Procédures légères
Développement de nouvelles générations de vaccins ciblant les orthopoxvirus face aux risques de ré-émergence et à la recrudescence de la menace.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Quatre-vingt-neuf macaques à longue queue doivent être gardés en vie à la fin du projet pour être réutilisés dans d'autres protocoles, les 102 autres étant tués pour prélever leurs organes. Les 191 animaux sont vaccinés puis infectés une ou deux fois par le virus du Mpox, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 12 d'entre eux, modéré pour 159 et sévère pour 20. Ils développent fièvre, lésions cutanées et gonflement des ganglions, subissent pendant la phase aiguë jusqu'à cinq prélèvements par semaine sous anesthésie, sang, liquide de pustules et lavages des muqueuses, et restent hébergés seuls jusqu'à six semaines. Le porteur inscrit ce travail dans "l'arsenal de la défense européenne" face à la variole, qu'il présente comme une arme biologique.
Objectifs
Ce projet vise à développer des contre-mesures médicales et notamment des vaccins, dont une jusqu'à la preuve de concept dans des modèles animaux contre les orthopoxvirus Certains d’entre eux peuvent être utilisés comme arme biologique. Le monkeypox (Mpox, ou variole du singe) et la variole, font partie des maladies provoquées par des orthopoxvirus. Récemment, nous avons été témoins de deux épidémies de Mpox distinctes. La première partie d’Afrique et touchant l’ensemble des continents est en cours depuis 2022, la seconde a débuté en République Démocratique du Congo en 2023, causée par un virus de Monkeypox différent de la première. Ces deux épidémies à l’origine distinctes sont les conséquences d’un accroissement récent de la capacité de transmission interhumaine par différentes voies (sexuelles, fomites…) du Mpox. Ainsi ce projet a aussi pour but de se prémunir de la ré-émergence des virus de la famille des orthopoxvirus. Les objectifs de notre projet sont le développement d’une stratégie vaccinale plus efficace et plus sûre que le vaccin de référence contre les orthopoxvirus , des approches d'administration innovantes pour les vaccins basées sur l'utilisation de micro-aiguilles et de micro-gouttelettes lipidiques, et des vaccins à base d'ARNm (acides nucléiques). Il s'agira notamment de mettre au point de nouveaux vaccins plus efficaces et à protection croisée contre les différents orthopoxvirus, en utilisant de nouvelles technologies vaccinales tel que les acides nucléiques par exemple utilisés pour le développement des vaccins contre la Covid 19.
Bénéfices attendus
Ce projet présente deux bénéfices distincts : Aujourd’hui le vaccin utilisé contre les orthopoxvrus ne semble pas forcément aussi efficace notamment à long terme que le vaccin de 1ère génération utilisée jusqu’aux années 1980 qui a permis l’éradication de la Variole. Le vaccin actuellement proposé aux personnes à risques, de part ces caractéristiques (vaccins à base de virus à la réplication déficientes), ne peut à ce jour pas être produit en très grande quantité. Des vaccins dits de 4ème générations semblent donc nécessaires pour mieux protéger les populations en cas de ré-émergence mondial d’un virus appartenant à la famille des orthopoxvirus. Ce projet présente deux bénéfices distincts : -Pour la société civile, la mise au point de vaccins qui seraient efficaces contre différents orthopoxvirus. En effet, en 2 ans, nous avons observé deux épidémies distinctes causées par deux souches différentes présentant une capacité accrue à se transmettre entre les Hommes. -Le développement d’une ou plusieurs contre-mesures vaccinales pour augmenter l’arsenal de la défense européenne face à la menace représentée par les orthopoxvirus, notamment le virus de la variole qui reste une arme biologique.
Procédures
- L’ensemble des procédures du projet sera effectué sur des primates anesthésiés pour éviter toute souffrance. - L’immunisation des primates par vaccination pourra être effectuée par différentes voies utilisées classiquement en vaccinologie. - La contamination virale sera réalisée 1 ou 2 fois durera environ 30 minutes par animal maximum. Lors de la phase d’infection pendant laquelle l’animal est contagieux, il sera hébergé individuellement tout en gradant des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec ses congénères. Il sera remis en groupe dès que la charge virale sera nulle (entre 3 et 6 semaines) - Des capteurs de température pourront être implantés au débit de l’étude sous la peau par chirurgie pour suivre l’état de santé et la température corporelle en continu (mesure toutes les 2 heures) (intervention 45 minutes). - Des prélèvements de sang seront effectués au maximum 5 fois par semaine pendant la phase aiguë du monkeypox se traduisant par la présence de lésions cutanées et de fièvre qui dure 4 semaines environ. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons en plus des prélèvements sanguins, prélèvement des liquides des pustules et de fluides mucosales ou lavages des sites infectieux et muqueuses. Ces prélèvements seront réalisés au maximum 5 fois par semaine (10 minutes pour l’ensemble des prélèvements) pour un nombre total de 30 maximum pour toute l’étude d’efficacité. Ces prélèvements cumulées avec les prélèvements de sang effectués pendant la phase d’immunisation pourront représenter jusqu’à 45 prélèvement sur 2 ans. - Pour accéder aux compartiments d’intérêt, nous effectuerons des lavages broncho-alvéolaires (30 minutes chacun) et nous prélèverons des petitis bouts de tissus par biopsies, actes chirurgicales non invasif de façon parcimonieuse.(30 à 45 min d’intervention suivant les tissus). -Les prélèvements de liquide séminal par voie naturelle seront effectués au maximum 1 fois par semaine pour un total de 8 maximum ; cela prendra 30 minutes environ. - Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives d’imagerie in vivo pour caractériser l’infection et la visualiser la clinique pulmonaire ainsi que le suivi inflammatoire en utilisant deux techniques d’imagerie 8 fois au maximum au cours de l’étude (2 heures maximum ; les animaux sont maintenus sur tapis chauffant). -
Impact sur les animaux
Nous avons déjà développé un modèle primate de monkeypox par transmission sexuelle chez le macaque Cynomolgus. Suite aux infections, les animaux présentent des symptômes comme de la fièvre, des perturbations de la numération sanguine, une lymphadénomégalie, des lésions cutanées. Normalement, ces effets sont transitoires (de l’ordre de deux semaines) exceptés les lésions cutanées qui persistent un peu plus longtemps (2 à 4 semaines).. Ici nous allons développer un modèle primate de la maladie par exposition au virus monkeypox par voie respiratoire, chez qui nous envisageons des symptômes similaires avec des signes cliniques respiratoires supplémentaires. La dose la plus appropriée de virus lors de la mise en place de ce modèle , devra provoquer des atteintes pulmonaires et une baisse des capacités respiratoires (oxymétrie). L’hébergement individuel lors des phases d’infection peut entrainer un stress qui sera compensé par un programme d’enrichissement de leur milieu de vie défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement . Au niveau des procédures expérimentales, nous interviendrons sur des animaux anesthésiés. Ces anesthésies répétées peuvent provoquer un effet indésirable telle que l’hypothermie ou une perte de l’appétit. Très majoritairement elles seront inférieures à 30 minutes pour le suivi lors de la phase « aigüe ». Il est possible que les différents types de biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.
Devenir
Des organes d’intérêt seront prélevés sur certains animaux euthanasiés dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. Ces prélèvements permettent d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition au virus sur les organes, ce qui ne serait pas possible en clinique. Un pan de ce projet est aussi de caractériser la réponse immunitaire au niveau des muqueuses notamment les muqueuses rectales et pulmonaires Enfin, il est prévu de garder en vie 89 animaux qui pourront être réutilisés dans de futurs projets. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.
