Procédures légères

Les embryons utilisés dans ce projet sont génétiquement incapables de former un cœur ou un pancréas, et reçoivent des cellules souches de chimpanzé et de macaque pour tester si elles compensent ce déficit. 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue. Les femelles donneuses reçoivent deux injections hormonales intrapéritonéales, les receveuses une chirurgie abdominale de quinze à trente minutes sous anesthésie générale, avec une douleur postopératoire attendue. Le calcul d'effectif part d'un minimum de cinquante embryons à analyser et d'au moins cinq réplicats, sans que le millier de souris mobilisées soit rapporté à ce chiffre.

Objectifs

Le développement d’approches innovantes de reconstruction d’organes représente un enjeu scientifique et biomédical majeur. Les malformations cardiaques congénitales ainsi que les pathologies pancréatiques sévères, notamment le diabète, constituent des problématiques médicales majeures pour lesquelles les options thérapeutiques curatives restent limitées. La transplantation d’organes est contrainte par la pénurie de greffons, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies de production d’organes fonctionnels. Dans ce contexte, la compréhension des mécanismes permettant la formation et la reconstruction d’un organe in vivo constitue un besoin scientifique fondamental. Le présent projet vise à évaluer une approche de complémentation embryonnaire inter-espèce appliquée à deux organes essentiels : le cœur et le pancréas. Cette stratégie repose sur l’injection de cellules souches pluripotentes (PSC) dans des embryons génétiquement incapables de former un organe donné, afin de tester si les cellules injectées peuvent compenser ce déficit développemental et contribuer à la formation de l’organe manquant. Si ce concept a été démontré dans des modèles intra-espèce chez le rongeur, son potentiel dans un contexte inter-espèce impliquant des cellules de primates non-humains reste encore largement inexploré. L’objectif principal est de déterminer si des PSC de primates non-humains (chimpanzé et macaque), rendues compétentes pour la colonisation embryonnaire, sont capables de s’intégrer dans des embryons murins déficients pour les gènes clés nécessaires à la formation du cœur ou du pancréas.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes du développement embryonnaire et sur la capacité de cellules souches pluripotentes à contribuer à la formation d’organes dans un contexte inter-espèce. Il apportera des données originales sur les interactions cellulaires précoces, la reconnaissance des signaux développementaux entre espèces différentes et les limites biologiques du chimérisme. À court terme, les bénéfices attendus concernent principalement l’avancée des connaissances scientifiques. Le projet permettra de déterminer si des cellules souches de primates peuvent s’intégrer dans un embryon murin déficient pour un organe donné (cœur ou pancréas) et participer à sa formation. Il permettra également d’identifier les freins biologiques à cette intégration, qu’ils soient liés à la différenciation cellulaire, à la compétition cellulaire ou à l’incompatibilité des signaux moléculaires entre espèces. Ces données contribueront à mieux comprendre les principes fondamentaux de la formation des organes et de la plasticité cellulaire. À moyen terme, les résultats obtenus pourraient permettre d’optimiser les conditions expérimentales favorisant la complémentation d’organes et d’identifier les paramètres déterminants pour une intégration efficace et contrôlée des cellules injectées. Cela pourrait contribuer à l’amélioration de modèles expérimentaux pertinents pour l’étude des anomalies du développement cardiaque et pancréatique. À long terme, ces travaux vont permettre une meilleure compréhension des mécanismes de complémentation inter-espèce pour la médecine régénérative. En particulier, ils vont participer, de manière progressive et encadrée, à la réflexion scientifique visant la génération d’organes fonctionnels dans un contexte contrôlé afin de répondre à la pénurie de greffons pour la transplantation.

Procédures

Pour la stimulation ovarienne, deux injections d’hormones en intréapéritonéales par souris seront effectuées pour les femelles donneuses. Pour les femelles receveuses des injections en intrapéritonéal d’antalgiques et d’anesthésiques seront effectués. Dans tous les cas, le geste est rapide et dure de 30 secondes à moins d’une minute). Concernant la récupértion des embryons après transfert embryonnaire, l’accès à l’utérus se fera par chirurgie sous anésthésie générale. L’intervention durera de 15 à 30 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent d'une part les injections intrapéritonéales pour les femelles donneuses et receveuses, et d'autre part, les chirurgies de réimplantation d’embryons pour les receveuses qui peuvent entrainer une douleur postopératoire et un stress modérés.

