Procédures légères

L'objectif déclaré est d'ajuster la durée d'isolement des macaques afin de récolter assez d'urine pour les analyses des études précliniques. Six femelles macaques à longue queue vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées en vie pour une réutilisation ultérieure. Chacune est enfermée seule dans un module pendant moins de seize heures, sans nourriture ni accès à l'eau. Le porteur qualifie ces collectes d'"indispensables" au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques, affirme qu'aucune méthode sans animaux n'apporte le même niveau d'information, et présente le projet comme une amélioration du bien-être des macaques.

Objectifs

Les études de collecte d’urine chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent d’évaluer des paramètres biochimiques pertinents (paramètres rénaux, métaboliques etc...). L’objectif du projet est d’amélioré le bien-être des animaux et la qualité des échantillons prélevés, lors de protocoles de collecte d’urine. En effet, différentes périodes d’isolement seront testées afin de réduire le temps d’isolement mais également permettre la collecte d’une quantité de matériel biologique suffisante pour des analyses.

Bénéfices attendus

Le protocole permettra d’acquérir des connaissances afin d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates lors de ce type de protocole de collecte d’urine.

Procédures

Les prélèvements d'urine sont réalisés directement dans le module d'isolement présent dans les volières d'hébergement Cependant, au cours de l'acte, l'animal est physiquement isolé de ses congénères pendant une durée inferieur à 16h, ce qui peut induire un stress léger. L’isolement en module implique une mise à jeun et une absence d’accès à l’eau. Cela peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieur à 16 heures pour le bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Les prélèvements d'urine sont réalisés directement dans le module d'isolement présent dans les volières d'hébergement Cependant, au cours de l'acte, l'animal est physiquement isolé de ses congénères pendant une durée inferieur à 16h, ce qui peut induire un stress léger. L’isolement en module implique une mise à jeun et une absence d’accès à l’eau. Cela peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieur à 16 heures pour le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Cette décision sera prise par un vétérinaire en consultation avec la SBEA.

Remplacement

Les études de collecte d’urine chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent d’évaluer des paramètres biochimiques pertinents. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information que ces prélèvements biologiques in vivo.

Réduction

6 animaux seront utilisés pour cette étude. Ce nombre permettra l’obtention de résultats fiables, transposables et de détecter : 1) Une tendance dans le groupe ; 2) Une valeur extrême ; Enfin, comme le protocole le permet, les animaux seront gardés en vie à la fin de l'étude dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques (cette décision sera validée par un vétérinaire en consultation avec la SBEA).

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (ex: température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air...). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : 1) Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont présents dans l’animalerie depuis plusieurs mois mais une période d'acclimatation de 7 jours minimum sera mise en place avant le début de l'étude. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Lors de l’isolement, les animaux garderont un contact visuel, olfactif et sonore avec ses congénères. Cela permet de limiter le stress lié à cet isolement.

Choix des espèces

Les candidats médicaments étudiés dans les études précliniques étant à visée humaine , il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) est régulièrement retenu dans le cadre de projets précliniques. Dans ce contexte, il est important de raffiner les protocoles sur cette espèce. Dans ce projet des macaques cynomolgus seront utilisés afin d’améliorer les protocoles de collecte d’urine. Six femelles seront utilisées pour ce projet . Seulement des femelles seront utilisée car elles forment un groupe sociale hébergé ensemble. Les résultats de ce projet ne nécessite pas qu’il soit réalisé également sur des mâles. De plus, cela impliquerait 12 animaux au lieu de 6 (réduction du nombre d’animaux).

Trois à quatre veines de la rétine sont obstruées au laser après injection d'un colorant photosensible, sur souris et rats anesthésiés. 1 425 souris et 1 425 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, tous tués en fin de protocole pour analyse des tissus. Le protocole teste des traitements contre l'occlusion veineuse rétinienne dans un cadre réglementaire d'évaluation d'efficacité et de tolérance, avec des gouttes oculaires jusqu'à huit fois par jour, des injections quotidiennes et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine. Le porteur écrit que l'affection recherchée n'induit pas de douleur et que les examens sont "totalement indolores et non invasifs", alors que le protocole détruit délibérément une partie de la vision de 2 850 animaux.