Remplacement
L’objectif est de développer un modèle animal de variole du singe par voie respiratoire pour tester des candidats vaccins avant leur utilisation chez l’Homme. Ce type d’évaluation nécessite un modèle animal expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite à l’immunisation et à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés in vitro ou sur des modèles de petits animaux (rongeurs, furets) dont le système immunitaire est très différent de celui de l’Homme. En effet, les symptômes du Mpox sont très différents chez les rongeurs. Le macaque a été choisi comme modèle animal car il présente une réponse immunitaire semblable à celle de l’Homme pour la plupart des infections virales. De plus, les outils nécessaires pour mener l’étude sont disponibles et maîtrisés chez cette espèce. Les animaux utilisés seront des macaques cynomolgus, espèce ayant une physiopathologie proche de celle de l’Homme lors de l’infection et étant un hôte naturel du virus. Enfin, le modèle PNH nous permet de faire un suivi plus poussé, notamment un suivi des cellules immunitaires pulmonaires grâce aux lavages broncho alvéolaires, ce qui n’est pas possible chez le modèle rongeur..
Réduction
Nous cherchons à développer un modèle PNH de variole du singe ou Monkeypox par voie respiratoire pour mener des tests d’efficacité de plusieurs candidats vaccins. La première dose de virus testée pour développer de modèle sera basée sur les données produites lors d’études précédentes . En utilisant un radiotraceur pour mimer le virus à la fois pour des expériences in vitro et in vivo, nous pourrons définir la dose optimale de virus à administrer. La première dose sera testée sur des petits groupes 2 animaux. Nous avons déjà validé cette approche dans notre institut pour la mise en place d’autres modèles infectieux (comme le SARS-CoV-2 ou différentes souches du virus de la grippe). Le nombre d’animaux utilisé pourra donc être réduit si la/les première(s) doses testée(s) et le premier outil d’aérosolisation testés permettent rapidement l’établissement d’un modèle respiratoire satisfaisant. Concernant les études d’efficacité de candidats vaccins, des groupes 6 PNHs seront utilisés dans les groupes vaccinés ; pour les groupes contrôles au fur et à mesure de l’avancée du projet et de l’accumulation de données, nous essaierons au maximum d’utiliser des contrôles historiques dont ceux issus des expériences de mise en place du modèle et ce afin de réduire le nombre d’animaux de l’expérience.
Raffinement
L’ensemble des interventions du projet sera effectué sur des animaux anesthésiés. Nous serons cependant très vigilants lorsque nous mettrons en place le modèle et ferons des évaluations cliniques régulières sous forme d’une « grille » regroupant des paramètres définis préalablement.. Cette « grille » de scoring sera adaptée et améliorée lors de cette phase afin de déterminer des critères d’arrêt précoces de l’étude. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puce permettant un suivi de l’état de santé de l’animal et la prise de température, peut induire une réaction au site d’incision (gonflement, suintement de la plaie). Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés individuellement suite à l’exposition virale pour empêcher toute surinfection liée à une contamination croisée, ce qui peut générer un stress ou de l’ennui chez l’animal. Le programme d’enrichissement pourra être étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement individuel, pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans l’ensemble des fluides corporels. L’injection des vaccins pouvant entrainer une réaction locale (démangeaisons, douleurs), une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision vétérinaire. L’exposition au virus monkeypox par voie respiratoire peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. En cas d’apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé. En cas d’une aggravation de l’état de santé des animaux (léthargie sévère, état moribond), l’animal sera sorti de protocole.
Choix des espèces
Les macaques cynomolgus ont été sélectionnés pour deux raisons : - Ils sont le seul modèle animal réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’Homme, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maîtrisés chez cette espèce. C’est par ailleurs un hôte naturel de la variole du singe. Ils représentent l’ultime modèle préclinique permettant l’entrée en phase de test clinique chez l’Homme. - Ils ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par la variole du singe, et ils présentent une physiopathologie comparable à l’Homme. Nous utiliserons des animaux au système immunitaire mature (2 ans minimum) : en effet, le système immunitaire évolue en fonction leur stade de développement et leur âge. Les candidats vaccins étudiés pourront faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature ». Pour les études qui nécessitent des prélèvements de sperme, nous utiliserons des animaux mâles matures sexuellement.
rôle de la matrice extracellulaire dans l’origine des tumeurs pulmonaires en utilisant un modèle murin de cancer pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 188 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes amputées d'un morceau d'oreille pour le génotypage, et 594 d'entre elles recevront chacune quarante-quatre injections dans l'abdomen. Les 594 autres reçoivent une injection sous la peau et une instillation dans la trachée. Le niveau de souffrance déclaré est sévère pour la moitié des animaux, léger pour l'autre, et toutes sont tuées pour prélever leurs poumons, organe vital dont le prélèvement impose la mise à mort selon le porteur. Les souris développent un cancer pulmonaire avec les difficultés respiratoires, la prostration et la perte de poids qui l'accompagnent, quand la culture de cellules respiratoires mise au point au laboratoire est écartée comme "encore très expérimentale".
Objectifs
Les cancers pulmonaires sont le résultat de la transformation d’une cellule saine en cellule cancéreuse. Ces transformations sont liées à l’apparition de mutations génétiques. Cependant, les mutations, seules, ne sont pas suffisantes pour induire la formation de tumeur. Nous étudions le rôle de l’environnement des cellules dans leur transformation de cellules saines à cellules cancéreuses. Nous utilisons des souris pour étudier ces mécanismes, dans l’espoir de développer des traitements plus adaptés et efficaces pour combattre ces cancers.
Bénéfices attendus
Comprendre comment l'environnement tumoral impacte les tumeurs permettrait de mieux comprendre la complexicité tumorale. En élucidant les mécanismes qui régissent le comportement des cellules et leur transformation, nous pouvons ouvrir la voie à des interventions thérapeutiques plus ciblées et efficaces pour traiter ces cancers.
Procédures
Ce projet est basé sur un total de 1188 souris qui subiront toutes une biopsie d'oreille (1x 30 secondes). 594 souris seront injectées 44x en injection intrapéritonéale . Durée de l’intervention : 1minute par souris par injection. 594 souris recevront une injection en sous-cutanée (durée de l’intervention 1 min), et une instillation intratrachéale 1x, durée de l’intervention 5 min.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un cancer avec les nuisances associées qui sont une difficulté́ respiratoire (respiration lente, saccadée ou très rapide), une prostration et une perte de poids. Les injections peuvent entrainer des plaies au niveau des sites d’injection. La nuisance liée au prélèvement auriculaire se manifeste parfois par un léger saignement de l’oreille.
Devenir
Cette étude vise à comprendre les mécanismes de tumorigenèse pulmonaire pour mieux appréhender les cancers pulmonaires humains . Afin de valider nos hypothèses, nous devons collecter le matériel biologique, c'est à dire le poumon. Le poumon étant un organe vital, nous devons mettre à mort les animaux.
Remplacement
Les cultures primaires de cellules bronchiolaires et alvéolaires murines et humaines en culture interface air-liquide (ALI) sont établies au laboratoire. La culture ALI est une méthode de culture cellulaire utilisée pour étudier les cellules épithéliales respiratoires. Cette technique reproduit de manière plus réaliste les conditions in vivo en maintenant une interface entre un environnement liquide et une exposition directe à l'air. Les cellules sont cultivées sur une membrane poreuse intégrée à un insert de culture. La membrane sépare un compartiment apical exposé à l'air et un compartiment basal immergé dans un milieu de culture liquide.Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et à ce jour, ne recapitulent pas l’hétérogénéité cellulaire de l’épithélium pulmonaire, c’est pourquoi, nous avons besoin de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum selon la méthode statistique prédictive en tenant compte de l’hétérogénéité des modèles. En fonction des resultats obtenus, toutes les conditions ne seront pas realisées.
Raffinement
Les animaux sont observés 1x par jour et pesés 1x par semaine tout au long des expériences. Des points limites adaptes à la procédure et généraux, prédictifs seront appliqués. De plus, pour le prélèvement auriculaire pour génotypage, actuellement nos zootechniciens et moi-même, sommes formés au prélèvement buccal (en remplacement de la biopsie d'oreille). Tant que cette technique n'est pas maitrisée et les résultats validés, nous continuerons le prélèvement à l’oreille ; puis, quand nous la maitriserons, elle deviendra la méthode standard de prélèvement.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans cette procédure est un modèle de référence pour l'étude du cancer pulmonaire et nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la communauté scientifique. Les animaux seront âgés d’au moins 8 semaines (adultes) pour ne pas interférer avec le développement pulmonaire embryonnaire qui continue jusqu’à trente jours après la naissance. Pour cette procédure, nous utiliserons des mâles et des femelles.
