Procédures légères

Jusqu'à deux gavages ou injections par jour pendant vingt et un jours, une échographie sous anesthésie chaque semaine, et des tumeurs du foie qui apparaissent spontanément entre la trentième et la quarantième semaine de vie : 750 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles ont été croisées pour que ces tumeurs surviennent plus tôt et plus souvent, et le porteur attend une diminution de l'appétit, une perte de poids, un stress accru, des plaies cutanées aux points d'injection et des difficultés d'endormissement et de réveil dues aux anesthésies gazeuses répétées. Il s'agit d'évaluer des candidats médicaments contre le cancer du foie, la mise à mort intervenant dès une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial. Sur ce total, 654 souris sont tuées pour prélever foie, tumeurs, poumons, rate, sang et moelle osseuse, et les 96 qui n'auront pas développé de tumeur et sortiront du projet en bonne santé pourront être réutilisées ailleurs.

Objectifs

Le cancer du foie est le troisième cancer le plus mortel au monde. Sa prise en charge tardive et l’efficacité limitée de l’oncothérapie actuelle rendent inévitable l'acquisition d'une résistance aux médicaments et la formation de métastases, responsables du taux élevé de morbidité et de mortalité du cancer du foie. Il est donc urgent d'identifier des cibles et des combinaisons médicamenteuses puissantes et efficaces. Un modèle de souris unique génère spontanément un cancer du foie similaire au cancer humain en termes d’hétérogénéité des tumeurs, de résistance aux médicaments actuellement utilisés et d’interaction entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires. Le modèle est également croisé avec d’autres souris, ce qui permet 1) d’avoir un modèle murin ayant les mêmes caractéristiques que les patients atteints de tumeurs du foie avec un type de mutation génétique spécifique ; 2) d’avoir un modèle où la fréquence et/ou le début de la formation des tumeurs est augmenté et/ou accéléré. Ainsi, ces modèles de souris de cancer du foie sont adaptés pour le criblage de nouvelles thérapies combinatoires dans un contexte de résistance aux médicaments actuellement utilisés. Le but de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.

Bénéfices attendus

La détection et le traitement précoce du cancer du foie, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à augmenter l’efficacité des traitements. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire le nombre de décès par an provoqués par ce cancer.

Procédures

Les animaux auront des imageries échographique (durée 4 minutes, sous anesthésie) une fois par semaine au maximum. Une partie des animaux aura des administrations de candidats médicaments soit par injections soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours, durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2 min).

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux sont susceptibles d’expérimenter ce qui suit : (1) Douleur et inconfort : l’apparition spontanée de tumeurs du foie peut engendrer une diminution de l’appétit chez l’animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entraîner des petites plaies cutanées au site d’injection. (2) Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps. (3) Prélèvements sur animaux vigiles. Génotypage : réalisé au sevrage (≈ 21 jours) par prélèvement de poils ; exceptionnellement, un prélèvement de fragment de queue pourra être réalisé. Durée : quelques minutes par animal. Nuisance : faible.

Devenir

Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations biologiques, biochimiques et moléculaires. Les animaux qui n'auront pas généré de tumeurs qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Afin de remplacer les animaux, des stratégies ont été mises en place : 1) les expériences sont réalisées en amont sur des cellules en culture (test in vitro) et/ou des tumoroïdes en culture (test ex vivo) pour déterminer les mécanismes clés et les cibles potentielles ; 2) seuls les candidats prometteurs sont testés in vivo afin d'établir leur pertinence dans un contexte physiologique. Le présent projet constitue la dernière partie de l’étude et nécessite un organisme entier, les souris transgéniques sont le modèle de mammifère le plus pertinent permettant de visualiser l'effets des traitements sur les tumeurs du foie et le remaniement associé du système immunitaire.

Réduction

Dans cette étude, nous utiliserons l’imagerie in vivo (échographe) similaires aux appareils utilisés chez les patients, mais adaptés à la taille de notre modèle rongeurs. Ces imageries nous permettent de suivre l’évolution des animaux, en particulier la croissance tumorale, sur plusieurs semaines et de réaliser plusieurs types de mesures, ce qui nous permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats utilisables. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé au maximum tout assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé qu'un effectif maximum de 10 animaux par groupe serait suffisant pour les expérimentations d’efficacité et 6 animaux par groupe pour les expériences de toxicité. De plus, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses post-mortem sur les tissus récupérés (foie, tumeurs, poumons, rate, sang, moelle osseuse).

Raffinement

Les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Si cela est nécessaire pour un candidat médicament, les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques générés et étudiés : 1) récapitulent l’hétérogénéité du cancer du foie chez les patients et la résistance aux traitements actuellement éployés chez les patients ; 2) permettent de tester de nouvelles thérapies. Il représente par conséquent un modèle d’une grande valeur d’un point de vue expérimental pour mieux comprendre le cancer du foie et ainsi évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie humaine. Pour étudier la formation et l'évolution de tumeurs dans le foie et des tumeurs secondaires dans le poumon, les souris seront utilisées au stade adulte. Les premières tumeurs apparaissent entre 30 ou 40 semaines en fonction du génotype de souris utilisé. Elles sont donc utilisées à partir de ces stades.

