Procédures légères
Etude du rôle d’ASXL1 et ASXL2 dans la mégacaryopoïèse pathologique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un score de douleur relevé lors des examens cliniques déclenche la mise à mort des souris qui atteignent les points limites terminaux. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle osseuse et la rate. Elles reçoivent une alimentation modifiée qui invalide les gènes Asxl1 et Asxl2, subissent jusqu'à douze prises de sang sous anesthésie générale et une injection d'une molécule qui s'intègre dans leur ADN. Le projet, ouvert en 2016, est prolongé pour consolider des résultats déjà obtenus, et l'effectif de 220 animaux n'est appuyé que sur un renvoi aux études publiées.
Objectifs
La mégacaryopoïèse est le processus qui conduit à la formation des plaquettes. Elle a lieu dans la moelle et est régulée par de nombreux facteurs dont des facteurs de transcription et épigénétiques. Les facteurs épigénétiques permettent de modifier l’état de la chromatine (l’ADN) et ainsi d’influencer la transcription. Parmi ces facteurs, nous nous sommes intéressés aux protéines ASXL1 et ASXL2 qui sont mutées dans des maladies hématologiques. L’objectif global de notre projet est d’étudier leurs fonctions dans la mégacaryopoïèse. Nous avons pu démontrer que l’invalidation de ces gènes chez la souris conduit à des anomalies de la mégacaryopoïèse, avec le développement de macrothrombopénies (diminution du nombre de plaquettes dans le sang, associée à la présence de grosses plaquettes), une diminution des progéniteurs mégacaryocytaires dans la moelle osseuse, des anomalies structurales et du contenu en ADN des mégacaryocytes. Par ailleurs, les plaquettes générées sont moins efficaces et donc moins capables de jouer leur rôle dans l’hémostase. Ce projet a été initié en 2016 et nous demandons une nouvelle autorisation pour le finaliser : consolider nos résultats et ajouter de nouvelles expériences visant notamment à étudier le cycle cellulaire des progéniteurs mégacaryocytaires.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le rôle des protéines ASXL1 et ASXL2 dans la mégacaryopoïèse. Nous rechercherons en parallèle si ces facteurs épigénétiques sont altérés chez des patients atteints de thrombopénies et pourront ainsi associer la thrombopénie observée à une cause génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - alimentation spécifique pour induire les pertes de fonction des gènes Asxl1 et Asxl2 - prise de sang bi-mensuelle ou mensuelle sous anesthésie gazeuse pour récupérer et étudier les plaquettes (n=6 à 12, durée 5 minutes, sous anesthésie générale)- injection unique d’une molécule qui s’intègre dans l’ADN des cellules en cycle pour les études de cycle cellulaire (durée 1 minute, sous anesthésie locale).
Impact sur les animaux
Lors de nos précédentes expériences, nous n’avons pas constaté de nuisances spécifiques ou effets indésirables associés à la délétion des gènes étudiés. La macrothrombopénie observée n'est pas profonde et n'a donc pas de conséquence clinique. Les nuisances seront donc courtes et légères (légère douleur) et liées aux gavages, aux prises de sang (sous anesthésie générale) et à l'injection unique d'une molécule permettant l'étude du cycle cellulaire).
Devenir
A la fin de chaque procédure, il est prévu de prélever les organes où s’effectuent la production des cellules du sang (moelle osseuse, rate) afin d’étudier les cellules progénitrices des plaquettes, ce qui nécessite l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Le processus de formation des plaquettes a lieu dans la moelle osseuse et est fortement influencé par l’environnement médullaire (autres cellules environnantes, architecture médullaire) qui est impossible à reproduire in vitro. Par conséquent, un modèle in vivo nous a semblé indispensable, afin de pouvoir étudier le rôle des facteurs épigénétiques dans ce processus. Par ailleurs, ce projet vise à finaliser les résultats obtenus lors d’une demande précédente, l’utilisation du même modèle est donc indispensable. Les approches in vitro ne permettent pas d’obtenir suffisamment de cellules pour les analyses de cycle, ni le maintien pendant plusieurs jours des cellules à l’état de cellules immatures. Enfin, la formation des plaquettes se fait sous l’action du flux sanguin, que nous n'avons pas dans nos systèmes de culture.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous étudions en parallèle les 4 groupes d’animaux d’intérêt (sauvage, délété pour Asxl1, délété pour Asxl2, délété pour Asxl1/Asxl2), afin de n’avoir qu’un seul groupe contrôle. L’étude des plaquettes sur les prélèvements sanguins sera couplée aux analyses médullaires afin de minimiser le nombre d’animaux. Le nombre nécessaire d’animaux a été estimé afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les études publiées.
Raffinement
Les animaux sont observés tous les jours. Un score de douleur est établi en observant le comportement des animaux lors des examens cliniques. Les points limites en découlant et les mesures prévues seront strictement appliquées. Si un signe de douleur est observé, un analgésique pourra être administré et un enrichissement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage (point limite précoce non terminal). Si un amaigrissement est observé, un aliment adapté, plus riche et plus préhensile sera mis à disposition. En cas d’atteinte des points limites terminaux, les animaux seront euthanasiés. Les souris seront anesthésiées lors des différentes interventions procédurales (anesthésie locale ou générale dépendamment des actes).
Choix des espèces
Les modèles murins sont adéquats pour notre étude, car ils nous permettent d’explorer les différentes étapes de la mégacaryopoïèse, dans un modèle mammifère qui reflète en général ce qui se passe chez l’homme. Par ailleurs, les modèles animaux développés nous permettent d’invalider les gènes d’intérêt spécifiquement dans les cellules produisant les cellules du sang. L’invalidation de ces gènes dépend de l’expression d’une enzyme que nous pouvons induire par l’alimentation des souris. Etant donné que nous souhaitons étudier la mégacaryopoïèse adulte, nous induirons les délétions de ces gènes chez les souris autour de 2 mois et étudierons les souris à partir de 5 semaines après induction, soit à partir de l’âge de 3 mois (âge adulte).
Traçage anatomique de circuits neuronaux dans le cortex préfrontal chez le ouistiti portant différentes variantes dans le gène du transporteur de la sérotonine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois heures d'anesthésie, l'ouverture du crâne et l'injection d'un virus dans deux zones du cerveau : douze ouistitis subissent cette chirurgie, quatre autres recevant deux injections intraveineuses de virus à quinze jours d'intervalle. Les seize animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, puis tués pour prélèvement de tissus. Le projet compare les connexions neuronales du cortex préfrontal chez des individus porteurs de variantes différentes d'un gène lié à la vulnérabilité à la dépression, la retombée annoncée pour les patients étant renvoyée au long terme. Le porteur signale par ailleurs que le rasage de la tête peut perturber les interactions sociales de l'animal, et affirme que le primate non humain est "le seul modèle approprié".
