Procédures légères

Des souris âgées de 18 mois et une lignée génétiquement modifiée qui, selon le porteur, n'existe que chez cette espèce : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont identifiées par poinçon à l'oreille, 40 reçoivent en plus une puce implantée, toutes reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours et passent six mesures de composition corporelle par résonance magnétique. Soixante-douze d'entre elles jeûnent douze heures, ce que le porteur associe à une perte de 10 à 15 % du poids, avant une administration orale de glucose, six prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures et un test de vitesse maximale de trente minutes sur tapis roulant, puis des tests comportementaux dont il ne dit pas lesquels. Les 160 souris sont tuées en fin de projet, le porteur indiquant devoir prélever de nombreux tissus pour ses analyses moléculaires.

Objectifs

Le vieillissement se traduit par atrophie musculaire, c'est à dire une perte de la masse musculaire, conduisant à la perte d’autonomie des personnes et à l’augmentation de leur mortalité. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ce phénomène est donc d’un intérêt clinique non négligeable. Cette perte musculaire affecte un type particulier de fibres, les fibres à contraction rapide. De plus, le vieillissement est également associé à une perturbation de la régulation du taux de sucre dans le sang avec une résistance à l’insuline. Notre projet à deux objectifs : 1) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perte de muscles induites par traitement aux glucocorticoïdes (médicaments anti-inflammatoires utilisés fréquemment) et au cours du vieillissement 2) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perturbation de la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang et résistance à l’insuline) qui apparait en en cas d’obésité ou au cours du vieillissement

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la perte de la fonction musculaire au cours du vieillissement pour permettre à plus long terme d’augmenter la qualité de vie (favoriser le bien vieillir). De plus, nous nous intéressons à la vulnérabilité des fibres musculaires à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours de différentes pathologies (cancers, infections, sclérose latérale amyotrophique, insuffisance cardiaque et la broncho-pneumopathie chronique obstructive) ainsi qu’en cas de jeûne ou d’hypoxie (manque d’oxygène). Nos résultats pourraient donc être aussi intéressants pour de nombreuses autres pathologies.

Procédures

Tous les 160 animaux seront identifiés par poinçon à l'oreille (1 fois, 2 secondes) ET 40 D’ENTRE EUX AURONT UNE IMPLANTATION D’UNE PUCE RFID (COMME LES PUCES VETERINAIRES). Ils seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 5 jours. Ils seront également soumis à des tests de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire (équivalent d'un IRM à l'hopital) (6 répartis sur l'ensemble du protocole, soit 6 x1min30 ). Ensuite, 88 animaux recevront aussi 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 7 jours ET PARMI EUX 40 RECEVRONT 1 DERNIERE INJECTION 30 MINUTES AVANT L'EUTHANASIE. Le reste des animaux (SOIT 72) subiront aussi une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (5 secondes par prélèvement) ainsi qu'un test de vitesse maximale aérobie sur tapis (1 fois, 30min). 72 ANIMAUX SERONT ISOLES POUR UNE DUREE INFERIEURE A 48H. Ils seront également soumis à des tests comportementaux (3 fois 5 min et 3 fois 10 secondes).

Impact sur les animaux

Tous les animaux POURRONT RESSENTIR UNE DOULEUR LEGERE LORS DE LEUR IDENTIFICATION PAR MARQUAGE A L'OREILLE OU PAR PUCE. Ils subiront des tests non-invasifs pour caractériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur métabolisme. Ces tests pourront induire du stress. Les tests de capacités fonctionnelles sur les tapis pourraient engendrer du stress chez les animaux. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables du traitement avec les glucocorticoïdes sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement qui sera arrêté si un changement important de comportement est observé. Les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (2 minutes/semaine), de motricité (3 fois 5 min). Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeûne (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Les prélèvements sanguins à la queue et le marquage à l'oreille induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables. Les injections induisent une douleur légère.

Devenir

Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes d’interaction liant fonte musculaire, vieillissement, inflammation et obésité, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite d’euthanasier les animaux en fin de projet.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’avec des animaux car il n’y a pas de modèles cellulaires alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibres musculaires. De plus le vieillissement et la résistance à l’insuline sont des problèmes pathologiques impliquant de nombreux facteurs et de nombreux organes ce qui ne permet pas non plus le remplacement par des méthodes in vitro.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel de calculs statistiques pour définir le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul groupe contrôle pour plusieurs procédures. L’utilisation des deux sexes nous permettra d’inclure tous les animaux à l’étude et d’éviter les mises à mort inutiles lors de la production des lots expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord 1 minute sans mouvement, puis 1 minute à vitesse réduite. L’habituation sera répétée 2 fois, espacées de 24h, avant le test. Le tapis roulant utilisé sera un nouveau modèle sur lequel l’utilisation de stimulation électrique pour motiver la souris à courir est remplacée par un système qui envoie de l’air sur l’arrière train de l’animal. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque geste permettant d’éviter une trop grande fatigue, le stress ou la blessure. Par expérience nous n'avons jamais vu de blessure, cependant si c’était le cas, l’animal serait soigné et sorti du protocole. Chez les animaux obèses, la nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives. Pour le change et la réalisation des tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (2 min environ). Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des souris obèses, nous utiliserons la grille de score adaptée. ENFIN, LES ANIMAUX POURRONT ETRE MAINTENUS EN GROUPE LORS DE L'ANALYSE DE L'ACTIVITE EN VIDEO-TRACKING INFRA-ROUGE GRACE AU SYSTEME DEVELOPPE (4 ANIMAUX ANALYSES EN MEME TEMPS).

Choix des espèces

Les conditions de perte de muscles chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons un modèle génétiquement modifié qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. D'autre part, des souris âgées seront utilisées pour étudier la perte de muscle qui s’installe à partir de 18 mois.

