Procédures légères

7 200 souris vont être utilisées dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère, réparties en groupes de six et toutes tuées, chacune pouvant subir dix microprélèvements de sang, deux prélèvements par voie rétro-orbitaire et un prélèvement terminal dans le cœur. Certaines passent jusqu'à quatre-vingt-seize heures seules en cage à métabolisme, ce que le porteur classe lui-même comme un stress modéré. Les molécules qu'elles reçoivent sont marquées par un radioélément pour suivre leur distribution dans les organes, à la demande des conseils scientifiques d'entreprises clientes. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'est envisagé, seules une moyenne et un écart-type étant calculés par groupe de six, ce qui laisse l'effectif de 7 200 animaux sans justification chiffrée.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un radioélément non toxique aux doses utilisées, la radioactivité de ces radioéléments pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements et donc cette radioactivité permet de suivre le candidat médicament dans les prélèvements effectués. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour objectif l’étude pharmacologique d'une sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un radioélément radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus et fluides biologiques d’intérêt. Les candidats médicaments ont été testées au préalable chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (organes cibles et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (3 fois/semaine, 20 s) ; Administration de composés comprenant anesthésie et analgésie (maximum 3 fois, 15 s) ; prélèvements de sang par microsampling (10 fois maximum, 1 min) Sur animal anesthésié : Administration de composé (maximum 1 fois, 15 s) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (2 fois maximum , 30 sec) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; hébergement individuel en cage à métabolisme pour un seul groupe soit 6 animaux max (1 fois sur 96 heures maximum)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intra péritonéale, intramusculaire ou intraveineuse ; stress et douleur légère liés au prélèvement sanguin par microsampling ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; stress modéré lors du placement en cage à métabolisme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Les molécules testes de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité in vitro et/ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Les groupes d'animaux utilisés sont en théorie de 6 animaux maximum par groupe car la méthode de quantification par mesure radioactive est très précise et répétable. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux. Néanmoins, dans certains cas et lorsque c’est possible, ce nombre pourra être diminué.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Transférés d'une cage à l'autre pour être confrontés à des congénères inconnus, douze porcelets subissent un stress social provoqué délibérément, dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère. Ils arrivent sevrés à vingt-huit jours, pèsent six à huit kilos, et subissent deux prélèvements de sang à la veine jugulaire ainsi qu'une série de prélèvements de salive par écouvillon, jusqu'à quarante-huit heures après le mélange. Le porteur mentionne les blessures dues aux griffures pendant les affrontements entre animaux dominants, et présente le projet comme un moyen de valider la salive comme méthode non invasive d'évaluation du bien-être des porcs en élevage. Six porcelets sont tués à l'issue pour constituer une banque d'organes destinée à des méthodes in vitro, les six autres étant placés.

Objectifs

Dans les élevages et les unités expérimentales, les problèmes de bien-être animal et les réactions de stress résultent d’un certain nombre de stimuli environnementaux, notamment les conditions d’alimentation et de logement, l’environnement social mais aussi les pratiques de gestion courantes. La capacité des animaux à faire face à de tels défis et leur vitesse de récupération ont un impact sur leur bien-être et in-fine sur leur santé. En raison des causes multiples qui peuvent conduire à un état de stress et des différents systèmes physiologiques impliqués dans la réponse au stress, divers biomarqueurs peuvent être utilisés pour l'évaluation du stress. Il se traduit par la libération d'hormones, dont le cortisol communément utilisé comme marqueur de stress, ou d'autres moélcules utilisées comme marqueurs de réduction des émotions positives. Le prélèvement sanguin, pratique stressante et douloureuse pour l’animal, est paradoxalement utilisé pour l’évaluation du stress. Or, il a été rapporté que la salive des porcs peut être utilisée pour mesurer des biomarqueurs qui peuvent aider à évaluer précocement le stress et donc fournir des informations sur leur bien-être et potentiellement sur leur état de santé. L'utilisation de la salive présente de nombreux avantages puisqu’elle peut être obtenue de manière non invasive, sans provoquer de douleur chez l’animal. Le cortisol salivaire est très utilisé comme indicateur de réaction de stress chez de nombreuses espèces y compris chez les porcs après divers stimuli tel que le stress social. Néanmoins, il a été montré que la réaction au stress diffère en fonction des situations rencontrées par les porcs dans les élevages commerciaux ou les unités expérimentales. De plus, pour la plupart des biomarqueurs de stress connus, peu de données issues d’études sur la salive sont disponibles. Il est donc pour le moment difficile d’optimiser leur utilisation et d’interpréter leur présence et leur modulation pour définir la salive comme matrice efficace d’évaluation du stress chez le porcelet. L’objectif de ce projet est d’établir, tout d’abord, un modèle de stress reproductible chez le porcelet qui servira à développer des solutions innovantes de réduction de ce stress. Ensuite, d’utiliser le prélèvement de salive comme méthode non invasive afin d’évaluer la réaction au stress appliqué en y détectant les biomarqueurs spécifiques de ces conditions de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider 1) le mélange des animaux comme modèle pour étudier la réaction au changement d’environnement social (stress), 2) l’utilisation de la salive comme méthode non invasive pour évaluer le bien-être et la santé des porcelets. Ce projet permettra d’identifier les biomarqueurs spécifiques d’une réaction de stress et de générer plus de données et de connaissances sur les biomarqueurs de la salive afin d'optimiser leur interprétation et leur application. La génération de ces données aidera à l'avenir à mieux définir les possibilités de la salive dans l’évaluation du stress en élevage.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 15 jours (13 jours d'adaptation et 2 jours de stress de mélange). Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels. Un animal d’un même groupe sera transféré d’une cage à une autre (manipulation du l'animal inférieure à 1 minute) afin de créer un stress social et mimer les traits de vie des porcs qui en condition d’élevage subissent des regroupements avec des congénères non familiers à différents moments de leur cycle de production. Le mélange aura lieu une fois de J13 à J15. Les animaux seront soumis à 2 prélèvements sanguins à J11 et à J15 au niveau de la veine jugulaire avec une période de récupération de 4 jours entre les prélèvements. A chaque temps de prélèvement, un volume de sang de 2 ml de sang nécessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguin sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute. Des prélèvements de salive seront réalisés à l’aide d’écouvillons en mousse présentés à chaque animal pour mastication à J11, à J13 (30 minutes, 1H ,3H et 6H post mélange) à J14 ( 24H post mélange) et à J15 (48H post mélange) pendant environ 2 minutes pour récupérer au moins 100µl de salive nécessaire et suffisant pour l’analyse des diffférents paramètres salivaires prévus.