Objectifs
La dépression et, plus largement, les troubles liés au stress constituent un enjeu majeur dans nos sociétés. Ces affections ont des origines multiples, avec une forte composante génétique. Des études ont montré que des modifications de l'activité de certaines zones du cerveau jouent un rôle clé dans les symptômes de ces troubles. Parmi un grand nombre de gènes décrits dans la littérature scientifique, nous nous sommes concentrés sur un gène précis dont les variantes présentes naturellement dans les populations humaines influencent la vulnérabilité ou la résilience face à la dépression. Il est intéressant de noter que l’effet de ces variantes est également observé chez les primates non humains. Pour approfondir notre compréhension, nous souhaitons examiner les éventuelles différences au niveau des connexions des neurones chez les animaux portant des variations différentes de ce gène.
Bénéfices attendus
Les troubles dépressifs sont des pathologies graves ayant un fort taux de rechute et d’échec thérapeutique. Mieux comprendre l’influence des différentes variantes d’un gène impliqué dans la dépression permettra de mieux appréhender ces maladies. Les données issues de ce projet permettront à long terme une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour la première procédure : les 12 animaux du lot 1 seront anesthésiés (durée 3h), puis une injection de virus sera réalisée dans deux zones du cerveau. Pour la seconde procédure : 4 animaux seront anesthésiés (durée 30 min) lors d’injections intraveineuses de virus. Chaque animal aura 2 injections de virus à 2 semaines d’intervalle.
Impact sur les animaux
Stress : un stress inhérent à la capture, aux anesthésies et aux piqûres. Chirurgie : douleurs liées à l’ouverture du crâne, potentiel problème d’interaction sociale dû au faite de raser la tête de l’animal, risque d’infection au niveau de la plaie. Injection intraveineuse : apparition d’un hématome qui pourrait masquer une inflammation
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements de tissus en vue d’analyses.
Remplacement
Il est très difficile de comprendre comment fonctionnent les circuits neuronaux dans notre cerveau. Les méthodes utilisées chez les humains ne sont pas assez résolutives. De plus, il n'existe pas de modèle artificiel des circuits étudiés permettant une simulation informatique. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous avons besoin d'un modèle qui soit proche de l’humain sur le plan anatomique et comportementale. En raison de la proximité anatomique et fonctionnelle des structures étudiées avec celles de l'humain, le primate non humain (PNH)est le seul modèle approprié.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux utilisés au minimum accepté par la communauté scientifique. Les études anatomiques sur le primate non humain sont généralement réalisées sur un minimum de 4 animaux par groupe (dans notre cas 2 groupes x4 = 8 individus). Nous avons prévu un nombre supérieur à 8 animaux, prenant en compte une possible erreur dans la localisation des sites d’injections. Nous estimons avoir besoin de 12 animaux pour ce projet auquel il faut ajouter 4 animaux pour les injections intraveineuses.
Raffinement
Nous mettrons en place des points limites préalablement définis. Les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et une médication appropriée (analgésie) sera fournie dans le but d'éviter toute souffrance liée aux chirurgies. Les animaux sont hébergés en groupe social (2 individus minimum par groupe), dans des espaces enrichis dont les dimensions dépassent la règlementation actuelle. Tester la validité de l’approche ‘injection intraveineuse’ ouvrira le champ à des expériences futures moins invasives pour les animaux.
Choix des espèces
Notre étude s’intéresse à comprendre comment certaines caractéristiques génétiques humaines contribuent à la vulnérabilité face aux maladies psychiatriques, notamment la dépression. En raison de la proximité anatomique et fonctionnelle des structures étudiées avec celles de l'humain, le primate non humain (PNH) est le seul modèle approprié. Nous avons besoin d’animaux matures de plus de 18 mois pour notre étude. Avant 18 mois, les individus sont juvéniles, leur système nerveux n'est pas encore complètement développé.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 11100
Cochons d'Inde : 900
Hamsters dorés : 2100
Arthrose, encéphalomyélite auto-immune, cancer, diabète, inflammations, infections bactériennes et morsures de tiques : ces pathologies sont induites chez 28 200 rongeurs pour tester, à la demande de clients de l'industrie pharmaceutique, l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux. 14 100 souris, 11 100 rats, 2 100 hamsters dorés et 900 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour analyses. Le porteur indique que l'encéphalomyélite induite peut provoquer une paralysie progressive de la queue puis des membres, accompagnée d'allodynie et de douleurs persistantes, et que le modèle d'arthrose peut conduire à de l'automutilation. La surveillance annoncée repose sur des scores de paralysie, sur l'observation des pattes et sur une pesée bihebdomadaire, sans qu'aucun seuil déclenchant la mise à mort ne soit chiffré.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux tel que l’arthrose, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le cancer, le diabète, l’inflammation, l’infection parasitaire et bactérienne. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs administrations d’une substance, de 2 à 5 administrations. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’administration d’une première substance, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’administration d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle de cancer, les animaux vigiles ou anesthésiés reçoivent une administration d’une solution de cellules cancéreuses. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’infection bactérienne, les animaux reçoivent une solution bactérienne. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation aiguë, les animaux reçoivent une solution d’une substance au niveau de la patte. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation chronique, les animaux reçoivent une solution d’une substance. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle anti parasitaire des tiques sont déposées sur la peau des animaux. La durée du dépot des tiques sera de 5 minutes maximum. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement de chaque modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Pour le modèle du diabète, les animaux reçoivent une administration d’une substance. Une chirurgie sous anesthésie générale et avec un protocole d’analgésie adapté pourra être réalisée si la substance test est administrée dans un organe cible, dans ce cas, la chirurgie sera de 1h30 maxium.