La production des données précliniques exigées par la réglementation avant tout essai chez l'humain fait partie de la finalité déclarée de ce projet sur le syndrome de Sanfilippo de type B, aux côtés de l'évaluation d'une thérapie génique et d'un traitement anti-inflammatoire. 2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées par perfusion intracardiaque après anesthésie profonde pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 320 reçoivent une injection dans la veine de la queue à l'état vigile, 660 subissent une chirurgie cérébrale de quarante minutes avec pose d'une canule guide, et 1 408 passent des tests d'anxiété, d'activité locomotrice et de reconnaissance d'objets. Le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet de suivre la biodistribution du vecteur et les réponses immunitaires, et écrit que les données de cette lignée murine sont "indispensable avant tout essai chez l'humain".

Objectifs

Le syndrome de Sanfilippo de type B (ou MPS IIIB) est une maladie pédiatrique génétique rare, touchant environ 0,5 naissance sur 100 000 en Europe. Elle est causée par un déficit d'une enzyme lysosomale qui entraîne l’accumulation de certaines molécules appelées oligosaccharides d’héparane sulfate dans le cerveau et d’autres tissus. Cette accumulation provoque des problèmes cellulaires, notamment un dysfonctionnement lysosomal, un stress oxydatif, une neuroinflammation et l’activation des cellules immunitaires du système nerveux, qui contribuent aux lésions neuronales et à la progression de la maladie. Les patients présentent un déclin intellectuel progressif et des troubles du comportement, avec une espérance de vie moyenne de 17 à 19 ans. Malgré les avancées en thérapie génique et en traitement enzymatique, aucun traitement ne permet aujourd’hui d'arrêter ou de ralentir l’évolution de la maladie. L’objectif de notre projet est de développer une approche thérapeutique pour le syndrome de Sanfilippo de type B, sur un modèle murin approprié, selon deux stratégies complémentaires : - Une thérapie génique, visant à restaurer l’activité enzymatique déficiente chez les enfants asymptomatiques, afin d’évaluer son potentiel curatif à un stade précoce de la maladie. - Un traitement anti-inflammatoire, destiné aux enfants non éligibles à la thérapie génique, visant à réduire la neuroinflammation, ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie. Pour cela nous utiliserons le modèle de souris génétiquement modifiée MPSIIIB développé par le laboratoire Jackson. Il s'agit du seul modèle murin MPSIIIB qui reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine, notamment l'accumulation de HSO, la neuroinflammation, le déclin comportemental et la mort prématurée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de développer et d’évaluer deux stratégies thérapeutiques complémentaires pour le syndrome de Sanfilippo type B. L’utilisation du modèle murin MPSIIIB permettra d’obtenir des données précliniques essentielles pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces approches et indispensable avant tout essai chez l’humain. En effet, les données générées constituent un prérequis réglementaire pour toute application clinique. Au plus long terme, elles contribueront au développement de thérapies innovantes pour une maladie pédiatrique grave et actuellement incurable et à une meilleure compréhension des maladies lysosomales et neuroinflammatoires.

Procédures

Les interventions concerneront: 1) une injection IV dans la veine caudale sur animaux vigiles (1320 souris, chaque injection prend quelques minutes); 2) une injection intracerebroventriculaire un type de chirurgies sous anesthésie générale (660 animaux, 40 minutes); 3) traitement par alimentation pendant 21 jours; 4) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1408), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal); 5) un prélèvement sanguin à la veine caudale ou mandibulaire (sous anesthésie) pour test sérologique (2240 animaux, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour l’injection IV, l’injection intraveineuse à la queue est susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans l’appareil de contention et/ou de la douleur chez l'animal sur une durée inférieure à cinq minutes. Pour l’injection ICV, malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Pendant les 48 premières heures post-chirurgie, l’injection intra-cérébrale et l’installation des canules guide peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration, anxiété et perte de poids. L'installation de la canule guide chez l'animal peut également entraîner de légères douleurs post-opératoires les premières 48 heures. Durant l'expérimentation, les animaux seront prélevés une ou deux fois en cours d'étude (prélèvement de sang) à la veine mandibulaire ou caudale, ce qui peut provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les 2244 souris seront mises à mort par perfusion intracardique après anesthésie profonde, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires (fibroblastes de patients MPSIIIB et lignée de microglie murine) qui ont démontré l’effet bénéfique des procédures thérapeutiques proposées dans ce projet. La thérapie génique et les traitements anti-inflammatoires agissent sur plusieurs tissus et impliquent des interactions immunitaires complexes. Seul un organisme entier permet de suivre la biodistribution du vecteur ou du traitement, d’évaluer l’efficacité dans le cerveau notamment par des tests de comportement et cognitifs, de mesurer les effets collatéraux ou indésirables, et d’observer les réponses immunitaires et inflammatoires au niveau systémique. Par conséquent, les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Une telle pertinence est essentielle pour garantir la robustesse des résultats et leur transposabilité dans des applications cliniques.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires pour les souris MPSIIIB et de 10 pour le groupe Wild-type. Pour les procédures 1 et 3, nous répéterons les expériences à 3 temps post-traitement différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour la procédure 2, nous répéterons les expériences à 5 temps post-traitement différents. Le calcul de puissance réalisé avec G*Power, basé sur une différence attendue de 20% entre groupes, une variabilité estimée à 15 % et une puissance de 70 %, indique un effectif nécessaire de 10 animaux par groupe. Pour le groupe MPSIIIB, nous prévoyons 12 souris par groupe afin de tenir compte d’une éventuelle mortalité ou exclusion. Ce nombre garantit la détection de l’effet recherché tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict minimum et avoir des résultats significatifs. Nous maximiserons également les données par animal : réalisation de multiples analyses (tests comportementaux, histologie, biologie moléculaire, analyses biochimiques...) sur les tissus prélevés afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Comme dans nos études précédentes, l’expérimentateur principal reste systématiquement en aveugle vis-à-vis du génotype et du traitement administré.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée soit par l’expérimentateur soit par le personnel de la zootechnie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48 heures se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >10 % du poids normal maintenue sur 72 heures ; -hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Pour la procédure 2 – chirurgie pour injection intracérébrale et installation de la canule guide- un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel oculoprotecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le dessèchement oculaire. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et par administration d'analgésique ( administrée 1 heure avant la chirurgie et toutes les 24 heures en fonction de l’état des souris dans les 48 heures postopératoires). La pose d'une canule guide va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'elle implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la canule guide sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré-, per- et post-opératoire. Enfin, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés, spécifiquement la souris MPSIIIB. Cette souche mutée pour l’enzyme lysosomale est le seul modèle à reproduire fidèlement les caractéristiques humaines : accumulation d’héparane sulfate, dysfonction lysosomale, neuroinflammation, troubles cognitifs et comportementaux et réduction de l’espérance de vie. De plus, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, une très bonne adaptation aux conditions expérimentales et surtout être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux seront utilisés à 1 mois, ce qui correspond à l’âge avant l’apparition des symptômes de la maladie pour mimer l’état des patients asymptomatiques qui seront éligibles à ce type de traitement (thérapie génique). De plus, ça permet de laisser 1 semaine entre le sevrage et le début de l’expérimentation pour limiter le stress dû au sevrage. les animaux seront également utilisés à partir de 2 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Et des animaux seront utilisés à partir de 21 jours afin d'étudier l’efficacité de la modulation de l’inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire.

Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever foie, cœur, reins et rate, les deux couples reproducteurs après la période de reproduction, et le sort des autres, âgées de 14 mois à la fin, reste ouvert : le porteur écrit qu'elles pourront être maintenues en vie pour d'éventuels projets compatibles ou être tuées. Le champ structuré du résumé annonce pourtant 4 mises à mort et 26 réutilisations sur 30 souris, un décompte que cette narration ne recoupe pas. Certaines sont génétiquement modifiées pour accumuler du fer, douze reçoivent une alimentation enrichie en fer pendant environ douze mois, et toutes passent cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse pouvant durer deux heures, précédés d'un jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que la faisabilité de sa méthode d'imagerie est déjà démontrée chez des souris saines et qu'il est désormais "nécessaire" de la valider chez des souris en surcharge de fer.

Objectifs

La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.

Procédures

Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.

Impact sur les animaux

Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.

Devenir

Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.

Raffinement

Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Choix des espèces

Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.

Des spores de microsporidie sont injectées dans la peau de l'oreille de souris transgéniques dont les cellules immunitaires sont fluorescentes, après élimination ou non de certains globules blancs par un anticorps injecté deux fois avant l'infection. 290 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 20 d'entre elles subissant en plus quatre jours d'imagerie quotidienne sous anesthésie. Le porteur écrit : "Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l'animal", et écrit ailleurs "Bien que tout stress ne puisse être totalement évité". Les 290 souris sont tuées, les unes à la fin de l'imagerie, les autres à cinq temps échelonnés de deux heures à sept jours après l'infection, pour prélever leurs tissus.

Objectifs

L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Les cellules dendritiques et les macrophages sont des cellules de l’immunité qui jouent un rôle important dans la réaction de défense contre l’infection par les microsporidies chez l’hôte infecté. En piratant ces cellules, la microsporidie contourne la réponse immunitaire de l’hôte. Cependant, peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies de piratage immunitaire in vivo. Notre projet vise tout d’abord à explorer, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre le parasite et les cellules de l’immunité innée (macrophages, cellules dendritiques). En particulier, le modèle du pavillon de l’oreille de la souris est un des plus utilisés pour analyser, par imagerie en temps réel, chez l’animal anesthésié, la dynamique de la réponse immunitaire innée. L’objectif est ici d’appliquer ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. En parallèle, les interactions entre les microsporidies et les macrophages ou les cellules dendritiques murines seront étudiées in vitro. En améliorant nos connaissances sur la réponse immunitaire dirigée contre la microsporidie E. cuniculi, de nouveaux traitements ciblant le système immunitaire pourront être mis au point pour mieux contrôler ces infections chez l’homme.

Bénéfices attendus

De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre l’espèce microsporidienne E. cuniculi, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies de traitement permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.

Procédures

1. Imagerie de la réponse immunitaire dirigée contre Encephalitozoon cuniculi -Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez des souris transgéniques possédant des cellules immunitaires fluorescentes. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. -Anesthésie générale des animaux traités ou non (avec ou sans polynucléaires neutrophiles) et infectés -Imagerie du tissu de l’oreille sur animal vivant anesthésié, par microscopie (imagerie en temps réel), chaque jour pendant 4 jours. Les animaux anesthésiés sont mis à mort à la fin de l’expérience (jour 4). Nombre total d’animaux concernés : 20 souris (10 souris traitées, 10 souris contrôle) 2. Expériences avec biopsies tissulaires chez les animaux C57BL6 infectés par E. cuniculi. - Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez les souris C57BL6. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. - Mise à mort des souris aux différents temps d’infection (2h, 24h, 48h, 72h et 7 jours). Les tissus d’intérêt sont prélevés très rapidement après vérification de la mort de l’animal. Nombre total d’animaux concernés : 135 animaux pour les études immunologiques et 135 animaux pour les mesures de charge parasitaire.

Impact sur les animaux

Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection intradermique des spores pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. Les expériences sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutanée est généralement minime. Point limite : Pendant toute la durée de l’expérience, toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière mènera à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec mise à mort des animaux.

