Procédures légères

705 des 735 souris, rats, lapins et chiens vont être réutilisés dans d'autres procédures, et 30 lapins et chiens proposés à l'adoption. Ils sont soumis à des prélèvements de sang, vigiles ou sous anesthésie, et à des injections de sérum physiologique qui peuvent durer dix minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur reconnaît que ces gestes sont exécutés par du personnel qui ne maîtrise pas encore les bons gestes, ce qui peut induire une douleur ou un stress anormal. La finalité est d'entraîner les opérateurs d'un établissement de toxicologie réglementaire, et pour les animaux ayant déjà servi ailleurs le porteur privilégie la réutilisation dans des procédures sans réveil.

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la recherche pré-clinique et effectue des études de toxicologie et pharmacologies réglementaires (Bonnes Pratiques de Laboratoire) indispensables à la mise sur le marché de médicaments, vaccins, dispositifs médicaux, thérapies, etc. Ce type d’études requièrent une qualification au poste et aux gestes techniques réalisés, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs. Pour que ces études soient menées par du personnel qualifié, la formation initiale et continue du personnel est primordiale. Ce projet a pour objectif de définir l’utilisation des animaux utilisés à des fins de formation afin de garantir la réalisation et la maitrise des gestes techniques dans les études. L’utilisation d’animaux de formation est nécessaire afin de permettre au personnel : - de se former sur les gestes techniques (cas de la formation initiale ou du maintien des compétences), - de s’exercer/s’entrainer à la réalisation de nouveaux gestes pour l’établissement d’un nouveau modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet assure la formation pratique du personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir la maitrise des gestes techniques nécessaires à la qualité des données expérimentales (précision, reproductibilité) et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de raffinement (impact minimum des gestes techniques sur le bien-être des animaux : en particulier stress, anxiété, douleur).

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang vigile et anesthésié dont le nombre et la fréquence suivent les recommandations EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Ils seront aussi soumis à des administrations de liquides inertes type sérum physiologique, dans des limites recommandées par, entre autres, les lignes directrices citées ci-dessus. Chaque administration dure de quelques secondes (pour la plupart) à 10 minutes pour des injections intraveineuses dites lentes.

Impact sur les animaux

Les animaux étant utilisés à une fin de formation, leur manipulation ainsi que les actes réalisés sont réalisées par du personnel qui ne maitrise pas encore les bons gestes. Ceci sera susceptible d’induire un niveau de douleur ou un stress anormal aux animaux, lié à la contention ou à l’acte technique, même si celui-ci est considéré a priori comme peu invasif et n'entraine a prirori pas de nuissances. Il n'est pas attendu que ces nuissances persistent plus de quelques heures étant donnés la nature des gestes techniques ainsi que les méthodes de raffinement et d'encadrements mises en place.