Impact sur les animaux
Le modèle d'arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations à plus ou moins long terme. Les effets liés au développement du modèle peuvent aboutir à une baisse d'activité ainsi qu'un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, ...). Ces effets peuvent apparaître à partir du 21ème jour. Le modèle d'encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres à plus ou moins long terme. Cette paralysie peut s'accompagner d'une allodynie et/ou d'une douleur plus ou moins persistante au niveau des memebres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaître le 10ème jour avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Le modèle de développement de cancer peut provoquer des douleurs liées à l'apparition des masses tumorales. Les premiers signes cliniques peuvent survenir dès l'apparition visible de ces masses. Les animaux peuvent avoir des difficultés pour se déplacer. Le modèle d'infection bactérienne peut générer différents signes cliniques liés à l'infection. Ces signes cliniques peuvent être une perte de poids, des poils hérissés, une prostration de l'animal. Le modèle de diabète peut générer différents signes cliniques tels qu'une augmentation de la consommation d'eau, une augmentation des mictions, une déshydratation, une perte de poids et une distension abdominale. Les modèles d'inflammations aiguës et chroniques peuvent engendrer de la douleur au niveau du site de l'inflammation, des rougeurs, de la fièvre ainsi qu'une perte des fonctions physiques normales. Le modèle d'infection parasitaire peut engendrer de la douleur liés aux morsures de tiques, ainsi qu'une inflammation cutanée de lazone mordue, une faiblesse générale, de la fièvre ainsi qu'un manque d'apetit. Les effets liés à ces modèles peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d'activité, baisse de la prise alimentaire) et physique (perte de poids, abscence de réflexes, immobilité). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l'abscence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Dans le cas de développement de cancer, il s’agit de l’apparition de tumeurs solides visibles ou sanguines (leucémie). Dans le cas d’activité antibactériennes, il s’agit d’une infection qui peut engendrer de la fièvre, une prostration de l’animal et des poils hérissés. Dans le cas du diabète il s’agit d’une perte de poids, une augmentation de la prise d’eau et des mictions, et d’une augmentation de la glycémie. Dans le cas d’inflammations aiguës et chroniques, il s’agit de rougeur et/ou de fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Dans le cas d’infection parasitaire, il s’agit de morsures de tiques entraînant des rougeurs, de la fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel. Il y aura environ 55 études par année (toutes procédures confondues).
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Pour le modèle de cancer, les tumeurs sont mesurées afin de suivre leurs évolutions. Pour le modèle de diabète, la glycémie est analysée régulièrement afin de suivre l’évolution du diabète. Pour le modèle antiparasitaire, le nombre et le poids des tiques détachés des animaux sont comptés. Pour le modèle d’inflammation aiguë, l’inflammation au niveau de la patte est mesurée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Pour la procédure d'arthrose, le choix du modèle dépend du volume et du mode d'administration. Pour la procédure d’encéphalomyélite auto-immune, le choix du modèle est la souris car uniquement celui-ci fonctionne sur ce modèle. Pour le modèle de cancer, le choix dépend du modèle de tumeur et du mode et du volume d'administration. Pour le modèle d'infection bactérienne, le choix dépend de l'agent pathogène. Pour le modèle de diabète le choix du modèle dépend de l'historique de la substance à tester et du volume d'administration. Pour le modèle d'inflammation aigüe, chronique et d'infection parasitaire le choix du modèle est fait selon le volume d'administration de la substance à tester. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Enseignement de travaux pratiques en expérimentation animale : Conception et réalisation de procédures sur rongeurs
- Formation professionnelle
Manipulés, gavés puis injectés dans l'abdomen par des apprenants dont certains n'ont jamais tenu un rongeur, 40 rats vont être utilisés deux jours de suite dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Tous seront tués une semaine après les travaux pratiques, pour prélèvement d'organes. Ces séances ne produisent aucune connaissance, elles valident un diplôme universitaire qui autorisera ensuite les participants à concevoir eux-mêmes des procédures. Le porteur écrit que les rats "ne subiront donc aucun stress lors de la manipulation par les apprenants", après avoir indiqué quelques lignes plus haut que cette manipulation peut engendrer un stress léger, précisément parce que les apprenants sont inexpérimentés.
Objectifs
L'objectif de ce projet s'inscrit dans le cadre d'une formation qui s'adresse à des apprenants qui vont être amenés à utiliser des animaux de laboratoire (rongeurs) dans le cadre de leur recherche. Le rat est une espèce largement utilisée en expérimentation animale. Ainsi, le but est de les familiariser avec les gestes de base couramment réalisés et de les sensibiliser au bien-être animal. Ils vont donc apprendre à tenir un rat en toute sécurité pour l'animal et l'apprenant, à réaliser des contentions permettant l'administration de substance. Si l'examen à l'issue de la formation est favorable, ils seront autorisés à manipuler des animaux de laboratoire en toute autonomie. Cette formation est donc essentielle et indispensable pour acquérir les gestes de base à l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de cette formation est que chaque apprenant puisse utiliser l'expérimentation animale à des fins scientifiques de la façon la plus éthique possible, de les familiariser avec les animaux de laboratoire (rongeurs), de leur montrer les bons gestes et surtout de leur faire prendre conscience que tout doit être réalisé en tenant compte du bien-être animal.
Procédures
Chaque animal subira une préhension/contention (1 minute maximum), un gavage (quelques secondes) et une injection intra-péritonéale (quelques secondes) par jour (sur 2 jours consécutifs).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux seront transitoires. Les animaux ressentiront une contrainte légère liée à l'administration Per Os ainsi qu'une douleur équivalente à la piqure d'une aiguille lors des injectipns intra-périronéales (douleur légère de courte durée). Chaque animal subira une préhension/contention, pouvant également engendrer un léger stress pour l'animal étant donné que les apprenants sont non-expérimentés sur animaux vivants.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés une semaine après la fin des 4 TPs et différents organes seront prélevés pour la réalisation d'analyses.
Remplacement
L'objectif de cet enseignement est de sensibiliser les apprenants aux gestes simples d'expérimentation animale sur rongeurs en respectant l'éthique et le bien-être animal. Les enseignements de TP suivis par les apprenants sont progressifs et s'inscrivent dans la démarche "jamais la première fois sur l'animal". Ainsi, après l'apprentissages des gestes simples d'expérimentation animale sur des modèles virtuels (rats et souris en peluche), le projet présenté dans le cadre de cette demande intervient en dernière position et vise à expérimenter sur des animaux vivants (rats). La théorie et la réglementation ainsi que la manipulation sur modèles virtuels ne peuvent malheureusement pas remplacer les gestes sur animaux vivants, surtout pour des apprenants,qui n'ont pour certains, jamais manipulé de rongeurs. Cet enseignement s'avère donc essentiel et indispensable pour la délivrance d'un DU en expérimentation animale niveau concepteur, qui autorise la réalisation de procédures en expérimentation animale de façon autonome.
Réduction
Chaque année, 8 animaux, séparés en 2 groupes de 4 rats seront utilisés (40 annimaux au total sur 5 ans). Chaque année, quatre groupes d'apprenants (de 4 personnes maximum / groupe) sont prévus au maximum et sont répartis sur 4 demi-journées consécutives. Ainsi, 4 animaux seront prévus par groupe, de façon à ne manipuler les animaux qu'une seule fois par jour.