Devenir

Procédure 1 : mise à mort à la fin de l’expérience de microscopie confocale. Le suivi des souris infectées s’effectue sur une durée de 4 jours. Au-delà, les animaux sont sacrifiés afin d’éviter les complications liées à la dissémination tissulaire des parasites. De plus, les animaux étant infectés, ils ne sont pas réutilisables pour d’autres expérimentations. Procédure 2 : mise à mort pour prélèvement de tissus

Remplacement

Notre projet inclut des expérimentations réalisées avec des cellules immunitaires en culture, mais elle reste largement insuffisante pour étudier en détail les interactions entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire à l'échelle tissulaire chez un animal. Le recours à l’approche d’imagerie en temps réel chez l’animal vivant anesthésié permet d’étudier la mise en place de cette réponse immunitaire au sein du tissu cutané.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Pour les expériences de microscopie en temps réel chez l’animal vivant, le nombre d'animaux requis sera faible (20 au total sur une année : 10 animaux avec ou sans polynucléaires neutrophiles) car cette approche permet d'étudier la réponse immunitaire chez un même animal en fonction du temps, après anesthésie. Pour les expériences étudiant la réponse immunitaire, ainsi que pour les mesures de charge parasitaire dans les tissus, le nombre total d'animaux utilisés est réduit au minimum et fixé à 135 (3 animaux par point de cinétique, 5 points de cinétique, 3 conditions expérimentales, 3 expériences). Ce chiffre a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Total des animaux utilisés sur 3 ans : 20+135+135= 290 animaux

Raffinement

Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont hébergés par groupes de 5 individus au maximum pour permettre le maintien d’un bien-être social. Ils sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis sont établis et les expériences sont arrêtées en conséquence. Bien que tout stress ne puisse être totalement évité, les procédures et mesures de raffinement mises en œuvre visent à en limiter l’intensité et la durée. En particulier, toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection des parasites dans la peau pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’infection, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. A chaque temps de l’expérimentation de microscopie, une couverture chauffante thermorégulée est placée sur l’animal anesthésié pour éviter l’hypothermie. Après l’expérimentation et pendant la phase de réveil, l'animal est maintenu sur le tapis chauffant et gardé en observation pendant 2 heures, puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les expériences de microscopie sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutané est généralement minime. Point limite : Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de la parasitologie et de l’immunologie. Le recours à une lignée de souris transgénique qui possède des cellules immunitaires fluorescentes nous permet de visualiser en temps réel chez l’animal anesthésié la mise en place de la réponse immunitaire innée lors d’une infection microsporidienne. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines (âge adulte), ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.

Pour évaluer des sérums neutralisants et des associations d'antibiotiques contre la leptospirose, 3 188 souris et 36 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris sont infectées par injection dans l'abdomen, reçoivent jusqu'à cinq injections supplémentaires et passent quatre séances d'imagerie de vingt à vingt-cinq minutes à J3, J7, J14 et J28, les cobayes étant utilisés pour produire des sérums enrichis en immunoglobulines. À dose élevée, le porteur décrit une perte de 10 à 12 % du poids, un poil hérissé, une perte de tonus, un ictère possible et une légère prostration. Chaque souris infectée à cette dose est tuée trois jours après l'infection, avant toute dégradation clinique, et aucun des 3 224 animaux non-humains n'est réutilisé, replacé ni adopté.

Objectifs

Cette étude porte sur la leptospirose, une infection bactérienne véhiculée par des animaux et transmise accidentellement à l’homme par contact avec des milieux contaminés (eaux, sols). Bien que méconnue, cette maladie représente un enjeu de santé publique croissant, parce-que liée à des facteurs comme les changements climatiques ou l’expansion des réservoirs animaux naturels. Les formes graves, bien que rares, peuvent entraîner des complications sévères, voire mortelles (10 % des cas). À ce jour, les options thérapeutiques disponibles restent limitées : • Aucun traitement préventif (comme un vaccin) n’offre une protection large et durable contre les nombreuses variantes de la bactérie responsable. • Le traitement actuel, basé sur des antibiotiques, n’est efficace que s’il est administré très tôt après l’infection. De plus, chez certains patients, il peut provoquer une réaction inflammatoire excessive et dangereuse, aggravant brutalement leur état. Par ailleurs, une fois la bactérie installée dans certains organes, elle devient résistante aux traitements classiques. Face à cette situation, il est urgent d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques, applicables dès les premiers signes de la maladie, pour améliorer la prise en charge des patients et réduire les risques de complications. Ce projet vise à évaluer deux stratégies thérapeutiques innovantes, appliquées précocement après l’infection, afin de : 1. Renforcer les défenses immunitaires par l’administration de préparations biologiques (sérums) capables de neutraliser les différentes souches de bactéries. Ces préparations sont obtenues grâce à un composé expérimental qui potentialise la production d’anticorps naturels. 2. Optimiser l’utilisation des traitements existants en : o Adaptant les protocoles d’administration pour en maximiser l’efficacité tout en réduisant les risques de réaction inflammatoire indésirable. o Testant des combinations thérapeutiques (associant le traitement de référence à des anti-inflammatoires ou à d’autres molécules aux propriétés antimicrobiennes), afin de limiter les effets secondaires et d’améliorer la réponse globale. Parallèlement, le projet cherchera à : • Comprendre les mécanismes à l’origine de la réaction inflammatoire excessive observée chez certains sujets après traitement. • Identifier les cellules immunitaires impliquées dans cette réponse, afin de mieux cibler les futures stratégies.

Bénéfices attendus

La leptospirose, infection bactérienne causée par des Leptospira, pose un défi thérapeutique majeur : les antibiotiques, bien que nécessaires, peuvent aggraver les symptômes et sont inefficaces une fois les bactéries installées dans les reins. Le traitement doit donc intervenir précocement, durant la phase de dissémination sanguine, pour être efficace. Ce projet de recherche explore deux stratégies thérapeutiques innovantes, appliquées en phase aiguë : 1. L’administration d’anticorps optimisés. L’objectif est de développer des préparations d’anticorps capables de cibler et neutraliser les leptospires, quelle que soit la souche infectante. Cela implique d’étudier les mécanismes d’action du composé pharmacologique utilisés pour améliorer la reconnaissance des bactéries et d’évaluer l’efficacité curative sur des modèles expérimentaux. Les bénéfices attendus sont une éradication rapide des leptospires après traitement et une prévention de la colonisation rénale chronique. 2. L’administration d’antibiotiques, seuls ou combinés. Actuellement, les antibiotiques restent le traitement de référence, mais leur efficacité est limitée à la phase précoce, et ils peuvent déclencher une réaction inflammatoire grave chez le patient. Ce projet cherche à : a) élucider les mécanismes cellulaires de la réaction inflammatoire, en lien avec le type d’antibiotique, la souche bactérienne, la dose infectante et le protocole d’administration, b) prévenir cet effet indésirable via des ajustements thérapeutiques ou en associant l’antibiotique avec d’autres composés pharmacologiques pour limiter la réponse immunitaire excessive, c) proposer de nouvelles recommandations cliniques pour une prise en charge plus sûre. Ce projet, dans sa globalité, permet de caractériser et définir les acteurs de la réponse immunitaire, au cours d’une infection à Leptospira. C’est un projet de recherche qui devrait apporter des éléments pertinents et adaptés pour une meilleure prise en charge des patients atteints de leptospirose. C’est important dans un contexte où, à cause du changement climatique notamment, cette maladie sous-estimée, négligée, connaît actuellement une réémergence.

