Procédures légères

Réformés pour la plupart, 45 rongeurs, 30 souris et 15 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour former des utilisateurs à un appareil d'imagerie par rayons X récemment acquis et pour en régler les paramètres. Chacun passe un ou deux examens sous anesthésie générale d'une heure au maximum, espacés de deux semaines, l'anesthésie entraînant une hypothermie et une dépression respiratoire et cardiovasculaire. Tous sont ensuite tués, leurs tissus pouvant servir à d'autres projets. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni effet indésirable n'est attendu dans ces conditions, tout en indiquant que les rayons X endommagent l'ADN et que cela peut entraîner à long terme l'apparition d'un cancer.

Objectifs

Suite à l'acquisition d'un microCT (micro computed tomography, Milabs) adapté aux études précliniques in-vivo, l'objectif de ce projet, est la formation d'utilisateur et l'étude de faisabilité sur animaux sains (de préférence de réforme). Ce nouvel équipement, basé sur les rayons X, permettra l'exploration in-vivo non-invasive du squelette et des poumons complétant d'autre modalité d'imagerie préclinique telle que l'imagerie par résonance magnétique (IRM).

Bénéfices attendus

Cet technique d'imagerie préclinique, présente dans les services cliniques de radiologie, permet de développer des protocoles transposables chez l'Homme et la réduction du nombe d'animaux par l'étude longitudinale du corps ou d'une partie du corps durant le développement d'une pathologie ou bien de la croissance, du vieillissement chez des rongeurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à un ou deux examens sous anesthésie générale d'une durée maximum d'une heure, espacé de 2 semaines.

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire. Aucunes nuisances ou effets indésirables sont attendus dans les conditions expérimentales appliquées au microCT. Une grande partie des dommages ionisants causés aux tissus biologiques, dont 60 à 70 % sont des dommages à l'ADN, est due aux radicaux libres hydroxyles (OH˙). Cela peut entrainer à long terme l'apparition de cancer.

Devenir

Les animaux majoritairement de réforme seront mis à mort. Les tissus pourront être prélevés et utilisés pour d'autre projet avec d'autre modalité.

Remplacement

En amont des expériences in-vivo, des fantômes, objets tests et cadavres seront utilisés autant que possible. La respiration et le battement cardiaque peuvent être sources d'artefact de mouvement sur les images. Nous devons tester les paramètres avec des animaux.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage au maximum deux fois du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens d'imagerie. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, éléments pour nidification, bâton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés à la procédure. Pendant la durée de l'examen d'imagerie, des constances physiologiques (température rectales, la fréquence respiratoire à minima et la fréquence cardiaque si nécessaire) sont suivies en temps réelles.

Choix des espèces

Le microCT est un appareil d'imagerie dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Nous utiliserons essentiellement des animaux adultes sauf besoin contraire d'un projet.

46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit trois injections, deux d'antibiotiques et une d'anesthésique, puis subit une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie fixe, pour suivre pendant deux heures le passage de l'amoxicilline, de la ceftriaxone et de la gentamicine dans le sang. Aucune souris n'est infectée, et l'efficacité de l'association antibiotique contre la listériose sera testée plus tard, dans un autre projet. Sur le remplacement, le porteur écrit que le recours à la lignée murine s'avère actuellement "indispensable" et que le passage par l'animal reste "une étape obligatoire et réglementaire", tout en reconnaissant que des données de pharmacologie de ces trois antibiotiques existent déjà dans la littérature.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine de 3 antibiotiques sur une période de 2h après injection, chez la souris non infectée. Cette caractérisation permettra d’évaluer le devenir des molécules, depuis leur entrée jusqu'à leur élimination en fonction du temps et ainsi d’avoir les bonnes concentrations et fréquence d’administration dans un modèle sain pour en évaluer leur efficacité ultérieurement (dans un modèle d’infection à Listeria).

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice susceptible de découler de ce projet est une nouvelle association de deux des antibiotiques testés afin de soigner l’infection invasive à Listeria, en comparaison au traitement de référence. Cette efficacité sera testée ultérieurement dans un autre projet.

Procédures

Les interventions sont : - les deux injections d’antibiotique (l’une en intrapéritonéal, l’autre en sous-cutanée), ainsi que l’injection de l’anesthésique en intrapéritonéal. Chaque injection dure 20secondes, soit une durée totale estimée à 1min par animal. - Une ponction intracardiaque de sang sera également réalisée sous anesthésie fixe. Cet acte, incluant la préparation et le prélèvement, dure maximum 1min par animal.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable principal est lié à la douleur, légère, et de courte durée générée par les trois injections (l’une en sous cutanée, l’autre en intra-péritonéal, et enfin, une dernière en intra-péritonéale pour l’administration de l’anesthésie fixe).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de doser les différents composés étudiés.