Raffinement
Durant la phase de stabulation, les animaux auront été habitués quotidiennement à être manipulés. Ce sont également des animaux jeunes, donc plus facilement manipulables et non agressifs. Ils ne subiront donc aucun stress lors de la manipulation par les apprenants. Des personnes expérimentées encadreront le TP et veilleront tout au long de la procédure au bien-être animal. Les gavages seront uniquement montrés aux apprenants par une personne expérimentée. Les injections intra-péritonéales seront réalisées à deux personnes, en binôme avec un encadrant. Chaque animal ne subira qu'une seule injection par jour (l'injection intra-pérotonéale). Les autres types d'injection seront montrés sous forme de vidéo de façon à supprimer au maximum le stress et la souffrance. Si les animaux sont trop agités par le nombre de personnes présentes dans la pièce, une pause sera effectuée jusqu'à à ce qu'ils se calment.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé en expérimentation animale. Les animaux seront livrés par un fournisseur agrée à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront donc manipulés par les apprenants à l'âge de 7 semaines. Il s'agit d'un bon compromis pour une manipulation optimale des animaux (dociles et conditionnés de façon positive). Il n'y a aucune influence du genre. Ainsi, 4 rats mâle et 4 rats femelle seront utilisés chaque année, ce qui permettra de rappeler aux apprenants l'importance de planifier ses expérimentations en amont et de bien réfléchir aux animaux dont ils ont besoin.
Potentialisation des immunoglobulines colostrales chez le veau : effet d’un prébiotique et de la micro-encapsulation sur le transfert immunitaire et l’immunité locale intestinale
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
32 veaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rendus à l'élevage laitier dont ils renouvelleront le troupeau. Chacun subit un gavage de colostrum dans l'heure suivant sa naissance, quatre prises de sang jusqu'à 28 jours et un prélèvement de fèces, pour mesurer l'absorption d'immunoglobulines issues d'un colostrum déshydraté additionné d'un prébiotique. Le bénéfice avancé, un meilleur transfert d'immunité passive, vise des veaux de production laitière auxquels le colostrum maternel est retiré au profit d'un substitut. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro robuste n'existe pour ce transfert chez le veau et conclut qu'il est "nécessaire" d'expérimenter sur eux.
Objectifs
Le projet vise à vérifier l’absorption des immunoglobulines issues de colostrum déshydraté en remplacement du colostrum naturel et d’augmenter cette absorption dans le but d’améliorer le transfert d’immunité passive (TIP). D’un point de vue scientifique, il s’agit de déterminer dans quelle proportion les immunoglobulines issues de colostrum apportées par voie orale dans la première heure de vie sont transférées dans la circulation sanguine et si l’ajout d’un prébiotique permet d’augmenter leur taux d’absorption. Le deuxième objectif est de confirmer qu’un apport continu et en faible quantité d’IgG colostrales par voie orale durant les 20 jours suivants la naissance permet de préserver le stock d'anticorps existants. Pour démontrer cet effet d’accumulation, la teneur en IgG circulantes sera mesurée à 24h, à 15 jours et à 21 jours d’âge.
Bénéfices attendus
L’échec de transfert d’immunité passive est fréquent chez les veaux laitiers. Les bénéfices attendus du projet sont d'augmenter l'absorption des immunoglobulines et de favoriser ainsi la mise en place du système imunitaire chez le veau pendant les 21 permiers jours de vie.
Procédures
4 prises de sang sur chaque animal (à la naissance, à 24h, à 21j, à 28j). Les prises de sang sont réalisées par du personnel entrainé, leur durée est inférieure à 15 secondes. 1 prélèvement de fèces par animal à 21 jours. La durée de prélèvement est d'environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
La contention et le gavage permettant l'apport du colostrum juste après la naissance des animaux représente un stress et un inconfort pour les veaux malgré sa réalisation par des animaliers expérimentés. Les prises de sang peuvent aussi générer du stress chez les animaux malgré toutes les précautions prises pour en limiter les effets indésirables (habituation des animaux à la présence humaine, contention limitée et de très courte durée, utilisation, durée de la prise de sang inférieure à 15 secondes, massage de la zone piquée juste après le retrait de l'aiguille). En cas d’hématome (cela est arrivé deux fois sur plus de 2000 prises de sang lors du projet précédent sur 70 animaux pendant 3 ans), un baume décongestionnant sera appliqué au niveau du sillon jugulaire. On prélève alors de d'autre côté, sur l'autre jugulaire.
Devenir
Pas de mise à mort, les animaux sont remis dans l'élevage et participeront au renouveau du troupeau laitier.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro robuste pour l’étude du transfert d’immunité passive chez le veau. Contrairement aux autres espèces, les bovins sont totalement dépourvus d’anticorps à la naissance en raison de l’absence de transfert d’anticorps transplacentaire. Les immunoglobulines G (IgG) présentes dans le colostrum permettent de transmettre l’expérience immunologique de la mère au nouveau-né (immunité passive) en attendant que celui-ci développe sa propre immunité (immunité active). Il est donc nécessaire de réaliser l’expérimentation sur les veaux.
Réduction
Sur la base des tests statistiques de puissance, nous avons défini qu'un nombre minimum de 32 animaux au total était suffisant pour tester les deux hypothèses : 1- l’effet positif éventuel d’un prébiotique sur l’amélioration de la perméabilité intestinale permettant l’optimisation de l’apport d’IgG via la prise initiale de colostrum par voie orale ; 2- une meilleure préservation de l’intégrité des IgG .
Raffinement
La contention des veaux et les prélèvements sanguins sont des éléments capitaux à la maîtrise de la douleur. Ces opérations sont toujours effectuées par les mêmes personnes formées et habituées à ces manipulations. Compte tenu de l'expérience et de l'efficacité des personnels chargés des prélèvements, la durée de ceux-ci est réduite au minimum (la contention dure deux minutes et la prise de sang moins de quinze secondes) ce qui permet de limiter le stress des animaux. Ces prélèvements sont espacés dans le temps (à 24 heures, 15 jours et 21 jours après la naissance). Les équipements de distribution des aliments (distributeurs automatiques de lait et de concentré) permettent de détecter toute anomalie au niveau de la prise alimentaire. Les animaux qui présenteraient des problèmes (diarrhée, sous-alimentation...) seront examinés et traités par le vétérinaire référent de l’élevage. Tous les animaux reçoivent une quantité d’IgG minimale d’IgG supérieure aux recommandations. Nous utiliserons un matériel moderne , développé par des vétérinaires, qui permet de réduire le stress et l’inconfort du veau au moment de l'adminisatration des IgG. Le tube est flexible et doux ce qui permet une ingestion facile par le veau. Le choix de cette méthode ici est uniquement à but expérimental car on a besoin de s’assurer que l’animal prenne bien l’entièreté de la ration de colostrum dès la première prise car la primo administration induit une réduction de la perméabilité de l’intestin pour les prises ultérieures . L’apport d’IgG durant les 20 jours suivants la naissance pour les lots expérimentaux des 2 essais s’ajoute à une quantité initiale d’IgG reçue à travers le colostro-remplaceur. De la naissance au jour 3, les veaux sont dans des cases individuelles, paillées avec une lampe chauffante et font l'objet de visites pluri-journalière des animaliers. Les animaux sont caressés à chaque visite. Les animaux peuvent se voir, s’entendre, se sentir et même se toucher s’ils se mettent debout. Au jour 4, les animaux retrouvent leur congénères dans la même aire paillée.