Procédures

1. Injections dans l’abdomen o Nombre : 1 à 5 injections par souris (selon protocole). o Durée : Quelques secondes par injection. 2. Intervention sous anesthésie o Nombre : 1 intervention par animal. o Durée : quelques dizaines de secondes 3. Injections intraveineuses o Nombre : 1 injection par souris. o Durée : Quelques secondes. 4. Infection par injection dans l’abdomen o Nombre : 1 injection par souris infectée. o Durée : Quelques secondes. 5. Imagerie o Nombre : 4 sessions par souris (J3, J7, J14, J28). o Durée : 20-25 min par session.

Impact sur les animaux

1. Effets liés aux injections et manipulations Les animaux (souris et cobayes) subissent des injections à différents stades du protocole : • Infection par la bactérie étudiée • Administration de composés pharmacologiques Les nuisances potentielles peuvent être une légère douleur locale lors de l’insertion de l’aiguille et du stress lié à la manipulation (contention) et durent généralement quelques secondes. 2. Effets liés à l’imagerie in vivo Les souris infectées subissent des séances d’imagerie pour suivre l’évolution de l’infection. Ces séances impliquent : • Une injection dans l’abdomen • Une anesthésie gazeuse légère pour immobiliser l’animal pendant l’acquisition des images. Les nuisances potentielles peuvent être liées à de l’inconfort lié à l’anesthésie et du stress lié à la manipulation (contention) et durent généralement de 20 à 25 mn maximum. 3. Effets liés à l’infection bactérienne ; durée de 3 jours en cas de dose sévère, < 5 jours pour une dose modérée Deux doses d’infection sont utilisées, entraînant des effets différents sur les animaux : a. Dose sub-létale (modérée) • Effets légers et transitoires (< 5 jours) : o Perte de poids limitée (~5 % du poids initial) o Signes cliniques mineurs sans impact sur le bien-être général. b. Dose élevée Cette dose est utilisée uniquement pour étudier les mécanismes des formes graves de l’infection. • Perte de poids attendue de 10 à 12% du poids initial Signes cliniques : poil hérissé, perte de tonus, ictère possible ainsi que légère prostration.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les organes cibles et/ou le sang de tous les animaux, sans aucune exception, seront prélevés et utilisés à l’étude scientifique menée.

Remplacement

L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …). Il existe une technique qui permet de générer des anticorps sans recourir à des animaux mais elle n’est pas adaptée à ce stade de notre projet car nous souhaitons obtenir une collection de sérums contre 3 souches bactériennes, mimant la réponse immunitaire naturelle et sa diversité, pour tester des traitements. Des données préliminaires menées ex vivo à partir de sang volontaires sains humains montrent une élévation des marqueurs inflammatoires dans les échantillons de sang mis en contact avec des leptospires, puis incubés avec des antibiotiques comparativement aux échantillons infectés non traités. Chaque fois qu’il est possible de progresser dans nos études avec des expériences ex vivo ou in vitro, cela permet de réduire et restreindre les études in vivo au strict nécessaire.

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) est établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Pour ce projet nous souhaitons étudier les deux sexes indifféremment, c’est pourquoi chaque groupe expérimental, selon les expériences utilisant des souris, est constitué de 3 ou 5 mâles et de 3 ou 5 femelles. Pour la procédure utilisant des cobayes, chaque groupe expérimental comprend de 2 à 6 individus selon l’expérience, mâles et femelles également. Ce nombre est défini d’après notre expérience, et avec l’aide d’un biostatisticien. Des tests statistiques sont appliqués pour déterminer la significativité des données. De plus, les expériences utilisant de l’imagerie permettent de suivre le cours d’une infection de façon longitudinale sans mises à mort intermédiaires, ce qui réduit significativement le nombre d’animaux utilisés et seules les expériences donnant des résultats intéressants seront répétées. Au fil des expériences, l’effectif de certains groupes témoins pourra être diminué selon la reproductibilité des données.

Raffinement

Les souris et cobayes, qu’ils soient témoins ou ne recevant que le composé chimique d’essai, bénéficient d’un suivi avec pesée régulière jusqu’à leur mise à mort. Les composés utilisés sont connus pour ne pas induire d’effets indésirables ou néfastes, à la dose utilisée. Chaque souris est observée, pesée quotidiennement jusqu’à 5 jours après infection puis hebdomadairement, et évaluée sur le plan clinique. Chaque symptôme clinique est relevé pour établir un score. Une échelle de sévérité de ces signes, spécifiques de la leptospirose est établie. Des points limites sont établis, à partir desquels l’animal est mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si des signes cliniques apparaissent, une aide à l’alimentation est ajoutée dans la cage (gel nutritif), ainsi qu’un surcroit de coton pour renforcer l’enrichissement. Après infection à dose sévère, chaque souris est mise à mort 3 jours après infection, de façon anticipée à toute dégradation clinique de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire proches de ceux de l’homme ; ainsi, les résultats expérimentaux et la compréhension des mécanismes immunitaires mis en place lors de l’infection par les leptospires seront très probablement transférables à l’Homme. L’étude de la leptospirose implique un hôte et les bactéries qui l’infectent. La complexité des mécanismes d’induction des réponses immunitaires et de l’interaction hôte-pathogène ne peut pas être appréhendée dans sa globalité in vitro. La souris, hôte naturel, est idéale pour pouvoir mieux comprendre la leptospirose. Le cobaye, est décrit comme un modèle crucial pour étudier le système immunitaire humain car ses gènes immunologiques sont plus proches encore de l’Homme que ceux de souris. C’est donc une espèce animale particulièrement appropriée pour générer des sérums enrichis en immunoglobulines, utiles à des essais de neutralisation avec du sang humain. Toutes les expériences utilisant des souris sont réalisées avec des animaux adultes (âgés de minimum 6 semaines à l’achat, et de maximum 12 semaines pour entrer en expérimentation). A cet âge, le système immunitaire est considéré mature, condition nécessaire pour pouvoir interpréter de façon fiable les données. Les cobayes utilisés dans la procédure 2 sont des animaux adultes (250-350 g), au système immunitaire mature de façon à garantir une quantité maximale de sérums avec le minimum d’animaux.