Devenir

Les procédures de ce projet sont des procédures légères au cours de laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Ainsi, si un vétérinaire rend un avis favorable, la plupart des animaux de ce projet pourront être réutilisés dans un autre projet autorisé, y compris celui-ci. Le vétérinaire prendra en compte l’effet cumulatif pour chaque animal (ou lot d’animaux pour les rongeurs) dans sa décision. Pour les animaux naïfs avant de commencer ce projet, il sera possible de les réutiliser dans des procédures légères ou modérées. Pour les animaux non naïfs au début de ce projet (c’est-à-dire ayant déjà été inclus dans au moins une autre procédure expérimentale), il sera privilégié la réutilisation dans des procédures sans réveil, bien qu’une utilisation dans des procédures légères ou modérées soient aussi possible.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux de formation est nécessaire afin de maitriser les bons gestes in-vivo avant la manipulation et la réalisation d’actes sur des animaux d’étude. Cela permet également de suivre l’état clinique de l’animal a posteriori de la formation, indiquant la bonne réalisation du geste ou non. De plus, le manque actuel de modèle mimant de manière satisfaisante l'anatomie des animaux implique le recours à l’animal. Pour des gestes techniques impliquant une chirurgie ou techniquement difficiles (ex : injection intratéchale), l’utilisation d’animaux euthanasiées dans le cadre d’autres procédures ou une procédure sans réveil sont privilégiées avant le passage à l’animal vivant.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement en vue d’être utilisé pour de la formation, les animaux non euthanasiés ou non utilisés en fin d’étude et les animaux sentinelles pourront être réutilisés en tant qu’animaux de formation. La commande d’animaux naïfs dans le cadre de ce projet doit répondre à un besoin précis, comme la formation à un nouveau geste, ou l’arrivée de nouveaux collaborateurs nécessitant un besoin d’animaux non couvert par les situations ci-dessus. De plus, afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre d’animaux de formation, chaque animal pourra être réutilisé en fonction des actes qu’il a déjà subis, et en cas de procédures terminales, plusieurs actes peuvent être fait sur l’animal anesthésié avant euthanasie afin de ne pas avoir à les effectuer sur plusieurs animaux.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours minimum est respectée pour les rats, souris, hamsters, de 7 jours minimum pour les lapins et cobayes, et de 15 jours pour les chiens. En cas de réutilisation, une période de repos de 7 jours minimum est respectée pour l’ensemble des espèces après la fin de la précédente procédure. Elle peut être allongée sur décision vétérinaire lors de la validation de la réutilisation. Cette validation est faite après un examen clinique individuel pour les chiens et par lot pour les rongeurs ou les lapins. Les animaux sont hébergés collectivement durant toute leur durée de vie (sauf exception en cas de bagarre, blessure, auquel cas un suivi vétérinaire et de la structure en charge du bien-être animal est mis en place), avec des enrichissements appropriés aux besoins physiologiques de chaque espèce (abris, matériel de nidation, plateformes, bois à ronger pour les rongeurs ; copeaux, plateformes, jouets de différentes matières et formes, récompenses alimentaires et périodes de jeux et d’interaction avec le personnel pour les chiens). En cas d’hébergement individuel (bagarre, blessure), les hébergements sont organisés de manière à permettre a minima un contact visuel avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire validé par la structure en charge du bien-être animal est apporté. Les animaux sont observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…), traitements thérapeutiques (antibiothérapie, antidouleur, etc) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré a minima 1 fois par semaine. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. En cas de besoins, un traitement approprié sera mis en place (injection de fluides, analgésiques, anti-inflammatoires, etc…) sous prescription et/ou avis vétérinaire. Pour la réalisation des actes techniques, les animaux pourront être anesthésiés et un temps de repos avant réutilisation (entre chaque session de formation) a également été défini.

Choix des espèces

Les études pré-cliniques sont des études réglementaires in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes. Les rongeurs, les lapins et les chiens sont trois types d’espèces fréquemment utilisées, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs et Lapins, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois et jusqu’à 5 ans.

Pour évaluer un extrait végétal enrichi en vitamine D censé réduire les défauts musculaires des poulets de chair, 48 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevés jusqu'à six semaines sur litière, ils subissent une seule prise de sang au sinus occipital, sur animal vigile, de quelques secondes. Le porteur décrit le stress de la contention, une légère douleur au point de prélèvement et un hématome possible. Tous sont tués ensuite pour analyser leurs muscles, l'intérêt annoncé étant à la fois la qualité de la viande pectorale et, pour le partenaire privé du projet, l'extension de l'usage commercial de cette forme de vitamine dans l'alimentation des poulets.

Objectifs

Les solutions nutritionnelles pour limiter l’apparition des défauts musculaires chez le poulet de chair sont dèveloppées depuis plusieurs années mais les gains obtenus sont généralement faibles. La vitamine D est connue chez les mammifères comme activant des gènes impliqués dans le dèveloppement musculaire et dans la santé musculaire chez des patients présentant un déficit musculaire lié à l'âge ou une atrophie musculaire. Chez le poulet de chair, des résultats précédents montrent que l’enrichissement en vitamine D dans l’aimentation permet d’améliorer la santé osseurse, l’immunité et la qualité des muscles pectoraux. L’objectif de ce projet est de proposer une stratégie alimentaire basée sur un extrait végétal naturel enrichi en vitamine D fourni sur toute la durée de l’èlevage afin d’évaluer les améliorations sur la qualité et la santé musculaire.

