en culture cellulaire. De plus, notre projet vise à étudier l'impact thérapeutique sur la physiologie animale complète qui implique de multiples types de cellules et de tissus. L'expérimentation animale est donc essentielle à la réalisation de notre projet.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous choisirons un point temporel par condition expérimentale. Grâce à des recherches antérieures approfondies dans le domaine de la DMD, ces points expérimentaux sont déjà bien établis, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. L’utilisation d’AAV nous permet de produire moins d’animaux pour obtenir nos animaux d’expériences. Nous avons déterminé que 7 animaux par groupe de traitement seront nécessaires afin d'obtenir une robustesse statistique. Nous n'utiliserons que des souris mâles car le gène responsable de la pathologie est localisé sur le chromosome X et les patients atteints sont principalement des hommes. Nous utiliserons également des contrôles internes pour réduire le nombre d'animaux. Pour l'injection intramusculaire, le muscle controlatéral sera injecté avec un virus vide pour servir de contrôle négatif. Pour l'injection intrapéritonéale chez les nouveau-nés, des animaux sans génotype complet mais injectés avec le virus serviront de contrôle négatif. Ces considérations permettent d'éviter de mettre à mort des animaux supplémentaires pour obtenir des échantillons de contrôle.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre traité ou non, type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres traités ou non), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les injections, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les prélèvements sanguins et la mesure de la force musculaire in situ seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les outils génétiques que nous avons construits sont créés chez la souris car les modifications génétiques utilisées sont mieux établies dans ce modèle. De plus, la souris mutante que nous utiliserons est un modèle de DMD déjà existant et bien connu. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. En fonction de l'objectif des expériences, nous devrons modifier le temps d'injection. Pour obtenir une promesse de thérapie rapide et simple, l'injection intramusculaire sur un jeune animal (6 semaines) est appropriée. Pour obtenir un effet de « sauvetage » (réexpression de la protéine active) et prévenir la maladie, une injection intrapéritonéale précoce sur un nouveau-né est appropriée. Enfin, pour pouvoir guérir une maladie déjà existante ou tardive, l'injection dans le sinus retro-orbital sur un animal âgé (17 mois) est appropriée. Notre projet couvre ces trois scénarios pathologiques. Nous attendrons l’apparition des phénotypes dommageables qui devraient survenir à partir de l’âge de 4 mois pour réaliser le dosage de la créatine kinase sérique, la mesure de la force contractile et collecter les tissus pour les analyses histologiques. Les animaux seront donc testés et mis à mort à l’âge de 6 mois sauf pour l’injection dans le sinus retro-orbital sur animaux âgés qui seront mis à mort à 22 mois.
Etude d’un candidat médicament sur l’activité quotidienne et les défauts moteurs d’individus atteints de maladies liées au défaut de transport axonal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris utilisées portent les mutations de la maladie de Huntington ou du syndrome de Rett et développent avec l'âge une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids continue. 188 vont être utilisées, dont 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes des mâles. Elles reçoivent un candidat médicament, subissent un prélèvement de sang à la queue au début et à la fin du traitement, et passent des tests de motricité et de force musculaire d'une durée maximale de trente minutes, que le texte ne nomme pas. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et documenter le mécanisme d'action du traitement.
Objectifs
Le projet de recherche vise à étudier l’effet d’un candidat médicament sur l’activité quotidienne, très diminuée chez d’individus atteints de la maladie de Huntington ou du syndrome de Rett. Ce candidat médicament a déjà montré des résultats positifs dans le traitement de symptômes moteurs et cognitifs caractéristiques de ces maladies. Ce projet a donc pour objectif de voir si, en plus d’avoir des effets positifs sur les symptômes des maladies, ce médicament démontre aussi un effet positif sur l’activité quotidienne, très diminuée dans ce genre de maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris de cette maladie génétique et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique du médicament ciblant les symptômes de cette maladie avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de la souris au début et à la fin du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin qui n’engendrera qu’un léger stress à l’animal. L’efficacité du traitement sera appréciée par des tests comportementaux, d’une durée maximale de 30 minutes. Ainsi, sur chaque animal, des tests de comportement moteur seront réalisés afin d’évaluer l’efficacité du traitement sur la motricité et sur la force musculaire.