Décryptage de l’activité neuronale et astrocytaire induite par l’ocytocine dans le cortex préfrontal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour comprendre comment deux types de cellules du cortex préfrontal permettent à une souris de reconnaître ses congénères, 3 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié, modéré pour l'autre. Chacune peut subir deux chirurgies d'une heure trente, pour injecter un virus dans le cerveau et y implanter des canules, avec un risque d'inflammation, d'infection au niveau des sutures et de perte de poids. Un test d'interaction sociale de vingt minutes suit une injection réalisée sur animal vigile, avant une chirurgie terminale. Les nouveau-nés sont amputés d'un bout de queue pour le génotypage, et ceux dont le profil génétique ne présente pas d'intérêt pour le projet sont tués.
Objectifs
Comprendre la reconnaissance de ses congénères constitue une compétence fondamentale dans les interactions sociales quotidiennes. Les altérations des interactions sociales représentent une caractéristique centrale à la fois dans les troubles du spectre autistique (TSA) et dans la schizophrénie. L'étude des mécanismes neuronaux sousjacents à la reconnaissance sociale pourrait permettre de fournir des informations précieuses pour le développement d'interventions médicales visant à traiter les TSA. Le cortex préfrontal est connu pour être impliqué dans le processus de reconnaissance des congénères. Notamment, les patients ayant subi des traumatismes crâniens localisé au niveau du cortex préfrontal présentent des altérations dans la reconnaissance sociale. Au sein du cortex préfrontal, certaines populations neuronales semblent responsables de la capacité à reconnaitre les congénères. D’autre part, d’autres cellules, les astrocytes, semblent impliquer dans le processus de reconnaissance sociale. Ces observations suggèrent l’existence d’une interaction entre ces astrocytes et les neurones somatostatines du cortex préfrontal qui contrôleraient la reconnaissance sociale, cependant ce terrain reste largement inexploré. En conséquence, ce projet vise à élucider l'interaction réciproque entre les astrocytes et les neurones somatostatines au sein du cortex préfrontal concernant le domaine de la reconnaissance sociale.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'acquérir une compréhension complète des mécanismes complexes régissant les fonctions de reconnaissance sociale au sein de la circuiterie du cortex préfrontal médian (mPFC). Plus précisément, ce projet de recherche vise à clarifier le rôle crucial joué par les interactions entre les neurones et les astrocytes dans la régulation de la reconnaissance sociale. La réussite de ce projet promet de fournir de nouvelles perspectives sur les bases neurobiologiques des fonctions de reconnaissance sociale. De plus, les résultats seront susceptibles de stimuler le développement de stratégies de traitement innovantes visant à relever les défis associés au trouble du spectre autistique (TSA).
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 principales intervention : 1. Biopsie pour déterminer le profil génétique des souris. 2. Deux chirurgies d'une durée de 1h30 maximum réalisée sous anesthésie générale et analgésie. 3. Injections sur animal vigile d'une durée de 1 minute réalisées 30 minutes avant les tests comportementaux 4. Un test comportemental d’interaction sociale de 20 minutes. 5. Une chirurgie terminale sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Les chirurgies visant à l’injection de virus et l’implantation de canules intracérébrales induisent des douleurs modérées. Elles peuvent induire des inflammations, des infections notamment au niveau des points de suture mais aussi une perte de masse de l’animal. Les injections intra-péritonéales et les biopsies induisent une douleur légère de courte durée. Les gestes de contention peuvent induire un stress transitoire aigu. Le test d’interaction social libre peut induire un stress.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis a mort en fin de procédure afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo. Les animaux caractérisés génétiquement qui seront de mais sans intérêt pour le projet seront mis à mort.
Remplacement
Pour étudier l'aspect complexe des interactions sociales et les mécanismes des circuits cérébraux sous-jacents, l'utilisation d'animaux dotés d'un cortex développé et de l’intégrité des circuits neuronaux impliqués dans la régulation des aspects cités ci-dessus en objet est inévitable. Il n'est donc pas possible d'utiliser des modèles in vitro tels que la culture cellulaire ou un modèle mathématique complet.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au minimum selon les règles statistiques de façon à garantir des enregistrements fiables exploitables statistiquement. Les résultats seront comparés avec des tests statistiques appropriés permettant de mettre en évidence le rôle du réseau astro-neuronale du cortex pré-frontal dans les interactions sociales chez la souris.
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives (groupes sociaux) enrichies (bâtons, frisure, tunnel en carton) permettant ainsi aux animaux d’exprimer leur comportement naturel. Les animaux seront préalablement acclimatés à leur environnement (2 semaines avant l’expérimentation) et habitués à la présence de l’expérimentateur, aux différents tests le cas échéant, et à la contention. Les approches invasives seront réalisées sous anesthésie analgésie. La température corporelle de l’animal sera garantie par des tapis chauffant thermostaté et le dessèchement de la cornée sera prévenu par application d’un gel oculaire hydratant. Pour faciliter la récupération post-opératoire de l’animal un traitement analgésique sera mis en place et de la nourriture gélifiée appétante sera ajoutée sur le sol de la cage. L’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille de score et des points limites précoces permettant d’interrompre les procédures et de mettre fin à la souffrance animal ont été définis. Concernant la procédure de biopsie invasive,le cannibalisme maternel après caudectomie est très rare. Pour limiter ce comportement lorsque les nouveaux-nés doivent être prélevés avant 6 jours chez la souris , l’opérateur frottera ses mains dans la litière de la cage afin de limiter le dépôt d’odeurs étrangères sur les petits.
Choix des espèces
Le modèle expérimental chez le souris est un standard pour ce type d’expériences et comporte une série de symptôme superposable avec la pathologie humaine (syndrome de Pradder-Willy, Troubles du Spectre Autistique, …). De nombreuses études sont réalisées concernant les réseaux astro-neuronaux chez les souris : les outils sont donc bien validés sur cette espèce, ce qui concourt à assurer la fiabilité des résultats obtenus, leur interprétation ainsi que leur comparaison avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 8 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mécanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures.
Etude des propriétés immunitaires des antigènes dérivés du génome non-codant.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Quatre protocoles différents, dont l'injection d'un produit cancérogène, l'application de cellules tumorales sur une peau abrasée et une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse : 6 516 souris vont être utilisées dans ce projet. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour 6 396 d'entre elles, léger pour 120, et toutes sont tuées à l'issue pour des analyses post mortem. Leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine, et le porteur signale après irradiation des diarrhées, une prostration et une altération de l'état général pendant trois semaines. L'effectif ne repose sur aucun calcul présenté, mais, écrit-il, sur des expériences similaires menées au laboratoire et sur la littérature.
Objectifs
L’essor récent des approches d’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de cancers préalablement incurables. Cependant, ces approches ne sont pas efficaces pour les patients et ne s’appliquent pas à tous les cancers. Pour élargir leur champ d’application, il est essentiel d’identifier des stratégies visant à combiner les médicaments d’immunothérapie déjà utilisés avec d’autres molécules ou approches qui augmenteront l’efficacité des traitements. Une piste privilégiée est le développement de vaccins anti-tumoraux. L’objectif de tels vaccins seraient d’induire le développement de cellules immunitaires capables de reconnaître les cellules tumorales. Une étape essentielle est d’identifier les molécules exprimées par les cellules cancéreuses (antigènes) et pas par les cellules saines. Cela est possible car pendant la tumorigénèse, les cellules cancéreuses divergent petit à petit des cellules normales par l’accumulation d’anomalies génétiques ou épigénétiques. On sait depuis longtemps que le système immunitaire peut détecter les anomalies génétiques associées aux cancers. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont montré qu’il peut détecter la plupart des anomalies épigénétiques acquises pendant la tumorigénèse. Cependant, il est nécessaire de tester si les cibles dérivant de ces anomalies épigénétiques sont adéquates pour une vaccination anti-tumorale, en déterminant notamment la stabilité de leur expression au cours du temps, leur capacité à induire une réponse immunitaire robuste, etc… L’objectif de ce projet est de fournir une description approfondie des réponses immunitaires contre les anomalies épigénétiques associées aux cancers, pour accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.