Devenir

Tous les animaux adultes seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures.

Remplacement

La pierre angulaire du projet est de tester la capacité de cellules souches dérivées au laboratoire de remplacer un organe au cours du développement embryonnaire. Aucune technique in vitro ne permet, à l’heure actuelle, de reproduire le développment normal d’un embryon ou d’un organe entier à long terme. Pour faire des analyses statistiques robustes, nous avons besoin d’un nombre suffisant d’embryons de qualité.

Réduction

Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Pour évaluer le nombre d’animaux nécessaires à ce projet nous avons tenu compte du nombre d'embryons à analyser de façon à déterminer si les cellules injectées sont capables ou non de coloniser, c’est-à-dire si on observe une colonisation significative (>50% de l’organe), en fonction des risques statistiques d’erreur (5%) et de la puissance des tests (80%). Ce type de test nécessite un minimum de 50 embryons analysés. C’est pourquoi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour avoir assez d’embryons (voir le Tableau 1 en annexe), tout en s’assurant que nous aurons suffisamment de réplicats (au moins 5) pour que nos données soient valables statistiquement.

Raffinement

Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), les souris ayant subi une injection ou une chirurgie seront placées en milieu enrichi (coton, dôme) dans une zone de stabulation dédiée, avec moins de bruit et de passages, et seront observées quotidiennement par un animalier ou l’expérimentateur. Nous insistons sur la formation et l’expérience des personnes pratiquant les injections et la chirurgie. La maîtrise de ces gestes réduit d’une part le temps de contention, diminuant ainsi les effets stress chez les animaux, et garantissent la bonne tolérance de la procédure et une meilleure reproductibilité auprès des animaux. Nous établissons les points limites les plus précoces possibles en fonction de l’objectif de l’expérimentation. Dans le cadre d’un raffinement, il existe une technique alternative à la chirurgie de transfert d'embryons qui sera testé au cours de ce projet. Cette technique dite de NSET 'Non-Surgical Embryo Transfer' se fait par les voies naturelles, permettant ainsi de réduire le stress et la douleur habituellement liés à la chirurgie lors d'un transfert d'embryons. Cette technique sera appliquée si elle s’avère aussi reproductible et efficace que la technique de chirurgie pour produire un nombre suffisant d’embryons par femelle.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris pour plusieurs raisons : 1- Le développement de l’embryon de souris est rapide et le nombre d’embryons par portée est important. 2- Les souris génétiquement modifiées sont un atout majeur et indispensable à l’étude et à la réalisation de notre projet. 3- Chez la souris, le développement embryonnaire est assez similaire à celui décrit chez l’Homme et donc un modèle très pertinant pour notre projet. Les animaux sont utilisés à maturité sexuelle, à partir de 8 semaines chez la souris.

Une opération bloque l'écoulement de la bile hors du foie, ce qui installe progressivement une maladie hépatique et, avec elle, une atteinte du cerveau. 1 355 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 1 340 tués à l'issue et 15 réutilisés dans d'autres études. Le porteur écrit que l'intervention peut provoquer des douleurs les premiers jours, puis une baisse d'activité, une perte de poids et d'autres signes liés à l'atteinte du foie et du cerveau, sur cinq semaines de suivi. Les rats passent des tests deux fois par semaine, de cinq à vingt minutes, décrits comme simples et destinés à mesurer un ralentissement des mouvements ou des troubles de la mémoire, sans qu'aucun de ces tests soit nommé.

Objectifs

Ce projet vise à développer et étudier un modèle chez le rat dans lequel la bile, un liquide produit par le foie, ne peut plus circuler normalement. Cette situation permet de reproduire une maladie du foie et de mieux comprendre une complication grave appelée encéphalopathie hépatique. Cette complication touche le cerveau et peut entraîner des difficultés à se concentrer, des changements de comportement, une désorientation, ou encore des troubles plus importants. Dans les cas les plus graves, elle peut aller jusqu’au coma. Cette maladie a des conséquences importantes sur la vie des patients et peut mettre leur vie en danger.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, des tests simples seront réalisés pour observer le comportement et les mouvements des animaux. Cela permet de repérer et de mesurer les troubles liés à la maladie, comme un ralentissement des mouvements, moins d’activité, des difficultés à se déplacer, ou des problèmes de mémoire. Ces observations seront faites régulièrement pour suivre l’évolution de la maladie au fil du temps et voir comment elle affecte le cerveau en parallèle de l’atteinte du foie. Ces informations sont importantes car elles permettent de mieux comprendre cette complication, mais aussi d’évaluer sa gravité et de tester l’efficacité de nouveaux traitements. À terme, ce travail pourrait aider à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies graves du foie.