Issues de lignées génétiquement modifiées élevées sur place, avec des témoins pris dans les mêmes portées et des "surplus" que le porteur dit limiter, 18 732 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles gestantes sont infectées par gavage avec la bactérie Yersinia pseudotuberculosis, ou soumises à un régime expérimental pendant treize semaines, tandis que leur descendance reçoit des injections intrapéritonéales, des inoculations intra-rectales sous anesthésie, des gavages répétés et jusqu'à quatre injections d'un marqueur de prolifération cellulaire, avec récolte de fèces une fois par semaine pendant neuf semaines. Un cancer colorectal est induit génétiquement chez une partie d'entre elles, la mise à mort intervenant dès une perte de poids supérieure à 20 %. Le porteur écrit employer des cultures cellulaires, des organoïdes intestinaux et des approches computationnelles en complément, et conclut que "l'utilisation d'animaux vivants demeure indispensable" pour atteindre les objectifs du projet.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains événements survenant chez la mère pendant la grossesse et la lactation, comme une infection, une modification du régime alimentaire ou une réaction inflammatoire, peuvent influencer le développement de l’intestin chez la descendance et modifier, plus tard dans la vie, le risque pour la descendance de développer un cancer du côlon et du rectum. L’intestin est un organe particulièrement sensible au début de la vie, car il se construit très tôt et de nombreux éléments importants s’y mettent en place de façon progressive et coordonnée. Des études menées chez l’être humain suggèrent que des événements précoces peuvent avoir des conséquences durables sur la santé, y compris sur le risque de certaines maladies à l’âge adulte, comme le cancer du côlon et du rectum. Cependant, on comprend encore mal comment ces effets apparaissent, et en particulier quelle est l’importance respective de la grossesse et de l’allaitement dans leur apparition et leurs conséquences. Ce projet poursuivra quatre objectifs principaux : 1. Caractériser les changements durables provoqués (ou les « empreintes tissulaires » laissées) dans l’intestin de la descendance par des événements survenant chez la mère pendant la grossesse ou l’allaitement. 2. Comprendre comment ces événements modifient, au cours du développement, le fonctionnement et les interactions entre les différents types de cellules présentes dans l’intestin. 3. Vérifier si ces changements sont encore présents à l’âge adulte et déterminer à quel moment du début de la vie ils se mettent en place, pendant la grossesse ou pendant l’allaitement. 4. Étudier les conséquences de ces changements sur le bon fonctionnement de l’intestin et sur le risque de développer plus tard in cancer du côlon et du rectum. Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’environnement maternel au tout début de la vie peut laisser des effets durables sur l’intestin de la descendance. Il contribuera à identifier les périodes les plus sensibles du développement ainsi que certains facteurs liés au mode de vie ou à l’environnement sur lesquels il serait possible d’agir. À plus long terme, les résultats pourraient contribuer à mettre en place des actions de prévention dès les premières étapes de la vie et à mieux comprendre pourquoi les cancers du côlon et du rectum semblent devenir plus fréquents chez les jeunes adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet générera des connaissances fondamentales sur la manière dont l’environnement au tout début de la vie peut influencer durablement la fonctionnalité des différents types de cellules présentes dans l’intestin. Il permettra d’identifier à quels moments précoces l’exposition à certains facteurs environnementaux de la mère enceinte ou du jeune enfant peut modifier, de façon durable, le développement normal de l’intestin et sa susceptibilité aux maladies au cours de la vie. En déterminant quand et sur quelles cellules les expositions maternelles, notamment inflammatoires, infectieuses et nutritionnelles, agissent sur le tissu intestinal au cours du développement, ce projet permettra d’identifier les fenêtres critiques au cours desquelles la susceptibilité au cancer colorectal est établie. Il précisera si ces effets résultent principalement de mécanismes mis en place pendant la grossesse ou de processus postnataux mis en place durant la lactation. De plus, ce projet évaluera si certaines altérations précoces peuvent être modulées, une question importante pour la biologie du développement et la prévention des maladies. Les bénéfices scientifiques attendus sont multiples : - mieux comprendre comment l’exposition précoce au cours de la vie à des facteurs environnementaux influence durablement le développement et le fonctionnement des cellules de l’intestin ; - identifier les périodes de la vie (prénatales ou postnatales) pendant lesquels les cellules de l’intestin sont le plus sensible à ces influences ; - améliorer les connaissances sur les origines précoces de certaines maladies intestinales, en particulier sur la compréhension du risque de cancer colorectal, envisagé non plus uniquement comme une maladie d’apparition tardive, mais potentiellement comme un processus influencé dès le développement durant la grossesse. Ce projet aura également des retombées biomédicales importantes en contribuant à expliquer pourquoi le risque de cancer colorectal varie selon les individus et pourquoi l’incidence de cette maladie semble augmenter chez les adultes de plus en plus jeunes. Les connaissances acquises fourniront des bases scientifiques pour identifier des facteurs de risque évitables et orienter, à terme, des stratégies de prévention ciblées dès les premières étapes de la vie.