Choix des espèces
Les espèces bovine et caprine sont les plus susceptibles de recevoir des immunoglobulines de lactosérum en complément des immunoglobines colostrales. L’espèce bovine a été choisie car la taille des animaux nouveau-nés autorise des prélèvements sanguins dès la naissance sans nuire à l’animal. Veaux de la naissance à 21 jours. Les veaux ne doivent pas consommer le colostrum maternel car le transfert d’immunité passive est effectué à partir de colostro-remplaceur.
Chocs septiques stériles et modèles d’exploration rapide de l’inflammation aigue systémique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1230
Le laboratoire provoque une inflammation générale par injection de lipopolysaccharide, pour qualifier ses lots de réactifs biologiques et évaluer des composés en développement. 1 230 rats et 1 230 souris vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue, dont 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent l'agent inflammatoire à l'état vigile, puis le composé à tester en quelques secondes ou sur plusieurs minutes, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur juge le recours à l'animal vivant "incontournable" à ce stade préclinique. Il s'attend, dans les cas extrêmes, à des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, ces signes constituant eux-mêmes les points limites qui déclenchent l'arrêt anticipé.
Objectifs
Les phénomènes inflammatoires sont des réactions normales des organismes mis en action en réponse à une agression tels que les traumas qui induisent des lésions, ou plus généralement consécutive à une infection par un hôte étranger. Au cours des maladies chroniques hépatiques telles que la cirrhose, des phénomènes inflammatoires peuvent être induits par un franchissement de la barrière intestinale à la perméabilité dégradée par de microorganismes issu du microbiote. L’inflammation présente donc un intérêt dans nos travaux. Par ailleurs, des modèles expérimentaux basés sur le pouvoir d’activation de l’inflammation de certains composants de la paroi de bactérie (LPS ou Lipopolysaccharide) sont très amplement utilisés au laboratoire pour l’étude de l’inflammation et des évaluations de propriétés pharmacologiques sur la voie de l’inflammation de composé en développement. Ce projet propose donc des procédures simplifiées de mise en œuvre de modèles inflammation systémique chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
L’utilisation de bio réactifs au cours de procédures longues, complexes et qui engagent un nombre significatif d’animaux comporte un part de risque d’échec. Il peut s'agir par exemple d'une induction trop faible en raison d'animaux qui ne réagissent pas correctement au stimulus ou au contraire qui montrent une réaction exhacerbée qui produit des pertes d’animaux. La qualification préalable des lots de bioréactifs nécessite l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux et permet à terme de réaliser des expériences en limitant les risques d’échec Cela contribue donc à la réalisation d’expérimentation plus fiables et reproductibles, et qui nécessitent moins de répétitions.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales pour la réalisation de la phase d’induction du processus inflammatoires, les animaux à l'état vigiles subiront l'action de l'agent d'induction de l'inflammation. Pour la réalisation de l’évaluation des propriétés des composés à tester, nous pourrons traiter les animaux dans un état vigile, soit de manière aigue dite " en bolus", et dans cette situation l'administration ne dire que quelques secondes ( 5 à 10 secondes), soit de manière lente et sur une plus longue durée ( plusieurs minutes ) Ils seront anesthésiés et subiront un prélèvement sanguin terminal puis seront mis à mort sans réveil.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, on s’attend à observer dans les cas extrêmes des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, mais ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé.
Devenir
Les analyses biochimiques réalisées pour les mesures de niveaux de cytokines sont rélaisées sur des prélèvements terminaux. Les animaux sont mis à mort en vue de recueil de leurs organes pour l'exploration de l'expression des proteines de la phase aigue de l'inflammation notamment d'origine hépatique.
Remplacement
Disposer d’un modèle animal translationnel qui puisse permettre d’évaluer les effets de composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre cette maladie. Nous disposons de modèles in vitro qui permettent d’évaluer les propriétés anti inflammatoires de composés, cette démarche est préalable à tout expérimentation chez l’animal L’utilisation de ces méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s s’impose. Cependant, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs, et d'activer toutes les voies de signalisation qui constituent les caractéristiques de ce modèle est incontournable. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques. La contrainte est de synchroniser les évènements. La réduction du nombre d'animaux engagés dans l'expérimentation consiste en premiers lieux d'estimer correctement le nombre des animaux nécessaires.. Cette estimation est faite à priori sur la base de données expérimantales déjà connues (étude pilote) ou sur la base de données publiées dans la literature. La détermination de la taille des effectifs est basée sur la connaissance de la variabilité d'un paramètre prioritaire étudié, , et sur le niveau de signification attendu (généralement p=0.05 ce qui signifie que nous admettrons que 5% des effets observés peuvent être dus au hasard). Enfin, nous accordons aussi l’importance à la puissance statistique, généralement entre 80 et 90%, ce paramètre exprime la probabilité de détecter un effet s’il existe. Plus la puissance sera élevée, et plus le nombre d’animaux devra être important. L’effectif théorique est donc calculé à partir de ces paramètres statistiques, il permet à l’expérimentateur d’ajuster son effectif en fonction de l’importance du paramètre qu’il étudie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant leur période d’acclimatation ou d’hébergement dans l’animalerie. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Au cours de la phase aigue de l'expérience, des critères cliniques observables définissent des points limites très spécifiques au modèle, ils sont prédictifs de l'issue de l'expérience et de l'atteinte proche d'un seuil de douleur à ne pas dépasser. Ils sont appliqués pour mettre un terme rapide à l'expérience et limiter ainsi les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Nos travaux de recherche (développement de modèles d’évaluation de propriétés thérapeutiques de médicaments, protocoles de pharmacologie etc ) sont réalisés chez les rongeurs (rat et souris). Ces espèces sont largement employées dans notre domaine d’étude qui concerne les troubles métaboliques car elles sont bonnes répondeuses à des stimuli et à des actions pharmacologiques. La nécessité d’avoir accès à des échantillons biologiques frais de ces mêmes espèces est donc évidente. Les animaux utilisés seront des anaimaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Evaluation de la contribution de vésicules bactériennes dans l’induction d’un sepsis (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection de vésicules bactériennes de quelques secondes, puis selon les cas une prise de sang sous anesthésie, une injection de colorant suivie de la mise à mort trente minutes plus tard, ou une injection d'agonistes plaquettaires suivie de la mise à mort trois minutes plus tard. 1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à comprendre comment ces vésicules déclenchent un sepsis et la formation de microthrombi qui bloquent la circulation dans les petits vaisseaux. Le porteur annonce une perte de poids et une perte de vitalité, puis écrit que les souris "récupèrent et vont mieux", alors que chaque procédure se termine par leur mise à mort.