Procédures

Les animaux réaliseront des tests de comportement deux fois par semaine pendant une période maximale de 5 semaines. Chaque test dure entre 5 et 20 minutes. Des prélèvements de sang seront également effectués sous anesthésie pour éviter toute douleur : un premier au début de l’étude, puis un dernier à la fin. Pour certains animaux, un prélèvement supplémentaire sera réalisé une fois par semaine après l’opération. Les quantités de sang prélevées restent limitées et respectent les recommandations, afin de ne pas nuire à la santé des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests réalisés pour observer le comportement des animaux sont simples et ne provoquent qu’une gêne légère et temporaire, liée surtout à la manipulation ou au fait d’être placés dans un environnement nouveau. Ils sont courts et espacés dans le temps pour limiter le stress. Les principales contraintes viennent du modèle lui-même, qui repose sur une opération permettant de bloquer l’écoulement de la bile et d’induire progressivement une maladie du foie. Cette intervention peut entraîner des douleurs après l’opération, surtout les premiers jours. Avec le temps, la maladie peut également affecter l’état général des animaux, avec moins d’activité, une perte de poids, ou d’autres signes liés à l’atteinte du foie et du cerveau. Les animaux sont surveillés de près tout au long de l’étude afin de limiter au maximum la douleur, le stress et la dégradation de leur état.

Devenir

Concernant la Procédure n°1 : les animaux seront réutilisés et replacés dans d'autres études. Pour la Procédure n°2 : tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les analyses de caractérisation du modèle. Enfin, la Procédure n°3 : tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les analyses pour étudier les effets des molécules d'intérêt.

Remplacement

Aujourd’hui, il n’est pas possible d’étudier cette maladie sans utiliser des animaux vivants. Cette affection est très complexe, car elle touche en même temps plusieurs organes, notamment le foie et le cerveau, et provoque des déséquilibres importants dans le corps ainsi que des modifications du comportement. Ces phénomènes sont liés entre eux et ne peuvent pas être reproduits correctement en laboratoire avec des cellules, des tissus isolés ou des outils informatiques. Même si certaines méthodes permettent d’étudier des aspects précis de la maladie, elles ne permettent pas de comprendre ses effets sur l’ensemble de l’organisme. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour mieux comprendre cette maladie et ses conséquences, notamment sur le cerveau et le comportement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au strict minimum nécessaire. L’organisation des études est pensée pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. Lorsque cela est possible, les mêmes groupes d’animaux sont utilisés pour plusieurs mesures, et toutes les informations recueillies sont exploitées au maximum. Des premières études permettent aussi de mieux cibler les moments clés de la maladie, afin d’éviter d’utiliser des animaux de manière inutile par la suite. De plus, le suivi du comportement se fait grâce à des méthodes simples qui permettent d’observer plusieurs fois les mêmes animaux au fil du temps, sans en utiliser davantage. Enfin, des groupes spécifiques sont parfois nécessaires, mais leur nombre reste limité pour éviter toute utilisation excessive d’animaux.

Raffinement

Une attention particulière est portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie, avec des traitements contre la douleur avant et après l’opération. Les animaux sont surveillés de près après l’intervention et pendant toute la durée de l’étude, afin de vérifier leur état général, leur alimentation, leur hydratation et leur comportement. Si nécessaire, des soins supplémentaires sont apportés, comme une alimentation adaptée ou un apport en liquide, pour éviter une dégradation de leur état. Les tests réalisés sont simples, de courte durée et peu contraignants. Si un animal montre des signes de souffrance trop importants, l’expérience est arrêtée et une euthanasie est réalisée rapidement afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat est souvent utilisé pour étudier les maladies du foie et leurs effets sur le cerveau, car son fonctionnement est bien connu. Cela permet de reproduire de manière fiable l’évolution de la maladie observée chez l’être humain, avec des atteintes du foie qui peuvent entraîner des troubles du comportement et du fonctionnement cérébral. Le rat a aussi des comportements variés, ce qui permet d’observer facilement des changements comme des difficultés à se déplacer, à apprendre ou une altération de l’état général. Les études sont réalisées chez de jeunes animaux adultes, car leur organisme est suffisamment développé pour réagir correctement à la maladie. Leur système de défense fonctionne bien à cet âge, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables.