Remplacement

La principale stratégie de remplacement de l’expérimentation animale reposerait sur l’utilisation de modèles in vitro (cultures cellulaires, tests enzymatiques, modélisations pharmacocinétiques). Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire fidèlement la complexité physiologique d’un organisme vivant. Ainsi, le recours au modèle murin s’avère actuellement indispensable, car il constitue la seule approche permettant de relier les concentrations plasmatiques observées à la réalité de la réponse biologique. Pour l’heure, le recours à l’animal reste une étape obligatoire et réglementaire dans le développement de nouvelles associations thérapeutiques à visée anti-infectieuse. Des données de pharmacologie de ces 3 antibiotiques sont disponibles dans la littérature. Néanmoins, elles restent limitées, réalisées dans des modèles murins différents (espèces, âge, sexe) qui ne permettront pas de s’assurer d’obtenir une pharmacocinétique précise dans notre modèle. L’étape suivante étant dans un projet ultérieur de tester l’efficacité de différents schémas antibiotiques, et d’en évaluer la synergie, il est indispensable d’obtenir des données fiables de pharmacocinétique pour en interpréter les résultats. La synergie du couple antibiotique ceftriaxone et amoxicilline étant obtenue in vitro à partir d’une concentration de ceftriaxone de 2 mg/L, il est impératif de s’assurer d’obtenir de telles concentrations sanguines sur un temps prolongé dans notre modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses a été réduit à 4 par groupe (par temps d’évaluation) pour la caractérisation de la pharmacocinétique de ces 3 antibiotiques. Nous administrerons les 3 antibiotiques aux mêmes animaux, au lieu de réaliser l’administration de chaque antibiotique sur des animaux distincts afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire et dans la mesure où l’injection concomitante de ces 3 antibiotiques n’est pas associée à une modification de leur pharmacocinétique. Aucun test statistique comparatif ne sera appliqué aux résultats des dosages, l’objectif étant avant tout descriptif.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et habilité. Les données de la littérature disponibles ne montrent pas de toxicité de ces 3 antibiotiques aux concentrations testées. Un suivi clinique rigoureux sera mis en place tout au long de l’expérimentation (état général, comportement, activité, respiration, poids), permettant une détection précoce de toute souffrance. Le choix d’un temps expérimental court permet une observation continue des souris et d’anticiper au mieux l’atteinte des points limites. L’environnement expérimental sera adapté (enrichissement du milieu, période d’acclimatation, hébergement en groupe de 5 ou 10) afin de favoriser le bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection invasive à Listeria dans d’autres projets. Souris de 8-10 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-25g.

Faire produire du lait à une chèvre sans qu'elle ait porté de chevreau, par stimulation manuelle ou mécanique du pis, occupe 40 chèvres adultes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit jusqu'à 38 prélèvements sanguins par ponction jugulaire sur quinze mois, sur animal vigile en contention, et cinq prélèvements de salive par coton à mâcher pour doser le cortisol. Vingt-six chèvres sont maintenues non gestantes, quatorze gestantes servent de groupe de comparaison. Aucune mise à mort n'est prévue, les chèvres étant réintégrées à l'issue dans le cycle de production du troupeau. Le porteur présente cette pratique comme un moyen de réduire le nombre de chevreaux nés et non conservés chaque année et de limiter la réforme des chèvres non gestantes, dans une filière caprine laitière dont il évalue la durabilité.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment faire produire du lait à une chèvre sans qu’elle ait eu de chevreau, uniquement par stimulation manuelle ou mécanique du pis, et sans recourir à des traitements hormonaux. Cette pratique, appelée « induction de la lactation », intéresse de nombreux éleveurs caprins car elle permettrait de réduire le nombre de naissances non souhaitées tout en maintenant la production laitière. Les quatre objectifs principaux sont : (1) mesurer les variations des hormones impliquées dans la production de lait au cours du protocole, afin de comprendre pourquoi certaines chèvres réussissent et d’autres non ; (2) suivre l’évolution du pis (température, forme, souplesse) pour documenter les changements physiques associés à la reprise de la lactation ; (3) évaluer si les conditions d’élevage, notamment l'accès au pâturage ou la distribution d’herbe fraîche en bâtiment, influencent la réussite de l’induction ; (4) s’assurer que le protocole n’affecte pas négativement l’état de santé et le comportement des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances scientifiques nouvelles sur les mécanismes biologiques de la production de lait chez la chèvre sans gestation annuelle. À terme, ces connaissances pourraient permettre aux éleveurs de mieux maîtriser l'induction de la lactation et d'identifier, dès le début du protocole, les animaux susceptibles de réussir ou d'échouer, grâce à des marqueurs précoces (profils hormonaux, paramètres mammaires, état corporel). Sur le plan pratique, une meilleure compréhension de ce phénomène pourrait contribuer à réduire le nombre de chevreaux nés et non conservés chaque année dans les élevages, à limiter la réforme de chèvres non gestantes, et à proposer des alternatives à la gestion actuelle du troupeau. Ce projet s'inscrit dans une démarche plus large visant à évaluer la durabilité et l'applicabilité de pratiques d'élevage alternatives dans la filière caprine laitière.