Impact sur les animaux

La durée du stress social n’est pas assez longue pour enregistrer des effets sur l’ingestion et la prise de poids. Blessures dues aux griffures lors de la lutte des animaux dominants pendant le stress de mélange. Inconfort et stress dû à la contention des animaux pour les prises de sang.

Devenir

Les animaux du groupe T2 , soit 6, seront mis à mort afin de prélever des tissus et des organes pour établir une banque d’échantillons qui serviront aux développements de méthodes d’analyses in vitro. Placement des animaux du groupe T1, soit 6 animaux.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet l'étude vise à montrer l’impact du mélange des animaux sur les biomarqueurs du stress analysés un niveau de la salive comme échantillon biologique obtenu de manière non invasive et moins douloureuse pour l’animal en comparaison aux prélèvements sanguins, afin de faciliter le suivi du contrôle du bien-être des animaux en ferme et de mieux répondre aux exigences sur les soins et l’utilisation des animaux de recherche.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux maximum a utilisé pour évaluer l’hypothèse de ce projet exploratoire. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter des bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux, de réaliser le mélange des animaux et générer des données scientifiquement interprétables. L'ensemble des analyses réalisées permettront de mieux définir les possibilités d'utilisation de la salive comme méthode non invasive d"évaluation du stress chez les animaux de ferme.

Raffinement

La contention des animaux en vue de leur transfert d’une cage à une autre est réalisée dans le calme et sans brutalité en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en attrapant les porcelets de 5 à 10 kg par la patte arrière juste au-dessus du jarret et en le soulevant en plaçant l’autre main sous la poitrine pour les sortir. L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux pour les prises de sang sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement et en respectant les périodes de récupération nécessaires. A la fin de la prise de sang, l’animal peut-être caresser au niveau du groin ou sous le cou. Une période d’adaptation et d’habituation aux écouvillons en mousse pour le prélèvement de salive en utilisant de la compote de pomme sera mise en place. Des enrichissements (jouets suspendus en caoutchouc ou à mâcher) seront mis en place dans toutes les cages de JO à J13 et puis retirés uniquement du groupe T2 lors du mélange des animaux de J13 à J15. Ce retrait des enrichissements dans le groupe T2 a été choisi pour ne pas compromettre l’impact du mélange sur les paramètres du stress pour le groupe T2 et renforcer le changement d’environnement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

L'évolution de l'industrie porcine vers des systèmes de production intensive à grande échelle a augmenté l'exposition des porcs aux facteurs de stress environnementaux, physiologiques et sociaux. Les porcins constituent donc une cible privilégiée pour élaborer des stratégies efficaces de lutte et améliorer le bien-être et prévenir les maladies liées au stress en élevage. De porcelets sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 6-8 kg en moyenne seront utilisés. Les animaux seront utilisés au stade de porcelets qui sont plus sujet à des réactions de stress résultants des changements d’environnement social mais aussi aux pratiques de gestion courantes dans les élevages commerciaux.