Impact sur les animaux
Les modèles animaux de ces deux maladies présentent des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Les animaux présentent notamment une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids constante, progressive et indépendante de la prise alimentaire.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de ces maladies sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec notre molécule sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de ces maladies. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Nos précédentes études ont montré que notre molécule améliorait certains symptômes caractéristiques de ces maladies neurodégénératives. Ce projet vise maintenant à étudier l’effet de notre molécule sur l’activité quotidienne, fortement altérée chez les patients atteints de ces maladies. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de ces maladies
Réduction
La variabilité entre individus est réduite par l'utilisation de souches de souris dont le risque de dérive génétique est maitrisé, limitant au minimum le nombres d’animaux nécessaire pour mener à bien ce projet. Ce nombre est par ailleurs validé par des tests de puissance statistiques robustes. Pour les deux modèles, nous limiterons nos études aux mâles puisque les différences phénotypiques mâles/femelles empêchent de regrouper les résultats au sein d’un seul et même groupe de traitement. L’utilisation de femelles obligerait donc à doubler l’effectif d’animaux par groupe afin que la puissance statistique soit conservée.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages dédiées permettant l’étude de l’activité quotidienne sans intervention extérieure, donc sans perturber les animaux. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites adaptés au développement de maladies liées au défaut de transport axonal. De plus, un protocole d’intervention ayant pour but de limiter ou arrêter l’inconfort de l’animal avant que les symptômes ne deviennent trop importants sera mis en place. Par ailleurs, des croquettes ainsi que de l’alimentation hydratée et hypercalorique seront posées à même la cage afin de limiter l’effort que l’animal doit fournir pour se nourrir et s’hydrater. Les tests comportementaux seront réalisés par le personnel compétent et sensibilisé à la contention douce, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces tests.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de ces maladies.
Impact du microbiote implanté à la naissance par une supplémentation anténatale en Human Milk Oligosaccharides (HMO) sur la prévention de l’allergie alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des femelles gestantes reçoivent un complément alimentaire jusqu'au dix-neuvième jour de gestation, puis sont tuées pour une césarienne. Les nouveau-nés sont confiés à des femelles adoptantes dont la portée est tuée aussitôt le remplacement fait, et les adoptantes le sont à leur tour après le sevrage. La descendance reçoit deux injections d'allergène à vingt-huit et trente-huit jours, puis un gavage à quarante-cinq jours qui déclenche la réaction allergique, chute de température, irritation de la bouche et des oreilles, isolement, avant d'être tuée à son tour. 193 souris vont être utilisées au total, 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et aucun des trois groupes ne sort vivant du protocole.
Objectifs
La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.
Procédures
L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendants au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.
Devenir
Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.
Réduction
Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendants) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.
Choix des espèces
Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles et femelles seront séparés, afin de poursuivre le protococole.
Evaluation clinique et biologique de marqueurs de biopsie mammaire biodégradables et visibles en imagerie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Tester la biocompatibilité et la dégradation de marqueurs de biopsie mammaire, étape de développement d'un dispositif médical destiné aux patientes, conduit ici à utiliser 115 rates, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit plusieurs clips implantés sous la peau sous anesthésie générale et locale, puis des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, quatre le premier mois puis une par trimestre jusqu'à trente-six mois. Douze rates subissent en plus jusqu'à huit prélèvements sanguins en deux ans. Le porteur indique implanter plusieurs clips par animal "afin d'augmenter le nombre d'essais et ainsi réduire le nombre d'animaux", et retient des femelles parce que les marqueurs sont destinés à des femmes.