Procédures

- Injection intrapéritonéale (dans la cavité abdominale) unique d’hormone: souris vigiles, quelques secondes. - Inoculation orale unique par gavage de bactérie: souris vigiles, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale unique d’une molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes. - Inoculation intra-rectale unique d’un dérivé d’une molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris anesthésiées, 1 min. - Injection intraveineuse unique de différentes molécules messagères de l’immunité : souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale d’une molécule outil de choix pour étudier la prolifération cellulaire: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 4 injections espacées de 24 heures. - Traitement avec une molécule outil de choix pour étudier la prolifération cellulaire dans l’eau de boisson : souris vigiles, pendant 7 jours maximum. - Prélèvement sanguin: souris vigiles, quelques secondes, 2 prélèvements espacés de 48 heures. - Injection intrapéritonéale de molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 3 injections espacées de 48 heures maximum. - Inoculation orale par gavage de molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 3 inoculations espacées de 48 heures maximum. - Récolte de fèces frais : souris vigiles, 5-10 minutes, répétée au minimum une fois par semaine pendant 9 semaines maximum. - Administration ad libitum d’un régime alimentaire expérimental ou contrôle : souris vigiles, pendant 13 semaines maximum. - Prélèvement sanguin terminal: souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Ce projet sera attentif aux 5 libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines procédures décrites dans ce projet peuvent induire divers effets indésirables, dont l’intensité et la durée dépendent de la nature de l’intervention. De manière générale, les effets les plus fréquemment observés sont une douleur et/ou un inconfort de courte durée liée aux différentes administrations (gavage, injections intrapéritonéales, intra-rectales ou intraveineuses), ainsi qu’aux prélèvements sanguins et à la collecte de fèces. L’infection intestinale des souris gestantes par la bactérie Yersinia pseudotuberculosis n’entraîne pas de signes cliniques majeurs (tels que léthargie, prostration, poil hérissé ou déshydratation), ni de mortalité. Elle peut toutefois induire une diminution modérée et transitoire du gain pondéral entre les jours 5 et 8 post-infection, avec un retour à la normale à partir du jour 11. L’infection reste localisée au tractus intestinal, sans dissémination systémique à d’autres organes, et est spontanément résolue avec une élimination bactérienne dans les fèces vers le jour 7 post-infection. Aucun passage transplacentaire n’est observé. Par conséquent, la taille des portées ainsi que la viabilité des nouveau-nés ne sont pas affectées. Le développement du cancer colorectal sera induit génétiquement par l’administration d’une substance chez des souris transgéniques. Cette procédure est susceptible d’entraîner des effets indésirables transitoires, notamment liés à l’administration d’une substance (altération temporaire de l’état général, perte de poids modérée) ainsi qu’aux premières étapes de l’induction tumorale. Toutefois, les analyses expérimentales seront réalisées à des stades précoces du développement tumoral, avant l’apparition d’une charge tumorale importante ou de signes cliniques marqués, limitant ainsi l’impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

Toutes les procédures expérimentales nécessitent l’analyse de cellules présentes dans le tissu intestinal. La seule façon d’effectuer ces analyses est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Les objectifs scientifiques de ce projet impliquent l’étude conjointe des systèmes immunitaire et épithélial intestinaux dans leur contexte physiologique et développemental intact. Les interactions systémiques complexes intervenant au cours de la vie prénatale et postnatale précoce – notamment les échanges mère-fœtus, la colonisation par le microbiote et la maturation progressive du système immunitaire – ne peuvent être reproduites de manière fiable par des approches alternatives. Des méthodes substitutives seront néanmoins mises en œuvre chaque fois que possible. Des cultures cellulaires, des organoïdes intestinaux et des approches computationnelles seront utilisées en complément afin d’explorer certains mécanismes moléculaires et de limiter le recours aux animaux. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’étudier de façon intégrée le dialogue entre cellules épithéliales et immunitaires in vivo, ni d’évaluer l’impact à long terme d’expositions précoces sur l’homéostasie intestinale et la susceptibilité au cancer colorectal. En l’état actuel des technologies disponibles, l’utilisation d’animaux vivants demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé à partir d’analyses de puissance statistiques basées sur des jeux de donnée antérieures et sur des études comparables, afin de garantir l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats valides et fiables. Les effectifs ont été estimés pour permettre la comparaison de plusieurs groupes expérimentaux à l’aide de tests statistiques appropriés, Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin d’optimiser l’utilisation de chaque cohorte. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes témoins seront mutualisés entre différents objectifs et procédures, chaque fois que possible. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque cohorte et le nombre de répétitions de chaque expérience sont décrits et justifiés en détails pour chaque procédure expérimentale décrite dans ce projet. Des études pilotes préalables permettront d’affiner les conditions expérimentales (par exemple pour la modification des régimes alimentaires) et de limiter le risque d’échec lors des expérimentations à plus grandes échelles. Les lignées de souris génétiquement modifiées seront élevées de manière à limiter les surplus, et des animaux contrôles issus de la même portée seront utilisés afin d’optimiser les données recueillies pour chaque cohorte. Toutes les expériences seront réalisées avec un nombre suffisant de réplicats biologiques pour tenir compte de la variabilité, tout en évitant toute répétition inutile.