Chaque diamant mandarin subit deux interventions chirurgicales dans le cerveau, de quatre à huit heures chacune, précédées d'une privation d'eau et de nourriture de trente minutes, et vit jusqu'à soixante jours seul dans une cage placée en caisson d'isolation acoustique. 90 oiseaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre eux reliés trois heures par jour, dix jours au maximum, à un câble qui limite leurs mouvements. Le porteur écrit que ce projet s'inscrit dans une "démarche d'amélioration du bien-être des animaux", l'appareil sans fil visé devant rendre à ces oiseaux le vol et les interactions sociales. Quatre-vingts d'entre eux seront tués et leur cerveau prélevé pour analyses, les dix n'ayant subi aucune chirurgie retournant à la colonie du laboratoire.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer un dispositif sans fil de quantification de l'activité neuronale destiné à être utilisé chez des petits oiseaux. Dans un premier temps, nous mettrons en place une version filaire du dispositif qui, dans ce cas, fait que les oiseaux sont reliés par un câble au système d'acquisition des données, limitant de fait leurs mouvements. Cette version filaire est pour autant nécessaire pour valider la technologie que nous adapterons dans un second temps sur un dispositif sans fil. Le format sans fil est particulièrement avantageux, car il permet aux animaux de se déplacer et d'interagir librement sans les contraintes physiques imposées par des installations filaires. Les deux systèmes (filaire et sans fil) permettont l'enregistrement simultané de l'activité neuronale de multiples neurones situés dans plusieurs zones du cerveau pendant le comportement naturel - nous nous intéressons ici au comportement de chant des oiseaux. Cela est essentiel pour comprendre comment différentes régions du cerveau se coordonnent lors de l'exécution de comportements complexes, tels que la communication vocale et l'interaction sociale. Ce projet s'inscrit non seulement dans une démarche d'amélioration du bien-être des animaux, mais il vise également à augmenter la qualité et l'interprétabilité des données en minimisant les artefacts liés au stress et les restrictions comportementales non naturelles. Le dispositif sera développé et validé chez des diamants mandarins mâles adultes (Taeniopygia guttata). Le diamant mandarin est un modèle d'oiseau chanteur largement utilisé en neurosciences. Les mâles adultes sont très sociables et vocaux, s'adonnant à une communication vocale et non vocale, en particulier dans leurs interactions avec les femelles. Cela les rend particulièrement adaptés à l'étude des réponses neuronales dans des contextes sociaux et sensoriels, ce qui correspond étroitement à nos objectifs de recherche. Si ces oiseaux s'accomodent de dispositifs filaires d'enregistrements d'activité cérébrale, il n'en reste pas moins que cela limite de fait les possibilités de mouvement de leur part et les études possibles. Mettre au point une solution sans fil est donc critique tant d'un point de vue scientifique qu'éthique, afin d'étudier le comportement d'individus placés dans des conditions plus écologiques permettant notamment le vol et des interactions sociales plus nourries.

Bénéfices attendus

Le principal avantage de ce projet réside dans le développement d'un outil sans fil de mesure de l'activité des neurones du cerveau. Bien que des dispositifs aient été développés, ils ne sont pas applicables chez des petits oiseaux, du fait des contraintes de poids limités susceptibles d'être portés par des oiseaux. Notre approche vise à effectuer des enregistrements simultanés à partir de plusieurs régions du cerveau tout en permettant une plus grande liberté de mouvements des oiseaux (notamment le vol libre) et d'interactions sociales. De plus, la méthode de quantification de l'activité neuronale que nous utilisons peut être utilisée pour enregistrer différents systèmes de signalisation neuronale (par ex. calcium, dopamine). Le projet permettra également de générer un ensemble de données uniques comprenant l'activité de multiples neurones localisés dans plusieurs structures cérébrales en même temps que des enregistrements audio et vidéo pendant les interactions sociales entre mâles et femelles. À long terme, le système sans fil pourra être adapté pour d'autres animaux vivant en groupe. Cela créera de nouvelles opportunités pour étudier l'activité cérébrale distribuée qui sous-tend les comportements sociaux complexes chez différentes espèces.