Objectifs
Le cancer du sein est un problème de santé publique. Il représente près de 30 % des cancers féminins. Lorsqu'une anomalie est découverte lors d'un examen d’imagerie (mammographie ou échographie), un prélèvement d’un échantillon de tissu ( biopsie tissulaire) est effectuée pour établir un diagnostic et un petit marqueur d’environ 5 mm appelé "clip" est placé sur le site prélevé. Il permet de marquer la zone biopsée pour pouvoir la retrouver facilement et précisément pour la suite de la prise en charge. Les clips de dernière génération sont composés de matériaux qui permettent aussi une détectabilité en échographie limitant ainsi l’usage de la mammographie et des radiations ionisantes. Ces marqueurs sont particulièrement utiles dans le suivi des lésions dont le caractère malin n’est pas confirmé. Les femmes présentant de multiples lésions solides sont souvent suivies pendant des mois, et les clips mis en place lors de la biopsie peuvent clairement indiquer quelles lésions ont été prélevées, ce qui évite de refaire des biopsies itératives. Cependant, le clip reste en place de manière permanente, même si le résultat de la biopsie ne révèle pas de cancer. C'est pourquoi le développement de marqueurs biodégradables est devenu un enjeu important dans ce cadre spécifique des biopsies mammaires. Les marqueurs sont conçus pour être implantés dans le corps humain et devront donc répondre à des exigences strictes. Ils devront être non toxiques et ne pas déclencher de réactions indésirables. Ils devront aussi répondre à un cahier des charges contraignant (injection à travers des aiguilles de biopsie, biocompatibilité et visibilité en imagerie multimodale), conserver une bonne visibilité en imagerie pendant une période d'environ 2 ans permettant ainsi un suivi médical prolongé et avoir un taux de dégradation contrôlé et progressif dans le temps. Notre laboratoire a développé des marqueurs de biopsie mammaire biodégradables visibles en imagerie multimodale. L’objectif de ce projet est de 3 ordres : évaluer in vivo leur biocompatibilité, leur visibilité en imagerie et leur biodégradabilité dans le temps.
Bénéfices attendus
Les marqueurs biodégradables représentent une avancée majeure pour répondre aux limites des solutions actuelles, notamment leur faible visibilité durable aux ultrasons et leur nature non biodégradable. En se dégradant naturellement après leur usage, ces marqueurs offrent une surveillance précise pour les traitements ou suivis à long terme, tout en éliminant les désagréments des implants permanents. Cette approche réduit non seulement le risque de réactions inflammatoires chroniques souvent associées aux corps étrangers, mais elle améliore également le confort et la qualité de vie des patientes. En intégrant cette technologie, il devient possible d’optimiser les protocoles de suivi, de rationaliser les interventions, et de mieux aligner les soins sur les besoins des patientes. Ce projet, centré sur l’expérience des patientes atteintes de cancer du sein, vise à améliorer les résultats cliniques et à répondre à la demande croissante pour des diagnostics et traitements plus précis, sûrs et axés sur le vécu des personnes concernées. Il incarne une étape importante vers des soins personnalisés.
Procédures
Les rats subiront une courte intervention (10 minutes environ) sous anesthésie générale et locale pour l’implantation sous-cutanée des clips . Ils seront ensuite soumis à plusieurs sessions d’imagerie espacées dans le temps (d'une durée de 10 minutes) et sous anesthésie générale (4 séances en 1 mois puis tous les 3 mois jusqu’à 24-36 mois). Au point terminal, un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie (d’une durée de 1 minute). Pour 12 animaux, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse, d'une durée de 1 minute à une fréquence de un prélèvement par trimestre (au maximum 8 prélèvements sur 2 ans).
Impact sur les animaux
Les rats subiront une courte intervention sous anesthésie pour la pose du clip (environ 5 minutes) qui génèrera une douleur légère et de courte durée (un jour) au site d’injection. Une inflammation locale légère à modérée peut survenir au site d’implantation du clip. Ils seront ensuite soumis à plusieurs sessions d’imagerie espacées dans le temps (4 séances en 1 mois puis tous les 3 mois jusqu’à 36 mois maximum) qui n’induiront aucun effet indésirable hormis un stress léger lié à l’anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus sur lesquels des analyses histologiques seront réalisées (observation fine des tissus et cellules sous microscope).