Bénéfices attendus

En raison de l'action de la forme de vitamine utilisée sur le métabolisme, l'utilisation d'une forme facilement assimilable devrait avoir une action plus rapide et pouvoir induire une réduction de la fréquence d'apparition des défauts musculaires chez les poulets. Pour l'unité , ce sera la première fois qu'il sera possible d'évaluer précisément l'impact de l'alimentation sur la qualité et la santé musculaire et de comprendre le mode d'action de la forme de vitamine étudiée. Pour le partenaire privé, l'amélioration du métabolisme musculaire et la réduction de la fréquence d'apparition des défauts musculaires permettraient d'étendre l'utilisation de cette forme de vitamine dans l'alimentation des poulets de chair.

Procédures

Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée, sera réalisée une seule fois à six semaines sur des animaux vigiles et ne durera que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome.

Devenir

Suite à la procédure de prise de sang, les animaux seront mis à mort pour analysrs les prélèvements de muscle .

Remplacement

L’étude de l’impact de la forme de vitamine étudiée chez le poulet pour limiter l’apparition des défauts musculaires ne peut se réaliser que chez l’animal et directement sur l’espèce cible c'est à dire la poule domestique.

Réduction

L’effectif de 48 animaux (12 animaux par groupe, 4 groupes) a été défini pour permettre de détecter statistiquement un effet de l’aliment sur la qualite et la sante du muscle, sur la base de données d’études précédentes réalisées dans des conditions comparables.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car il s’agit de l’espèce agronomique cible du projet. Les poussins éclos au couvoir commercial seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à l’âge de six semaines.

Produire des larves de Toxocara dans des muscles de souris, pour que les analystes des services sanitaires apprennent à les reconnaître dans les carcasses de sangliers : 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune avale une fois 20 microlitres d'eau contenant des œufs embryonnés du parasite, déposés au coin de la bouche à la micropipette, puis vit quatre à huit semaines le temps que les larves migrent dans ses muscles. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur invoquant le caractère zoonotique du parasite et la collecte des muscles post mortem. Il affirme que l'infestation reste asymptomatique chez la souris et n'induit ni douleur ni stress, et justifie l'effectif par les "données de la littérature" et les besoins de collecte de larves, sans avancer d'autre chiffre.

Objectifs

Toxocara est un parasite nématode cosmopolite qui infeste les mammifères et les oiseaux. Les espèces zoonotiques sont T. canis (dont l'hôte définitif est le chien) et T. cati (dont l'hôte définitif est le chat). La contamination de l'environnement par des oeufs embryonnés a pour conséquence la contamination des autres animaux et des humains, qui sont ainsi des hôtes intermédiaires non essentiel au cycle parasitaire. Toxocara survit alors sous forme de larva migrans chez ces hôtes. Les animaux se contaminent également par la consommation de carcasses infectées par des larva migrans. L’homme se contamine lui aussi par la consommation d’une viande crue ou peu cuite, voire des produits charcutiers puisque ni la fumaison, ni la salaison ne sont des méthodes assainissantes. Chez l'humain, la toxocarose peut être bénigne, voire asymptomatique, mais elle peut aussi présenter des manifestations cliniques sérieuses liées aux larva migrans viscérales, occulaires ou neurologiques. Des analyses sur les carcasses de sangliers sauvages inspectées dans les établissements français de traitement de gibiers sauvages ont révélé depuis deux ans la présence régulière de larves de Toxocara spp. Dans ce contexte, la formation des analystes des services sanitaires permettra d'améliorer la détection de ces larva migrans dans les carcasses et de mieux protéger les consommateurs. Cette formation nécessite l'apprentissage de la reconnaissance des larves de Toxocara présentes dans les matrices carnées. Elle sera ensuite validée par la mise en place d'essais inter-laboratoires d'aptitude par l'autorité compétente afin d'améliorer la performance du réseau de laboratoires d'analyses vétérinaires. L'objectif est donc de pouvoir préparer du matériel de référence (matrice carnée) contenant des larva migrans de Toxocara canis.