Procédures

Prélèvements sanguins par ponction jugulaire (animaux vigiles) : 38 prélèvements maximum par animal sur 15 mois, durée inférieure à 2 min chacun. Prélèvements de salive, par présentation d'un coton à mâcher, pour le dosage du cortisol : 5 prélèvements par animal sur les 40 chèvres, à des temps clés du protocole, durée de quelques secondes à 1 minute par prélèvement (temps de mastication spontanée) avec une contention manuelle par un agent formé.

Impact sur les animaux

La stimulation de la mamelle correspond à une manipulation similaire à la traite habituelle. Une légère sensibilité mammaire transitoire peut être observée chez certaines chèvres en début de stimulation. Les prélèvements sanguins par ponction jugulaire constituent la principale source potentielle de stress. Ils sont de courte durée (inférieure 2 minutes), réalisés sur le quai de traite dans l'environnement habituel, par du personnel formé. Les volumes prélevés sont adaptés afin qu’ils n’induisent aucun risque d’anémie.

Devenir

Les animaux seront maintenus en vie à l'issue de l'ensemble des procédures et seront réintégrés dans le cycle classique de production du troupeau, conformément aux pratiques habituelles de l'établissement. Aucune mise à mort n'est prévue dans ce projet.

Remplacement

Ce projet porte sur la physiologie de la lactation chez la chèvre laitière. Les phénomènes étudiés, notamment la reprise de la production de lait sous l’effet d’une stimulation, les réponses hormonales et les changements du comportement animal, ne peuvent être observés et mesurés que sur l’animal vivant dans ses conditions réelles d’élevage. Aucun modèle de laboratoire ou alternative n’est actuellement capable de reproduire ces interactions complexes entre l’organisme entier, l’environnement et la production laitière.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Sur le total de 40 chèvres pour les 5 années du projet, 26 chèvres seront non gestantes, tandis que 14 autres seront gestantes, constituant ainsi un groupe témoin. L’effectif de 26 chèvres non gestantes a été calculé en tenant compte d’un taux de réussite de l’induction estimé à 50 %, afin de disposer d’au moins 6 à 7 animaux par sous-groupe. Les 14 chèvres gestantes témoins constituent le groupe de référence minimal pour disposer de comparaisons fiables. Le nombre de prélèvements sanguins a été limité à 38 par animal sur 15 mois, avec un intervalle minimum de deux semaines entre chaque session. Le cortisol est mesuré sur salive plutôt que sur sang, ce qui évite des prélèvements supplémentaires dédiés à cet indicateur.

Raffinement

Les animaux seront logés dans les conditions habituelles de cet élevage : logement en groupe sur aire paillée propre équipées d’au moins 2 d’abreuvoirs et d’une brosse rotative. Les chèvres auront accès au pâturage de mars à août. Les chèvres sortent entre la traite du matin et celle du soir lorsque les conditions météorologiques le permettent ; en cas de forte pluie continue, d’orage ou de fortes chaleurs, les chèvres seront mises à l’abri en batiment dans leur aire paillée. Toutes les mesures possibles ont été prises pour limiter l’inconfort des animaux. La grande majorité des observations (production de lait, état du pis, comportement, état corporel) est réalisée directement lors de la traite quotidienne, sans manipulation ni contention supplémentaire. Les prises de sang sont de courte durée (moins de 2 minutes), effectuées dans l’environnement habituel des chèvres, et espacées d’au moins deux semaines. Le cortisol salivaire est obtenu sans piqûre grâce à un coton à mâcher. Les mesures du pis (température, photographies, souplesse) sont non invasives. Une surveillance quotidienne du bien-être animal sur des paramètres collectifs et individuels spécifiques au caprin est effectué et enregistré via des grilles d’évaluation.

Choix des espèces

La chèvre laitière est l’espèce cible de ce projet. Les éleveurs caprins sont en effet les plus nombreux à pratiquer ou envisager l’induction de la lactation sans gestation. Les résultats seront directement transposables à leur pratique, ce qui justifie de travailler sur l’espèce réelle plutôt que sur un modèle animal différent. Les animaux utilisés sont des chèvres adultes multipares (plusieurs lactations), représentatives du troupeau laitier standard.

20 brebis seront tuées pour prélever leur utérus dans des conditions standardisées, l'imagerie qui fait l'objet du projet étant menée hors du corps, sur organe perfusé. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sur brebis vigiles, sous contention manuelle et en présence de leurs congénères. Chacune reçoit une éponge intravaginale et cinq injections pour synchroniser son cycle hormonal, puis un, trois, six ou neuf prélèvements sanguins selon le groupe, avec un risque d'hématome ou d'irritation locale. Le porteur affirme qu'aucun dispositif in vitro ne reproduit la complexité des petits vaisseaux de l'utérus et que l'approche hors du corps, choisie pour supprimer les mouvements respiratoires et cardiaques, rend le recours aux brebis "indispensable".