Raffinement

Les modifications du régime alimentaire seront réalisées au moyen d’aliments purifiés spécialement formulés et nutritionnellement définis, administrés ad libitum aux animaux sans procédure invasive. Pour les manipulations répétées (prélèvements sanguins, injections), des méthodes peu invasives seront privilégiées et les sites d’injection ou de prélèvement seront alternés afin de limiter les irritations locales. Les modèles expérimentaux de cancer colorectal utilisés sont conçus pour étudier les phases précoces de l’initiation tumorale, en réduisant au maximum la durée d’exposition et la charge tumorale. Les protocoles d’induction seront optimisés pour permettre l’analyse des mécanismes précoces de dysrégulation des cellules souches dans des délais compatibles avec les objectifs scientifiques. Les expérimentations seront interrompues dès l’atteinte de points limites prédéfinis, sans laisser évoluer les animaux vers des stades avancés de la maladie. Un suivi clinique régulier sera assuré (état général, activité, comportement, poids) avec une surveillance renforcée en période de gestation, de lactation, et après infection ou induction du cancer colorectal. En cas de besoin, des mesures de raffinement supplémentaires seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Celles-ci incluront notamment la mise à disposition d’une litière douce, d’éléments supplémentaires pour l’enrichissement du milieu (éléments à ronger par exemple), le maintien de conditions thermiques appropriées (avec apport de chaleur si nécessaire grâce à des chaufferettes placées sous la cage, en particulier pour les animaux fragilisés ou les nouveau-nés), ainsi que l’administration de supports nutritionnels adaptés (gel nutritif). Une attention particulière sera également portée aux portées, incluant la sélection de femelles présentant de bonnes aptitudes maternelles et, si nécessaire, la mise en place d’adoptions croisées afin d’assurer la survie et le bon développement des nouveau-nés. Des points limites précis, spécifiques et précoces pour chaque protocole expérimental seront établis : tout animal présentant des signes de détresse ou de douleur persistante (léthargie, piloérection, perte de poids supérieure à 20%) sera mis à mort immédiatement selon les procédures appropriées.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement pertinent pour étudier l’impact d’expositions précoces au cours de la vie sur la susceptibilité au cancer colorectal à l’âge adulte. Son développement prénatal et postnatal, ainsi que l’organisation de son système immunitaire et de son épithélium intestinal, présentent des similarités importantes avec ceux de l’être humain. De plus, la gestation courte et la maturation rapide permettent d’explorer efficacement les effets d’expositions survenues pendant la vie fœtale ou l’allaitement et d’en évaluer les conséquences à long terme. De nombreux modèles murins de cancer colorectal sont bien caractérisés et reproduisent les étapes précoces de l’initiation tumorale. Une large gamme de lignées de souris génétiquement modifiées est disponible pour étudier finement les mécanismes impliqués. La petite taille des souris facilite également la constitution de cohortes expérimentales de taille appropriée tout en limitant l’impact sur le bien-être animal, comparativement à des espèces de plus grande taille. Les souris seront utilisées entre 2 et 12 semaines de vie. Les points temporels précoces (avant sevrage à 3 semaines) sont essentiels pour analyser comment le régime alimentaire maternel, l’inflammation et l’exposition au microbiote programment les cellules immunitaires et la niche des cellules souches intestinales durant cette fenêtre critique du développement gastro-intestinal. L’étude au stade adulte (à partir de 6-7 semaines de vie) est nécessaire pour déterminer si ces programmations précoces persistent à l’âge adulte et influencent l’homéostasie intestinale ainsi que la susceptibilité au cancer colorectal. L’étude de ces différentes fenêtres développementales permettra d’identifier le moment où survient l’empreinte au niveau de l’intestin et d’évaluer si une programmation inadaptée établie précocement peut être modifiée ultérieurement au cours de la vie.

Les expérimentateurs chauffent rapidement l'eau des bacs jusqu'à ce que les poissons perdent l'équilibre. Trois espèces sont concernées, 342 vairons, gardons et gobies à taches noires juvéniles, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit un stress thermique aigu, accélération respiratoire, agitation, fatigue importante et perte d'équilibre, reconnaît un risque de non-récupération ou de mortalité malgré l'arrêt immédiat du test, et présente par ailleurs les aquariums de stabulation de deux cents litres, avec rochers, plantes et cachettes, comme un "environnement non stressant". Ils sont ensuite tués pour des analyses physiologiques de leurs tissus.

Objectifs

Le changement climatique entraîne une augmentation de la fréquence et de l’intensité des vagues de chaleur. Les conséquences de ces épisodes extrêmes sur les écosystèmes aquatiques restent encore mal connues. Ce projet vise à comprendre comment des vagues de chaleur affectent les organismes vivant dans les lacs, depuis les algues microscopiques et petits invertébrés jusqu’aux poissons. Une attention particulière sera portée à trois espèces de poissons d’eau douce : le vairon, le gardon, et le gobie à taches noires. Le vairon est un petit poisson très répandu et souvent utilisé pour étudier l’impact des changements de l’environnement. Le gobie à taches noires est une espèce envahissante dont il est important de comprendre la capacité à s’adapter au réchauffement. Le gardon est une espèce très commune qui joue un rôle important dans les écosystèmes aquatiques. Étudier ces trois espèces permettra de mieux comprendre comment différents poissons réagissent à l’augmentation de la température de l’eau.Les poissons seront maintenus soit en laboratoire, soit dans des mésocosmes (bassines extérieures reproduisant un mini-lac). Ils seront ensuite exposés à une augmentation progressive de la température afin de déterminer leur limite de tolérance thermique. L’objectif est de savoir si la capacité d’un individu à résister à la chaleur permet de prédire la survie des espèces et le fonctionnement global de l’écosystème lors d’une vague de chaleur. Les résultats permettront de mieux comprendre la vulnérabilité des espèces aquatiques face au réchauffement climatique et d’améliorer les outils permettant d’anticiper les effets futurs du changement climatique sur la biodiversité.