Procédures

Les animaux seront placés dans des cages individuelles, elles-mêmes placées dans des caissons d'isolation acoustique afin de pouvoir enregistrer leurs vocalisations dans les meilleurs conditions possibles, leurs vocalisations étant enregistrées automatiquement, sans intervention requise. Les oiseaux seront quotidiennement mis en contact avec une femelle accompagnatrice qui sera présentée pendant au minimum 3h consécutives soit dans une cage adjacente, soit directement dans la cage de vie des sujets. Ces derniers resteront dans le caisson pendant 60 jours maximum. Les oiseaux seront soumis à deux procédures chirurgicales pour les manipulations intracérébrales, chaque intervention durant entre 4 et 8h. Ces deux procédures seront suffisamment espacées dans le temps (30 jours) pour permettre une récupération complète des invididus. Les vocalisations émises spontanément par les oiseaux seront enregistrées pendant toute la durée de l'expérience, et des sons pourront être diffusés. Une partie des oiseaux seront reliés par un fil à un système d'acquisition, limitant de fait leurs mouvements. Cela durera 3h et sera répété 10 jours maximum.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables associés à ce projet sont ceux liés aux interventions chirurgicales. Chaque oiseau subira deux interventions chirurgicales stéréotaxiques, d'une durée totale dde 4 à 8 heures. Avant chaque intervention, les oiseaux seront placés en restriction hydrique et alimentaire pour une durée de 30 minutes. L'intervention chirurgicale provoquera une douleur et une gêne légères et temporaires, même si elle est réalisée sous anesthésie et qu'une combinaison de différents analgésiques est utilisée. Toutefois, d'après notre expérience, les oiseaux reprennent généralement une alimentation et un toilettage normaux dans les 1 à 2 heures suivant l'intervention chirurgicale et le réveil de l'anesthésie, et la cicatrisation complète est prévue dans les 3 à 4 jours. Pendant toute la durée de l'expérience, les oiseaux seront placés dans des cages individuelles. Une femelle accompagnatrice sera présentée quotidiennement soit dans une cage adjacente, soit dans la même cage afin de favoriser les interactions sociales.

Devenir

Les animaux (n=80 maximum) ayant subi des procédures invasives seront euthanasiés et leur cerveau collecté pour analyses histologiques. Les animaux n'ayant subi aucun procédure chirurgicale (n=10) retourneront à la colonie du laboratoire.

Remplacement

Les systèmes in vitro (par exemple, les cultures cellulaires, les coupes cérébrales, les organoïdes) fournissent des informations précieuses sur les mécanismes cellulaires. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire l'activité neuronale du comportement naturel chez les animaux en interaction. Ce projet nécessite des enregistrements in vivo pour mettre au point un dispositif sans fil de quantification de l'activité neuronale et étudier comment différentes régions du cerveau se coordonnent pendant les comportements sensoriels et sociaux. Ces objectifs dépendent de la complexité totale de l'animal vivant et ne peuvent donc pas être atteints avec des alternatives non animales.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum en structurant le projet en deux étapes consécutives. Tout d'abord, une version filaire du dispositif de quantification de l'activité neuronale sera validée ; ce n'est qu'après avoir réussi cette étape qu'une version sans fil sera testée, techniquement plus difficile à mettre en oeuvre. Cette approche par étapes garantit que chaque étape aborde des défis techniques spécifiques, évitant ainsi l'utilisation inutile d'animaux. À chaque étape, nous commencerons avec un petit nombre d'oiseaux plutôt que d'utiliser la cohorte complète. Cela nous permettra d'aborder étape par étape les questions techniques ou méthodologiques spécifiques et d'optimiser les procédures avant de poursuivre. Chaque étape sera finalisée une fois ses objectifs atteints, garantissant ainsi que l'utilisation d'animaux reste justifiée et minimale tout au long du projet.