Bénéfices attendus

Le projet permettra des bénéfices immédiats avec l'amélioration de la détection du parasite et ainsi la protection des consommateurs par le suivi d’un plan assurance qualité visant la vérfication de la performance des contrôles sanitaires des viandes issues d’espèces animales sensibles à Toxocara spp., principalement les sangliers.

Procédures

La seule intervention qui sera faite sur les animaux consistera en une infestation par voie orale du parasite Toxocara. Les animaux seront infectés par voie orale avec un volume de 20 uL d’eau contenant les oeufs embryonnés. Cela se réalise une seule fois sur chaque animal en plaçant le cône d'une micropipette au coin de la bouche de la souris. Celle-ci par reflexe avale le liquide contenant les larves. Le geste d'inoculation dure en moyenne 20 secondes. Les animaux infectés seront gardés sur une période de 4 semaines (minimum pour que le cycle se fasse dans l'hôte avec migration des larves dans les muscles) à 8 semaines maximum (la préparation des échantillons pour le matériel de référence est souvent étalées sur 4 semaines).

Impact sur les animaux

L’infestation par Toxocara spp. est asymptomatique chez l’animal (contrairement à l’humain) et n’induit pas d’inconfort ou de stress chez l’animal. Les souris infectées ne sont pas contagieuses entre-elles et peuvent de fait rester en groupe de 5 ou 10 individus dans une cage. Le gavage des souris se fait une seule fois en posant au coin de la bouche de la souris le cône d'une micropipette contenant les 20 uL d'eau avec les oeufs de Toxocara. Par reflexe, la souris avale le liquide. La contention est légère et se fait dans la main de l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux étant infestés par un parasite zoonotique, ils doivent être mis à mort en fin d’expérimentation d’autant plus que nous aurons besoin de collecter les tissus : muscles en post mortem. Les souris seront donc toutes mises à mort.

Remplacement

Il est impossible à l’heure actuelle de réaliser un cycle parasitaire de Toxocara sans recours à l’animal. Nous ne nous pouvons donc pas nous affranchir des modèles souris.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au maximum pour les différentes expérimentations prévues sans risquer de compromettre les résultats. Le nombre est estimé par rapport aux données de la littérature et aux besoins en terme de collecte de nombre de larva migrans.

Raffinement

L’infection par Toxocara ne provoque pas de symptômes chez l’animal aux doses que nous utilisons, ni douleur, ni stress. L’infection se fait par voie orale sous un volume de 20 uL pour la souris. Néanmoins, lors de la surveillance quotidienne des animaux si une souffrance était constatée l’animal serait mis à mort. Les souris sont hébergées par groupe de 5 ou 10 dans une même cage. L'hébergement se fera en présence d'enrichissement classique (carré de coton, abri en plastique, balcon, roue).

Choix des espèces

L’espèce souris est particulièrement sensible à Toxocara et constitue l’espèce animale privilégiée pour l'obtention de larva migrans. Elles seront commandés à un poids (20 à 30g ) permettant une infection avec une charge parasitaire optimale pour obtenir le meilleur rendement par animal tout en restant asymptomatique et limiter ainsi le nombre d’animaux.

Isolés jusqu'à trois jours, anesthésiés, amputés en moins d'une minute d'un fragment de nageoire caudale, 2 400 poissons zèbres adultes passent par un génotypage invasif dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement sert à séquencer un gène et à repérer les porteurs d'une mutation reproduisant des maladies rénales génétiques humaines. 1 020 poissons sont gardés vivants et deviennent reproducteurs. Les 1 380 autres, ceux qui ne portent pas la mutation attendue, sont tués.