Bénéfices attendus

Habituellement, la mesure de tolérance thermique est réalisée sur des individus isolés, en laboratoire. Ici, elle sera également étudiée dans un écosystème complet intégrant plusieurs niveaux de la chaîne alimentaire. Cette approche est importante car la présence d’autres espèces et les interactions naturelles peuvent modifier la tolérance réelle à la chaleur et conduire à des résultats différents de ceux obtenus en conditions simplifiées.

Procédures

Les poissons seront marqués individuellement pour pouvoir suivre leur comportement. 16h avant la mesure de tolérance (c.-à-d. la veille), les poissons seront mis à jeun car la digestion peut influencer la mesure de tolérance. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances susceptibles d’être observées sont le stress lié à la capture, au transport, et aux manipulations (incluant le marquage des individus). Lors des tests de tolérance à la chaleur, les poissons peuvent présenter un stress thermique aigu se traduisant par une augmentation du rythme respiratoire, une agitation, une fatigue importante et une perte d’équilibre. Un risque limité de non-récupération ou de mortalité existe malgré l’arrêt immédiat du test dès l’apparition des points limites définis.

Devenir

Les individus seront euthanasiés afin de réaliser des analyses physiologique de leur tissus.

Remplacement

L’écologie a pour objet l’étude de la dynamique des peuplements et des écosystèmes. Les recherches en écologie nécessitent donc d’intégrer des niveaux d’organisation du vivant allant jusqu’à l’écosystèmes. Ainsi, il n’est pas possible de substituer des tissus ou des cellules à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des trois R : remplacement) étant donné qu’il s’agit ici d’étudier la réponse physiologique de poissons. Nous avons choisi d’utiliser les poissons car ils sont souvent les tops prédateurs dans les écosystèmes aquatiques. Utiliser un modèle vertébré (le poisson) est pertinent dans ce contexte car il s’ajoute au modèle invertébré, déjà présent dans cette expérimentation.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés est déterminé de manière à obtenir des résultats fiables, tout en limitant le nombre d’animaux. D’après la littérature scientifique, la température maximale supportée par le vairon est estimée autour de 32°C, celle du gardon autour de 35,8°C et celle du gobie à taches noires autour de 35°C également. Ces estimations permettent d’anticiper les seuils critiques lors des tests. Deux opérateurs assureront une surveillance continue pendant l’augmentation de la température. Dès qu’un poisson montre qu’il atteint sa limite de tolérance (perte d’équilibre), il est immédiatement retiré et placé dans un bac à température adaptée pour favoriser sa récupération. L’augmentation de la température sera organisée de façon progressive et décalée entre les différents bassins afin d’éviter que tous les poissons atteignent leur limite thermique en même temps.

Raffinement

Les aquariums où les poissons sont maintenus avant les expériences contiendront des rochers, des plantes et des cachettes afin de leur offrir un environnement non stressant. Leur grand volume (200 litres) permet aux poissons de s’isoler et d’avoir des comportements naturels. Les aquariums utilisés pour les tests seront plus petits et simples afin d’observer clairement les réactions des poissons. Trois côtés seront opaques pour réduire les stimulations visuelles liée aux déplacements de l’observateur, accompagné d’un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront bien oxygénés et alimentés avec une eau identique à celle des aquariums de stabulation. La température et la qualité de l’eau seront contrôlées régulièrement. Les poissons seront manipulés avec précaution : capturés un par un, placés brièvement dans un petit bac sombre pour les transferts (environ 30 secondes), et maintenus par deux afin de limiter l’isolement. L’éclairage des pièces sera tamisé pour réduire le stress. Des critères d’arrêt précis (points limites) sont définis afin d’interrompre immédiatement l’expérience en cas de signe de souffrance.

Choix des espèces

Le vairon, le gardon et le gobie à taches noires ont été choisis pour leurs caractéristiques écologiques complémentaires et leur pertinence pour l’étude des réponses aux stress thermiques. Le vairon est une espèce d’eau douce couramment utilisée en toxicologie, sensible aux variations environnementales et bien adapté à la manipulation expérimentale, ce qui permet de relier des mesures physiologiques en laboratoire à des réponses observables en mésocosmes. Le gobie à taches noires est une espèce exotique envahissante à fort impact écologique, dont l’étude de la tolérance thermique permet de mieux comprendre son potentiel de persistance dans un contexte de réchauffement climatique. Finalement, le gardon est une espèce généralise et très abondantes dans les écosystèmes aquatiques. Il est plus tolérant que le vairon. Seuls des individus juvéniles seront utilisés afin de s’affranchir des effets liés à la reproduction et d’attribuer les variations observées uniquement aux traitements thermiques.