Objectifs
Notre objectif est de comprendre comment les vésicules bactériennes contribuent à la physiopathologie au sepsis (mise en place et aggravation). Nous nous intéressons en particulier à l’activation des plaquettes sanguines et la formation de microthrombi qui bloquent la circulation sanguine dans les petits vaisseaux entrainant la dysfonction des organes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules bactériennes dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure induisant une infection par injection de vésicules bactériennes (1 seule injection par souris de quelques secondes) dans le premier établissements utilisateur. Une seule prise de sang sera réalisée sur les souris anesthésiées (d’une durée environ de 2 min) (second établissements utilisateur). Suite à cette prise de sang unique, les animaux seront euthanasiés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue, injection d'une durée de 2-3 minutes) de colorant sera réalisée sur les souris anesthésiées, suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection (second établissements utilisateur). Pour l'évaluation du thromboembolisme, 1 injection d'un mélange d'agonistes plaquettaire sera réalisé en intra-veineux (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 3 min apres l'injection (premier établissements utilisateur).
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés de ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Lors de l’infection par les vésicules bactériennes, il peut y avoir dans un premier temps, une atteinte de l’état général, puis les souris récupèrent et vont mieux. Les effets indésirables attendus sont une perte de poids et une perte de vitalité.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et l’inflammation, l’hémostase, la perméabilité endothéliale ou la formation de thrombi seront analysés. .
Remplacement
Des résultats obtenus in vitro montrent que les vésicules bactériennes impactent l’activation plaquettaire et la formation du thrombus. Pour la suite de notre étude, le recours au modèle murin est irremplaçable pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Réduction du nombre d'animaux : plusieurs résultats obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Suite à l'infection, nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes. Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Une approche statistique sera utilisée pour vérifier les différences obtenues entre groupes.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. Les points limites seront basés sur la perte de poids et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience, difficultés respiratoires (respiration rapide). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus décrit pour l’étude du sepsis. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. De plus, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées (pas de phénotype dommageable). Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, Système cardiovasculaire mature).
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 2/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 3 520 un niveau modéré et 440 un niveau léger. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, une chirurgie, des séjours à 4 °C ou à 30 °C et des isolements pouvant durer cinq jours. L'exposition aiguë au froid peut provoquer une hypothermie modérée à sévère, et le porteur reconnaît une mortalité chirurgicale inférieure à 10 %. Il indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer l'animal pour produire des adipocytes bruns modifiés, avant de conclure qu'"aucun autre modèle n'est susceptible d'apporter les réponses aux questions posées".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Complément à l’évaluation des mécanismes de neuroprotection de la barrière sang-cerveau dans un modèle de pathologie périnatale avec inflammation chez le rat en développement (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les ratons utilisés naissent avec un retard de croissance provoqué, leurs mères ayant été nourries pendant les 22 jours de gestation avec un régime pauvre en protéines. 244 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 216 ratons analysés entre le premier et le vingt-huitième jour de vie. Après la naissance, ils reçoivent sous anesthésie gazeuse une injection intrapéritonéale de lipopeptide puis passent deux heures en atmosphère appauvrie en oxygène, ce qui réduit de moitié leur prise de poids sur les 24 premières heures. Les ratons sont tués à différents âges pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, celles qui ont échappé au régime carencé pouvant servir jusqu'à cinq reproductions.
Objectifs
Le cerveau est un organe privilégié au sein de l’organisme, notamment du fait de l’existence de barrières sang-cerveau qui protègent l cerveau et contribuent aux besoins de celui-ci. Ces barrières sont de deux types : la barrière hématoencéphalique (entre le sang et le tissu cérébral) et la barrière sang-liquide céphalorachidien (entre le sang et le liquide qui entoure le cerveau). Au cours de la période périnatale, le cerveau par l’intermédiaire de ces barrières sang-cerveau peut être soumis à des traumatismes multiples : inflammation, hypoxie (manque d’oxygène) ou autres facteurs de risque tel que le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Ces traumatismes, surtout lorsqu’ils sont associés, peuvent être responsables de déficiences sévères à long terme. En France, on estime que la moitié des déficiences sévères constatées chez l’enfant de 7 à 8 ans est d’origine périnatale. L’objectif de notre projet qui sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs EU1 et EU2 , est d’évaluer les lésions induites par l’inflammation sur le cerveau en développement à l’aide de différents modèles. Nous souhaitons comprendre le lien entre les lésions cérébrales et l’altération des barrières sang-cerveau. Notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi surviennent des lésions cérébrales sévères en période périnatale. Nous avons également pour objectif de mieux prendre en charge ces lésions sévères en testant l’efficacité d’une molécule neuroprotectrice pour prévenir ou diminuer ces déficiences.
Bénéfices attendus
Nous estimons que ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodévelopement. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables que dans le cadre d’un stress inflammatoire seul. Par exemple des différences de signal pourraient être visualisés en micro-IRM chez les animaux ayant subis une inflammation et une hypoxie. Par ailleurs nos premiers résultats montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions multiples à court terme. Les consequences à long terme doivent donc être caractérisées. Enfin ce projet ouvrira une perspective therapeutique interesante qui sera etayées par des données mécanistiques.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagnée ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse, et à un environement hypoxique modèré pendant 2 heures. Les analyses sont ensuite effectuées entre 1 et 28 jours (216 animaux) . Certains animaux sont soumis à une IRM au plus tard 21 jours après la naissance, qui s'effectue également sous anesthése gazeuse (18 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l' établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Les ratrons soumis à l'hypoxie à l'exposition au lipopetide se nourissent moins pendant les premières 24h (augmentation de poid réduite d'environ 50 % par rapport aux controles), difference qui disparait ensuite.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à differents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) protectrices existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des differentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance fetal. Par ailleurs, le role reconnu de la circulation du liquide cérébrospinal dans les processus neuroinflammatoire , en particulier comme vecteur de cellules immune et de cytokines, ne peut être reproduit in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
- Les rates gestantes ne bénéficiant pas d’un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle). - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin d’assurer la fiabilité statistique des données générées. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée. Enfin les données obtenues dans le cadre d’une étude précédente seront incorporées, ce qui limite fortement le nombre d'animaux inclus dans cette présente demande.