Objectifs

Certaines maladies rénales génétiques sont responsables de l’arrêt de fonctionnement des reins avant l’âge adulte. Il n’y a pas de traitement disponible à ce jour pour ces maladies qui nécessitent inévitablement la dialyse et une transplantation rénale. Ces maladies génétiques sont variables avec des différences d’âge d’apparition de la maladie ou d’autres organes atteints. Ceci suggère l’existence de gènes capables de modifier l’expression de la maladie. Ce projet a pour but de créer des modèles de ces maladies chez le poisson zèbre en modifiant les gènes impliqués par des techniques d’édition du génome qui vont permettre d’introduire des mutations similaires à celles retrouvées chez les patients. Ces modèles seront utilisés pour valider l’implication de nouveaux gènes ce qui est essentiel au diagnostique, mieux comprendre les mécanismes à la base de ces maladies rénale pour obtenir de nouvelles pistes de traitements, et mener des études pour tester l’efficacité de molécules qui pourraient ouvrir la voie vers un possible médicament.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouveaux modèles animaux des maladies rénales génétiques. Ces modèles permettront un meilleur diagnostique des patients en validant l’implication de nouveaux gènes, de mieux comprendre le rôle des gènes dans le développement rénal, l’impact de certaines mutations identifiées chez les patients et de disposer de modèles pré-cliniques robustes et fiables permettant de tester l’efficacité de molécules thérapeutiques candidates.

Procédures

Prélevement nageoire caudale : 1 fois, durée inférieure à 1 minute

Impact sur les animaux

Stress léger dû à l’isolement des animaux (3 jours maximum, 1 seule fois).

Devenir

A la fin de la procédure, seuls les poissons porteurs des mutations sont gardés en vie et utilisés comme reproducteurs.

Remplacement

Certains des défauts du rein observés chez les patients sont retrouvés chez les embryons de poisson zèbre de moins de 5 jours porteurs de mutations des mêmes gènes que les patients, permettant ainsi de disposer de modèles robustes et fiables pour étudier les mécanismes responsables de ces maladies, caractériser l’impact des mutations des gènes impliqués ainsi que de tester des pistes thérapeutiques pour lesquelles l’expérimentation animale reste incontournable. Une des approches de remplacement envisagée est l’utilisation d’organoïdes rénaux, mais cette approche utilisant des cellules humaines en culture ne permet pas l’étude de reins fonctionnels ni, pour l’instant, d’étudier les différents aspects de la maladie.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet.

Raffinement

Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Les poissons bénéficient d’un apport en nourriture vivante (Paramécies et Artémias), d’un enrichissement social en s’assurant du maintien d’un nombre de poissons suffisant par aquarium et d’accouplement régulier.

Choix des espèces

Les maladies rénales sur lesquelles nous travaillons sont des maladies génétiques récessives, seuls les individus porteurs des deux copies mutées du gène impliqué développent la maladie. C’est la même chose chez le poisson où seuls les animaux porteurs de deux copies de la mutation générée présentent des phénotypes. Ce projet a pour but la création et l’élevage de poissons porteurs d’une seule copie du gène mutée qui ne sont donc pas malades. Ils servent à la reproduction pour obtenir des embryons qui portent deux copies du gène mutées qui eux présentent les défauts du rein qui nous intéressent et que l’on visualise au microscope sur des embryons anesthésiés de moins de 5 jours par une méthode non invasive. Pour identifier les poissons porteurs d’une seule copie du gène mutée et les différencier des poissons ne portant aucune mutation, il est nécessaire d’effectuer un prélèvement d’une toute petite partie de la nageoire caudale pour pouvoir séquencer le gène d’intérêt. Ce prélèvement ne peut être fait que chez le poisson adulte agé de trois mois. Il est réalisé sous anesthésie générale et sous analgésie. La nageoire régénère spontanément en quelques jours.