Objectifs

Les occlusions veineuses rétiniennes (OVR) représentent une pathologie fréquente de la rétine, marquée par l'obstruction des veines rétiniennes, entraînant une perturbation significative de la circulation sanguine au niveau de la rétine. En termes de fréquence, l'OVR est la deuxième maladie vasculaire rétinienne la plus courante après la rétinopathie diabétique, affectant principalement les personnes âgées de plus de 50 ans. L'incidence globale est estimée à environ 0,5 % à 1,2 % de la population générale, avec une prévalence plus élevée chez les individus présentant des facteurs de risque cardiovasculaires. Les mécanismes d'apparition impliquent généralement une thrombose ou un blocage de la veine rétinienne, souvent lié à des altérations de la paroi vasculaire, à une stase sanguine ou à des anomalies de la coagulation. Ces obstructions entraînent une augmentation de la pression veineuse, une fuite de fluide, et des hémorragies rétiniennes, perturbant ainsi la fonction rétinienne. Les causes des OVR sont variées et incluent principalement des facteurs systémiques tels que l'hypertension artérielle, le diabète, l'hyperlipidémie et les maladies cardiovasculaires, des facteurs oculaires ou des facteurs hématologiques. Sans traitement, les patients peuvent développer des complications sévères comme l'œdème maculaire, des néovascularisations et, dans certains cas, une perte sévère de la vision. Les traitements des OVR visent à réduire l'œdème rétinien, à prévenir les complications et à améliorer la fonction visuelle. Les options thérapeutiques incluent les injections intravitréennes de composés anti-angiogéniques pour réduire l'œdème maculaire, les injections de corticostéroïdes pour leurs effets anti-inflammatoires et les traitements au laser pour gérer les néovascularisations. Si de nombreux traitement peuvent être proposés, nous ne savons toujours pas comment désobstruer la veine et aucun traitement n’a, à ce jour, fait la preuve certaine de son efficacité pour améliorer l’acuité visuelle. En conclusion, la reconnaissance précoce et la prise en charge appropriée des occlusions veineuses rétiniennes sont essentielles pour minimiser les complications visuelles et améliorer le pronostic des patients affectés. Les recherches sur ces traitements et de nouveaux se poursuivent donc.

Bénéfices attendus

Le modèle expérimental d’occlusions veineuses rétiniennes chez le rongeur consiste à obstruer par photocoagulation 3 à 4 veines rétiniennes. Cette étape essentielle est réalisée sur animal anesthésié à l’aide d’un biomicroscope et d’un laser après injection d’un traceur photosensible comme du Rose Bengal. Après cette étape des animaux seront suivis et examinés quotidiennement la première semaine puis toutes les semaines pendant un mois à l’aide d’appareils permettant d’évaluer l’état du fond d’œil et de la rétine en particulier. Durant cette période, certains animaux suivront un traitement visant à réduire les complications de ces occlusions veineuses.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est dû à une obstruction par photo coagulation laser de veines rétiniennes après injection d’un composé photosensible sous anesthésie. Cette étape clef sera réalisée 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durée plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésie seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, angiographie, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés à leur manipulation et à l’administration des produits. L'affection recherchée – les occlusions veineuses rétiniennes - n'induit pas de douleur chez l'animal. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet secondaire en dehors d'une dégradation de la vision. Des hémorragies rétiniennes indolores et transitoires peuvent survenir lors de la mise en place du modèle. La manipulation des animaux sera limitée au maximum et sera réalisée par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement et l'effectif sera évalué à l'aide d'outils statistiques avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. Dans le cas où des signes de douleur sont manifestés, un analgésique sera administré. Cette administration sera renouvelée au tant que nécessaire. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2017. Il est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 6 à 12 semaines à leur arrivée dans notre animalerie conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Sélectionner les souris porteuses du génotype recherché est l'objet unique de cette autorisation. 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, celles dont le génotype ne présente pas d'intérêt étant mises à mort et les autres passant dans des autorisations d'expérimentation. Le prélèvement se fait au premier jour de vie par section d'un fragment de queue, un geste que le porteur décrit comme provoquant une très légère douleur et qu'il juge "indispensable" faute de méthode non invasive aussi fiable sur des nouveau-nés sans poil. Trois situations déclenchent la mise à mort du nouveau-né, le rejet par sa mère, un saignement de queue trop important, l'incapacité à se déplacer ou à s'alimenter.

