Procédures légères

Privés par chirurgie des transporteurs neuronaux du glucose ou du lactate, 188 rats sur 224 subissent une opération stéréotaxique de 75 minutes avec deux injections dans le cerveau. Les 224 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement des cerveaux. Trois semaines après l'opération, chacun passe six séances de dix minutes dans une arène blanche où l'on mesure sa reconnaissance des textures, puis 118 d'entre eux subissent une heure d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie. Le porteur qualifie ces deux techniques d'imagerie de "non-invasives pour les animaux" et annonce par ailleurs qu'un changement important du rythme cardiaque ou respiratoire peut survenir sous anesthésie, ce qui arrête l'expérimentation.

Objectifs

L'énergie est indispensable au fonctionnement des neurones, notamment pour accomplir des tâches complexes comme l'apprentissage et la mémoire. Historiquement, il était admis que le glucose était la source d’énergie des neurones. Cependant des recherches récentes indiquent que le lactate, un métabolite du glucose, fabriqué en grande partie par les astrocytes (des cellules de soutien du cerveau), pourrait aussi être source d’énergie pour les neurones. Il a été proposé que lors de l’activation cérébrale, les astrocytes captent le glucose depuis la circulation sanguine, le transforment en lactate qui est transféré aux neurones. Dans les neurones, ce lactate pourrait servir de carburant. Les preuves de ce processus ont été mises en évidence sur des cultures de cellules ou à partir de prélèvement de cerveaux mais jamais chez l’animal vivant. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier in vivo le métabolisme énergétique cérébral de rongeurs, lors de l’activation cérébrale. Ce projet vise à déterminer quel est le carburant préférentiel des neurones lors de l’activation cérébrale. Pour répondre à cet objectif, nous évaluerons la contribution et le rôle du glucose ou du lactate dans l’apprentissage et la mémoire associative à long terme chez des animaux privés de transporteurs de glucose ou de lactate. Ce projet se déroulera dans deux EU. Dans un premier temps, cette évaluation sera réalisée chez les rats, par analyse d’apprentissage, de reconnaissance et de mémorisation des textures de certains objets de son environnement. Par la suite, de l’imagerie par résonnance magnétique sera réalisée afin de détecter de l’activité cérébrale des rats lors de la stimulation de leurs moustaches. La spectroscopie par résonnance magnétique complétera les données afin de mesurer les quantités de lactate ou du glucose dans le cerveau activé. Ainsi, le maintien ou non de l’activité cérébrale chez ces rats permettra de statuer sur l’importance de la consommation neuronale du glucose ou de lactate dans l’activation neuronale. Outre l’importance de ces résultats au niveau fondamental, la compréhension de ces mécanismes pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les maladies ou le métabolisme énergétique est défaillant (hypoxie-ischémie néonatal, cancer, maladies neurodégénératives).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébral et les interactions entre les différentes cellules qui constituent le cerveau. Ces interactions sont cruciales d’un point de vue fondamental. De plus, la compréhension de ces processus pourrait aussi permettre de développer des stratégies thérapeutiques pour certaines maladies dans lesquelles ce métabolisme énergétique est dérégulé (hypoxie-ischémie néonatale, accident vasculaire cérébral, maladie d’Alzheimer, …).

Procédures

Pour la mise en place du modèle de rat dépourvu de transporteurs neuronaux de glucose ou du lactate, des chirurgies stéréotaxiques seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésiant chez les rats (75 min d’intervention avec deux injections par animaux, N=188) à l'EU1. Après 3 semaines post-chirurgie, le test de comportement sera réalisé sur tous les rats (N=224) au sein de l'EU1. Le test sera effectué dans une arène blanche en 6 sessions (1 session/jour ; 10 min par session). Après le test de comportement, les rats anesthésiés (N=118) seront soumis à de l’imagerie par résonnance magnétique et de la spectroscopie par résonnance magnétique (1 heure/animal) au sein de l'EU2. Ces deux techniques sont non-invasives pour les animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Chirurgie : un inconfort transitoire au réveil et une douleur post-opératoire, une perte de poids légère et transitoire dans les premières 48h-72h l’intervention. - IRM : un inconfort transitoire à la suite de la pose des cathéters, un changement important du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé sous l’animal, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entrainera l’arrêt de l’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour les analyses moléculaires, protéiques et métaboliques.