Objectifs

Chez la femme, au cours du cycle hormonal, les vaisseaux sanguins de l’utérus subissent de très forts changements pour accompagner les besoins physiologiques du corps. C’est particulièrement vrai pour les petits vaisseaux de l’endomètre – la muqueuse utérine, qui prolifère tout au long du cycle, puis dégénère au moment des règles. Ces très petits vaisseaux sont extrêmement importants, notamment pour la bonne implantation de l’embryon, en cas de grossesse. A l’heure actuelle, ils sont cependant complètement invisibles par toutes les méthodes d’imagerie clinique, et leur rôle dans de nombreuses pathologies gynécologiques et obstétricales est donc assez mal connu. Le premier objectif de ce projet est d’adapter une méthode très récente d’imagerie échographique, afin de pouvoir visualiser les petits vaisseaux de la muqueuse utérine. Le second objectif est d’étudier l’évolution de ces petits vaisseaux au cours d’un cycle hormonal normal, pour mieux comprendre les modifications profondes qu’ils subissent. Dans le cadre d’une expérimentation préclinique, nous imagerons des utérus de brebis. La brebis est en effet un modèle bien établi pour de nombreuses pathologies gynécologiques et obstétricales, en raison de similarités morphologiques avec les femmes. Cette étude sera réalisée ex vivo, pour s’affranchir des mouvements naturels (respiration, battements cardiaques), et permettre l’étude la plus détaillée possible des petits vaisseaux. Nous établirons les premières cartes des petits vaisseaux de l’utérus au cours d’un cycle hormonal, et étudierons finement leurs caractéristiques, en termes de dimensions, morphologie et flux sanguins associés. Combinées à des méthodes d’analyse d’image permettant de compenser les mouvements naturels, les solutions développées dans ce projet seront donc directement utilisables chez la femme, permettant un transfert rapide vers la pratique clinique. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les petits vaisseaux sanguins de l’utérus sont impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques liés à la reproduction. On soupçonne également leur rôle dans certaines pathologies, comme l’endométriose, une maladie gynécologique chronique pouvant provoquer douleurs et infertilité, ou la pré-éclampsie, une complication grave de la grossesse caractérisée par une hypertension artérielle. Ce projet doit nous apporter une meilleure connaissance ces petits vaisseaux et de leur évolution au cours d’un cycle hormonal normal. A plus long terme, cela nous permettra de mieux comprendre ses altérations dans les cas pathologiques. Par ailleurs, les technologies développées dans ce projet constituent une première étape cruciale pour pouvoir appliquer notre méthode d’imagerie chez la femme.

Procédures

Les 20 brebis seront soumises : A une pose d’éponge intravaginale d’une durée de 1 à 2 minutes A 5 injections d’une durée de quelques secondes chacunes. En cas de nécessité, à 2 injections supplémentaires d’une durée de 1 à 2 minutes, espacées de 3 à 5 minutes. A des prélèvements sanguins, selon les groupes expérimentaux, 5 brebis seront soumises à 1 prélèvement sanguin, 5 brebis à 3 prélèvements sanguins, 5 brebis à 6 prélèvements et 5 brebis à 9 prélèvements. Chaque prélèvement dure 1 à 2 minutes. Toutes les interventions décrites seront réalisées sur des animaux vigiles, sous contention manuelle douce et en présence des congénères.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place dans ce projet peuvent induire un stress ou un inconfort léger et de courte durée chez les animaux au moment de la contention pour la pose des éponges intravaginales, les injections, et les prélèvements sanguins. Elles peuvent également induire une douleur légère et de courte durée suite aux injections et prélèvements sanguins. Les prélèvements sanguins pourraient donner lieu à un hématome, un saignement ou une légère réaction locale (irritation).

Devenir

A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire, afin de permettre le prélèvement des utérus dans des conditions standardisées et reproductibles.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet se fait après de nombreuses études in vitro pour le développement et l’optimisation de notre méthode d’imagerie. Nous avons notamment utilisé des dispositifs expérimentaux reproduisant les caractéristiques du corps humains (« fantôme d’imagerie »). Ces dispositifs permettent d’étudier des cas simples, faisant intervenir un très petit nombre de vaisseaux, de calibre relativement gros. La physiologie du cycle menstruel chez la femme fait cependant intervenir beaucoup de paramètres hormonaux et structurels (taille et nombre des vaisseaux, flux sanguins, …). Il n’existe pas aujourd’hui de dispositif expérimental permettant de mimer tous ces paramètres in vitro, et en particulier la complexité des petits vaisseaux sanguins de l’utérus. Par ailleurs, afin d’optimiser nos méthodes, et d’imager le plus précisément possible les très petits vaisseaux, nous avons besoin de limiter les mouvements au maximum pendant toute la durée de l’acquisition ultrasonore. Pour cela, nous avons besoin de mettre en place une approche ex vivo d’utérus perfusé, et le recours à des animaux est donc indispensable. Les méthodes d’imagerie et d’analyse de données qui pourront ainsi être développées dans un cas idéal seront toutefois utilisables in vivo chez la femme, en les combinant à d’autres techniques développées par l’équipe. L’utérus étant un organe abdominal, sujet à ses contractions intrinsèques mais également aux mouvements cardiaques et respiratoires, la mise en œuvre de notre méthode chez la femme nécessitera notamment l’utilisation de méthodes de compensation de mouvement. Bien que les variations hormonales de la brebis soient différentes de celles de la femme, elles impliquent également des modifications des vaisseaux sanguins de l’utérus. Morphologiquement, l’utérus de la brebis et en particulier ses vaisseaux sont de dimensions similaires à celle de la femme. C’est également un modèle animal établi pour plusieurs pathologies gynécologiques et obstétricales. Ce modèle animal est donc essentiel pour obtenir des résultats scientifiques exploitables et pertinents pour la physiologie humaine.