Raffinement

L'anesthésie sera soigneusement surveillée afin de garantir une profondeur suffisante mais non excessive pendant l'intervention chirurgicale, et une combinaison d'analgésiques sera administrée avant, pendant, à la fin de l'intervention chirurgicale et pendant la période de récupération postopératoire afin de maximiser le soulagement de la douleur. Les médicaments utilisés seront préchauffés à la température corporelle des oiseaux afin de minimiser l'inconfort. Pendant la période de récupération postopératoire, en plus de l'analgésie par voie orale, de la nourriture à base d'œufs mélangée à du glucose sera placée sur le sol de la cage pour faciliter l'accès, et les oiseaux seront logés avec un accès visuel et acoustique à des femelles de la même espèce afin de réduire le stress. Afin de réduire le stress et l'inconfort pendant les expériences, des dispositifs de soutien ou factice seront utilisés dans un premier temps, afin de permettre aux oiseaux de s'adapter progressivement aux conditions expérimentales. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement. Si des signes de douleur ou de détresse sont observés, des analgésiques, antibiotiques et solution de glucose seront administrés. Pendant toute l'expérience, les individus seront placés dans des cages avec divers enrichissements (miroir, perchoirs à différentes hauteurs, nourriture variées) et une congénère sera placée soit dans une cage à proximité soit dans la cage d'hébergement pour favoriser les interactions sociales.

Choix des espèces

Les diamants mandarins mâles adultes (Taeniopygia guttata) ont été sélectionnés pour ce projet pour deux raisons principales. Premièrement, ils sont très vocaux et sociables. Les mâles adultes chantent et font la cour aux femelles, ce qui fournit des comportements quantifiables pertinents pour l'étude de la communication vocale et sociale. Deuxièmement, les diamants mandarins constituent un modèle neurobiologique bien établi. Les noyaux cérébraux spécialisés de leur système vocal ont été largement caractérisés sur le plan anatomique et fonctionnel, ce qui permet de les comparer à la littérature existante et de valider les performances de notre nouveau dispositif. Seuls des diamants mandarins adultes seront utilisés, car les mâles adultes produisent des chants et des parades nuptiales destinés aux femelles. Les adultes sont également robustes, ce qui leur permet de supporter des implants cérébraux et de se rétablir de manière fiable.

1 800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq administrations pour déclencher la maladie puis jusqu'à quarante administrations de composés, toutes sur souris éveillée. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré, avec cinq prises de sang au maximum puis un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse, et toutes les souris sont tuées pour des analyses immunologiques et histologiques. Le porteur écrit que les injections répétées peuvent provoquer de petits hématomes, et que la contention et la piqûre entraînent une douleur légère de quelques secondes. Aucun traitement ne guérit aujourd'hui le purpura thrombopénique immunologique, et l'attente affichée se limite à une hausse du taux de plaquettes chez les groupes traités.

Objectifs

Le Purpura Thrombopénique Immunologique (PTI) est une maladie rare dans laquelle le système immunitaire attaque par erreur les plaquettes, des cellules du sang indispensables pour arrêter les saignements. Cette destruction entraîne une diminution du nombre de plaquettes, appelée thrombopénie, qui peut provoquer l'apparition de bleus, de petites taches rouges sur la peau ou des saignements plus importants. Même si cette maladie n'est généralement pas douloureuse, elle peut avoir un impact important sur la vie quotidienne des patients, qui doivent parfois limiter certaines activités afin de réduire le risque de saignement. Chez l'enfant, la maladie guérit souvent spontanément en quelques semaines. Chez l'adulte, elle devient fréquemment chronique et peut persister pendant plusieurs années. Des traitements existent pour augmenter temporairement le nombre de plaquettes et réduire le risque de saignement. Cependant, leur efficacité est souvent limitée dans le temps et aucun traitement ne permet aujourd'hui de guérir définitivement la maladie. C'est pourquoi il est nécessaire de poursuivre la recherche afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et durables.

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’est efficace à ce jour pour guérir les patients atteints de PTI, l’efficacité des traitements proposés est transitoire. Le but est ici d'étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous nous attendons dans ce projet à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités qui consiste notamment à une augmentation du taux plaquettaire dans le sang.