Comprendre le rôle d'une protéine de stress dans l'inflammation du foie conduit à utiliser 1 260 souris génétiquement modifiées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur ce total, 756 reçoivent une injection unique de cinq secondes, et les 504 autres une injection par jour pendant quatre jours. Le porteur annonce une gêne abdominale transitoire et une réaction de type état grippal, avec baisse d'activité et diminution de l'appétit, et prévoit la mise à mort des souris chez lesquelles ces signes persistent. Leur foie et leurs macrophages péritonéaux sont prélevés après la mise à mort, et l'effectif de 1 260 est présenté comme issu d'une "méthode mathématique reconnue" que le porteur ne nomme pas.

Objectifs

La maladie du foie gras touche de plus en plus de personnes et peut évoluer vers une inflammation chronique du foie, une fibrose et un cancer du foie. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine présente en grande quantité dans le foie des personnes atteintes par cette maladie métabolique, et impliquée dans la manière dont les cellules du foie réagissent lorsqu’elles sont soumises à des situations de stress, comme l’accumulation excessive de graisses. Pour mieux comprendre son rôle, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin d’étudier comment cette protéine influence l’accumulation de graisses et l’inflammation dans le foie, en particulier dans les cellules immunitaires. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de déterminer si cette protéine peut être un candidat important comme future cible thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à l’accumulation de graisses et à l’inflammation dans le foie. Les résultats pourront contribuer au développement de nouvelles stratégies pour prévenir, ralentir ou inverser la progression de la maladie du foie gras et de ses complications.

Procédures

Une injection unique (environ 5 secondes) sera réalisée sur 756 animaux. Quatre injections consécutives (une injection par jour pendant 4 jours, environ 5 secondes par injection) seront réalisées sur 504 animaux.

Impact sur les animaux

Les modèles utilisés chez la souris peuvent entraîner un léger inconfort lié aux injections (réalisées en quelques secondes), une gêne abdominale transitoire ainsi qu’une réaction temporaire de type état grippal pouvant se traduire par une baisse d’activité, une diminution de l’appétit et un comportement plus calme. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter ces signes le plus tôt possible. Des seuils d’alerte ont été définis pour permettre une prise en charge rapide et éviter toute souffrance prolongée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs tissus : le foie pour étudier l’inflammation, le métabolisme et certains mécanismes de mort cellulaire, et les macrophages péritonéaux pour analyser leur fonctionnement.

Remplacement

Avant de recourir aux animaux, des expériences sont réalisées sur des cellules cultivées en laboratoire afin d’étudier certains mécanismes impliqués dans l’inflammation et le fonctionnement du foie. Ces méthodes sont utilisées chaque fois qu’elles permettent de répondre aux objectifs scientifiques et de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes. Cependant, les interactions entre le foie, le système immunitaire et le reste de l’organisme sont très complexes et ne peuvent pas être reproduites avec des cellules cultivées seules. Pour les étudier correctement, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain.»

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été déterminé à l'aide d'une méthode mathématique reconnue permettant de calculer le plus petit effectif nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. Chaque animal permettra de recueillir plusieurs types d'informations à partir des mêmes prélèvements, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Les expériences seront réalisées par étapes : certaines ne seront engagées que si les résultats des précédentes le justifient. Cette stratégie permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés tout en répondant aux objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour cette étude car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain. De nombreux outils génétiques et moléculaires ont été développés chez la souris, permettant de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses maladies. Les expériences seront réalisées sur des souris dont les principaux systèmes étudiés, notamment le foie et le système immunitaire, ont atteint une maturité fonctionnelle et un fonctionnement stable, afin d’obtenir des résultats fiables et représentatifs des mécanismes biologiques étudiés.

6 300 animaux non-humains vont être utilisés, 2 100 souris, 2 100 rats et 2 100 lapins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des instillations oculaires répétées plusieurs fois par jour, maintenus immobiles à chaque application, puis subissent des examens de la sensibilité cornéenne à l'esthésiomètre de Cochet-Bonnet, des mesures de la fente palpébrale à la règle et des observations comportementales que le porteur ne détaille pas. Provoquer chez eux un inconfort et une douleur oculaires, rougeurs et irritations comprises, est l'objet même du projet, qui vise ensuite à évaluer des traitements candidats. Environ 90 % sont tués pour des analyses histologiques de la rétine, de la choroïde et de la sclère, les 630 autres, écartés avant l'induction ou en cours de protocole, pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur affirme mener ces inductions dans le "strict respect des principes du bien-être animal".

Objectifs

L’objectif du projet est de développer et de mettre en œuvre, dans le strict respect des principes du bien‑être animal, des modèles expérimentaux induisant un inconfort léger à modéré chez l’animal. Ces modèles ont pour finalité de mieux comprendre les mécanismes de l’inconfort oculaire et de permettre l’identification, la caractérisation et l’évaluation de traitements candidats susceptibles de le prévenir ou de le réduire. L’ensemble des procédures est conçu de manière à minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par le recours à des méthodes non invasives, des durées d’exposition limitées et une surveillance régulière des paramètres de bien‑être. Les modèles expérimentaux utilisés représentent un compromis nécessaire entre la pertinence scientifique et l’application rigoureuse des principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de garantir une utilisation responsable et éthique des animaux à des fins de recherche biomédicale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet résident dans l’identification, la caractérisation et la sélection de nouveaux traitements susceptibles d’améliorer la prise en charge clinique de l’inconfort et de la douleur oculaires. Les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, visant à soulager les patients présentant des affections oculaires associées à une altération du confort visuel et du bien‑être. À terme, ce projet pourrait ainsi participer à l’amélioration de la qualité de vie des patients, en favorisant l’accès à des options thérapeutiques innovantes et mieux adaptées aux besoins cliniques, tout en répondant aux exigences actuelles de sécurité, d’efficacité et de tolérance.