Bénéfices attendus
Le développement de l’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de nombreux cancers. Cependant, ces protocoles ne sont pas efficaces pour tous les patients et ne s’appliquent pas à toutes les pathologies. Améliorer leur efficacité est un enjeu central en cancérologie. Le développement de vaccins anti-tumoraux thérapeutiques est une piste prometteuse pour améliorer le champ d’application de l’immunothérapie. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont identifié de nouvelles sources de molécules exprimées par les cellules tumorales qui peuvent être détectées pour le système immunitaire. Cependant, il est nécessaire de mieux décrire les réponses immunitaires contre ces nouvelles molécules si on veut s’appuyer sur cette découverte pour améliorer la prise en charge clinique des patients. Le projet proposé ici apportera une compréhension approfondie des réponses immunitaires contre les cancers et consolidera les approches visant au développement de vaccins anti-tumoraux.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, une molécule carcinogène (induisant la formation des tumeurs) sera injectée à des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie inf à 5 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un deuxième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse et les animaux seront traités 2 fois par semaine par injection pendant toute la durée de la procédure. La mesure de la tumeur et l’injection pour le traitement sont réalisées en même temps (une seule contention inf à 2 min). Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront appliquées aux animaux anesthésiés après abrasion douce de la peau (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie env 20 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un quatrième lot d’animaux, les animaux seront irradiés pour éliminer les cellules immunitaires. 4h après irradiation, des cellules de moelle osseuse d’intérêt seront injectées par voie intraveineuse sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour reconstituer le système immunitaire. 6-8 semaines après injection, un prélèvement de sang sera réalisé sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour évaluer la reconstitution.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou soumis à une procédure de carcinogenèse chimique développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de carcinogènes, de cellules ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est également attendu une douleur légère liée à la piqûre elle-même (gène de courte durée ). Suite aux irradiations, certains animaux peuvent présenter des problèmes de diarrhée, prostration, altération de l’état général pendant les 3 premières semaines suivant l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro ainsi que de nombreuses analyses bioinformatiques qui nous ont permis d’identifier des peptides dérivant de gènes, de mutations ou du génome silencieux exprimés par plusieurs lignées tumorales. Cependant, pour analyser si leur expression peut être affectée lors d’une réponse immunitaire efficace, il nous est essentiel de réaliser certaines expériences en utilisant des modèles de souris. En effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de système d’activation in vitro permettant de récapituler la complexité des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire lors du développement d’un cancer. Par conséquent, pour décrire les propriétés immunologiques des antigènes dérivés du génome non-codant, il nous est essentiel d’avoir recours à un modèle animal. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait de la proximité des systèmes immunitaires entre hommes et souris.
Réduction
Nous avons réalisé des approches expérimentales et bioinformatiques en profondeur pour caractériser au mieux l’expression de différents types d’antigènes par nos cellules tumorales d’intérêt et ajuster les expériences à faire in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme entier où les interactions complexes entre cellules tumorales et système immunitaire seront reproduites. D’autre part, nous utiliserons systématiquement des approches dites de « multiplexage », qui permettront de suivre dans la même souris le comportement d’au moins 20 peptides différents. Ces approches complexes ont déjà été mises en place au laboratoire, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux utilisés dans ce projet . Les nombres d’animaux dans les différentes procédures ont été déterminés sur la base d’expériences similaires au laboratoire et sur la base des données de la littérature
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer la souffrance, et des points limites ont été définis. Les animaux seront mis à mort à l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans la grille de score. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Il y a également de nombreux modèles de tumeurs transplantables disponibles, bien décrits et reproductibles, qui permettront de répondre rapidement aux questions posées dans ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Travaux pratiques sur le modèle « lapin »
- Formation professionnelle
Le lapin est retenu ici parce qu'il figure au deuxième rang des espèces les plus utilisées en recherche. 96 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun peut recevoir jusqu'à trente administrations, par voie orale, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire ou intraveineuse, et subir jusqu'à dix prélèvements de sang à l'artère de l'oreille ou à la veine jugulaire, tous réalisés sur animal vigile par des élèves. Une dizaine des plus âgés sont tués chaque année pour des dissections de BTS, 30 sur l'ensemble du projet, quand 46 restent dans l'animalerie pédagogique et 20 sont proposés à l'adoption à deux ans.
Objectifs
Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques en tant qu’applicateur de procédures expérimentales sur l’espèce lapin. Le but est d’acquérir les techniques de manipulations classiques pour réaliser des administrations et des prélèvements en évitant toute souffrance pour l’animal et en garantissant la sécurité de l’opérateur et de l’animal. En parallèle, avec l’utilisation de l’animalerie pédagogique, les apprenants avec encadrement sont initiés aux différentes techniques de base en matière d’hébergement, élevage , techniques d’anesthésie, soins pré/post opératoires et observations des animaux dans le respect du bien être animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux pratiques font partie intégrante de la formation des techniciens applicateur de procédures utilisant des animaux à des fins scientifiques. L’obtention de leur diplôme ou habilitation leur donne la possibilité de travailler dans le cadre de projets scientifiques sur animaux vivants et permet aux employeurs de bénéficier de techniciens compétents techniquement et opérationnels réglementairement dès leur entrée dans l’entreprise. La méthode d’apprentissage basée sur les règles de bien être animal permet d’acquérir les bons gestes afin de garantir sécurité et respect éthique de l’animal. L’animalerie pédagogique permet aux apprenants d’acquérir d’autres notions importantes tel que le maintien des ces animaux en milieu confiné, l’observation quotidienne, l’élevage, l’hygiène et la prophylaxie. L’acquisition des ces compétences théoriques et pratiques démontre l’importance d’avoir des animaux hébergés dans de bonnes conditions et une approche des règles de bien être animal facilite leur manipulation. Les entreprises sont à la recherche de personnel formé et autonome rapidement. Notre établissement est très réputé dans la formation de techniciens applicateurs grâce à l'expertise technique de formateurs reconnus depuis de nombreuses années et un outil pédagogique tel que l’animalerie complètement rénovée cette année.