Remplacement
Dans le cas des études de biocompatibilité portant sur la sécurité d'utilisation d'un dispositif médical, le recours à l’animal est incontournable car nous devons déterminer la toxicité éventuelle des marqueurs de biopsies en mesurant une potentielle réaction inflammatoire aiguë ou chronique en réaction à l’implantation d’un corps étranger (fibrose, inflammation). Cette réaction immunitaire appelé « réponse de l’hôte » est complexe et fait intervenir différents mécanismes biologiques qui ne peuvent être modelisés finement in vitro ou in silico. De plus, les études de biodégradabilité de ces marqueurs doivent être évaluer in vivo afin de caractériser le profil de dégradation du dispositif en condition physiologique et en temps réel. Les essais préliminaires de dégradation in vitro ont fournis un début de réponse mais ne donnent qu’une estimation de leur durée de vie.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimal d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et la réalisation des objectifs de l'étude. Des calculs statistiques ont été effectués sur la base d'études similaires dans ce domaine. Trois clips ne présentant pas de toxicité dans les études in vitro seront testés lors d’une étude pilote sur un petit nombre de rats et sur trois temps court (1, 7 et 15 jours) afin de sélectionner les marqueurs ne présentant pas de réaction inflammatoire aiguë et une bonne visibilié en imagerie (échographie et rayons X). Une étude au long cours sera ensuite menée avec au maximum 2 marqueurs de biopsies. Plusieurs clips seront implantés par animal afin d’augmenter le nombre d’essais et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les implantations des marqueurs de biopsie seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse associée à une anesthésie locale au site d’implantation. Les rats seront stabulés en groupe sociaux par 2 ou 3 par cages dans un environnement enrichi afin de favoriser l’activité et les comportements naturels. Les rats qui seront gardés longtemps (plus de 3 mois) seront hébergés par 2 en prévision de leur prise de poids par rapport à la surface de la cage. Les animaux seront observés quotidiennement pendant les 15 premiers jours puis 2 fois par semaine si aucune toxicité locale n’est relevée. La fréquence d’observation pourra être augmentée en cas d’anomalie observée. Des points limites adaptés seront mis en place et strictement appliqués. Une revue régulière de la littérature liée aux 3R sera effectuée afin d'identifier les possibilités d'amélioration qui pourraient être appliqués à ce projet.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur le rat car nous réalisons des études de toxicité et de biodégradabilité sur une longue durée et les rats ont une durée de vie plus longue que les souris (3 ans versus 2 ans). Il offre également une plus grande surface corporelle permettant l’implantation de plusieurs clips sur différents sites. Nous utiliserons des femelles car ces marqueurs de biposies sont destinés à des femmes présentant une anomalie lors d’une mammographie qui nécessitera une biopsie diagnostique.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou du composé X dans la cicatrisation chez la souris diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Deux plaies sont taillées dans la peau du dos de souris rasées, puis maintenues ouvertes par des disques de silicone cousus, opération d'une vingtaine de minutes par animal. 740 souris vont être utilisées, 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 180 un niveau léger, toutes tuées à la fin pour prélever des organes. Les pansements sont changés chaque jour sous anesthésie, et des injections intrapéritonéales quotidiennes alternent d'un côté puis de l'autre, l'objectif déclaré étant de tester si un composé produit lors d'un régime cétogène accélère la cicatrisation chez la souris diabétique. Le porteur écrit que ce composé, produit naturellement par l'organisme, "ne présente donc pas d'effet nuisible", et ne dit rien des deux plaies chirurgicales.
Objectifs
Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est altérée comme lors d’un diabète.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. La cicatrisation de personnes atteintes de diabète est altérée, non seulement elle est plus lente mais les surinfections sont également plus fréquentes. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est diminuée comme lors d’un diabète.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris.
Impact sur les animaux
Le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et ne présente donc pas d’effet nuisible sur les animaux.
Devenir
La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en oeuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (3 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la relative facilitée d'hébergement et de soins, à la grande taille des portées et au temps de génération court. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car l’insulinémie augmente brusquement à partir du sevrage pour atteindre son maximum à l’âge de 2-3 mois puis elle chute.
Méthode de prélèvement pour génotypage de souris génétiquement modifiées en condition d’élevage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un à deux millimètres du bout de la queue sont coupés sur des souriceaux âgés de sept à vingt-trois jours, ou un morceau d'oreille au-delà de vingt-quatre jours, sans analgésie. 92 112 souris sont concernées sur deux ans, dans des procédures classées en souffrance légère, pour génotyper 200 lignées entretenues au profit d'une trentaine d'équipes. Le porteur écrit vouloir prélever "de manière à optimiser au maximum le bien-être animal", et indique dans le même paragraphe qu'aucune analgésie ne pourra être pratiquée, la crème à la lidocaïne étant écartée parce que l'animal se lécherait. Le devenir reste flou, les souris rejoignant d'autres projets, l'accouplement ou le tutorat, et le porteur annonce que les mises à mort d'animaux "non utilisables" seront effectuées "avec parcimonie", sans en chiffrer le nombre.