Gardés en vie pour être réutilisés après trois semaines de repos, deux macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit jusqu'à quatre sessions d'enregistrement d'environ une heure sous anesthésie générale, avec insertion d'électrodes, précédées d'un jeûne de six à seize heures. Au réveil, des pertes d'équilibre et une hypothermie légère sont attendues, et les animaux passent jusqu'à une heure isolés de leurs congénères dans une cage plus basse. Il s'agit de valider une mesure de la conduction du nerf ulnaire qui servira ensuite aux études de toxicité réglementaire d'un candidat médicament contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Objectifs

La validation des enregistrements de la conduction nerveuse au niveau du nerf ulnaire est une étape préalable à des études de pharmacodynamie et de toxicité dans le cadre du développement d’un candidat médicament visant à traiter une maladie neurologique invalidante en réduisant la surexpression d’une protéine. La finalité du présent projet est la validation de la méthode de mesure de la vitesse de conduction nerveuse du nerf ulnaire chez le primate non humain et l’évaluation de la faisabilité de l’enregistrement de ce nerf en complément d’un panel de nerfs déjà validé pour des enregistrements de la conduction nerveuse dans des études de toxicité. L’ajout de la mesure de la vitesse de conduction du nerf ulnaire en complément des autres nerfs cités permettra d’évaluer plus efficacement la toxicité de ce candidat médicament car ce nerf, de part ses spécificités anatomiques, est particulièrement sensible aux effets secondaires d’une réduction trop importante de la protéine cible.

Bénéfices attendus

La conduction du nerf ulnaire sera mesurée dans les études précliniques (préliminaires et réglementaires) d'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament destiné à traiter la maladie de Charcot-Marie-Tooth Type 1 (CTM1), une maladie neurologique invalidante pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement. Cette évaluation permettra de caractériser le profil toxicologique de ce candidat avec une sensibilité accrue afin de mieux anticiper les éventuels effets lors de futurs essais cliniques et d'assurer la sécurité des patients qui seront potentiellemet traités avec ce médicament. En outre, après validation, cette technique d’enregistrement du nerf ulnaire pourra aussi être utilisée pour l’évaluation de la toxicité d’autres candidats médicaments pour d’autres applications (cardio-vasculaires, anticancéreux, antibiotiques, immunosuppresseurs).

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum 4 sessions d’environ 1 heure d’enregistrement de la vitesse de conduction nerveuse. Chaque session sera réalisée sous anesthésie générale. Une mise à jeun sera faite 6 à 16 heures avant chaque anesthésie. Les sessions d’enregistrement seront espacées d’au moins 3 jours.

Impact sur les animaux

La procédure liée à l’insertion d’électrodes et l’enregistrement de l’activité nerveuse étant réalisée sous anesthésie générale n’entraine pas pas d’effets négatifs. Les nuisances générées lors de la procédure sont les suivants : - Mise à jeun pré-anesthésie (au minimum 6 heures et au maximum 16 heures avant la procédure) ce qui peut entrainer une sensation de faim temporaire chez l’animal - Injection intramusculaire d’un agent anesthetique et analgesique. La piqure d’aiguille peut engendrer une douleur légère de courte durée - Lors du réveil de l’anesthésie, des pertes d’équilibres et une hypothermie légère peuvent être observées et correspondent à des stress physiques temporaires et légers. - Lors de la surveillance au réveil, les animaux sont temporairement (au maximum pendant une heure) en situation d’isolement de leurs congénères et dans une cage moins haute que leur cage habituelle (évitant les risques de blessures en cas de pertes d’équilibres).

Devenir

Le degré de sévérité de la procédure étant classé a priori comme léger, les animaux seront gardés en vie pour une éventuelle réutilisation après une période de repos (minimum 3 semaines).

Remplacement

L’objectif de ce projet est de valider la méthode d’enregistrement de la conduction du nerf ulnaire afin de pouvoir ensuite réaliser ces enregistrements dans les études de pharmacodynamie et toxicité réglementaire préalables au passage du candidat médicament contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth Type 1 (CTM1) en essai clinique. Les spécificités de ce candidat médicament nécessite son évaluation chez le primate non humain. Un travail préparatoire sur manuel d'anatomie a été réalisé cependant évaluer la réponse fonctionnelle du nerf en fonction du placement des électrodes est nécessaire dans cette validation ; cette validation ne peut donc pas se faire ex vivo, in vitro ou in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique en tenant compte des éventuelles variations anatomiques (variation individuelle dans les repères anatomiques externes).