Réduction

Afin de limiter le nombre de séquences d’imagerie ultrasonore à tester, et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés, nos paramètres d’imagerie seront développés et optimisés in vitro dans des dispositifs expérimentaux modélisant les vaisseaux sanguins de manière simplifiée (fantômes d’imagerie). Pour cette étude, une comparaison entre les différentes phases du cycle hormonal sera effectuée par des tests statistiques. Les paramètres comparés seront la densité, la tortuosité et le diamètre des vaisseaux, ainsi que les flux sanguins observés dans les petits vaisseaux. Sur la base des données de la littérature se rapprochant le plus de notre méthode, à savoir de l’imagerie Doppler, nous avons effectué des tests statistiques pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires. Nous évaluons que nous avons besoin de 5 animaux par phase du cycle soit un total de 20 animaux. Pour chaque animal, nous imagerons l’utérus perfusé aussi longtemps que possible (tant que le tissu reste viable) afin de collecter autant de données que possible, afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.

Raffinement

Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés, n’induisant pas de stress. Un enrichissement adapté leur sera proposé. Afin de limiter le stress et l’inconfort des animaux, toutes les procédures du projet seront réalisées sous contention manuelle, douce et de courte durée, par du personnel formé. Pour les prélèvements sanguins à la veine du cou, une attention particulière sera portée à l’alternance des sites de ponction lorsque cela est possible, afin de prévenir toute irritation locale. Après chaque prélèvement, le site de ponction sera inspecté afin de vérifier l’absence de saignement prolongé, d’hématome ou de réaction locale. Les brebis seront surveillées quotidiennement tout au long du protocole pour détecter tout signe de douleur, de stress ou d’altération de l’état général. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Notre étude vise à explorer les vaisseaux sanguins de l’utérus au cours du cycle hormonal, mais également à développer des outils d’imagerie qui pourront être utilisés chez la femme dans le futur. Nous avons donc besoin d’un modèle animal dont l’utérus est morphologiquement proche de celui de la femme, et qui présente une variation vasculaire due au cycle hormonal. L’utérus de la brebis est de taille similaire à celui de la femme. Il présente une variation cyclique due aux variations hormonales. C’est également un modèle bien établi pour plusieurs pathologies reproductives. Nous voulons étudier le système reproducteur féminin mature. Nous utiliserons donc des brebis adultes.

Sept groupes de douze souris, six mâles et six femelles, chacun recevant un vaccin candidat différent contre le virus Nipah : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur sang et leur rate. La moitié de chaque groupe est tuée quinze jours après une injection unique, l'autre moitié reçoit une seconde injection à trente jours et est tuée quinze jours plus tard. Les souris sont identifiées par des encoches pratiquées dans les oreilles, geste qui provoque selon le porteur une douleur et un stress légers, et les prélèvements sanguins se font sous la mâchoire. Le projet ne mesure que l'immunogénicité, l'ampleur et la nature des réponses en anticorps et en lymphocytes, la protection réelle contre ce virus restant à établir dans des travaux ultérieurs.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer parmi les six candidats vaccins développés quels sont les plus immunogènes contre les antigènes majeurs du virus Nipah.

Bénéfices attendus

L’efficacité de la plateforme vaccinale utilisée dans ce projet a déjà été démontrée contre un premier virus très pathogène chez l’Homme. Cette plateforme a été utilisée à nouveau pour mettre au point différents candidats vaccins contre le virus Nipah, un virus hautement pathogène chez l’Homme. Grâce à l’analyse des prélèvements réalisés sur les animaux après chacune des deux injections de vaccins, nous pourrons mesurer l’évolution des réponses immunes aux antigènes du virus Nipah pour chaque vaccin et également comparer qualitativement et quantitativement ces différentes réponses immunes entre les vaccins. L’ensemble des résultats obtenus permettra de déterminer quels sont les vaccins les plus immunogènes, donc les plus susceptibles de protéger contre ce virus.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une identification (quelques secondes ) au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - La moitié des animaux subira une injection intrapéritonéale de vaccin, l’autre moitié subira deux injections de vaccin (injections durent quelques secondes réalisées à un mois d’écart). - Un prélèvement sanguin submandibulaire (quelques secondes) sera pratiqué sur tous les animaux quinze jour après chaque injection de vaccin.