Procédures

Induction de la maladie: maximum 5 administrations (30 secondes/souris). Administrations de composés: maximum 40 administrations (30 secondes/souris). L’induction et les administrations se font sur animaux vigiles. Prélèvements de sang: maximum 5 prélèvements (30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Ce modèle n’induit aucune douleur à l'animal liée au développement de la pathologie. Aucune perte de poids n’est attendu. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqûre de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Les effets secondaires liés aux candidats médicaments ne sont pas attendus.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Le Purpura Thrombopénique Immunologique (PTI) est une maladie rare dans laquelle le système immunitaire attaque par erreur les plaquettes, des cellules du sang indispensables pour arrêter les saignements. Cette destruction entraîne une diminution du nombre de plaquettes, appelée thrombopénie, qui peut provoquer l'apparition de bleus, de petites taches rouges sur la peau ou des saignements plus importants. Même si cette maladie n'est généralement pas douloureuse, elle peut avoir un impact important sur la vie quotidienne des patients, qui doivent parfois limiter certaines activités afin de réduire le risque de saignement. Chez l'enfant, la maladie guérit souvent spontanément en quelques semaines. Chez l'adulte, elle devient fréquemment chronique et peut persister pendant plusieurs années. Des traitements existent pour augmenter temporairement le nombre de plaquettes et réduire le risque de saignement. Cependant, leur efficacité est souvent limitée dans le temps et aucun traitement ne permet aujourd'hui de guérir définitivement la maladie. C'est pourquoi il est nécessaire de poursuivre la recherche afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et durables

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou du gel de réhydratation seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris C57BL/6, BALB/c dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - La souris de laboratoire est la plus utilisée par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Le choix des souches de souris sera donné par le laboratoire donneur d’ordre, en fonction de ce qui a déjà été fait sur leurs candidats médicaments, de manière à assurer une continuité dans les résultats. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Le paramètre étudié est l’évolution du taux plaquettaire sanguin. L’évolution de ce taux étant basé sur la destruction des plaquettes suite à la formation d’un complexe immun, une souris juvénile induira un biais dans l’expérimentation.

Capturés à l'épuisette puis amputés d'environ 10 % de leur nageoire caudale sous anesthésie, des poissons zèbres passent environ cinq minutes par procédure d'identification génétique. 33 600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur annonce la mise à mort des poissons génétiquement modifiés à l'issue du projet. L'objet est de déterminer si un gène appelé wt1 commande la formation des ovaires ou des testicules chez cette espèce, en modifiant son activité dès les premiers stades de l'embryon. Les effets de ces modifications restent inconnus, un retard de croissance ou une infertilité étant annoncés comme possibles, et aucune procédure autre que le prélèvement de nageoire n'est décrite pour un effectif de cette taille.

Objectifs

De nombreuses maladies humaines présentent des différences selon le sexe des patients, aussi bien dans leur fréquence que dans leur évolution. Il est donc important de prendre en compte le sexe des individus dans les études utilisant des modèles animaux. Le poisson zèbre constitue un modèle de référence pour l’étude du développement et de nombreuses pathologies humaines. Cependant, les mécanismes génétiques impliqués dans la détermination sexuelle chez cette espèce restent encore mal caractérisés dans les souches utilisées en laboratoire, ce qui limite la prise en compte du sexe comme variable biologique dans les études utilisant ce modèle. Ce projet vise à comprendre le rôle d'un gène appelé wt1, déjà connu pour être essentiel dans le développement des organes reproducteurs chez les mammifères. Comme ce gène existe également chez le poisson zèbre, nous voulons déterminer s'il joue un rôle similaire. Pour répondre à cette question, nous modifierons l'activité de ce gène dès les premiers stades du développement de l'embryon, puis nous observerons les conséquences de ces modifications sur le développement des ovaires ou des testicules et par conséquent sur tout le développement sexuel de l’individu. L'objectif est de mieux comprendre comment le sexe est déterminé chez le poisson zèbre et d'améliorer l'utilisation de cette espèce comme modèle pour la recherche biomédicale.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes de détermination du sexe dans cette espèce facilitera l’interprétation des études biomédicales utilisant ce modèle, notamment lorsque l’incidence ou la progression des phénotypes étudiés dépend du sexe. Les bénéfices attendus sont de nature fondamentale et contribueront à l’amélioration des connaissances en biologie du développement et en biologie de la reproduction.