Procédures
Toutes les administrations et prélèvements sont réalisées sur animaux vigiles. Les différentes voies d'administrations sont la voie sous cutanée, intra dermique, intra musculaire, intra veineuse et orale. L'animal est soumis à 2 administrations maximum par semaine pour toutes les administrations sauf la voie intra dermique réalisée une ofis par an avec anesthésie locale au préalable. La durée d'administration est inférieure à 1 minute. Le nombre d'administrations pour un animal est inférieur à 30. Les prélèvements sanguins sont effectués à l'artère auriculaire et à la veine jugulaire 1 fois par semaine maximum. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute. Le nombre de prélèvements pour un animal est inférieur à 10.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces séances de travaux pratiques sont faiblement invasives. Les nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en apprentissage. La prise de sang peut également engendrer un hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux sont conservés à l'issue de cette procédure sauf 10 animaux maximum par an (les plus âgés) utilisés dans le cadre du programme de BTS pour des dissections. Le reste des animaux est maintenu dans l'animalerie et sert aux apprenants pour l'acquisitions de compétences comme l'observation, l'entretien, ou la manipulation. Ces animaux sont proposés à l'adoption à l'âge de 2 ans.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau applicateur), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (intramusculaire, sous cutanée, intraveineuse et voie orale sur animal vigile) pour les maîtriser au mieux et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations sans animal ou avec « peluche »). La réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles. Le but étant de permettre aux futurs applicateurs d’acquérir les bons gestes en évitant stress et souffrance aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes (voir annexe 3). Ce calcul est fonction du nombre de sesssions réalisées pendant une semaine en tenant compte du nombre maximum d'apprenants. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont aussi utilisés pour des travaux pratiques hors projet comme le sexage, la préhension, les contentions,les activités zootechniques. Cette double utilisation permet de réduire le nombre d'animaux. Le nombre de lapins utilisés au maximum sur 1 semaine est 56 lapins. Cependant afin de réduire le nombre d'animaux utilisés tout en maintenant des phases de repos nécessaires au bien être de nos lapins, les sessions de travaux pratiques sont réparties tout au long de la semaine en alternant travaux pratiques "projet" avec des travaux pratiques "hors projet". Le lapin est utilisée 1 fois par jour ouvré au maximum avec 2 administrations différentes par semaine ou 1 prélèvement sanguin par semaine. Cette organisation nous permet de diminuer le nombre de lapins à 32 par an soit une diminution de 40%. Ce nombre sera adapté chaque année scolaire en fonction du nombre d'apprenants. A partir de 2 ans d'âge les animaux sortent du projet pour être maintenu dans l'élevage, ils sont également proposés à l'adoption. La réhabilitation d'animaux fait partie intégrante du cursus d'apprentissage de nos futurs techniciens.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont hébergés en groupe socialement harmonieux de 2 ou 3 individus. Les animaux bénéficient d’un programme d’enrichissement alternatif et évolutif (Exemple: bâton à ronger, tunnel, foin, plateforme, balle, altère...). Tous les animaux sont entraînés en début d’année scolaire par les apprenants en classe de terminale, lors des premières séances de travaux pratiques. Les classes de seconde ou premières années débutent par l'habituation au contact applicateur/animal puis par la préhension de l'animal. Une attention particulière est portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Les élèves peuvent également proposer des mesures de raffinement observées pendant leur période de stage en entreprise comme une nouvelle technique de contention. Après chaque procédure d'administration ou de prélèvement, les apprenants effectuent un acte de renforcement positif (récompense alimentaire, caressing).
Choix des espèces
Le lapin est une espèce nécessaire à l’apprentissage du futur technicien applicateur de procédures expérimentales sur animaux. Cette espèce est une des plus utilisée en recherche (2ème au classement en 2022 avec environ 8.96%). Les lapins sont âgés au minimum de 4 semaines en début de projet et sont mis en réforme à 2 ans d’âge pour une adoption éventuelle. L’âge de réforme et la proposition à l’adoption se fait en fin d’année scolaire généralement. Avec des animaux de 2 ans, l’espérance de vie pour les adoptants reste intéressante.
Formation et entrainement aux gestes techniques sur souris
- Formation professionnelle
225 souris vont subir jusqu'à trois gestes techniques chacune, à un jour d'intervalle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Tatouage, prélèvement de tissu pour génotypage, gavage, injections dans l'abdomen, sous la peau, dans le muscle ou le sinus rétro-orbitaire : les gestes sont exécutés par des personnes en cours d'apprentissage, et le porteur reconnaît qu'une injection hésitante peut provoquer des lésions, voire la mort de l'animal. Ces séances ne produisent aucune connaissance, elles servent à remplir le cahier de compétences du personnel, et les animaux utilisés sont des souris de réforme, surnuméraires ou porteuses d'un génotype inutile aux protocoles en cours. Toutes sont tuées après leur troisième séance, le porteur jugeant "indispensable" que la formation se fasse sur des animaux vivants.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de former le personnel aux gestes techniques qu'ils auront à effectuer pour leurs projets sur les animaux. Ces formations permettront d'établir et de compléter pour tous les personnels le cahier de suivi de compétences à la fois pour la formation initiale et les formations continues. L'objectif est de garantir le bien etre des animaux par leur bonne manipulation et la reproductibilité des résultats. Ainsi la maitrise des gestes techniques permet de s’assurer du bien être animal et de réduire le nombre d’animaux utilisés lors de projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Le projet permettra la transmission des bonnes pratiques qui diminueront le biais manipulateur-dépendant dans les protocoles expérimentaux lié au stress ou à la douleur de l’animal et de garantir des résultats scientifiques reproductibles. Il permettra également aux manipulateurs de travailler en autonomie et dans le respect de la réglementation afin de s’assurer du bien être des animaux lors des procédures.
Procédures
3 animaux pourront être utilisés par participant pour reproduire le geste une seule fois par animal. 3 gestes maximum (hors contention) peuvent être réalisés par animal avec un jour d'intervalle entre chaque geste. Selon les besoins, les utilisateurs seront formés à l'identification par tatouage (durée 2s), au prélèvement pour génotypage (durée 1s), à l'administration orale sur animal (durée 30s), aux injections (durée 30s) (intra-péritonéale, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, rétro-orbitaire), aux prélèvements sanguins (durée 30s) (sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié, veine mandibulaire), à l'anesthésie (durée 10min maximum).
Impact sur les animaux
Ces gestes mal maitrisés peuvent engendrer un stress par la répétition d'essai de contention et contention plus longue, par le stress de l'expérimentateur et par une durée de manipulation plus longue et hésitante. La douleur chez l’animal peut également etre plus importante que lors de ces gestes d'apprentissage du fait d'injection hésitante et difficulté à trouver le site précis lors des injections/prélèvements veineux. Ces gestes mal réalisés peuvent entrainer des lésions voire le deces de l'animal.
Devenir
1 seul geste est réalisé lors d'une séance de formation sur chaque animal. 3 gestes maximum (hors contention) peuvent être réalisés par animal avec un jour d'intervalle entre chaque geste. Afin de ne pas multiplier le stress et la douleur des animaux ayant participé à 3 sessions d'entrainement, ils seront mis à mort
Remplacement
L'objectif de ce projet est de former le personnel aux gestes techniques qu'ils auront à effectuer sur les animaux vivants pour leurs projets. il est ainsi indispensable d'utiliser pour la formation des utilisateurs des animaux vivants dans les memes conditions afin de s'assurer que ces gestes techniques soient réalisés dans les meilleures conditions.
Réduction
La formation aux bons gestes techniques permet une réduction du nombre d'animaux en assurant la reproductibilité des résultats. Ce projet utilisera des animaux de réforme issu de nos élevages ne pouvant pas rentrer dans un protocole de recherche (animal surnuméraire ou présentant un génotype non compatible avec le protocole expérimental) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques. 1 seul geste est réalisé lors d'une séance de formation sur chaque animal mais ils seront réutilisés pour réduire le nombre d'animaux sacrifié. 3 gestes maximum (hors contention) peuvent être réalisés par animal avec un jour d'intervalle entre chaque geste. L'apprentissage nécessite un nombre limité par participant et ne fait pas l'objet de tests statistiques.
Raffinement
L'apprentissage des bons gestes contribue au raffinement des procédures en assurant le bien etre des animaux par leur bonne manipulation. Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, papier, tunnel), avec accès illimité à l’eau et à l’alimentation standard dans une atmosphère contrôlée, avec alternance jour/nuit. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, lors d'anesthésie, l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. 1 seul geste est réalisé lors d'une séance de formation sur chaque animal afin de réduire le stress de l’animal. 3 gestes maximum (hors contention) peuvent être réalisés par animal avec un jour d'intervalle entre chaque geste. La surveillance journalière des animaux sera renforcée pendant ces 3 jours. Les animaux par groupe de 3 (répétabilité sur 3 animaux pour les gestes techniques) seront transférés ensemble dans une nouvelle cage. Afin de limiter les bagarres, les males de différentes cages ne seront pas mélangées et les gants seront changés entre chaque cage afin de limiter le transfert d’odeur. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux les écarte de toute utilisation.
Choix des espèces
La formation est nécessaire pour que nos expérimentateurs puissent mettre en oeuvre leurs projets concernant le modèle expérimental "souris" de manière la plus reproductible et dans le respect du bien etre animal. Les gestes doivent etre enseignés et appris sur ce modèle expérimental. Le critère d’âge n’est pas restrictif sur l’utilisation de ces animaux. Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité.