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec au moins un congènère de même sexe dans des volières ammenagées avec l’enrichissement structurel (perchoir, balancoire) avec une litière au sol. Des jouets sont fournis aux animaux et de l’enrichissement est aussi apporté via l’alimentation (sélection de fruits et légumes, graines/noix à décortiquer) en plus des rations alimentaires. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin de détecter tout signe clinique. La procédure d’enregistrement sera réalisée sous anesthésie avec un agent ayant des propriétés analgésiques avec une surveillance anesthésique (au minimum fréquences cardiaque et respiratoire et température corporelle de l’animal). Les animaux seront placés sur tapis chauffant pendant l’anesthésie. L’anesthésie sera réversée par l’utilisation d’un antagoniste médicamenteux pour faciliter le réveil. Les animaux seront gardés isolés dans des compartiments de réveil après la procédure pour éviter les chutes/blessures liées à des pertes d’équilibres lors du réveil. Une observation des animaux sera réalisée pendant la phase de réveil. Si nécessaire, des mesures de réchauffement peuvent être mises en place dans les compartiments de réveils (e.g. lampe chauffante). Les animaux seront replacés dans leur volière seulement une fois après contrôle du réveil complet. Après le retour en volière d’hébergement, une lampe chauffante pourra aussi être placée dans la salle d’hébergement.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus a été choisi pour cette étude pour être en cohérence avec l’espèce qui sera utilisée pour les études de toxicologie règlementaire. En effet, les études de toxicologie réglementaire pour le développement d'un candidat médicament contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth Type 1 (CTM1) doivent être réalisés chez le macaque cynomolgus à cause de l’homologie de séquence ARN (acide ribonucléique) entre l’homme et le primate non-humain. La validation de la vitesse de conduction nerveuse du nerf ulnaire doit donc être réalisée dans la même espèce La validation du test de conduction nerveuse se fera sur “jeunes adultes”/”adultes” comme pour les études de toxicologie réglementaire qui seront réalisées par la suite.

Améliorer les pièges vulnérants pour capturer la quasi-totalité des femelles en âge de se reproduire suppose de connaître leurs déplacements. 144 rats noirs, 232 petites mangoustes indiennes et 138 opossums communs, soit 514 individus vivant à l'état sauvage aux Petites Antilles, vont être capturés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés. Chacun reste au piège moins de douze heures, est anesthésié à l'isoflurane, épilé sur un à deux centimètres carrés, puis reçoit sous la peau du cou une puce d'identification posée au trocart, soixante femelles adultes recevant en plus un collier muni d'une balise satellitaire. Le porteur justifie ces captures par la protection d'oiseaux et de reptiles endémiques menacés, la finalité opérationnelle étant de réduire durablement les effectifs de ces trois espèces introduites.

Objectifs

Les espèces exotiques envahissantes représentent la 3ème cause de perte de biodiversité insulaire. Le transport volontaire ou non par l’homme d’êtres vivants peu conduire à leur développement à l’état sauvage en dehors de leur aire naturelle de répartition. Lors du développement de ces animaux dans la nature, des effets négatifs peuvent être observés sur les espèces natives et des milieux colonisés, ainsi que sur la santé humaine, et les activités économiques. Afin de limiter au mieux ces effets négatifs, une bonne connaissance de l’utilisation de l’espace des animaux exotiques est requise afin de proposer des dispositif de piégeage permettant d’en capturer le maximum – voire la totalité. L’utilisation de l’espace par les animaux est mesurable par différentes méthodes : la capture-marquage-recapture (CMR), la réception de signaux émis par des petits émetteurs à haute fréquence, ou encore, la géolocalisation automatisée par des balises miniaturisées réceptionant des signaux de satellites (GPS). Ce projet a pour objectif principal de mieux connaître l’amplitude des mouvements, la densité de population, et l’effet d’une sédation des animaux sur l’amélioration de leur probabilité de recapture, chez trois espèces de petits mammifères exotiques envahissants dans une île tropicale, grâce à des géolocalisations satelittaires, et par CMR : la petite Mangouste Indienne Urva auropunctata, l’Opossum commun Didelphis marsupialis, et le Rat noir Rattus rattus. Cette connaissance de l’utilisation de l’espace permettra de mettre en place des dispositifs de piégeage permettant d’en capturer le plus grand nombre – si ce n’est la totalité -, pour s’assurer qu’une diminution significative des abondances de ces mammifères est bien liée à l’augmentation attendue de celles de leurs proies potentielles, permettant de sauvegarder des espèces endémiques menacées d’extinction (oiseaux, reptiles).