Raffinement
- Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - La methode du régime pauvre en protéine est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). Le poids des rates gestantes bénéficiant d’un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction - Les ratons issus du modèle RCIU seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral régulier. - Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport qui présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront transportés avec leurs mères dans des conditions de température controlée. La proximité des deux lieux géographiques (500 mètres) permet de minimiser le temps de transport. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans les études précédentes. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les dnnées déjà acquisent l'ont été avec ce modèle. LLes prélèvements et mesure de perméabilité seront effectué chez le raton après la naissance, puis chez l’animal agé de 30 jours. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU et de l'hypoxie associés ou non à l'inflammation sur l'integrité des interfaces sang-cerveau au cours du déveopement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermée (Impact sur la programmation foetale, P30).
Prélèvements sanguins non terminaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 408
Jusqu'à 21 prélèvements sanguins caudaux au cours de la vie d'un même animal, à raison de deux par semaine ou de trois par jour, tous sur animal non anesthésié. 408 rats et 306 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire et important" de mettre en place des méthodes de prélèvement minimisant le stress, et le projet consiste à répéter ces ponctions sur des animaux réformés d'autres protocoles pour former les techniciens de l'animalerie et maintenir leurs compétences. Tous sont mis à mort à l'issue, sans qu'aucune raison en soit donnée.
Objectifs
Il est nécessaire et important de mettre en place des méthodes de prélèvements sanguins minimisant le stress pour les animaux. De ce fait il parait important d’adapter les méthodes de prélèvement et de former le personnel dans cet optique. Chaque technicien embauché suit une formation interne allant de l’entrée à l’animalerie jusqu’aux compétences les plus techniques à réaliser. Pour toutes les formations impliquant une manipulation d’animaux, un maintien de compétence est nécessaire. Ce genre de formation se fera sur des animaux d’étude réformées (DAP déjà présentes, réutilisation) n’ayant pas reçu toutes les manipulations possibles proposées dans la procédure dans laquelle ils sont passés ;
Bénéfices attendus
Cette procédure permettra d'anticiper l'évolution de la réglementation en termes de bien-être animal (avec objectif principal de réduire au maximum le stress des animaux lors de prélèvements de sang) et d’avoir un personnel qualifié aux procédures internes, permettant ainsi une homogénéité de performance dans nos techniques et notre suivi du bien-être des animaux quel que soit le personnel présent.
Procédures
Prélèvement sanguin : sur toute la vie de l’animal : jusqu’à 21 prélèvements caudaux (animaux non anesthésiés), - à une fréquence de 2 prélèvements caudaux par semaine (quelques minutes), - ou 3 prélèvements par jour avec un repos de 7 jours entre 2 phase de prélèvement (quelques minutes). Les autres modes de prélèvements seront faits à 1 semaine d’intervalle chacun (avoir au moins 1 semaine de repos entre 2 prélèvements) sur animaux non anesthésiés (quelques minutes)
Impact sur les animaux
Le stress dû à la prise de sang, l’anesthésie et la contetion.
Devenir
A l’issu de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle a pour but de former des personnes à la manipulation des animaux. Le remplacement du modèle animal est donc impossible.
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons des animaux de réforme afin de limiter l’utilisation d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet a pour but d'améliorer les méthodes de prélèvements présentes au sein de l’entreprise. En effet certaines techniques sont de plus en plus discutée par les institutions. Nous devons donc trouver d’autres moyens pour remplacer cette méthode. Du fait de sa raison éducative, cette procédure sera réalisée sous tutelle d’une personne experte et compétente, connaissant les risques liés aux techniques réalisées et aux solutions pour les résoudre. Cela fait aussi partie de l’apprentissage du formé d’apprendre les mesures prises afin de réduire au maximum les nuisances sur les animaux. L’observation et le suivi du bien-être de ces animaux sera précis et adapté à ce qu’ils auront subi afin de mettre en lumière le plus rapidement possible un effet indésirable et de le traiter au mieux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et des points limites adaptés. Une éventuelle analgésie pourra être effectuée si cela est nécessaire.
Choix des espèces
Nous travaillons avec ces deux espèces (rat et souris), il est primordial que le personnel soit formé à l’ensemble des techniques utilisant ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade adulte, comme pour nos études.
Elevage d’une lignée murine nécessaire à la compréhension des mécanismes moléculaires d’activation endothéliale dans le purpura thrombotique thrombocytopénique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris qui ne portent pas le génotype recherché servent à la formation interne de l'équipe ou partent vers d'autres équipes, les autres étant tuées pour l'étude du purpura thrombotique thrombocytopénique. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir une lignée invalidée pour un gène dans une zone sans pathogènes. Chaque animal subit une seule biopsie de la queue de 2 mm au maximum, vigile, avec une crème anesthésiante posée trente minutes avant et une compresse d'eau oxygénée pour arrêter le saignement. Le porteur retient la souris pour sa proximité génétique avec l'humain, sa facilité d'élevage en grand nombre et un coût inférieur à celui des primates.
Objectifs
L'objectif essentiel de cette demande de projet est d'assurer la préservation des souches de souris dans un environnement sans germes opportunistes, visant ainsi à garantir la reproductibilité de nos expériences tout en cherchant à minimiser le nombre d'animaux utilisés. La manipulation génétique par l'élimination d'un gène spécifique codant pour une protéine spécifique offre une approche précise pour mettre en lumière l'implication des mécanismes physiopathologiques endothéliaux. En maintenant cette souche de souris dans cet environnement, nous favorisons une constance dans nos expérimentations, ce qui s'avère essentiel pour parvenir à des conclusions fiables et significatives dans le domaine de la recherche médicale. Notre axe de recherche se concentre sur l'étude des mécanismes d'activation endothéliale au cours du purpura thrombotique thrombocytopénique. Des croisements sont effectués pour maintenir cette souche. La validation du génotype de ces souris demeure une étape cruciale assurant la fiabilité de notre modèle animal expérimental. La vérification systématique du génotype des souris invalidées pour ce gène survient après chaque naissance. Ces échantillons sont ensuite récupérés au sein de notre structure de recherche pour une analyse du génotypage.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'exercer un contrôle sur la population animale, offrant ainsi la possibilité de restreindre leur nombre au strict minimum pour résoudre nos hypothèses sur la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le purpura thrombotique thrombocytopénique. Notre production locale d’animaux est adaptée à nos besoins.
Procédures
Les animaux sont soumis à une seule biopsie de queue (maximum 2 mm dans les deux cas) par animal. Ce geste est effectué sur des animaux vigiles. La procédure dure moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée au prélèvement des biopsies de 2 mm maximum. Une seule biopsie par animal, le geste est réalisé par du personnel compétent et dure 2 à 5 minutes maximum avec la contention.