Objectifs

L'objectif de cette demande est de caractériser génétiquement les animaux. Cette DAP de prélèvement invasif de tissus pour génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt utilisés dans des DAP d’expérimentation

Bénéfices attendus

Le génotypage est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le génotype est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. Le génotypage permet : - l’obtention de résultats fiables ; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.

Procédures

Les animaux de cette DAP seront soumis à un geste technique invasif : 1 fois, durée de quelques secondes

Impact sur les animaux

Ce geste provoque une très légère douleur.

Devenir

Les animaux ayant un génotype d’intérêt pour les projets seront utilisés en continue dans des DAP d’expérimentation et les animaux sans génotype d’intérêt seront mis à mort.

Remplacement

A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d’écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable sur les équipements robotisés. Un doute sur les résultats des génotypages conduirait à la nécessité de procéder à de nouveaux prélèvements et génotypages. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; - la naissance d’animaux avec des phénotypes potentiellement délétères ; - l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables si l’erreur n’est pas détectée précocement. Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable et il n’existe pas de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue. Par ailleurs, dans notre contexte expérimental, les résultats du génotypage doivent être précoces, incompatible avec un âge où il est possible de prélever un follicule pileux ou faire un prélèvement salivaire. En effet, les animaux nouveau-nés n'ont pas de poil et il n'est donc pas possible de prélever des follicules pileux. La taille de ces animaux est également très petite rendant difficile les prélèvements à base d'écouvillons salivaires sans créer de dommages sur l'animal.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le nombre d’animaux produits est conditionné par le schéma d’accouplement entre hétérozygotes, schéma qui est obligatoire en raison de la létalité des animaux homozygotes. Par ailleurs, la lignée sera cryoconservée en cas d’arrêt temporaire de projet scientifique de façon à n’utiliser la lignée que pour la production d’animaux nécessaires au projet scientifique.

Raffinement

L’acte de génotypage est réalisé par un personnel expérimenté à jour de ses formations. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ce génotypage des animaux est réalisé avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Des points limites sont définis comme suit et impliquent l’arrêt du protocole et la mise à mort du nouveau-né concerné : -il est rejeté par sa mère -un saignement trop important de sa queue est observé -il n'arrive plus à se déplacer ou s'alimenter

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont génotypés le premier jour de vie (J1). A cet âge de vie : -les animaux sont aisément manipulables -le cartilage est souple -les groupes sociaux ne sont pas constitués.

Quinze souris vont être utilisées pour vérifier qu'un virus injecté supprime bien un gène dans le foie, une mise au point technique dont le résultat servira à d'autres projets du laboratoire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger et les quinze souris seront tuées pour prélever leurs organes. Chacune reçoit une injection unique du virus sous anesthésie générale, en moins de cinq minutes. Le porteur écrit avoir volontairement réduit les effectifs et n'attendre aucun effet indésirable, le projet servant à valider un outil pour des travaux ultérieurs sur le rôle d'un récepteur au froid dans les cardiopathies.