Remplacement

Des modèles de co-culture (lignées neuronale et astrocytaires) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure intégrative : décrypter le métabolisme énergétique cérébral. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de définir quelle est la source énergétique qui permet l’activation neuronale (glucose ou lactate), il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Concernant la réduction, nous avons réalisé en amont, des expériences sur des neurones en culture (in vitro) afin de valider l'utilisation des réactifs nécessaires au projet. Cette phase d'étude in vitro limitera le nombre de rats utilisés dans le projet. Des études précédentes menées par l’équipe nous a permis de déterminer les effectifs d’animaux nécessaire pour lisser la variabilité interindividuelle et mettre en évidence les différences significatives entre les individus contrôles et ceux qui sont privés de transporteurs de glucose ou le lactate. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Les modèles d’inhibition des transporteurs pour le glucose ou le lactate utilisé dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraine pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, l’appétit, et la mobilité des animaux. Les animaux seront hébergés en cycle inversé dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce (bloc de bois et tunnel) afin d'éviter l'ennui et complété par un suivi hebdomadaire de leur état de santé dès leur arrivée à l’animalerie. Ils auront accès à l’eau et de la nourriture ad libitum. Le bien-être des animaux sera pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide à identifier des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. Cela permettra une prise en charge afin d’arrêter toute souffrance des animaux. Le bien-être animal est pris en compte à chaque étape avec une pesée 1 fois par semaine et pendant 7 jours après l’intervention chirurgicale. Toutes les phases du projet seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, auquel les rats seront habitués avant le début de la procédure. Les animaux bénéficieront d’une prise en charge antalgique avant et post-chirurgie afin de réduire au maximum la douleur.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous maîtrisons l’expertise des actes chirurgicaux et ainsi la manipulation de ce modèle de rat. Dans cette étude, les rats mâles et femelles seront utilisés à l’âge de 10 semaines car le métabolisme énergétique cérébral est différent à des stades plus précoces.

Tuées après quatre jours de régime modifié ou après un gavage, les mères le sont avec leurs petits, dont les cerveaux sont prélevés à des stades embryonnaires puis postnatals successifs. 760 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés reçoivent pendant cinq jours une injection quotidienne destinée à détruire des cellules immunitaires du cerveau, ou sont anesthésiés par hypothermie pour recevoir des traceurs neuronaux, tandis que les femelles gestantes sont gavées d'une solution inhibitrice. Le porteur annonce que ce gavage peut provoquer des mises bas prématurées, des lésions de l'œsophage et des atteintes des embryons, et écrit dans le même texte que l'étude "nécessite impérativement l'utilisation d'un organisme complet".

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel de progresser dans la connaissance des mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous nous intéresserons au rôle des cellules immunitaires lors la mise en place des circuits neuronaux précoces. Notre projet vise à déterminer le rôle de ces cellules, en conditions physiologique et pathologique, dans la construction des circuits neuronaux. Pour ce faire, nous caractériserons l’impact d’une absence transitoire ou locale de ces cellules. Nous analyserons également plus en détails les conséquences de diverses altérations fonctionnelles de voie de signalisation microgliale sur la morphogénèse et le développement des circuits cérébraux afin d’avancer sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leurs origines dans des perturbations complexes du développement cérébral, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie embryonnaire à l'adolescence. Cette complexité découle d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales, comme des perturbations immunitaires lors des étapes cruciales du développement cérébral. Des études ont montré que les perturbations immunitaires modifient non seulement directement les circuits neuronaux, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau, des acteurs clés du développement cérébral. Nos connaissances sur les rôles de ces cellules dans la mise en place du cerveau en cours du développement demeurent encore limitées. Ce projet vise ainsi à approfondir notre compréhension des processus de développement clés dans la formation du cerveau. En fournissant des informations essentielles sur la fonction des cellules immunitaires dans le câblage cérébral, atteindre nos objectifs apportera des connaissances précieuses à la compréhension générale des troubles neuropsychiatriques, ouvrant la voie à la stratification des patients et à des approches thérapeutiques adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : i) Injection répétée quotidiennement (sur 5 jours) d’une substance permettant de dépléter les microglies chez des nouveaux nés (quelques secondes); ii) Changement de régime alimentaire des mères et leurs petits (durée 4 jours, prise spontanée) puis euthanasie des femelles par une méthode réglementaire et injection d’analgésique et anesthésie des petits, suivi par une euthanasie à différents stades (durée quelques minutes); iii) Anesthésie par hypothermie et injections de marqueurs neuronaux traceurs axonaux sur souriceaux (environ 3 min) iv) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les microglies chez des nouveaux nés (quelques secondes); v) Administration orale sur femelles gestantes d’une solution permettant d’inhiber les voies de signalisation microgliale (quelques secondes sur animal vigil puis euthanasie des femelles par une méthode réglementaire (durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : i) Le changement de nourriture des femelles gestante, peut induire un stress sur les animaux dû à la nouveauté qui peut conduire à une diminution de prise alimentaire transitoire; ii) Le chirurgies nécessaires pour les injections de virus chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection; iii) L'administration orale des molécules aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et immunohistochimiques permettant de répondre à nos questions scientifiques

Remplacement

L’étude du rôle des cellules immunitaires dans la mise en place de la morphogénèse et des circuits cérébraux pendant le développement embryonnaire et post-natal nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des microglies et leurs interactions avec le tissu neural. Des signaux hormonaux, immunitaires ou encore de tensions tissulaires émanant du système endocrinien, de la circulation sanguine, de l’environnement maternel ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés et dépendants de variations systémiques, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes in vitro, qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité cellulaire et des interactions systémiques nécessaires. Les simulations in silico, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent l’activité des microglies et le développement des circuits neuronaux. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures sur les processus développementaux intégrés au développement de circuits neuronaux et gliaux complexes. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique.