195 rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs tissus. Leur maladie s'aggrave avec le temps et gêne de plus en plus la marche et la respiration. S'y ajoutent un prélèvement de queue pour le génotypage, une injection intraveineuse pratiquée sur rat éveillé, des prises de sang hebdomadaires et, chaque mois, des mesures cardiaques, musculaires et respiratoires pouvant durer une demi-heure. Une partie des rats est traitée entre 1 et 15 jours de vie puis tuée entre 3 et 18 mois, pour représenter des patients de moins de quatre ans. Le porteur écrit que l'agence européenne du médicament lui demande ces études précliniques sur un candidat déjà en essai clinique chez des enfants de 6 à 10 ans, et que les agences réglementaires "imposent de recourir à l'animal" pour ce type d'études.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire affectant uniquement les garçons. La pathologie est causée par des mutations du gène DMD qui entraînent la perte de la dystrophine, une protéine indispensable à la fonction des muscles. En l’absence de dystrophine, les muscles subissent une diminution progressive et généralisée de force amenant à une perte des capacités motrices, souvent compliquée par une faiblesse respiratoire et/ou cardiaque. La dystrophie musculaire de Duchenne se manifeste dès les premières années de la vie et réduit la qualité et l’espérance de vie des patients. Notre laboratoire a développé un candidat-médicament pour soigner cette pathologie. Le candidat est composé d’un transporteur permettant d’apporter dans les muscles un gène capable de produire la protéine déficiente. Ce produit est actuellement évalué dans un essai clinique chez des patients âgés de 6 à 10 ans. Puisque la maladie est différente selon l’âge du patient, l’agence européenne du médicament nous demande de réaliser de nouvelles études précliniques dans le modèle murin de la pathologie afin d’anticiper l’application de notre produit à une population pédiatrique très jeune (0 à 4 ans), et à une population non ambulante de moins de 18 ans. Dans les études précliniques de ce projet, nous utiliserons le modèle de rongeur le plus pertinent de pathologie de Duchenne, le rat DMD, qui reproduit les symptômes musculaires, cardiaques et respiratoires de la pathologie. L’efficacité thérapeutique sera analysée à court et long terme dans chacune des deux populations animales, en utilisant un intervalle de doses allant de la dose testée en clinique jusqu’à des doses supérieures déterminées sur la base des données de la littérature.

Bénéfices attendus

Le bénéfice thérapeutique des approches thérapeutiques utilisant des produits similaires au nôtre a déjà été démontré dans de nombreux modèles animaux, et dans plusieurs études cliniques (dont la nôtre) chez des patients atteints de la myopathie de Duchenne. Cependant, aucune étude n’a encore permis d’évaluer l’efficacité de notre produit chez des patients très jeunes (moins de 4 ans) ou chez des patients présentant une forme très sévère de la maladie (patients non ambulants de moins de 18 ans). Cette étude nous permettra de déterminer si notre produit présente les mêmes effets thérapeutiques dans ces 2 populations de patients que dans la population en cours de traitement (enfants de 6 à 10 ans). Elle pourrait nous conduire à ajuster la dose si le produit s’avérait moins efficace dans l’une ou l’autre de ces 2 populations (voire dans les deux).

Procédures

Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques seront délivrées par une injection intraveineuse unique sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes) : ces prélèvements seront réalisés 1 fois par semaine au maximum. Les rats seront soumis à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes (maximum 1 fois par mois): mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité et de mobilité et mesure de composition corporelle (durée moyenne 15min).

Impact sur les animaux

Les animaux ont une maladie qui atteint les muscles, la respiration et le cœur. La maladie s’aggrave avec le temps. Les animaux ont des difficultés de plus en plus importantes pour bouger et respirer. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation de la fonction des organes seront réalisés sous anesthésie. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un bout de queue ou d’oreille, des injections du traitement thérapeutique, des injections de molécules anesthésiques ou antidouleurs, ainsi qu’au moment des prélèvements de sang. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient apparaitre lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire. Des irritations de la peau pourraient être observées à l’endroit de l’épilation nécessaire pour la mesure de la fonction cardiaque. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement des tissus et les analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie de Duchenne est causée par l’absence d’une protéine appelée la dystrophine : les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions. Le projet consiste à mesurer l'effet d’un médicament composé d’un virus non pathogène transportant la dystrophine au sein des cellules cardiaques et musculaires malades : ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de virus transporteurs de notre médicament entraine une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre les virus, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. Enfin, les agences réglementaires du médicament nous imposent de recourir à l’animal pour ce type d’études. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.