Procédures

Les manipulations des poissons nécessitent leur capture à l'aide d'une épuisette, ce qui peut provoquer un stress temporaire. Pour les identifier, un seul prélèvement correspondant à environ 10 % de la nageoire caudale (environ 2 mm²) sera effectué sous anesthésie, après administration d'un analgésique pour limiter la douleur. L'ensemble de la procédure dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées à ce projet sont principalement liées aux procédures d’identification des génotypes et aux conséquences possibles des modifications génétiques. Le génotypage des animaux porteurs de mutations ou de transgènes nécessite un prélèvement d'un fragment de la nageoire caudale. Cette procédure invasive peut induire un stress transitoire, une gêne de courte durée ainsi qu’une diminution temporaire de l’activité de nage ou une modification passagère du comportement alimentaire. Les effets des modifications génétiques sur le développement sexuel du poisson zèbre étant encore inconnus, des effets indésirables ne peuvent être totalement exclus tels un retard de croissance ou l’infertilité.

Devenir

A l’issue du projet, les animaux étant génétiquement modifiés seront mis à mort

Remplacement

Ce projet a été conçu et sera conduit dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour étudier la biologie du développement et les mécanismes de différenciation sexuelle, qui reposent sur des processus dynamiques impliquant interactions tissulaires, vascularisation et organisation tridimensionnelle. À ce jour, les approches in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) ne permettent pas de reproduire de manière fiable ces processus complexes et présentent des limites pour l’étude du développement des ovaires et des testicules in vivo. Néanmoins, une veille scientifique sera assurée et, si des méthodes alternatives pertinentes et validées deviennent disponibles, elles seront privilégiées afin de remplacer tout ou partie de l’utilisation des poissons zèbres.

Réduction

La planification des croisements et l'identification des animaux porteurs des modifications génétiques d'intérêt permettront d'ajuster la production animale aux besoins stricts du projet et d'éviter toute surproduction. Les schémas de croisement seront optimisés afin d'obtenir les animaux présentant les caractéristiques génétiques recherchées avec un nombre minimal d'animaux. Les effectifs ont été estimés à partir des proportions mendéliennes attendues des différents profils génétiques et du sex-ratio attendu chez le poisson zèbre (environ 50 % de femelles et 50 % de mâles), ainsi que du nombre d'animaux nécessaire à la réalisation des analyses prévues. Les modifications génétiques étant susceptibles d'influencer ce sex-ratio, les effectifs seront ajustés au cours du projet en fonction des résultats obtenus si cela est nécessaire. Les groupes de reproducteurs seront constitués de manière à respecter le comportement grégaire de l'espèce, à garantir la présence des deux sexes et à disposer d'un effectif suffisant pour la réalisation des analyses, tout en prévoyant des périodes de repos. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques, les mêmes individus pourront être utilisés pour plusieurs analyses afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. La production de nouveaux animaux sera interrompue dès que le nombre d'individus nécessaire à la réalisation des analyses prévues aura été obtenu.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en œuvre afin de minimiser la douleur, le stress et la souffrance des animaux. Les prélèvements de nageoire caudale seront réalisés sous anesthésie, avec une durée d’anesthésie limitée au strict nécessaire et un prélèvement de taille minimale pour l’analyse génétique. Compte tenu de la forte capacité de régénération de la nageoire caudale chez le poisson zèbre, aucune séquelle durable n’est attendue. Une surveillance post-procédure sera assurée jusqu’à la reprise d’un comportement normal de nage et d’alimentation. Des points limites sont définis : tout animal présentant un réveil prolongé ou des troubles persistants de la nage sera euthanasié par surdose d’anesthésique afin de prévenir toute souffrance prolongée. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux recommandations pour l’espèce (densité adaptée, enrichissement du milieu et suivi sanitaire régulier) afin de limiter le stress et de favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle largement utilisé pour étudier le développement des organes et de nombreuses maladies humaines. Cependant, les mécanismes qui déterminent si un individu devient mâle ou femelle restent encore mal compris chez cette espèce. Mieux comprendre ces mécanismes permettra d'améliorer l'interprétation des études utilisant ce modèle, notamment lorsque le sexe influence les résultats. Cette recherche présente également un intérêt plus général, car elle permettra de mieux comprendre comment les mécanismes de détermination du sexe ont évolué chez les vertébrés. Elle pourrait aussi avoir des applications en aquaculture, où la maîtrise du sexe des animaux peut être utile. Enfin, le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce type d'étude grâce aux nombreux outils disponibles pour modifier son patrimoine génétique et à des conditions d'élevage bien maîtrisées. Les analyses seront réalisées sur des poissons âgés de 19 à 30 jours après la fécondation, une période au cours de laquelle les organes reproducteurs se développent progressivement et se différencient pour former des ovaires ou des testicules.