Trois générations de sélection génétique pour écarter deux lignées de brebis sur leur taux de méthylation de l'ADN : 690 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants dans l'élevage à l'issue. Chaque agneau subit trois prises de sang à la veine jugulaire sur animal vigile, à 30, 45 et 64 jours d'âge, contenu entre des claies. La finalité déclarée porte sur les caractères de production, croissance et reproduction, et sur la "transition agroécologique de l'élevage ovin". Le porteur reconnaît un risque d'hématome, de phlébite voire d'infection au point de ponction, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" à l'utilisation d'animaux vivants.

Objectifs

L'amélioration génétique est traditionnellement basée sur l'utilisation d'enregistrements de phénotypes ou de caractères en tenant compte de données familiales pour estimer des valeurs individuelles. Plus récemment, les données de polymorphismes de l'ADN ont commencé à être utilisées dans l'estimation de ces valeurs dans certaines espèces dans le cadre de la sélection génomique. Quoi qu’il en soit le postulat qui est derrière ces approches suppose que les différences génétiques entre les individus sont dues à des différences de séquence d'ADN héritées de façon mendélienne. Les variations observées dans les phénotypes de production sont donc en partie dues à ce déterminisme génétique mais aussi à des effets de l’environnement et l’interaction qui existe entre les deux. Les connaissances récentes sur les effets de l’environnement pointent sur des effets dits « épigénétiques ». En effet, des modifications biochimiques de l’ADN (méthylation des cytosines par exemple) et des protéines avec lesquelles il est en interaction (méthylation, acétylation des histones) sont autant de marques épigénétiques qui peuvent influencer l’expression des gènes en réponse à l’environnement, démontrant que le génome eucaryote répond de manière dynamique aux variations du milieu auxquelles chaque individu se trouve exposé. De nouvelles questions scientifiques se posent donc autour de la relation Génétique/Epigénétique dans le cadre de l’amélioration des espèces et leur adaptation aux nouveaux systèmes de production. Notre projet est la continuité d'un projet précédent initiant des lignées génétiques divergentes pour des niveaux bas ou haut de méthylation global de l’ADN sanguin (TGMA). En effet, nous avions montré que le TGMA était variable entre individus et héritable. Nous avons réalisé deux générations de sélection sur ce critère et observé une différence de moyenne de valeurs génétiques entre nos deux lignées. Cependant, afin d’obtenir une divergence plus contrastée, 3 générations supplémentaires sont nécessaires. Ce contraste génétique nous permettra d’évaluer l’impact de cette sélection sur l'adaptation des animaux aux conditions d’élevages (nutrition, santé, environnement, …) changeantes dans le cadre global de la transition agroécologique des élevages.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d'aboutir à une divergence génétique basée sur le taux de méthylation de l'ADN contrastée entre nos deux lignées. Cette divergence nous permettra d'étudier son impact sur les capacités d’adaptation des animaux face à des aléas sanitaires ou alimentaires et sur les caractères de production classiques (croissance, reproduction) pour répondre aux besoins de recherche sur la transition agroécologique de l'élevage ovin.

Procédures

Les animaux auront trois prises de sang réalisées sur animaux vigiles, espacées de 15 jours, à 30, 45 et 64 jours d'âge. Chaque prise de sang n'exedera pas 30 secondes.

Impact sur les animaux

Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général des animaux. La prise de sang peut engendrer un hématome au niveau de la jugulaire et les différentes contentions peuvent engendrer du stress pour les animaux.

Devenir

À la fin des prises de sang, les animaux seront tous gardés en vie et resteront dans l'élevage.

Remplacement

La réalisation et le suivi d’accouplement prédéfinis, ainsi que la caractérisation des agneaux, impliquent l’utilisation d’animaux vivants. Il n'y a pas de méthode alternative.