Impact du fractionnement spatial de la dose d’irradiation sur la réponse vasculaire pulmonaire chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Irradiées au thorax sous anesthésie, puis gardées jusqu'à six mois avant d'être tuées pour prélever leurs poumons, 1 000 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 792 d'entre elles, léger pour 208. Le porteur indique que les doses employées provoquent une fibrose pulmonaire au-delà de trois mois et que les animaux peuvent finir en détresse respiratoire, voire mourir avant le terme. Parmi les bénéfices attendus, il place l'anticipation de l'arrivée de cette technique en clinique et l'acquisition de compétences par son institut. Il écrit aussi vouloir "saisir l'opportunité du positionnement de l'institut et de la France" sur la question.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des pierres angulaires du traitement du cancer. Les avancées technologiques de ces dernières années ont permis une amélioration considérable de la balistique des traitements mais les complications liées aux tissus sains restent la principale limitation à cette technique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles modalités de traitement qui permettraient de mieux protéger les tissus sains tout en garantissant un bon contrôle tumoral. Les techniques de fractionnement spatiale de la dose (SFRT) comme les mini faisceaux de radiothérapie (MBRT) sont de nouvelles modalités innovantes et très prometteuses qui utilisent une méthode radicalement différente pour l’administration de la dose : le fractionnement spatial de la dose. De nombreuses études précliniques ont montrés que le fractionnement spatial de la dose active des mécanismes radiobiologiques spécifiques qui conduisent à une meilleure préservation des tissus sains tout en maintenant un contrôle tumoral équivalent voir supérieur. Ces études précliniques ainsi que le traitement récent des deux premiers patients mettent en évidence que la MBRT est une technique très prometteuse. Bien que le potentiel de la SFRT ait été mis en évidence, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacent à cette technique et sa relation avec le fractionnement spatial de la dose. Afin de mieux comprendre comment la modulation de paramètres physiques et dosimétriques affectent la réponse biologique, il est nécessaire de conduire de nouvelles études précliniques. Ce projet se focalisera sur le compartiment vasculaire qui est très affecté par les rayonnements. En effet, d'un point de vue physiopathologique, le compartiment vasculaire, à l'interface entre le sang et les tissus, a été démontré comme jouant un rôle clé dans l'initiation la progression des lésions au tissu sain après radiothérapie. L'impact du fractionnement spatial de la dose sur le compartiment vasculaire au niveau du tissu sain est mal connu car très peu étudié et probablement que les paramètres physiques, comme le volume irradié, jouent un rôle déterminant dans les effets biologiques observés aigues et tardifs.
Bénéfices attendus
Les enjeux autour de ces nouvelles techniques de radiothérapie en particulier le fractionnement spatial de la dose ici (SFRT) sont nombreux : • Anticiper l'émergence susceptible d’être très rapide de ces techniques en clinique. • Questionner la justification de ce type de techniques en termes de radioprotection des patients, puisqu’elle repose sur un changement de paradigme important. • Saisir l’opportunité du positionnement de l’institut et de la France autour de cette question • Acquérir des connaissances et des compétences autour des concepts liés aux modifications du volume d'irradiation pour alimenter l’expertise concernant la radioprotection des patients.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie chimique (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 1 mois, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Les seules manipulations réalisées sur animal vigile seront les pesées (2 fois par semaine les deux premiers mois puis une fois par semaine). Selon les groupes expérimentaux, certains animaux seront anesthésiés pour réaliser une imagerie scanner ou une échographie (durée maximale de 10 min, maximum 4 fois). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation du thorax entier à 18 Gy à a été bien caractérisé dans notre laboratoire lors de projets précédents et a montré que les doses délivrées sont fibrosantes au niveau pulmonaire au temps tardifs (plus de 3 mois après irradiation). Aux temps les plus tardifs de l’étude (, les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux devront donc être surveillés de près et euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être. Compte-tenu de l’objectif qui est d’étudier la réponse vasculaire pulmonaire de ces nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire de fixer un temps d’étude long, ici de 6 mois, pour toutes les études envisagées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire, qui joue un rôle sur la réponse moléculaire des cellules. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les études sur les lésions pulmonaires causées par la radiothérapie dépendent beaucoup de la physiologie des animaux utilisés. Pour faire des tests statistiques sur les analyses histologiques, les microscans, les analyses moléculaires en cytométrie ou les analyses d'expression génique, il faut des groupes de 10 animaux. Pour les analyses génétiques, des groupes de 4 à 6 animaux suffisent, car ces tests utilisent des milliers de cellules par échantillon, augmentant la précision des résultats. Selon les données obtenues, différents tests statistiques peuvent être utilisés : un ou plusieurs tests, paramétriques ou non.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie. Lors des irradiations, les souris seront anesthésiées sous anesthésie chimique. Afin d’assurer un meilleur réveil, elles seront placées en thermacage dès la fin de l’irradiation. Des poches d’eau gélifiées ainsi que des croquettes seront également placés dans les cages de transport. Les souris de cette souche pouvant montrer des signes d’agressivité, des enrichissements supplémentaires seront mis dans les cages (bâtonnet en bois, dôme en carton, coton, papier kraft si nécessaire).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions pulmonaires radio-induites. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 à 10 semaines, ce qui correspond au stade jeune adulte. On choisit des souris de même âge, et jeunes adultes, pour éviter l’éventuelle hétérogénéité de la réponse liée à l’âge. Il s’agit de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ce modèle d’irradiation localisée. Comme tenu du caractère agressif des souris mâles, ils seront hébergés par 3 à 4 avec un enrichissement augmenté par rapport aux standards de l’animalerie.
Evaluation de la contribution de vésicules bactériennes dans l’induction d’un sepsis (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées trente minutes, parfois trois minutes, après une injection unique, 1 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'injection de vésicules bactériennes leur fait perdre du poids et de la vitalité, avant que leur sang et leurs organes soient prélevés pour mesurer l'inflammation et la formation de caillots. Les animaux passent d'un site à l'autre, le projet se déroulant dans deux établissements. Le porteur qualifie le recours au modèle murin d'"irremplaçable", au motif que les mécanismes en jeu ne seraient pas modélisables in vitro.
Objectifs
Notre objectif est de comprendre comment les vésicules bactériennes contribuent à la physiopathologie au sepsis (mise en place et aggravation). Nous nous intéressons en particulier à l’activation des plaquettes sanguines et la formation de microthrombi qui bloquent la circulation sanguine dans les petits vaisseaux entrainant la dysfonction des organes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules bactériennes dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure induisant une infection par injection de vésicules bactériennes (1 seule injection par souris de quelques secondes) dans le premier établissements utilisateur. Une seule prise de sang sera réalisée sur les souris anesthésiées (d’une durée environ de 2 min) (second établissements utilisateur). Suite à cette prise de sang unique, les animaux seront euthanasiés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue, injection d'une durée de 2-3 minutes) de colorant sera réalisée sur les souris anesthésiées, suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection (second établissements utilisateur). Pour l'évaluation du thromboembolisme, 1 injection d'un mélange d'agonistes plaquettaire sera réalisé en intra-veineux (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 3 min apres l'injection (premier établissements utilisateur).
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés de ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Lors de l’infection par les vésicules bactériennes, il peut y avoir dans un premier temps, une atteinte de l’état général, puis les souris récupèrent et vont mieux. Les effets indésirables attendus sont une perte de poids et une perte de vitalité.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et l’inflammation, l’hémostase, la perméabilité endothéliale ou la formation de thrombi seront analysés. .
Remplacement
Des résultats obtenus in vitro montrent que les vésicules bactériennes impactent l’activation plaquettaire et la formation du thrombus. Pour la suite de notre étude, le recours au modèle murin est irremplaçable pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Réduction du nombre d'animaux : plusieurs résultats obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Suite à l'infection, nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes. Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Une approche statistique sera utilisée pour vérifier les différences obtenues entre groupes.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. Les points limites seront basés sur la perte de poids et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience, difficultés respiratoires (respiration rapide). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus décrit pour l’étude du sepsis. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. De plus, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées (pas de phénotype dommageable). Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte).