Impact sur les animaux

L’identification des souris sera réalisée par des encoches aux oreilles ce qui peut provoquer une douleur et un stress léger chez les animaux. Des vaccins utilisant la même plateforme vaccinale ont déjà été utilisés chez la souris et aucun effets secondaires liés aux injections n’a été constaté. Les injections des vaccins peuvent néanmoins provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère et de courte durée. La manipulation des animaux peut induire une peur ou un stress physique de même que le prélèvement sanguin submandibulaire peut entrainer une douleur locale légère de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au cours de la procédure car leur sang et leur rate doivent être prélevés pour analyser les réponses immunitaires aux vaccins inoculés.

Remplacement

Les réponses immunes à des antigènes sont un ensemble de mécanismes cellulaires répartis dans de nombreux types de cellules immunitaires au sein de différents organes et qui évoluent au cours du temps. Il est impossible à l’heure actuelle de reproduire par des expérimentations in vitro ces réponses immunitaires. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité de candidats vaccins.

Réduction

Ce projet implique 7 groupes de 12 animaux chacun constitué de 6 mâles et 6 femelles. Chaque groupe sera inoculé avec un vaccin différent. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort 15 jours après la première inoculation pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection 30 jours après la première injection et sera mise à mort 15 jours plus tard pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires après une seconde vaccination. La mise à mort de six animaux par groupe (3 femelles et 3 males) après chaque vaccination constitue un effectif minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser ainsi des tests statistiques robustes de comparaison de groupes (one way anova principalement) et pour s’assurer également que les résultats obtenus ne sont pas dépendants du sexe des animaux. Les résultats obtenus lors d’un précédent protocole basé sur des effectifs identiques ont montré que les résultats des mesures des paramètres immunitaires obtenus à partir des prélèvements sur les animaux pouvaient être assez dispersés mais que les effectifs étaient suffisants pour réaliser ces tests statistiques. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des résultats, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé, conçu pour garantir leur bien-être et limiter tout risque de perturbation extérieure. Leur habitat sera régulièrement nettoyé et stérilisé, et leur alimentation ainsi que leur hydratation seront adaptées pour répondre à leurs besoins physiologiques. Des mesures spécifiques seront mises en place pour enrichir leur environnement (matériaux de nidification, cachettes, etc.) et favoriser leur confort, notamment en cas de besoin accru en eau ou en chaleur. Lors des manipulations (injections, prélèvements), des précautions rigoureuses seront prises pour minimiser les risques d’inconfort ou d’infection. Les zones concernées seront désinfectées avant et après chaque intervention, et les gestes techniques seront réalisés dans des conditions optimales de sécurité. En cas de réaction locale (rougeur, gonflement) au point d’injection, des soins adaptés (nettoyage antiseptique) seront appliqués sans délai. Un suivi quotidien sera assuré, avec une attention particulière dans les jours suivant chaque vaccination. Les animaux seront observés pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de modification de leur état général (perte d’appétit, changement de comportement, altération de l’apparence). En cas de perte de poids supérieure à 10 % par rapport au poids initial, ou d’apparition de signes cliniques persistants tels que la prostration, la fermeture partielle des yeux ou une inflammation locale au site d’injection, les animaux seront mis à mort. L’ensemble de ces mesures vise à garantir le respect des animaux tout au long du projet, en appliquant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et en s’appuyant sur les bonnes pratiques reconnues en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée est un modèle largement employé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.

Produire du sang, du sérum, du plasma et de l'urine de chien pour des laboratoires et des fabricants de kits de diagnostic : 200 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit soit un prélèvement pouvant atteindre 15 % de son volume sanguin circulant, suivi de quatre semaines de récupération, soit une ponction d'urine par cystocentèse, aiguille introduite dans la vessie sous anesthésie locale ou après tranquillisation, et peut être mis à jeun jusqu'à seize heures la veille. Les mêmes chiens sont prélevés plusieurs fois au cours du projet, 120 d'entre eux restant disponibles pour d'autres procédures expérimentales à l'issue, tandis que 80 chiens du stock dédié seront placés. Le porteur désigne le chien comme "l'espèce nécessaire, définit par le Donneur d'Ordre", à qui il revient de justifier pour chaque commande l'impossibilité de substituer le prélèvement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire les matrices biologiques suivantes :du sang, du sérum, du plasma ou de l’urine de chien. Les matrices biologiques produites sont utilisées dans divers pays de l’Europe continentale dans le cadre de la mise en place de méthodes de dosage de nouvelles molécules dans des laboratoires de recherche ou pour la production de kits de diagnostic en santé humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de dérivés sanguins ou d'urine permettant de réaliser des projets in vitro ou de mettre en place des méthodes d’analyses ou de diagnostics. Ainsi les matrices biologiques du même animal peuvent être utilisées par plusieurs chercheurs ce qui contribue à la réduction du nombre total d’animaux qui serait nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques des différents projets.