Bénéfices attendus

Le projet alimentera les premières observations sur l’utilisation de l’espace par le Rat noir, l’Opossum commun, et la petite Mangouste Indienne, constituant une connaissance de l’écologie spatiale qui est encore peu connue pour ces espèces. C’est également le cas de leurs densités de populations qui ne sont pas documentées dans les habitats de forêts tropicales sèches. Les bénéfices attendus du projet concernent surtout une amélioration des statuts de conservation de populations d’espèces de petits vertébrés endémiques menacées d’extinction (oiseaux, reptiles), que ce soit directement ou indirectement, par une prédation ou une compétition pour la nourriture ou des sites de refuges et d’abris par ces mammifères exotiques envahissants. Par ailleurs, les dispositifs de luttes (pièges vulnérants) pourront être améliorés afin d’atténuer des risques liés à la capture d’individus d’espèces non cibles susceptibles de pâtir des campagnes de lutte. Un autre bénéfice attendu est la mise en place de protocole de suivi des abondances de ces populations au moyen de pièges photographiques, évitant la capture physique des individus de ces espèces. La pose d’un collier munis de balises miniaturisées réceptionant des signaux de satellites fixé sous sédation par anesthésie gazeuse sur le terrain n’est pas employée dans le cas de suivi de la petite Mangouste Indienne, très peu documentée pour le Rat noir, et inconnu pour l’Opossum commun : le projet permettra de calibrer, et d’apprécier les avantages et les inconvénients de cette méthode. A noter que ce protocole permettra également d’évaluer l’effet de la manipulation sous sédation sur la probabilité de recapture des individus en comparaison d’animaux manipulés sans être endormis – qui est attendue plus élevée chez les individus manipulés inconscients en comparaison de ceux manipulés à l’état vigile. En effet, le stress induit par la manipulation de animaux capturés peut les inciter à mois se refaire capturer.

Procédures

Sous anesthésie générale (Isoflurane) – qui ne durera pas au-delà de 5 minutes, au maximum 684 animaux seront marqués par une puce d’identification par radio-fréquence (RFID) implantée sous la peau (Procédure 1) uniquement lors de leur première capture, afin de les reconnaître lors de leur recapture ultérieure (ou ils seront relâchés immédiatement après avoir noté leur numéro d’identification et leur masse, sans autre manipulation). Egalement sous anesthésie générale (Isoflurane), 60 individus seront marqués par une puce RFID sous-cutané et avec la pose d’un collier munis de balises miniaturisées réceptionant des signaux de satellites (Procédure 2). L’implantation de la puce d’identification sur l’animal inconscient est effectuée par un trocard stérile à usage unique introduisant une puce de 11 mm3 (équivalente à un grain de riz pesant 0.031 g) parallèlement sous la peau du cou (profondeur de 1,5 cm), après application d’un gel analgésique une fois la zone d’implantation épilée (sur 1-2 cm2) et désinfectée. Profitant de l’anesthésie gazeuse lors de la pose de la puce d’identification, un lot de femelles adultes sera également équipé d’un collier muni d’une balise GPS miniaturisée (Procédure 2) représentant moins de 4% de leur poids (5 g pour les rats [soit

Impact sur les animaux

La pose d’une puce d’identification RFID sous-cutanée sous anésthésie (procédure 1), réalisée dans l’environnement familier de l’animal, est de courte durée (tout au plus 30 minutes de temps de récupération de leur capacité post-anesthésique) et n’entraine pas de faim/soif/malnutrition chez l’individu, ni aucune détresse, stress physique/thermique ou peur, ou encore de lésion ou de maladie. Ce geste n’induit qu’une légère douleur au moment de l’implantation de la puce sous la peau.

Devenir

Les animaux sont relâchés marqués par une puce d’identification sous-cutanée, et pour un sous-lot de femelles adultes additionnellement muni de leur équipement de suivi satellitaire, afin de mesurer les distances qu’ils parcourent dans leur domaine vital pendant au moins 15 à 20 jours. La mesure de ces distances aidera à améliorer les dispositifs de captures de ces espèces, que ce soit 1/ à des fins de contrôle de leur population exigé par la loi pour favoriser la survie d’espèce de petits vertébrés menacés d’extinction en relation avec leur prédation par les espèces étudiées, ou 2/ de la surveillance de leur répartition et de leur abondance dans des habitats protégées. Un effort particulier sera appliqué pour allonger le temps de chance de recapture à au moins 20 jours – à partir de la date du dernier individu équipé - afin de pouvoir déséquiper les individus.

Remplacement

L’étude porte sur l’acquisition de connaissance du mode de déplacement d’individus dans des populations « à l’état sauvage », dans leurs environnements naturels. Dès lors, l'utilisation d'animaux capturés vivants dans leur environnement ne peut être remplacée par d'autres modèles non animaux, ou d’origine captive. Une amélioration des connaissances acquises dans le cadre du projet devrait toutefois permettre, à termes, de disposer d’informations permettant de progresser sur une modélisation spatiale des risques d’impacts de ces mammifères exotiques envahissants à de plus larges échelles sans avoir recours à leur capture et manipulation, ainsi que les modalités d’un protocole de suivi des abondances des populations par piégeage photographique sans recours à une capture physique.