Etude de l’impact du Phosphate dans le contexte d’une pathologie osseuse grâce à l’utilisation d’un modèle de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Tous tués pour que leurs tissus osseux soient analysés, 2 640 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie, deux séances d'imagerie sous anesthésie et un mois et demi de régime pauvre ou riche en phosphate. Une partie d'entre eux porte une mutation responsable d'une pathologie osseuse, et le porteur range les malformations squelettiques attendues parmi les nuisances, au même rang que le stress de l'anesthésie. Il présente pourtant le poisson comme une espèce permettant "des approches largement non-invasives sans nécessité d'intervention chirurgicale".
Objectifs
Des malformations du crâne sont retrouvées dans des maladies associées à un métabolisme du phosphate défectueux. Le but de ce projet est d’étudier, les effets d'un régime pauvre ou riche en phosphate sur la formation du crâne et des sutures crâniennes chez des poissons exprimant une mutation génétique responsable de pathologie osseuse. Les mécanismes cellulaires impliqués seront observés grâce à des techniques d'imagerie non invasives en temps réel, tandis que des analyses post-mortem permettront d'étudier la structure du crâne et la minéralisation des os.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du phosphate au cours de la formation du crâne dans des conditions normales et pathologiques. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défauts du squelette craniofacial. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- Prélevement nageoire caudale sous anesthésie: 1 fois,
Impact sur les animaux
- Prélevement nageoire caudale : douleur légère - Isolement : stress - Anesthésie : stress - Malformations squelettiques : douleur légère
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet sera mis à mort pour prelevements et analyses des tissus osseux
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différents types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencés par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statisques nécessaires à l'analyses des données.
Raffinement
Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Nous serons attentifs au comportement des animaux face à la nourriture qui sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les zootechniciens. D’autre part, l’apparition de symptômes comportementaux (immobilité, nage anormale) sera suivie et les poissons seront scorés deux fois par semaine par le chercheur en charge du projet durant la mise sous régime des animaux. Les poissons seront génotypés sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésique pendant 48h. L’acquisition d'images sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette . Le squelette présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d’observer par microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse sera réalisée de 1,5 mois post fécondation à 3 mois post fécondation, période de formation de la voûte crânienne.
Rôles des péricytes dans le développement des microglies
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées une fois, injectées une fois, traitées par l'eau de boisson, 2 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes, leurs embryons prélevés aux 14e, 16e et 18e jours de gestation, les souriceaux et les adultes sont tous tués pour prélèvement d'organes. L'objet est de comprendre comment les péricytes, cellules qui bordent les vaisseaux du cerveau, influencent la formation des cellules immunitaires cérébrales pendant le développement. Le porteur écrit avoir établi que huit animaux suffisent à obtenir des résultats significatifs, et déclare 2 508 animaux pour ce projet.
Objectifs
Ce projet vise à explorer comment certaines cellules cérébrales interagissent durant les premières étapes de la vie pour assurer le bon développement du cerveau. Plus précisément, il s’intéresse aux péricytes, des cellules situées autour des petits vaisseaux sanguins du cerveau, et aux microglies, des cellules immunitaires résidant dans le cerveau. Les péricytes protègent le cerveau en régulant les échanges entre le sang et les tissus cérébraux, tandis que les microglies jouent un rôle de "gardiens", aidant au développement, au nettoyage des débris et au maintien de l’équilibre du système nerveux. Bien que ces cellules aient des fonctions distinctes, elles semblent interagir et collaborer, en particulier durant le développement prénatal. Ce projet cherche à comprendre comment les péricytes influencent les microglies : leur formation, leur localisation dans le cerveau et leurs fonctions. Les chercheurs étudient également les signaux échangés entre ces deux types de cellules et leur impact sur la diversité des microglies, qui ne remplissent pas toutes les mêmes rôles. En combinant des techniques avancées sur des modèles murins, nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes clés dans ce dialogue cellulaire et les conséquences sur la mise en place du cerveau. Ces travaux pourraient permettre de mieux comprendre certaines maladies du cerveau, notamment celles liées à des dysfonctionnements immunitaires ou vasculaires, et offrir des pistes pour des avancées médicales.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait offrir des bénéfices importants pour notre compréhension de certaines maladies mentales et neurologiques, qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Des troubles comme l’autisme et la schizophrénie touchent une grande partie de la population et ont des conséquences profondes sur le quotidien des personnes affectées. Ces maladies se manifestent souvent par des difficultés cognitives, comme des problèmes de mémoire et d'attention, qui sont liées à des anomalies dans le développement du cerveau. Cependant, les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces. Mieux comprendre les origines de ces troubles pourrait nous aider à développer de nouvelles approches thérapeutiques. En se concentrant sur les interactions entre deux types de cellules clés du cerveau – les péricytes et les microglies – ce projet vise à mieux comprendre comment ces interactions influencent la formation et le fonctionnement du cerveau dès les premières étapes de la vie. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans la protection et le développement du cerveau, notamment en contribuant au bon fonctionnement des vaisseaux sanguins et des structures associées. Des anomalies dans ces mécanismes pourraient contribuer à certaines pathologies cérébrales, particulièrement celles qui apparaissent précocement, comme les troubles neurodéveloppementaux. Ainsi, ce projet pourrait contribuer à éclairer des processus fondamentaux du développement du cerveau et offrir des pistes pour mieux comprendre certains troubles, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour leur prévention et leur traitement.
Procédures
Gavage de molécule une fois. La durée est estimée à 2 minutes. Injection de molécule une fois. La durée de l’injection est estimée à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Lorsqu'un animal doit recevoir une injection dans l'abdomen ou un gavage avec une sonde, il est parfois nécessaire de le maintenir immobile pendant un court instant. Cette manipulation peut provoquer un stress temporaire chez l'animal, qui pourrait perturber son comportement habituel et entraîner des signes d'anxiété. De plus, l'ajout de certains traitements dans l'eau de son biberon peut parfois réduire la quantité d'eau qu'il boit, ce qui pourrait éventuellement affecter son poids. Ces aspects sont attentivement surveillés pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures.
Devenir
Toutes les mères traitées ainsi que les embryons, souriceaux et adultes seront euthanasiés en fin de procédures afin de réaliser un prélèvement d’organes.
Remplacement
L’étude du rôle des péricytes, acteurs clés de la barrière hémato-encéphalique (BHE), dans le dévelopement des microglies pendant les périodes prénatale et périnatale nécessite l’utilisation d’un organisme entier, comme la souris. En effet, les microglies et la BHE sont influencées par de nombreux signaux provenant du reste du corps, comme des hormones, des facteurs immunitaires et la circulation sanguine, qui modulent de manière dynamique leurs fonctions. Ces signaux influencent le comportement des microglies, leur migration et leur intégration dans le cerveau ainsi que la création d’une barrière efficace et sélective, capable de protéger le cerveau des substances indésirables. Les interactions entre les microglies et les péricytes dépendent de nombreux facteurs du corps entier, qui sont difficiles à reproduire dans des expériences en laboratoire. Les systèmes en culture cellulaire (in vitro) ou les modèles réduits (organoïdes) ne peuvent pas reproduire les interactions complexes et les signaux venant de l’ensemble de l’organisme, ce qui ne permet pas d’étudier en profondeur des processus encore mal compris. Dans le cadre de ce projet, nous poursuivrons nos recherches précédentes sur la façon dont les différentes cellules du cerveau se développent et interagissent pour former des circuits neuronaux et gliaux complexes. Pour observer ces processus dans leur contexte naturel et complet, un modèle vivant, comme la souris, est essentiel. Ce modèle nous permettra d’étudier comment les microglies et les péricytes interagissent et réagissent aux signaux provenant du reste du corps pendant le développement. Toutefois, dès que cela sera possible et avant d'étudier ces mécanismes dans l'organisme vivant, nous testerons certains gènes candidats sur des cellules en culture pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux phénotypes que nous observerons, avant de les analyser plus en détail in vivo.