Procédures

Une des interventions suivantes sera réalisée en fonction des besoins : a) Prélèvement sanguin sur animaux vigiles (intervention de quelques minutes) : un prélèvement de moins de 15% du volume circulant sanguin suivi d’une période de récupération suffisante (1 semaine de repos pour 7,5% du volume circulant prélevé en 24h, 2 semaines pour 10% et 4 semaines pour 15%). b) Prélèvement sur animaux vigiles ou tranquillisés (anesthésie locale) (intervention de quelques dizaines de minutes) : prélèvement d’urine par cystocentèse. Les animaux pouvant être réutilisés plusieurs fois dans ce même projet, plusieurs prélèvements uniques pourront être réalisés sur un même animal lors de différentes utilisations. Le nombre total, la fréquence et le volume de ces prélèvements respecteront les recommandations internationales et le bien-être de l’animal. Pour chacun de ces prélèvements, les animaux pourront être mis à jeun la veille sur justification scientifique.

Impact sur les animaux

Aucune administration de produit d’essai ne sera réalisée. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux sont : - Celles liées au stress de la contention pour tout type de prélèvement - Pour les prélèvements sanguins : une sensibilité transitoire au niveau du point d’introduction d’aiguille ou un hématome localisé. - Cystocentèse : une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction de l’aiguille pour le recueil de l'urine et/ou pour la tranquilisation, le cas échéant. - Mise à jeun des animaux si l’objectif scientifique de la demande le justifie. La mise à jeun n’excède pas la durée réglementaire (16h).

Devenir

Tous les animaux du stock dédié seront placés à la fin du projet, soit environ 80 chiens. Les 120 chiens inclus ponctuelement dans ce projet seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à une période de récupération suffisante.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car il n’existe pas de méthode alternative pour produire des dérivés sanguins ou de l'urine nécessaires dans certaines étapes de la recherche. Pour chaque demande, le Donneur d’Ordre justifiera de l’impossibilité de substitution des prélèvements sur le chien pour répondre à ses besoins et le responsable de la mise en œuvre du projet vérifiera systématiquement chacune des demandes avant que les échantillons ne soient prélevés. Pour des prélèvements sortant de l’ordinaire en termes de volume à prélever, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux pourra être consultée afin de s’assurer que la demande est bien couverte par l’autorisation de projet en cours.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum estimé, selon notre expérience passée, pour répondre aux besoins habituels en sang, sérum ou plasma (les plus demandés) ou plus ponctuellement urine. Pour chaque demande, le Donneur d’Ordre justifiera le volume souhaité pour répondre à ses besoins et le responsable de la mise en œuvre du projet vérifiera systématiquement la cohérence entre le nombre d’animaux utilisés et les volumes demandés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur le site dans des conditions adaptées à leur âge avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnels/plateformes). Pour des besoins spécifiques, comme une glycémie basse, les chiens adultes pourront être mis à jeun la veille du prélèvement sans dépasser 16 heures. En fonction des interventions, comme pour les prélèvements d’urine, les animaux seront tranquillisés et/ou anesthésiés localement selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux agités sur la table ne seront pas prélevés afin d’éviter tout stress ou blessure involontaire lors du prélèvement. Tous les animaux sont habitués aux contentions douces et aux manipulations par l’Homme depuis leur plus jeune âge, ce qui rend ces occasions rares. Les volumes et les fréquences de sang prélevé respecteront les recommandations internationales pour le bien-être des animaux. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : prostration de l’animal, signe de malaise, hématome, saignement, douleur au point de prélèvement…), il sera pris en charge par le vétérinaire et recevra un traitement adapté pour le soulager.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce nécessaire, définit par le Donneur d’Ordre. Pour chaque demande, le Donneur d’Ordre justifiera de l’impossibilité de substitution des prélèvements sur le chien pour répondre à ses besoins. Chiens adultes de statut correspondant aux besoins du Donneur d’Ordre dans le cadre de leur recherche et développement (mâles, femelles).