Réduction

En se basant sur des estimations théoriques où de très fortes densités de population seraient observées pendant les opérations de terrain, nous envisageons d’utiliser dans les deux procédures prévues dans le projet au maximum 144 rats, 138 opossums, et 232 mangoustes a cours de deux sessions de piégeages. Ainsi – au total sur 2 années, ce sont au grand maximum 514 individus qui pourraient être soumis à une anesthésie gazeuse : 454 à but de simple marquage par puce d’identification sous-cutanée (Procédure 1), et 60 femelles adultes soumises à double marquage constitué d’une puce d’identification sous-cutanée et d’un collier muni d’une balise miniaturisée de suivi par satellites (Procédure 2). Pour les mesures à partir des données d’équipement de suivi par satellites, en faisant l’hypothèse d’une population d’origine infinie, un échantillon de 16 individus tirés au hasard dans cette population doit permettre d’estimer une moyenne de l’amplitude spatiale du mouvement avec une précision convenable (Coefficient de variation = 20%), pour une erreur de mesure tolérée de 10%. En d’autres termes, un total de 16 femelles doit être échantillonné au hasard dans la population pour s’assurer à 95 % de chance que la moyenne du paramètre mesuré se situe dans les 10 % de la moyenne réelle de la population. Toutefois, l’emploi d’un dispositif de suivi par satellites n’ayant pas été testé auparavant pour deux des trois espèces considérées (opossum commun et rat noir), laisse une part d’échec possible que nous estimons, de notre expérience sur des suivis par balises satellitaires de petits rongeurs de l’ordre de 25%. Ce taux d’échec est proche de celui rapporté pour la petite mangouste indienne (21%). Nous envisageons donc d’utiliser 4 femelles adultes en plus (20%) pour chaque espèce aux 16 nécessaires pour disposer d’une mesure précise de notre paramètre de détection spatiale, conduisant à utiliser au maximum 20 femelles adultes.

Raffinement

La petite mangouste indienne est diurne, alors que les rats noirs et les opossums communs sont nocturnes. Un premier relevé des pièges aura lieu dans les 3 hrs suivant le lever du soleil afin de libérer les animaux capturés dans la nuit et en matinée, et dans les 3 hrs avant le coucher du soleil pour ceux capturés de jour. Les pièges seront appâtés (beurre de cacahuète, saucisse, et fruit). Des débris végétaux seront placés au fond de la cage piège – pour constituer une cachette, ou encore un tapis. Les cages seront disposées à l’ombre, et en hauteur pour éviter un risque d’inondation en cas de pluie. Le critère le plus strict utilisé à ce jour exige que les pièges de contention homologués retiennent des animaux pendant 24 heures avec moins de 57 % d’entre eux présentant des blessures graves pouvant diminuer la survie après relâchés. Les individus seront maintenus captifs 150 g seront sélectionnées, ainsi que des mangoustes > 450 g, et des opossums > 800 g, correspondant à un ratio de masse compris entre 1% et 4% selon les espèces. Ce ratio laisse la possibilité de perte/gain de poids potentiel des individus de 10% (correspond au remplissage/vidage d’un estomac – e.g. chez le rat noir) pendant la période de leur équipement tout en restant avec un ratio de masse ≤ 5% pour les mangoustes, et < 4% pour les rats noirs et les opossums communs. De plus, l’anesthésie aurait un effet positif sur les individus en limitant le stress à la capture. Un individu recapturé ayant perdu sa balise ne sera pas rééquipé.

Choix des espèces

Les rats noirs, les opossums communs, et les petites mangoustes indiennes, sont les principaux mammifères à l’origine d’une pression de prédation avérée sur des espèces d’oiseaux ou de reptiles (terrestres ou marins) endémiques menacées des Petites Antilles, avec les chats harets. Une bonne connaissance de leur mode d’utilisation de l’espace est essentielle dans l’objectif de pouvoir disposer de protocole efficace de leur limitation afin de sauvegarder/restaurer les populations menacées d’extinction de leurs proies. Le projet nécessite la capture d’individus « in natura », pour lesquels i) un nombre maximum d’individus a été défini, ii) des conditions optimales de captivité temporaire dans le piège ont été prévues (durée, abri, protection, apport alimentaire), iii) une manipulation rapide par contention chimique (anesthésie gazeuse à l’isoflurane, temps moyen estimé max. de 10-15 mn), iv) analgésie et prévention de risques d’infection pour le marquage sous-cutané, et v) le relâché sans prélèvement. Toutes les classes d’âge, que nous supposons être majoritairement constituées de sub-adultes et d’adultes (hors période de reproduction), seront utilisées lors de la capture-marquage-recapture. Une appréciation réaliste de la densité doit prendre en compte la variabilité liée à la structure d’âge de la population. Sur un autre plan, seules des femelles adultes seront équipées de balises GPS sous anesthésie gazeuse. L’objectif du projet est de disposer d’un protocole efficace de diminution des effectifs des populations de trois espèces de mammifères exotiques envahissants dans le but de mesurer l’augmentation consécutive de ceux de leurs proies, constituées d’espèces de petits vertébrés endémiques menacés d’extinction. Or, la limitation durable d’une population exige la mise en place d’un dispositif de piégeage permettant de capturer la quasi-totalité des femelles en âge de se reproduire.