Réduction

Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats ; 2) L’utilisation de données historiques et la partage de certains groupes de rats témoins entre procédures ; 3) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) ; 4) l’obtention des rats non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux et 5) un suivi quotidien, des règles strictes de raffinement et le respect des points limites permettant de garantir le bien-être animal et l’exploitation de toutes les données produites.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant certains tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles. Lors de certains de ces tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant le test. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour mesurer l'efficacité de médicaments pour la maladie de Duchenne (DMD), pathologie qui affecte le bon fonctionnement des muscles et du cœur. Le modèle de souris de cette maladie permet une évaluation très complète des différents muscles, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque typique des Hommes affectés par la maladie. Le rat est le seul modèle de rongeur reproduisant tous les aspects de la pathologie (atteinte des muscles et du cœur). L'utilisation du modèle de rats DMD permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. De plus, afin de pouvoir comparer les résultats avec les données historiques, les agences réglementaires exigent que l’évaluation des effets du produits soit réalisée sur le modèle animal de rats utilisé lors des études précliniques précédentes. Afin de modéliser une population de patients DMD âgés de moins de 4 ans, les rats juvéniles auront entre 1 à 15 jours au moment du traitement puis entre 3 à 18 mois à l’euthanasie afin d’évaluer les effets à court et à long terme. Afin de modéliser une population de patients DMD non ambulants de moins de 18 ans, les rats auront entre 6 à 9 mois en début de traitement et entre 9 à 18 mois à l’euthanasie pour permettre l’évaluation des effets à court et long terme.

Irradiées sur la moitié du thorax sous anesthésie, puis une seconde fois neuf semaines plus tard sur la même zone, 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs poumons. S'y ajoutent un gavage quotidien jusqu'à dix fois, deux prélèvements sanguins sur souris éveillée et un scanner sous anesthésie gazeuse. Le projet cherche à savoir si deux médicaments éliminant les cellules sénescentes rendent le poumon plus tolérant à une seconde irradiation, une option envisagée pour ré-irradier des patients. Le porteur écrit qu'aucun recul n'existe sur la toxicité d'une ré-irradiation de la même zone thoracique ni sur ses effets cutanés, et n'énonce aucun seuil déclenchant la mise à mort.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement essentiel utilisé chez environ 60 % des patients atteints de cancer à un moment de leur parcours. Grâce aux progrès médicaux, les patients vivent plus longtemps. Cependant, cette amélioration augmente le risque de voir apparaître une récidive du cancer, des métastases ou un nouveau cancer, ce qui peut nécessiter une nouvelle radiothérapie. La ré-irradiation correspond à l’application d’une seconde radiothérapie sur une zone déjà traitée. Elle peut entraîner davantage d’effets secondaires, car les organes pourraient garder une « mémoire » de la première irradiation et être plus fragiles lors de la seconde. Il existe peu d’études cliniques sur ce sujet. Elles portent sur un petit nombre de patients et utilisent des méthodes différentes, ce qui rend les comparaisons difficiles et limite les conclusions sur les risques. Les études chez l’animal sont également rares et peu adaptées à l’homme, car les doses, les protocoles et les intervalles de temps ne sont pas directement comparables. Dans ce projet, nous proposons d’aborder les choses autrement en administrant un médicament connu pour ses effets bénéfiques sur les lésions pulmonaires afin de déterminer si limiter la toxicité d’une première irradiation peut augmenter la tolérance du poumon à une seconde irradiation. Les deux médicaments choisis ciblent les cellules sénescentes, qui sont des cellules « activées » participant à l’inflammation chronique des tissus, et incapables de s’orienter vers la mort cellulaire. Les forcer à mourir empêche leur accumulation dans le poumon et limite les dommages tissulaires. Le modèle utilisé est une irradiation localisée du poumon gauche chez la souris avec un faisceau de la taille du poumon gauche, puis une 2nde irradiation à l’identique (faisceau large), ou en utilisant plusieurs mini-faisceaux. Diviser un faisceau large en plusieurs petits faisceaux (fractionnement de la dose dans l’espace) consiste à alterner des zones irradiées et des zones non-irradiées dans le poumon. Cette technique a été montrée comme moins toxique. Cette stratégie fait partie des options envisagées en radiothérapie afin de pouvoir ré-irradier les patients de manière plus sûre. Nous additionnerons donc dans ce projet l’effet des médicaments et celui du fractionnement de la dose dans l’espace.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre au point un modèle d’irradiation hémithoracique avec ré-irradiation chez la souris, avec l’apport d’une preuve de concept sur l’implication des cellules sénescentes dans le développement des lésions pulmonaires. Il pourrait également montrer qu’en éliminant ces cellules sénescentes, on peut : 1) Réduire les effets secondaires pulmonaires liés à la radiothérapie, 2) Rendre possible une seconde irradiation du thorax dans de meilleures conditions de sécurité, 3) Permettre des traitements plus efficaces et plus intensifs, tout en protégeant les tissus sains. En somme, ce travail vise à ouvrir la voie à des traitements anticancéreux plus performants et mieux tolérés pour les patients atteints de tumeurs thoraciques.

Procédures

Selon les lots : - Irradiation de la moitié du thorax sous anesthésie chimique (durée 5 à 10 min, 2 fois maximum à 9 semaines d’intervalle) - Gavage quotidien (contention 1 min, maximum 10 fois) - Prélèvement sanguin vigile (2 fois, à 3 semaines d’intervalle) - Scanner sous anesthésie gazeuse (durée 4 min)

Impact sur les animaux

D’après la bibliographie, l’irradiation de la moitié du thorax à une dose unique de 30 Gy ne génère pas de mortalité. En revanche, aucun recul n’existe sur la toxicité d’une ré-irradiation de la même zone thoracique, qui pourrait générer de la toxicité. Les effets cliniques de l’irradiation au niveau thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une première dose de 30 Gy peut générer des lésions à la peau. D’après des études précédentes au laboratoire, les lésions cutanées à la peau (irradiation de la patte) après 30 Gy cicatrisent en 40 jours. La ré-irradiation aura lieu 9 semaines après la première, la peau aura donc cicatrisé. En revanche, nous n’avons pas de recul sur les effets cutanés d’une ré-irradiation. Du stress et de l’anxiété peuvent être générés au moment de la manipulation (gavages, pesées).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement pulmonaire à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

On ne peut vraiment comprendre comment le tissu pulmonaire réagit aux rayonnements ionisants qu’en l’étudiant dans un organisme vivant, où toutes les fonctions biologiques interagissent entre elles

Réduction

Les expériences faites pour étudier les lésions causées par l’irradiation dépendent beaucoup du fonctionnement naturel du corps (la physiologie). Pour que les résultats des tests statistiques soient fiables, il faut utiliser au moins 10 animaux par groupe exposé à l’irradiation. Cela permet d’obtenir des données suffisamment solides pour tirer des conclusions valables. En revanche, 6 animaux par groupe sont suffisants pour les groupes non irradiés. A noter que l’aspect réponse tumorale sera abordé in vitro sur un modèle de sphéroïdes de cancer pulmonaire.