Objectifs

Parmi les récepteurs sensibles aux variations de température, le principal récepteur au froid est une protéine nommée « TRPM8 ». Plusieurs projets actuellement menés au laboratoire ont pour but de déterminer son rôle dans 1) l’apparition des complications cardiaques au cours de pathologies cardiovasculaires associées au diabète, 2) l'effet cardioprotecteur de l'hypothermie thérapeutique, dans le cadre de l’infarctus du myocarde et 3) les modifications des conditions mécaniques de circulation du sang observées lors d’une hypothermie et d’une anesthésie. Nous avons déjà acquis de nombreux résultats préliminaires prometteurs démontrant un rôle clef de TRPM8 dans le développement d’une pathologie cardiaque associée au diabète. Ces résultats suggèrent que ce rôle de TRPM8 découlerait en partie de son activité dans le foie. Pour aller plus loin dans les investigations, nous avons donc besoin de supprimer TRPM8 dans le foie, grâce à l’utilisation d’un virus permettant la modification du gène codant cette protéine, spécifiquement dans le foie de l’animal infecté. La validation de ce modèle technique nous permettra par la suite de réaliser les expériences clefs pour continuer nos projets. L’objectif du présent projet est donc de valider l’efficacité d’une approche virale de suppression de TRPM8 spécifiquement dans le foie.

Bénéfices attendus

A court et moyen-terme, l’outil validé dans ce projet (virus adéno-associé) sera utilisé pour poursuivre nos projets visant à préciser les mécanismes d’action de TRPM8 et son potentiel thérapeutique dans le cadre des cardiopathies.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique injection (du virus d’intérêt) sous anesthésie générale (introduction d’une aiguille – moins de 5 minutes)

Impact sur les animaux

L’anesthésie réalisée au moment de l’intervention peut induire un léger inconfort/stress de courte durée au moment de l’induction de l’anesthésie et au réveil (le cas échéant). L’intervention, qui consiste en l’introduction d’une l’aiguille pour l’administration du virus, induit une douleur légère de courte durée. Aucun effet indésirable n’est attendu en lien avec l’administration du virus aux doses prévues, (compte tenu des doses envisagées et de la construction du virus). Aucun effet indésirable n’est attendu non plus concernant la répression de TRPM8 dans le foie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le nécessaire prélèvement des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à vérifier l’efficacité d’un virus à réprimer un gène d’intérêt spécifiquement dans le foie, chez un modèle de souris génétiquement modifié à cet effet. La mise au point de cette approche servira ultérieurement dans un projet de maladie chronique qui ne peut pas être réalisée par un autre moyen que l’expérimentation sur animal.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de pouvoir évaluer la reproductibilité de la diminution de l'ADN génomique TRPM8. L'objectif est de voir une différence importante (minimum 50%). La précision de la mesure et sa validation statistique pourra être complété ultérieurement lorsque le modèle mis au point pourra être déployé pour étudier le rôle de TRPM8 dans le foie. De ce fait, les effectifs prévus ici sont volontairement très réduits. Grâce à l’expérience déjà acquise sur l’utilisation d'un autre virus au laboratoire, s’ajoutant aux données de la littérature, une seule dose de virus sera testée. De même, les voies d’administration et la durée d’infection sont déjà optimisées, maximisant les chances de réussite du projet. Le projet est organisé en étapes (la réalisation de la seconde étape est conditionnée à l’issue de la première), évitant ainsi toute utilisation pas ou peu pertinente d’animaux.

Raffinement

L’intervention (introduction d’une aiguille en vue de l’injection du virus) est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée. L’anesthésie envisagée est une anesthésie gazeuse, permettant une durée d’anesthésie la plus courte possible. Pour toute la durée de l’anesthésie, la température corporelle de l’animal sera maintenue par le biais d’une couverture chauffante rétro-régulée (sonde rectale). Les animaux en réveil sont placés en couveuse chauffée. Des points limites spécifiques ont été mis en place.

Choix des espèces

Les modèles pathologiques d'infarctus du myocarde et de cardiopathie diabétique développés chez la souris miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid notamment). Les animaux participant à ce projet auront entre 8 et 20 semaines (jeunes adultes). Ceci est concordant avec les autres projets du laboratoire en cours et donc avec la population d’étude.