Réduction

Une estimation maximum de 760 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Néanmoins, notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse, alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à différents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.

Jusqu'à 23 tests de sensibilité à la douleur par animal, sur sept semaines : 1 040 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. La douleur est provoquée par l'oxaliplatine, un anticancéreux courant, et le porteur annonce un abaissement du seuil douloureux persistant quelques jours, des œdèmes, des troubles de la locomotion et de l'alimentation. Aucune souris ne peut être réutilisée, les substances administrées et l'état douloureux installé fausseraient une nouvelle procédure. Le porteur affirme qu'il lui est "indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe" et décrit la souris comme "incontournable" en neurosciences, après avoir déjà obtenu des résultats avec ces mêmes molécules chez elle dans d'autres protocoles de douleur.

Objectifs

Les chimiothérapies provoquent souvent des effets secondaires importants. Parmi eux, beaucoup de patients développent des douleurs chroniques. L’oxaliplatine, un médicament utilisé pour traiter plusieurs types de cancers, est très efficace. Cependant, il peut aussi provoquer des douleurs neuropathiques. Même si ces atteintes peuvent parfois disparaître après l’arrêt du traitement, certaines personnes continuent à souffrir de douleurs nerveuses chroniques qui réduisent leur qualité de vie. Ces douleurs se traduisent par une hypersensibilité : des sensations comme le froid, la chaleur ou le toucher, qui ne sont normalement pas douloureuses, peuvent alors devenir très pénibles. Les traitements actuels contre ces douleurs sont souvent partiellement efficaces et peuvent provoquer des effets secondaires importants. Par exemple, l’utilisation prolongée d’opioïdes peut paradoxalement augmenter la sensibilité à la douleur. L’objectif de ce projet de recherche est donc de trouver de nouvelles approches pour prévenir ou traiter ces douleurs nerveuses liées aux chimiothérapies. Nos travaux suggèrent que certains récepteurs présents dans l’organisme, appelés récepteurs RFamide, pourraient jouer un rôle dans ces douleurs. Nous avons récemment identifié des molécules capables de bloquer spécifiquement ces récepteurs. En étudiant leurs effets dans un modèle expérimental de douleur causée par l’oxaliplatine chez la souris, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs et ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients.

Bénéfices attendus

L’étude de l’effet de nos composés dans ce modèle de douleur neuropathique provoquée par l’oxaliplatine, un anticancéreux communément utilisé chez l’homme, nous permettra de mieux comprendre le rôle de récepteurs spécifiques dans la mise en place de la douleur et ainsi d’envisager de nouveaux traitements thérapeutiques mieux tolérés.

Procédures

Dans le protocole 1 les animaux subiront : 18 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 4 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 5 semaines. Dans le protocole 2 les animaux subiront : 23 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 12 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 7 semaines. Dans le protocole 3 les animaux subiront : 20 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 15 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 7 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux à un niveau modéré pouvant persister quelques jours, l’apparition d’inflammation / œdème, des comportements anormaux, des problèmes de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.

Remplacement

Les molécules testées in vivo, sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ou l’on peut conserver les interactions inter organes avec leur physiologie ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables (un outil informatique est utilisé afin de calculer ce nombre). L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et les femelles afin de s’affranchir d’un biais de réponse lié au sexe et de représenter la répartition homme/femme dans la population générale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi composé d’un carré de coton, de frisure, d’un bâton en bois à ronger et de tunnel. Le change sera fait à l’aide d’un tunnel, les souris seront manipulées à l’aide de ce tunnel ou prises en cup quand cela sera possible. Quotidiennement, une observation de l’état clinique des souris sera assurée par une personne compétente et les animaux seront pesés toutes les semaines. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et au matériel utilisé afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Chaque geste rattaché à une procédure sera raffiné au maximum afin de maximiser le bien-être des animaux. Ainsi, chaque arrivée d’animaux sera suivie d’une semaine d’acclimatation à nos locaux. Puis d’une ou deux semaines d’habituation, durant lesquelles les animaux seront manipulés par l’expérimentateur et habitués à la contention afin de faciliter les expériences futures. Toutes les injections seront réalisées avec une taille d’aiguille la plus fine possible. Les animaux étant très bien habitués à être mis en contention légère dans un torchon, les injections seront grandement facilitées et ne provoqueront que très peu de stress et de douleur car les sites d’injections deviennent multiples. Chaque test de sensibilité sera arrêté après un certain temps garantissant la non lésion des tissus. Après chaque manipulation de cage, une pincée de flocon d’avoine stérile sera donnée dans la cage afin de récompenser les animaux.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de molécules sur les douleurs persistantes provoquées par un traitement anti-cancéreux, l’oxaliplatine. Il nous est donc indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. De plus, nous avons déjà obtenus de bons résultats avec ces molécules antagonistes chez la souris, dans d’autres modèles de douleur neuropathique. Nous utiliserons des animaux âgés de 2 à 6 mois afin de travailler sur un animal adulte.