Réduction

Nous avons minimisé le nombre d'animaux expérimentaux afin d'atteindre notre objectif d'obtenir un écart génétique conséquent entre nos deux lignées, pour contraster au mieux les capacités d'adaptation. Nous avons jusqu’à présent réalisé deux générations de sélection et nous avions pu faire une très forte pression de sélection sur la première génération de sélection en phénotypant plus de 800 agneaux. En partant des reproducteurs de la seconde génération (140 femelles et 12 mâles), nous exercerons une pression de sélection plus faible sur la voie mâle à chaque génération, le gain génétique sera donc plus petit. Il nous faudra donc 3 générations de 140 femelles et 12 mâles (+12 remplaçants) soit 690 animaux pour atteindre l'objectif de divergence génétique entre nos lignées.

Raffinement

Les agneaux et leurs mères sont hébergés dans la bergerie de l'installation. Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les agneaux et leurs mères sont placés ensemble en lots sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit (entre des claies) en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence répétée des expérimentateurs en interaction positive en dehors des procédures (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du comportement de fuite de l’animal et donc de son stress face à la contention. Les animaux sont surveillés de façon journalière. Lors des prises de sang (par ponction veineuse à la jugulaire), les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront réalisés en alternant les veines jugulaires droite et gauche. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale ou avec son intervention si nécessaire.

Choix des espèces

Nous travaillons en sélection génétique sur des animaux de rente, le mouton est notre modèle d'étude. Le phénotypage des agneaux pour le taux de méthylation sanguin (via une prise de sang) aura lieu entre 1 et 2 mois d'âge. Le protocole constituant une sélection génétique sur plusieurs générations; les animaux sélectionnés pour être reproducteurs, donneront naissance à la génération suivante.

Tuées par dislocation cervicale avant l'apparition des symptômes du paludisme, 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par injection intrapéritonéale ou intraveineuse à l'état vigile, subissent jusqu'à cinq prélèvements sanguins par piqûre de la veine caudale, puis sont exposées sous anesthésie à des moustiques qui prennent leur repas de sang pendant quinze à trente minutes, à raison de deux repas au maximum par animal. Une même souris peut nourrir 400 à 500 femelles de moustiques, et celles réutilisées le lendemain reçoivent une injection de solution saline pour compenser la perte de sang. Au-delà de l'étude des interactions entre moustiques et parasites, le laboratoire indique fournir aussi des moustiques infectés à des établissements extérieurs.

Objectifs

Le paludisme est une affection causée par des parasites du genre Plasmodium et transmise par des moustiques du genre Anopheles. Cette maladie provoque chaque année dans le monde la mort de plus de 600 000 personnes, principalement des jeunes enfants et des femmes enceintes. Les inconvénients liés à l’utilisation d’insecticides (apparition de moustiques résistants, destruction de nombreuses autres espèces animales), la difficulté technique que représente la création d’un vaccin efficace, et l’apparition de parasites résistants aux médicaments antipaludiques existants, ont conduit la communauté scientifique, et notamment notre laboratoire, à étudier les bases de l’interaction moustique/Plasmodium et à rechercher de nouvelles stratégies de lutte contre ce fléau. Les animaux de ce projet seront utilisés pour des infections de moustiques avec des parasites, et pour des tests de transmission du parasite de moustiques infectés vers des souris. L’objectif de ces expériences est de comprendre les interactions entre les moustiques et les parasites, et d’utiliser ces connaissances pour mettre au point de nouvelles stratégies de lutte contre le paludisme. Notre laboratoire fournit également des moustiques infectés à des établissements extérieurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans ce projet sont de mieux comprendre les interactions moustique/parasite afin de mettre en place et tester de nouvelles stratégies permettant de lutter efficacement contre cette maladie.