Réduction
Notre projet est conçu pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, tout en garantissant des résultats fiables et précis. Nous avons pris en compte la nécessité d'obtenir plusieurs échantillons pour vérifier que les résultats sont cohérents et reproductibles, tout en limitant les influences des différences biologiques (comme le sexe ou les caractéristiques génétiques) et environnementales (par exemple, les effets de l'interaction avec la mère). Pour garantir la stabilité génétique des souris et lorsque cela est possible, nous réalisons ces croisements de manière à obtenir à la fois des animaux témoins et des mutants issus de la même portée. Cette méthode permet de comparer des animaux génétiquement similaires, réduisant ainsi les variations liées à la génétique, et évite les risques de dérive génétique que pourrait engendrer des croisements consanguins. En optimisant cette approche, nous réduisons la variabilité des résultats, ce qui permet de diminuer le nombre d'animaux nécessaires. Nous avons également optimisé la taille des groupes expérimentaux pour garantir des résultats statistiquement fiables avec un nombre réduit d'animaux. Grâce à notre expérience passée, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) suffisent pour obtenir des résultats significatifs tout en respectant les critères de rigueur scientifique. Cela permet de minimiser l'impact sur les animaux tout en maintenant la robustesse des conclusions. De plus, dans nos différentes expériences, si les premiers tests (comme l’observation des tissus au microscope ou l’analyse de la barrière qui protège le cerveau) ne donnent pas de résultats clairs, nous ne réaliserons pas les autres expériences prévues (comme les analyses biochimiques, génétiques ou sur des cellules en laboratoire). Cette approche permet d’utiliser moins d’animaux tout en conservant la rigueur de nos recherches. Enfin, après le sevrage des souriceaux, les mères qui n'ont pas été traitées pourront être réutilisées pour de nouveaux accouplements, ce qui contribue également à réduire le nombre total d'animaux nécessaires, tout en respectant les normes éthiques et scientifiques de notre projet.
Raffinement
Les conditions dans lesquelles les souris sont élevées, hébergées et soignées sont soigneusement optimisées pour minimiser au maximum toute douleur, souffrance, stress ou dommage à long terme. Notre priorité est de réduire l'inconfort des animaux. Par exemple, des éléments comme des dômes en carton, du coton et des baguettes en bois seront ajoutés pour permettre aux femelles de construire un nid plus confortable, réduire leur stress et favoriser l'usure naturelle de leurs dents. De plus, en dehors des périodes d'accouplement, les souris seront maintenues en groupes pour favoriser leur bien-être social. Pendant les périodes d’accouplement, les souris sont dès que possible groupées par lot de deux pour ne pas qu’elles soient isolées. Les animaux traités, ou dont la mère a été traitée, seront quotidiennement surveillés jusqu'à leur euthanasie. Si une souris ou un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress, tels que des souriceaux hors du nid, des difficultés à se nourrir (absence de lait dans l'estomac), une posture anormale, des problèmes de croissance, de la léthargie, l'absence de nid ou un pelage négligé, l’expérimentateur pourra consulter l'équipe de l'animalerie ou un vétérinaire pour évaluer la situation et, si possible, administrer un traitement approprié. En cas de souffrance grave ne pouvant pas être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié, sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas disponible. Cette approche garantit que le bien-être des animaux est toujours une priorité.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, nous étudierons les animaux à différents stades de leur développement, en fonction des objectifs de nos expériences. Les embryons seront examinés à des étapes précises de la gestation (14ème, 16ème et 18ème jour de gestation), qui correspondent à des moments clés de la formation des microglies, des cellules du système immunitaire du cerveau. Ces étapes nous permettront de mieux comprendre les interactions entre les microglies et d'autres cellules du cerveau, ainsi que les mécanismes biologiques impliqués. Après la naissance, les souriceaux seront observés à différents moments de leur développement (1er, 3ème, 7ème et 14ème jour de vie postnatale). Ces périodes sont particulièrement importantes car elles marquent la maturation des microglies et leur intégration dans le cerveau en croissance. Enfin, nous étudierons des souris jeunes, à un stade plus avancé (20ème jour de vie postnatale), pour explorer comment les interactions précoces influencent les microglies à l’âge adulte, dans un cerveau mature. Ce plan d'étude a été conçu pour nous offrir une vision complète des étapes qui mènent au développement et à la maturation des microglies, depuis les débuts embryonnaires jusqu’à l’âge adulte.
Expansion des lymphocytes in vivo dans le modèle Souris en vue d’une caractérisation moléculaire in vitro
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une minute d'administration par le nez, une seule fois, pour chacune des 200 souris qui vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par une souche atténuée de salmonelle qui multiplie dans leurs poumons des lymphocytes rares, puis tuées pour que leurs organes soient collectés et ces cellules cultivées in vitro. Le porteur indique que l'infection n'entraîne pas de mortalité et provoque une perte de poids d'environ 10 % le premier jour. La finalité immédiate reste de produire assez de cellules pour des expériences en éprouvette, les applications thérapeutiques annoncées étant renvoyées au long terme.
Objectifs
Les lymphocytes MAIT (pour Mucosal Associated Invariant T) sont des acteurs majeurs de l’immunité en particulier dans les organes barrières comme les poumons. Selon le contexte, les lymphocytes MAIT peuvent exercer des fonctions anti-bactériennes, de réparation tissulaire ou d'inhibition des autres lymphocytes. Les gènes contrôlant le type de réponse produite par les lymphocytes MAIT sont inconnus. De manière générale, la biologie des MAIT reste relativement mal comprise du fait de leur rareté en l’absence d’infection. Pour contourner ce problème, un modèle d’infection intra-nasale par une souche atténuée de salmonelle a été mis en place par plusieurs équipes. L’infection est bégnine pour la souris mais induit une forte expansion des lymphocytes MAIT des poumons, qui peuvent alors être isolés et caractérisés in vitro. Le but de notre projet est d’identifier les mécanismes contrôlant les fonctions des lymphocytes MAIT des poumons. A long terme, l'objectif est de pouvoir manipuler à façon les lymphocytes MAIT afin de stimuler ou réduire l'inflammation ou la réparation des poumons.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir des lymphocytes MAIT en nombres suffisants pour des études de fonction in vitro, permettant de déterminer les mécanismes qui controllent la fonction des lymphocytes MAIT. Identifier des gènes controllant la fonction des lymphocytes MAIT peut offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques pour inhiber, augmenter ou orienter ces cellules selon le bénéfice souhaité.
Procédures
Administration (1 fois) par voie intranasale sur animaux vigils (1 minute par administration).
Impact sur les animaux
La procédure n'implique aucune injection. L'infection intra-nasale par la souche atténuée de salmonelle n'induit aucune mortalité, mais peut conduire à une perte de poids d'environ 10% le premier jour suivi d'une reprise de poids progressive.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem : collecte des organes, analyses par cytométrie en flux et cultures in vitro.
Remplacement
Trois protocoles d’expansion in vitro des lymphocytes MAIT, faisant varier les conditions de stimulation, ont été testés mais n’ont pas donné de résultat satisfaisant. Il n'existe actuellement aucune méthode alternative à l'expérimentation animale permettant d'étudier les lymphocytes MAIT du poumon.
Réduction
Le nombre des animaux a été réduit au maximum tout en gardant un effectif convenable pour réaliser une étude statistique fiable, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (échantillons indépendants) ou de Friedman (échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.
Raffinement
Les inoculations seront réalisées dans une salle dédiée, différente de celle où seront logés les animaux et où se déroulent d’autres phases d’analyses afin d'éviter tout stress supplémentaire à l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score adaptée sera utilisée pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes MAIT ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le seul modèle pour lequel un protocol d'expansion in vivo des lymphocytes MAIT a été décrit. -Les souris seront utilisées à l’âge adulte. -Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire matures.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.