Raffinement

Les animaux utilisés pour les expériences sont soignés et hébergés dans des conditions adaptées, afin de réduire au maximum leur souffrance. Ils sont surveillés régulièrement, anesthésiés pendant les irradiations et vivent en groupe dans un environnement enrichi pour leur bien-être. Les gestes techniques sont assurés par des techniciens expérimentés.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu et très utilisé pour les recherches avant les essais sur l’humain. C’est aussi l’animal de référence dans notre laboratoire. Les études précédentes sur l’irradiation des poumons ont déjà été réalisées sur des souris. Les animaux utilisés auront entre 10 et 22 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte. Nous choisissons des souris adultes car notre recherche porte sur les effets à long terme de la radiothérapie chez les adultes. Les effets chez les enfants (ou jeunes sujets) relèvent d’un autre domaine de recherche. Enfin, des animaux mâles et femelles seront utilisés.

Fournir à un dossier d'autorisation de mise sur le marché les données réclamées sur l'espèce à laquelle le produit est destiné : 720 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester des produits vétérinaires contre l'obésité canine. Ils reçoivent des administrations et des prélèvements sanguins, éveillés ou anesthésiés, des écouvillons rectaux et des prélèvements urinaires, et passent chaque semaine un examen physique avec notation de leur état corporel, les périodes d'alimentation individuelle pouvant faire baisser leur prise alimentaire. Parmi les atteintes attendues, le porteur liste des signes cliniques secondaires à l'obésité, troubles métaboliques, douleurs articulaires et troubles cardio-vasculaires, alors qu'il présente le bénéfice du projet comme une amélioration du "bien-être" de la population canine obèse par la réduction de ces mêmes risques. Sur les 720 chiens, 625 seront réutilisés dans d'autres procédures et 65 adoptés, 30 étant tués pour des prélèvements après leur mort.

Objectifs

L'obésité chez le chien est un problème de santé majeur, sachant que plus d'1 chien sur 3 est en surcharge pondérale et que l'obésité est associée à des désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires. L'objectif de ce projet est d’évaluer des produits vétérinaires destinés à lutter contre l’obésité chez le chien. Avant qu’un traitement ne soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique tout en présentant une innocuité acceptable sur l’obésité de l’animal. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.

Bénéfices attendus

Ces études permettent de définir l’innocuité et l’efficacité des produits vétérinaires testés et d’expliquer la relation entre la dose et la réponse, c'est-à-dire, l'effet du produit. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration (parentérale, orale, …) du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Ces informations sont nécessaires à l’obtention de l’AMM de nouveaux produits. Les bénéfices de ce projet sur la population canine obèse sont d’améliorer leur bien-être en réduisant les risques liés à l’obésité, désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires

Procédures

Les administrations s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié, selon l'objectif de l'étude et durent environ 3 minutes. Les prélèvements sanguins s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié en fonction du comportement de l'animal, selon le protocole et durent environ 3 minutes. Des écouvillons rectaux peuvent être effectuer en fonction des objectif de l'étude ainsi que des prélèvements urinaires. Ces actes peuvent durer 5 à 10 minutes. Enfin, un examen physique complet (incluant pesée et body condition score) de tous les animaux en vigile est prévu 1 fois par semaine ou plus si jugé nécessaire et dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les produits à l’étude ont déjà fait preuve de leur innocuité chez d’autres espèces (rongeurs). Les nuisances attendues sur les animaux sont : stress dû à la contention ; douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements ; stress / baisse de la prise alimentaire pendant les périodes d’alimentation individuelle (training prévus pour limiter le stress de la prise alimentaire individuelle) et baisse de prise alimentaire et perte de poids trop importante durant les périodes de traitement ; signes cliniques secondaires à l’obésité (apparition potentielle de troubles métaboliques, de douleurs articulaires, troubles cardio-vasculaires,...).

Devenir

Les animaux seront réutilisés et/ou adoptés. Dans le cadre de certaines études d'efficacité ou d'innocuité, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post mortem.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer la pharmacocinétique ou la pharmacodynamie des produits pharmaceutiques vétérinaires. Les modèles in silico et/ou in vitro/ex vivo permettent de sélectionner des molécules potentiellement efficaces. Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques d’un futur candidat médicament.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires de pharmacocinétique/Pharmacodynamique (3 ou 4 animaux par groupe). Il sera ensuite calculé pour les études suivantes selon la variabilité entre individus observée antérieurement et pourra atteindre jusqu’à 10 animaux. Compte-tenu de la variabilité individuelle, les études d’innocuité et d’efficacité seront réalisées sur des groupes pouvant aller jusqu'à 8 ou 12 animaux. Ces effectifs s'évaluent en fonction de la bibliographie, de l'historique ou des objectifs de l'étude. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.

Raffinement

Une période d’acclimatation optimale de 7 jours est prévue. Les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. Pour limiter le stress lié à l’alimentation individuelle, celle-ci est réduite au minimum (

Choix des espèces

Il s’agit des espèces cibles pour les produits. Des données concernant l’espèce doivent être fournies au dossier pour l’obtention de l’AMM. Les animaux inclus peuvent être des chiens avec ou sans embonpoint. Les chiens utilisés ont plus de 9 mois. L’âge dépend de l’objectif de l’étude et du scope d’utilisation du produit testé (AMM).