Objectifs
Unité mixte de service et recherche technologique, notre centre offre une expertise reconnue en génétique de la souris et en immunologie. Nous offrons à nos utilisateurs et partenaires académiques ou privés une suite unique de plateformes technologiques intégrées et spécialisées dans la conception, le développement de modèles de souris pré-cliniques et leur caractérisation en conditions normales et pathologiques (inflammation, auto-immunité, cancer, infection). L’unité de service participe à plusieurs programmes de recherche et alliances nationaux et internationaux portant sur l'immunologie, l'infection, le cancer, et les maladies rares. Nous sommes également membre fondateur de plusieurs Infrastructures nationales et membre de plusieurs consortia internationaux. L'objectif de cette demande est de permettre aux chercheurs pour lesquels nous hébergeons des lignées murines d'identifier et de caractériser leur souris au niveau génétique. Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation et caractérisation de modèles animaux génétiquement modifiés pour les projets de recherche. Il vise à permettre la gestion de 200 lignées murines génétiquement modifiées pour trentaine d’équipes de recherche. L’identification des animaux ainsi que le prélèvement de queue ou de bout d'oreille est un indispensable pour le suivi des lignées murines et la production de lot pour trentaines d’ équipes de recherche et/ou plateformes technologiques hébergées dont les chercheurs et ingénieurs n’ont pas accès à l’animalerie.
Bénéfices attendus
Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation et caractérisation de modèles animaux génétiquement modifiés pour les projets de recherche. Il vise à permettre la gestion de 200 lignées murines génétiquement modifiées pour trentaine d’équipes de recherche. L’identification des animaux ainsi que le prélèvement de queue ou de bout d'oreille est un indispensable pour le suivi des lignées murines et la production de lot pour trente équipes de recherche hébergées dont les chercheurs ne rentrent pas dans l’animalerie. Ce projet permettra de - réaliser une identification permanente de qualité sur les souris afin de les distinguer en fonction de leur génotype - réaliser un prelevement de qualité - identifier et récupérer une biopsie sur les souris de manière à optimiser au maximum le bien-être animal - permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur caracteristiques genetiques -permettre l’utilisation de ces animaux dans de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société.
Procédures
Biopsie de 1-2mm du bout de la queue : 1 fois par animal dans sa vie (entre 7 et 23 jours de vie) Biopsies d'oreille: 1 fois par animal dans sa vie ( à partir de 24 jours )
Impact sur les animaux
Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. La douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour analyse génétique (biopsie de la queue et d'un bout d'oreille). Les animaux seront surveillés de façon accrue afin de vérifier leur santé et la potentielle survenue d’infection ou autre pathologie.
Devenir
Les animaux du projet seront utilisés dans des projets scientifiques ou mis en accouplement ou utiliser pour tutorat. Les mises à mort d'animaux car non utilisables seront effectués avec parcimonie.
Remplacement
Dans ce projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous passer du modèle animal. Les projets scientifiques dépendant de notre production de modèle utilisent tous la souris afin de répondre à des questions à l'échelle d'un organisme entier en condition inflammatoire, infectieuse notamment.
Réduction
L'établissement d'élevage gère environ 900 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. Le projet comprend donc 92 112 animaux sur 2 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin et autorisé. Les demandes d'accouplements sont données par les équipes de recherche via le logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien-être animal (SBEA). Sans justification scientifique du maintien en élevage d'une lignée, la cryoconservation de sperme sera systématiquement proposée. Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Concernant le prélèvement d’un bout d’oreille, certaines des équipes hébergées travaillent sur les cellules dendritiques et ont besoin que les oreilles soient non impactées pour leurs expérimentations d’où l’utilisation de la biopsie de la queue. Nous ne pourrons pas effectuer d'analgésie lors de ce prélèvement. En effet la seule analgésie pouvant etre envisagée est la crème à la Lidocaïne. Apres application un temps de pose de trente minutes est nécessaire pour que ce médicament soit efficace. En relâchant la souris après application elle va certainement se laver en se léchant (ou la mère le fera) pouvant provoquer un endormissement de la langue et avoir un effet néfaste sur l’abreuvement de la souris. Les animaux seront hébergés en zone protégée avec leurs parents puis en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft . Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et les signes cliniques seront observés. Un signe clinique sévère entrainera, si des soins ne sont pas envisagés par notre vétérinaire réfèrent, une mise à mort pour souffrance
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour la procédure 3 les animaux peuvent être biopsés entre 4 et 8 semaines.