Les souris de cette lignée portent une dystrophie musculaire, maladie qui atteint le muscle squelettique et le cœur. 2 277 d'entre elles vont être élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec une biopsie de la queue sur quelques animaux pour l'identification génétique. Le porteur indique que le phénotype se déclare vers vingt mois et que les souris utilisées entre trois et six mois ne devraient pas l'exprimer, tout en prévoyant la mise à mort de tout animal blessé ou en situation d'inconfort. Une partie des souris est transférée vers d'autres demandes d'expérimentation, dont certaines ne sont pas encore écrites, les animaux au mauvais génotype et les anciens reproducteurs étant tués.

Objectifs

Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche : ces souris sont dystrophiques. Les recherches ciblent le muscle squelettique et le coeur et en particulier la régénération et la fibrose musculaire. La lignée de souris dystrophique est essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire, la fonction cardiaque et la fibrose dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc la génération de lots de souris dystrophiques pour mener à bien les projets de recherche.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la régénération musculaire et la réduction de la fibrose dans les dystrophies musculaire chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et le coeur et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La régénération musculaire et le développement de la fibrose sont des processus qui sont altérés notamment dans la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés).

Procédures

Une biopsie caudale pour identification génétique sera réalisée sur un nombre limité d'animaux (quelques animaux) vigiles (1x par animal concerné, acte de 1minute).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer un phénotype de dystrophie musculaire vers l'âge de 20 mois. Les animaux dont le phénotype se déclare pourront avoir une atteinte musculaire légère pouvant induire une mobilité réduite et une douleur légère. Une biopsie caudale pour l’identification génétique des animaux sera réalisée sur quelques animaux, ce qui pourra engendrer un léger stress de courte durée.

Devenir

Une partie des animaux seront transférés pour expérimentation et affectés à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Un projet est déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux ne portant pas le génotype d’intérêt et les anciens reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire .

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires et cardiques. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

2277 animaux seront utilisés dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet elevage, nous contrôlons le nombre de couple afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés et les croisements sont optimisés pour obtenir uniquement les animaux du génotype d'intérêt. En effet les croisements se feront entre souris homozygotes afin d'obtenir 100 pour 100 de descendance avec le bon génotype. Si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopréservation sera envisagée.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les animaux sont maintenus sous un statut sanitaire exempte de pathogènes et d'opportunistes, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Une période d’acclimatation de 10 jours est prévue pour les animaux fondateurs en provenance d’un fournisseur extérieur avant de mettre en place les accouplements.Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux ne devraient pas développer de phénotype aux âges utilisés dans ce projet, si une déclaration précoce se présente, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Si un signe clinique anormal est observé, nous utiliserons une grille de scoring générale basée sur les 4 critères principaux (apparence, alimentation, respiration, comportement). Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire et cardiaque est la souris due à la facilité d'élevage, le coût relativement peu élevé ainsi que la disponibilité d'outils analytiques. Des animaux dystrophiques sont indispensables pour étudier le muscle et le coeur in vivo dans un système pathologique. Les animaux seront mis en accouplement entre 2 et 8 mois, ils seront utilisés dans le cadre de projets autorisés entre l'âge de 3 à 6 mois car les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques à cet âge. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu.

Dix secondes de contention et l'extrémité de la queue coupée sur animal vigile, une fois par individu et 100 000 fois en cinq ans, dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère. Les souris qui portent le génotype recherché rejoignent d'autres projets déjà autorisés, les autres sont tuées par une méthode réglementaire. Le porteur maintient plus de 160 lignées de souris pour répondre aux demandes des équipes de son institut et affirme que le développement du cerveau, les interactions entre aires cérébrales et l'origine des comportements ne s'étudient que sur des "organismes entiers". L'effectif de 100 000 animaux repose sur le cumul des années passées, sans calcul détaillé.