Sept cents souriceaux seront tués pour étudier leur squelette et leur éruption dentaire, les cent mères étant gardées en vie pour être réutilisées. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souriceaux reçoivent quatre injections d'agents pharmacologiques ou chimiques sous anesthésie gazeuse pendant leur première semaine de vie, leurs mères étant anesthésiées à chaque séance et hébergées seules pendant les cinq jours précédant la mise bas, et le porteur signale que la manipulation des nouveau-nés peut conduire la mère à rejeter sa portée. Les agents testés sont choisis à partir d'un questionnaire d'exposition rempli par des patients, et le porteur écrit qu'aucun dispositif in vitro ne peut recréer "la complexité d'un organisme entier en croissance".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer les impacts sur la croissance squelettique, en particulier l’éruption dentaire, de certains agents pharmacologiques utilisés en pédiatrie et/ou d’agents chimiques auxquels peuvent être exposés les jeunes enfants. Ces dernières années une augmentation des défauts d’éruption dentaire nommés rétentions primaires a été observée en clinique et la question de l’origine de ces défauts s’est posée. A côté de l’origine génétique observée pour certains patients avec présence de mutations génétiques, une origine environnementale est suspectée correspondant à une exposition à des agents pharmacologiques ou chimiques pendant l’enfance, plus spécifiquement entre 3 et 12 ans. Les agents à évaluer seront donc déterminer à partir d’un questionnaire d’exposition remplit par chaque patient listant les traitements pharmacologiques reçus ainsi que les expositions possibles à des agents chimiques selon le(s) lieu(x) de résidence pendant cette période. La finalité est d’identifier les agents induisant des défauts primaires d’éruption afin d’anticiper leur survenu et de les prendre en charge cliniquement avant qu’ils s’installent irréversiblement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir les agents pharmacologiques et les autres agents chimiques ayant un impact sur la croissance squelettique et plus spécifiquement l’éruption dentaire lorsque des enfants y sont exposés entre 3 et 12 ans. La prévalence de l'ensemble des rétentions dentaires primaires est estimé à 1/500 et le coût sociétal est difficilement quantifiable mais sans aucun doute important. Le but de ce projet n’est pas de remettre en cause l’utilisation de certains agents pharmacologiques dont l’intérêt pour les jeunes patients n’est plus à démontrer (antibiotiques, agents de chimiothérapie…) mais d’identifier leur possibles effets « secondaires » sur le squelette en croissance afin de pouvoir les prendre en charge le plus tôt possible avant que ces effets deviennent irréversibles.

Procédures

Les femelles gestantes seront en hébergement individuel pendant 5 jours (5 jours d'acclimatation correspondant à la fin de gestation ). Les souriceaux recevront une injection sous anesthésie (4 fois, durée de l'acte moins d'une minutes) sur tapis chauffant. Les mères ne recevront aucune injection. Les mères seront anesthésiées 4 fois correspondant aux séances d'injection (anesthésie gazeuse légère inférieure 10 minutes) sur tapis chauffant.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles sont : (i) les manipulations des souriceaux, surtout dans les premiers jours de vie, qui peuvent induire un stress chez la mère pouvant aboutir au rejet des petits, (ii) les injections qui pourront induire une douleur de courte durée aux animaux, (iii) les nuisances liées à l'anesthésie telles que la baisse de la thermo-régulation et la détresse cardio-respiratoire dans de rares cas, et (iiii) l'hébergement individuel des femelles gestantes (en fin de gestation durant la période d'acclimatation qui correspond à la période de nidification).

Devenir

Afin d’analyser les conséquences sur le squelette en croissance et en particulier l’éruption dentaire des différents agents testés, les animaux (700) seront euthanasiés et leur squelette étudié. Les mères (100) seront gardées en vie pour être réutilisées.

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier l’impact d’agents pharmacologiques/chimiques sur la croissance squelettique (incluant l’éruption dentaire) qui est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires et de nombreuses régulations hormonales. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier en croissance avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu ainsi que toutes les signalisations hormonales et autres impliquées.

Réduction

800 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. S’agissant d’évaluer l’impact sur la croissance et l’éruption dentaire chez le nouveau-né d’injections d’agents pharmacologiques ou chimiques, l’unité de base est la portée. Deux portées par agent à évaluer a été retenu sachant que l’impact de chaque agent sera initialement évalué sur une portée euthanasiée au jour 14 et que si et uniquement si un effet est observé alors la deuxième portée sera engagée pour évaluer l’irréversibilité de l’effet observé avec une euthanasie de la portée au jour 28. Dans cette démarche de réduction du nombre d’animaux impliqués, des contrôles internes seront utilisés au sein de chaque portée correspondant à un ou deux petits, selon le nombre de petits dans la portée, injecté(s) uniquement avec la solution saline servant de solvant de l’agent testé.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont standards. Les femelles en fin de gestation sont hébergés 5 jours en cage individuelle auprès de leurs congénères (contacts visuels) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Cette période de 5 jours en cage individuelle correspond à la période d'acclimatation des femelles gestantes ainsi qu'à leur période de nidification. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum dont des frisotis et/ou du coton compressé permettant la réalisation du nid et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Une anesthésie gazeuse légère de la mère et des petits est mise en place pour les injections aux petits afin de limiter le stress chez la mère et de réduire la douleur des injections chez les petits. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Lors des anesthésies un tapis chauffant est systématiquement utilisé pour éviter les baisses éventuelles de la thermorégulation chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix concernant les études de la croissance des mammifères. Les étapes et la physiologie de la croissance sont bien connues et très homogènes dans les lignées consanguines. Le nombre de petit par portée permet d’avoir des contrôles internes à la portée important pour l’analyse d’effet d’injections de substances en limitant les biais que pourrait induire le travail avec des animaux non-sevrés issues de mères différentes. Afin d’analyser l’impact d’agents pharmacologiques et chimiques sur la croissance squelettique les souris seront traitées par 4 injections au cours de la première semaine de vie et euthanasiées aux jours 14 ou 28 de vie. Cette cinétique est la plus adaptée pour l’analyse de la croissance du squelette en particulier au niveau crâniofacial.