Procédures

Tous les animaux recevront des instillations oculaires conformément au protocole expérimental. Ils seront maintenus immobile pendant quelques secondes pour permettre l'application topique. Ces administrations sont répétées plusieurs fois par jour et étalées sur un ou plusieurs jours selon la procédure choisie. Les examens réalisés dans le cadre des évaluations sont non invasifs et ne durent que quelques minutes. Ils reposent principalement sur des observations comportementales, sur l’évaluation de la sensibilité cornéenne à l’aide d’un esthésiomètre de Cochet‑Bonnet, la mesure de la fente palpébrale avec une règle et l'apparence de la surface oculaire. Ces examens, conçus pour limiter au maximum toute gêne ou contrainte pour l’animal, peuvent être répétés plusieurs fois au cours de la même journée en fonction du plan expérimental, sans impact significatif sur le bien‑être animal, il dure chacun quelques secondes à quelques minutes. L'animal est alors maintenu afin qu'il reste immobile pour permettre l'évaluation. L'ensemble de ces interventions seront étalées sur une journée.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver des traitements à la douleur ou à l'inconfort oculaire. Les animaux vont sur une courte période ressentir un inconfort ou une douleur modérée. Des rougeurs et des irritations ponctuelles et réversibles pourront aussi apparaitre.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux ayant suivi la totalité du protocole pourront être euthanasiés de manière éthique et conforme à la réglementation, afin de permettre les analyses ex vivo nécessaires. Ces analyses pourront comprendre notamment : des études histologiques des structures oculaires (rétine, choroïde, sclère), des dosages biochimiques ou moléculaires, ainsi que des évaluations morphologiques complémentaires indispensables à la validation scientifique des résultats. En revanche, les animaux non inclus dans l’intégralité de la procédure, estimés à environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d’un point limite), pourront être réutilisés dans d’autres protocoles compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Il en va de même pour les animaux retirés avant l’induction pour une anomalie anatomique ou physiologique, un défaut oculaire préexistant. Ces individus n’auront subi ni induction, ni administration de traitement expérimental. Ils n’auront été exposés qu’à des examens non invalidants, sans conséquences durables. Dans ces conditions, leur réutilisation éventuelle s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une réduction du nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant la protection du bien‑être animal et le respect des exigences scientifiques du projet.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, constitué de structures anatomiques et physiologiques étroitement interconnectées (cornée, cristallin, rétine, choroïde, sclère, nerf optique), jouant un rôle central dans la perception sensorielle et la réponse aux stimuli irritatifs ou nociceptifs. Le maintien du confort oculaire repose sur des équilibres mécaniques, physicochimiques et biologiques précis, ainsi que sur une innervation et une vascularisation fonctionnelles. Toute perturbation de ces équilibres peut conduire à l’apparition d’inconfort ou de douleur oculaires. Bien que des approches alternatives telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico aient progressé ces dernières années, elles demeurent insuffisantes pour reproduire l’ensemble des interactions structurelles, fonctionnelles et pharmacocinétiques impliquées dans la genèse et la modulation de l’inconfort et de la douleur au sein d’un œil vivant. Ces modèles ne permettent notamment pas de simuler de manière fiable les réponses tridimensionnelles des tissus oculaires, l’intégration des signaux sensoriels et nociceptifs, ni les réponses cliniques et comportementales associées. Dans ce contexte, l’étude in vivo reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Elle permet d’observer de manière intégrée et dynamique les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’apparition de l’inconfort et de la douleur oculaires, d’évaluer l’efficacité et la tolérance de traitements administrés par voie oculaire ou systémique, et d’étudier leurs effets à court et à long terme sur les différents tissus oculaires au sein d’un environnement physiologique complet, intégrant innervation, vascularisation et régulations neurosensorielles.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilités. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8-12 semaines, ces âges correspondent à la maturité visuelle.

Tous tués en fin de projet parce qu'ils sont génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, 1 920 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour produire des lignées mutantes croisées avec des lignées fluorescentes dont d'autres travaux se serviront ensuite pour étudier la cicatrisation de la peau. Une minorité subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour l'identification génétique, ce qui suppose un isolement pouvant durer jusqu'à dix jours. Ces poissons sociaux peuvent alors s'immobiliser comme s'ils dormaient profondément ou changer de couleur sous l'effet du stress, et une partie des lignées développe à partir de six mois une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. Le porteur justifie le choix du poisson zèbre par ses capacités de réparation de la peau, du cœur ou de la queue et par la transparence de ses embryons, et décrit cet élevage de mutants comme un outil "puissant et indispensable".