Devenir
Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont utilisés pour de la formation interne à l’équipe ou rétrocéder à d’autre équipes. Les animaux de génotype d’intérêt nous permettent d’évaluer les mécanismes d'activation endothéliale au cours du purpura thrombotytique thrombocytopénique.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un endothélium dans un contexte de purpura thrombotique thrombocytopénique,avec la totalité des cellules figurées du sang (neutrophiles, monocytes, érythrocytes, plaquettes) et les molécules solubles du plasma participant à l’activation endothéliale. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro.
Réduction
Nous veillons à produire un nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour réaliser le maintien de notre lignée dans un statut sanitaire sans pathogènes. Deux accouplements sont réalisés avec un male et deux femelles de 10 semaines afin d'assurer la reproduction de la lignée. Ces accouplements sont conservés jusqu'à ce qu'ils ne produisent plus puis remplacés par deux autres accouplements. D'autres accouplements peuvent être faits, mais seulement à la demande et selon les projets apafis en cours utilisant ces animaux. Sinon, le minimum de souris est élevé afin de réduire au maximum le nombre de souris euthanaisées en cas de non utilisation en expérimentation.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 maximum dans des cages de portoir ventilé avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Un cycle circadien est appliqué dans les locaux de l'animalrie. Un enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton est ajouté dans toutes les cages. L’ensemble de la lignée est hébergé dans la partie sans pathogènes de l'animalrie . Seul le personnel de l'animalrie a accès à ces animaux et en assure l’entière surveillance (Bien-être animal et procédure incluse dans cette demande). Le personnel du de l'animalrie est en lien avec les expérimentateurs et les porteurs de projets via Expeboard pour réaliser les biopsies, les sorties de biopsies et les accouplements. Les animaux reproducteurs sont 3 par Cages (Un male pour deux femelles d’un âge supérieur à 7 semaines) pour cette lignée. Une application de crème anesthésiante EMLA est faite sur la queue des souris 30 min avant la biopsie de la queue. Puis, après chaque biopsie de la queue, une compresse imbibée d'eau oxygénée est appliquée sur le bout de la queue pour arrêter le saignement.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elles ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaine correspond à une souris jeune. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. D'autre part, le choix de la souris est associé aussi à un coût relativement faible, puisque comparé à d'autres modèles animaux tels que les primates, le coût des souris est moindre. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.
Rôle des microglies dans la période critique chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour savoir si la microglie participe à l'ouverture de la période critique du cerveau, 547 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La microglie est appauvrie pendant la vie intra-utérine par un traitement mêlé à la nourriture des mères, ou une inflammation prénatale est provoquée par une injection intrapéritonéale sur femelle gestante vigile. Après transfert vers un second établissement, la moitié des souriceaux de chaque groupe subit la suture d'une paupière sous anesthésie, puis une imagerie du cortex visuel d'environ deux heures, avant d'être mise à mort sans avoir été réveillée. L'effectif compte 67 mères, dont 40 ne sont utilisées que pour accompagner leurs petits pendant le transport.
Objectifs
La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique. Ce projet, qui est multisite, a déjà fait l’object d’une demande similaire, qui a été validée, avec le même nombre d’animaux. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.
Procédures
Les animaux seront produits par accouplements contrôlés dans le premier établissement utilisateur (EU2/2), pour produire les 3 groupes d’animaux : 1) ceux dont lesquels la microglie aura été déplétée pendant le développement in utero (par traitement pharamacologique non dommageable présenté dans la nourriture), 2) ceux qui auront été exposé à une procédure mimant une inflammation prénatale (injection à un stade précis de la gestation- geste réalisé par des expérimentateurs entrainés (injection de quelques secondes réalisée sur animal vigile) et suivi intensifiés dans les 3 jours suivants (voir ci -dessous)), et 3) un groupe non manipulé d’animaux contrôle. Les animaux seront ensuite transférés dans un deuxième établissement utilisateur situé à proximité (EU1/2), dans des cages de transport scellés, avec des congénères de chaque portée, et ont une période d’acclimatation d’au moins une semaine après ce transport. Certains animaux devront être transporté avant sevrage pour leur laisser une semaine d’adaptation, et dans ce cas particulier, les mères seront également transportées. Dans le deuxième établissement utilisateur (EU1/2), nous procéderons à 3 actes sur les animaux. Pour la moitié des animaux de chaque groupe, nous réaliserons une fermeture transitoire de la paupière par suture chirurgicale, réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée (20 minutes environ pour l’entièreté de l’acte) et avec suivi post-opératoire pendant 3 jours. Après 3 jours, la plasticité induite par cette fermeture, ou l’absence de fermeture (autre moitié de chaque groupe), sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h), réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée, et qui seront euthanasiés par méthodes règlementaires avant réveil.
Impact sur les animaux
L’induction des modèles d’étude se fera sur les mères et leurs embryons soit par l’alimentation sans contrainte autre que le changement de l’aliment, soit par une injection intrapéritonéale qui peut induire un stress lors de la contention une douleur de courte durée lors de l’injection au point de piqûre. Les animaux seront ensuite transportés dans un autre établissement ce qui pourra induire un léger stress. Dans le second établissement, la procédure chirurgicale mise en œuvre est rapide mais entraîne néanmoins un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie générale. De plus, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants tels que grattages et petites plaies autour de l’œil. En fin de période de maintien, les animaux subiront une imagerie sous anesthésie (stress thermique/risques anesthésiques) puis seront euthanasiés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par méthodes règlementaires, ce qui permet de réaliser les analyses et prélèvements nécessaires.
Remplacement
Des données préliminaires obtenues in vitro par notre équipe indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé, mais pouvoir établir des conclusions scientifiquement et statistiquement fiables. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 547 le nombre total d'animaux (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui devront accompagner les animaux en plus bas âge au moment du transport et 27 mères ayant subies des traitements). Nous avons également choisi de réaliser un groupe contrôle unique pour les deux conditions expérimentales, afin de réduire le nombre total d’animaux.
Raffinement
Sur l’ensemble de la trajectoire de vie des animaux, et donc sur les deux établissments utilisateurs, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à la manipulation des souris gestantes, nous aurons un suivi particulier de ces animaux et de leur descendance (grâce à des points limites définis, et protocoles analgésiques dédiés). Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Pour le transport, nous veillerons à maintenir les congénères de chaque portées et une semaine d’adaptation. Suite à la chirurgie de fermeture d’un oeil, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’oeil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, la procédure sera réalisée sous anesthésie et préparée par une injection analgisante. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté, dans les deux établisssments utilisateurs.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit aux jours post-nataux 21, 28, 50 et 100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers le jour post-natal 28. - Au jour post-natal 21, la période critique commence à s’ouvrir. - Au jour post-natal 50, la plasticité est largement réduite - Au jour post-natal 100 la période critique est totalement fermée.