Procédures

Les animaux sont infectés par injection péritonéale ou intra veineuse sur animal vigile. Ces deux procédures sont rapides (1-2 min maximum depuis la préhension de l’animal jusqu’à sa remise en cage). Les souris sont infectées sur une courte période de temps et mises à mort avant l’apparition des symptômes de la maladie. Les animaux sont soumis à un prélèvement sanguin par piqûre de la veine caudale sur animal vigile, avec un maximum de 5 prélèvements. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Un maximum de deux repas sanguins de moustiques (15-30 min) est fait sur un animal donné, et sous anesthésie. Les ponctions cardiaques sont réalisées rapidement (1-2 min maximum) sur animal anesthésié (procédure terminale). Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.

Impact sur les animaux

Après infection d’une souris par un parasite du paludisme, sa parasitémie augmente, sans symptôme dans les premiers jours. Dans ce projet, toutes les souris sont mises à mort avant l’apparition des premiers symptômes à une parasitémie

Devenir

Toutes les souris infectées sont mises à mort par dislocation cervicale avant l’apparition des symptômes du paludisme. A terme, cette maladie conduit à une anémie importante et à la mort de l’animal.

Remplacement

L’utilisation comme modèles d’étude de parasites murins P. berghei et P. yoelii nécessite l’utilisation des rongeurs comme hôtes. En effet, outre l’importance du système in vivo pour certaines des expériences que nous menons (cycle complet du parasite avec infection de souris à partir de moustiques infectés pour « recycler » le parasite, ou bien pour tester la capacité vectorielle de nos moustiques), il n’est pas possible de maintenir ces deux parasites en culture cellulaire (ce qui nécessiterait dans tous les cas du sang de rongeur).

Réduction

La réalisation des passages par injection intra-veineuse nous permet d’infecter le nombre exact de souris nécessaires à nos expériences et donc de réduire au minimum le nombre de souris à infecter. Le calcul du nombre de souris nécessaires à une infection repose sur les critères suivants : (1) une souris peut nourrir jusqu’à 400-500 femelles (dans le cas d’une procédure terminale), (2) si les moustiques sont répartis en plusieurs cups, 4 cups peuvent être nourries l’une après l’autre sur la même souris sans que cette dernière ne perde en attractivité ou en infectivité pour les moustiques. Dans ce cas, les tests statistiques que nous faisons portent sur les moustiques (prévalence, charge parasitaire), pas sur les souris. Dans le cas où nous testons la capacité vectorielle des moustiques, nous utilisons le test exact de Fisher pour comparer le nombre de souris ayant été infectées dans les différents groupes, après un repas sanguin pris par des moustiques infectés. Un minimum de 20 souris est alors nécessaire (10 pour les moustiques contrôles et 10 pour les moustiques tests) pour détecter une réduction d’au moins 50% de leur capacité à transmettre le parasite.

Raffinement

Les souris utilisées pour les repas sanguin infectieux sont hébergées par groupes sociaux et bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont anesthésiées avant d’être placées sur la cage de moustiques. Durant le repas, les yeux des souris sont protégés avec un gel pour éviter qu’ils ne se dessèchent et une couverture chauffante leur permet de conserver leur chaleur. Lorsque les souris infectées sont réutilisées le lendemain, elles reçoivent une injection de solution saline physiologique après le repas infectieux pour compenser la perte en volume sanguin. Pendant la phase de réveil, les souris sont placées sous lampe chauffante pour limiter les déperditions en chaleur. Les souris infectées sont mises à mort à un stade asymptomatique du paludisme. Elles sont sacrifiées sous anesthésie après un repas sanguin ou une ponction cardiaque.

Choix des espèces

Parmi les espèces de rongeurs possibles, Mus. musculus s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences. En effet cette espèce est sensible aux parasites P. berghei et P. yoelii. De plus, elle est utilisée pour ce type d’expériences depuis plusieurs décennies par de nombreux laboratoires dans le monde et les protocoles d’infection sont donc bien établis. Nous utilisons des souris adultes âgées de plus de 8 semaines et d’un poids suffisant pour permettre d’infecter l’ensemble des moustiques d’un groupe expérimental.