Objectifs

Cette demande d'autorisation concerne la création de poissons zèbres génétiquement modifiés. Une meilleure réparation de la peau après blessure est une préoccupation majeure chez l'homme. Ainsi, dans la plupart des cas, après blessure, la surface de la peau se répare bien, au contraire de la partie inférieure de la peau. Il y a alors souvent formation d'une cicatrice qui peut être associée ou non à une perte de fonctions. Le poisson zèbre, lui, est un modèle de choix pour étudier la cicatrisation, car il présente des capacités étonnantes de réparation de sa peau mais aussi de plusieurs de ses organes (le cœur ou le cerveau par exemple). Pour autant, on ne sait pas précisément comment le poisson zèbre arrive à réparer aussi bien sa peau après blessure. L'objectif de notre projet est d'étudier la cicatrisation du poisson zèbre. Cette demande d'autorisation concerne plus particulièrement la nécessité, pour le projet, d'élever des poissons mutants. Ces mutations ciblent différents acteurs de la cicatrisation. Les poissons mutants seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise à disposition de poissons qui pourront être utilisés pour l'étude de la cicatrisation cutanée. Ces poissons mutants ciblent différents acteurs de la cicatrisation de la peau et seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple). A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de cicatrisation cutanée pourrait être précieuse en médecine humaine. L'épiderme conserve une grande capacité de réparation chez l’homme tandis que la réparation de la couche dermique profonde entraîne, dans la majorité des cas, la formation d'une cicatrice qui peut être associée à une perte substantielle de sa structure, de ses propriétés mécaniques et de sa fonction d'origine. Faciliter et améliorer la cicatrisation cutanée et minimiser l'impact esthétique sur le patient en améliorant la restauration de l'épiderme mais surtout du derme restent donc des préoccupations majeures pour garantir une bonne réparation des tissus et améliorer le bien-être des patients.

Procédures

Certains poissons seront soumis à une unique biopsie d'un fragment de nageoire réalisée sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Pour certains poissons, à partir de 6 mois, les signes à surveiller sont l'apparition d'une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. De plus, pour connaître l'identité génétique des poissons, il est nécessaire de prélever un petit bout de sa nageoire caudale, ce qui peut causer du stress chez le poisson, étant donné qu’il faut le capturer et le manipuler. Enfin, par nature, les poissons-zèbres sont des animaux sociaux qui ont besoin d’interaction avec leurs congénères afin de vivre au mieux durant les périodes de repos et d’activités. Les poissons zèbres placés en isolement lors de la période d'identification peuvent donc développer des comportements anormaux comme une apparence de sommeil profond, ou encore un changement de couleur dû au stress. La période d'isolement ne dure pas plus de 10 jours et est communément bien plus courte mais les délais d'obtention des cartes d'identité génétique peuvent nécessiter un isolement jusqu'à 10 jours maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet. Les animaux étant tous génétiquement modifiés, on ne peut donc pas les faire adopter en fin de procédure.

Remplacement

Le processus de réparation de la peau intervient dans un environnement complexe qu'il n'est pas possible de reproduire entièrement in vitro. Par exemple, le recrutement des cellules de défense de l'organisme est un paramètre important. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour ce projet.

Réduction

La capacité de fécondation externe des poissons zèbres permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. La sélection des poissons fluorescents (au stade embryonnaire) permet de n'élever et ne conserver que les poissons intéressants. Une minorité de poissons élevés pendant les 2 ans subira le prélèvement nécessaire pour établir son identité génétique. Le nombre de poissons nécessaires a été optimisé afin d'assurer la pérennité de chaque lignée.

Raffinement

Les poissons génétiquement modifiés susceptibles de développer des symptômes seront suivis avec une fréquence rapprochée, en portant une attention particulière aux signes préoces connus pour cette lignée. Des points limites adaptés à la procédure et suffisamment prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être et souffrance des animaux. Les accouplements sont réalisés sur des paillasses recouvertes de photographies de flore aquatique afin de limiter le stress le plus possible. La réalisation des prélèvements de l’extrémité de la nageoire caudale (située à l'extrémité du tronc du poisson) sera effectuée sous anesthésie générale. Lors des périodes d'isolement, les animaux seront placés par 2 dans un bac avec un séparateur au milieu afin qu'il y ait échange hormonal et que les poissons isolés puissent tout de même voir et sentir leur congénère. De plus, lors de cet isolement les poissons bénéficieront de nourriture vivante (artémia).

Choix des espèces

Les outils génétiques disponibles chez le poisson zèbre peuvent aider à identifier le rôle des acteurs impliqués dans la réparation parfaite de la peau après blessure et de les suivre en temps réel . Ce projet d'élevage et de création de mutant va ainsi constituer un outil puissant et indispensable pour permettre ensuite de comprendre le rôle de ces acteurs. Le poisson zèbre est un modèle de choix pour étudier la réparation parfaite de ses organes chez les vertébrés car il montre des capacités de réparation étonnantes comme celle du cœur ou encore de sa queue. D'autres avantages comme le développement externe et rapide des embryons, leur transparence ainsi que celle des jeunes alevins et leur traçabilité génétique en font pourtant un modèle idéal pour l'imagerie de la dynamique de la cicatrisation. Dans nos conditions d’élevage, les poissons adultes atteignent leur maturité sexuelle à 6 mois et sont donc utilisés comme reproducteurs entre 6 et 12 mois pour produire les géniteurs de la génération suivante. L'identification génétique par biopsie d'un fragment de nageoire est réalisée sur des poissons de 3 à 5 mois car la distinction entre mâles et femelles ne peut pas être détectée plus tôt (pas de chromosome sexuel). Aussi nous pouvons préserver un bon ratio mâle-femelle dans nos élevages.