Les souris de ce projet portent une recombinase qu'une injection déclenche, pour marquer certaines cellules du cœur et suivre leur descendance. 224 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, sur deux jours consécutifs quand la seconde est jugée utile, les femelles gestantes étant injectées entre le sixième et le treizième jour de gestation. Toutes sont ensuite tuées pour prélever des organes, alors que le porteur écrit n'avoir jamais observé d'effet délétère chez les animaux injectés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier les gènes et cellules qui participent au développement du système cardiovasculaire chez l'embryon et au maintien de l'homeostasie du cœur chez l'animal adulte afin de mieux appréhender l'étiologie des cardiopathies congénitales et acquises qui se développent après la naissance. Le développement du cœur et l’homéostasie cardiaque dépendent de l'expression d'un nombre important de gènes et la contribution de différents types cellulaires. Dans cet objectif, nous utiliserons des souris transgéniques chez lesquelles on peut induire l'activité d'une recombinase qui permet la détection des cellules recombinées et de leurs dérivées. Différentes lignées sont ciblées: les progéniteurs cardiaques, les cellules dérivées de l’épicarde, les cellules des crêtes neurales et enfin les cardiomyocytes. Les études sur le développement cardiaque nécessiteront l’induction au cours de la gestation tandis que les études après la naissance seront réalisées par des inductions chez les mâles et femelles. Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement et le maintien du système cardiovasculaire ainsi que sur l'étiologie des pathologies congénitales et acquises.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement cardiaque depuis les stades précoces du développement cardiaque. Il étudiera l’importance de ces évènements précoces sur le maintien du système cardiovasculaire. Les résultats attendus doivent également permettre de mieux aborder l’étiologie des pathologies cardiaques congénitales et acquises.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections intrapéritonéales. Si deux injections sont réalisées, elles seront réalisées sur 2 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Nous n'avons jamais observé d'effet délétère sur les animaux injectés lors de nos expériences précédentes. Une possible infection peut apparaître au site d'injection, mais cela n’a jamais été observé lors de nos expériences précédentes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de modèle in vitro ne permet pas de reproduire le développement cardiaque ni celle du coeur dans leur compléxité physiologique chez l'animal. Les stratégies de remplacement n'existent pas et l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés telle que présentée ici est la seule approche qui nous permette actuellement de répondre à nos objectifs de suivi des cellules qui contribuent au développement et à l'homéostasie du coeur.

Réduction

Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Nos études précédentes nous montrent qu’il faut en moyenne 10 souris par groupe pour avoir des données exploitables. Nous arrêterons de générer des animaux aussitôt que nos résultats seront exploitables statistiquement..

Raffinement

La réglementation est appliquée selon la législation en vigueur pour tous les animaux en procédure pour ce qui concerne l’hébergement, la surveillance et la mise à mort. Les injections sont toujours des actes planifiés à l'avance et rapides ce qui permet de limiter le stress de l'animal. L'apparition d'infection au site d'injection si elle a lieu sera traitée par un antiseptique. Si l’animal présente un signe de souffrance il recevra une injection d'anti-inflammatoire. Une grille de score avec les différents points limites est disponible et adaptée aux besoins du projet.

Choix des espèces

Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Les souris génétiquement modifiées représentent donc un modèle pertinent pour nos recherches fondamentales afin d'appréhender au mieux les maladies humaines. Les femelles gestantes seront injectées au plus tôt au stade embryonnaire de 6.0 jours après l'accouplement, stade qui correspond à l'identification des premiers progéniteurs cardiaques, et au plus tard avant le 13ème jour embryonnaire, la gestation chez la souris étant de 21 jours. Lorsque l'étude s'adressera à des animaux après la naissance, les injections seront réalisées entre le stade P0 et P3 ou au stade adulte lorsque requis, entre 8 et 12 semaines. Les animaux seront injectés deux fois sur deux jours consécutifs lorsque nécessaire afin de s'assurer de la recombinaison de l'ensemble des cellules ciblées. La nécessité de deux injections pour une recombinaison fiable résulte de l'expérience acquises au cours des années et est en faveur de la règle des 3R car cela permet d'obtenir des résultats plus stables rapidement et de réduire le nombre d'animaux injectés.