Objectifs

Comprendre comment les processus biologiques émergent, se développent, fonctionnent et se détériorent est la clé de voûte des connaissances qui sont le fondement de l’éducation scientifique et la base qui servent à garder la santé humaine et animale. Notre objectif dans cette demande de projet est de fournir un socle commun pour l’identification des animaux utilisés afin de réaliser les missions de notre institut de recherche. Dans cette demande, nous décrirons la procédure consistant au prélèvement de tissu pour l’identification génétique individuelle. Nous mettons en œuvre un processus de réduction en minimisant au maximum le nombre de croisements réalisés pour arriver à conclure de façon fiable les observations à la base des découvertes. Nous nous assurons de la qualité de la réalisation de la procédure par le personnel qualifié et compétent pour minimiser la souffrance pouvant avoir lieu lors de la réalisation de cette procédure. Pour limiter les souffrances, les animaux, herbergés dans une animalerie de laboratoire, ont libre accès à des enrichissements physiques et bénéficient d’enrichissements sociaux.

Bénéfices attendus

L’ensemble des travaux de recherche réalisé dans notre centre de recherche et nécessitant le recours aux animaux génotypés constitue le socle de découvertes fondamentales permettant de faire progresser les connaissances scientifiques à court et long terme. Le bénéfice en terme d’importance des connaissances est conséquent tant les recherches réalisées grâce à ces animaux nous informe sur le fonctionnement du vivant dans des domaines allant du développement cellulaire et des organismes, du fonctionnement d’intéractions ligands récepteurs, champs récepteurs et circuits neuronaux entre autre. Nous nous assurons de la qualité de la réalisation de la procédure par le personnel qualifié et compétent pour minimiser la souffrance pouvant avoir lieu lors de la réalisation de cette procédure. Les animaux sont hébergés dans une animalerie de laboratoire avec les enrichissements sociaux et physiques permettant de limiter leur souffrance.

Procédures

Nous réaliserons un prélèvement d'un petit bout de queue effectué une seule fois sur l’animal vigile pour identification du génotype. Cette procédure est réalisée en moins de 10 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables que l’on pourra observer sont le stress lié à la contention et la douleur légère et de courte durée au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue. Ces effets indésirables seront très limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

Les animaux ayant le genotype souhaité souhaité pour la mise en œuvre des projets de recherche, seront intégrés aux projets correspondants préalablement autorisés dans le cadre d’une utilisation continue. Les animaux n’ayant pas le génotype souhaité seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Remplacement

Beaucoup des projets de recherche s’appuient sur des résultats in vitro produit en amont. Cependant nous essayons de comprendre des mécanismes integrés de neurosciences comme par exemple les mécanismes du développement du cerveau, ou la manière dont les différentes aires du cerveau interagissent entre elles ou encore les origines et les régulations des comportements (sommeil, apprentissage etc). Pour l'instant, aucune technique ne permet de fairer ces études ex vivo et elles ne peuvent se faire que sur des organismes entiers.

Réduction

Nous maintenont plus de 160 lignées de souris dans notre animalerie pour répondre aux besoins de l’ensemble des projets des équipes. Chaque équipe concoit ses projets de recherche dans lesquels l’utilisation des souris se basent sur des justifications solides et sur des tests statistiques appropriés qui sont validés dans des Demande d’Autorisation de Projet indépendants. Sur la base des années passées, mais aussi du nombre cumulés d’animaux utilisés dans les projets de recherches, nous anticipons que nous utiliserons 100000 souris sur les 5 années de ce projet. Nous mettons en œuvre un processus de réduction en minimisant le nombre de croisements réalisés en fonction du besoin d’animaux des équipes de recherche. Les lignées en maintien qui ne seront pas utilisés pourront être cryo-conservés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en portoir ventilé, avec eau et nourriture ad libitum et contrôle de la température et de l’hygrométrie, eclairage alterné jour/nuit. Du papier Kraft et un dome en carton est placé dans la cage pour l'enrichissement. Les animaux sont manipulés par du personnel compétent pour éviter le stress. Le prélèvement tissulaire est minimal, unique et réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des animaux dans un endroit calme et avec la mère et le reste de la portée à proximité pour un retour rapide dans un environnement réconfortant. Le personnel opère une surveillance journalière aux point limites : perte de sang anormal, poils herissés, animal prostré.

Choix des espèces

La souris est actuellement le modèle de choix pour les recherches sur le système nerveux en partie du fait des nombreuses modifications génétiques. La pertinence de ces modèles est justifiée par chaque projet en fonction de leur domaine d’expertise. Le prélévement sera fait au moment du sevrage, soit à 21 jours, c'est-à-dire à un stade où la séparation des souriceaux et de la mère n'est pas problématique et où il n'y pas encore de terminaisons nerveuses dans les tissus prelevés pour l'identification génétique.