Pour transférer des lignées de souris génétiquement modifiées entre animaleries et les conserver congelées sous forme d'embryons, 5 025 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle pour produire davantage d'embryons, avant d'être tuées pour qu'on les récupère. Les mères porteuses subissent une chirurgie de transfert d'environ cinq minutes et trois injections, les mâles une vasectomie dans les mêmes conditions. Les mères porteuses sont tuées au plus tard au sevrage de leurs petits, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées comme reproductrices ni remises au transfert après une chirurgie, et les mâles vasectomisés le sont quand leurs performances d'accouplement diminuent, au bout de dix mois au plus tard.

Objectifs

Le projet présenté vise en premier lieu à permettre le transfert des lignées entre les animaleries en préservant l'état sanitaire des animaux. Pour cela, nous produisons des embryons par croisement des animaux (femelles et mâles fertiles), en induisant une stimulation hormonale des femelles pour augmenter le nombre d'ovules fécondables. Les embryons ainsi produits sont prélevés et transférés par voie chirurgicale sous anesthésie générale dans des femelles porteuses de statut sanitaire contrôlé dans l'animalerie de destination. Pour obtenir des femelles capables de recevoir ces embryons et de mener la gestation à bien jusqu'à la naissance des petits, il faut croiser ces femelles adultes avec des mâles vasectomisés. Cet accouplement permet de préparer physiologiquement la femelle à la gestation. Les petits obtenus sont débarrassés de tout germe potentiellement infectieux pouvant nuire à la santé des animaux et à la qualité de la recherche. Ce projet vise également à mettre en sécurité les lignées de souris sous forme d'embryons. En effet, cette technique de congélation robuste permet de préserver les lignées transgéniques pendant des décennies sans nécessité de garder des animaux vivants. On réduit de ce fait considérablement le nombre d'animaux utilisés pour le maintien d'une lignée, mais on la préserve aussi d'une perte occasionnée par une infection ou tout autre évènement imprévu ( incendie, catastrophe naturelle...). De plus, la forme congelée facilite les échanges de modèles avec d'autres laboratoires à travers le monde tout en évitant le stress lié au transport d'animaux vivants. La congélation d’embryons est complémentaire de la congélation de sperme, permettant la préservation de lignées présentant des mutations sur le chromosome X ou des mutations multiples.

Bénéfices attendus

La congélation des lignées de modèles de souris génétiquement modifiées générées dans le cadre des projets de recherche permet d’en assurer la préservation à long terme, tout en maintenant leurs caractéristiques génétiques et sanitaires. Cette approche contribue à réduire le nombre d’animaux maintenus en élevage. Elle facilite également les échanges avec des collaborateurs à l’échelle internationale et ainsi limite la création de modèles en double dans différents laboratoires, ce qui participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. La décontamination par transfert d’embryons constitue la méthode la plus sûre pour restaurer et garantir un haut niveau de qualité sanitaire des lignées. Ce statut sanitaire élevé est essentiel pour assurer la fiabilité et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs, cette technique facilite également les échanges de modèles entre établissements, ce qui évite d'avoir à recrééer le même modèle, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.

Procédures

Les souris donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Ces actes sont rapides et se font sous contention manuelle sur animaux vigiles. Les souris mères porteuses recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons : Une injection d'analgésique pré-opératoire (30 minutes avant), une injection d’un cocktail anesthésique avec action analgésique et décontractante musculaire (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. 1 injection d'anti-inflammatoire couplée à celle de solution saline pour réhydrataion est réalisée en post opératoire et avant le réveil. Chaque femelle mère porteuse recevra au total 3 injections. Les mâles qui seront vasectomisés recevront lors de la chirurgie pour la vasectomie : Une injection d'analgésique pré-opératoire (30 minutes avant), une injection d’un cocktail anesthésique avec action analgésique et décontractante musculaire (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. 1 injection d'anti-inflammatoire couplée à celle de solution saline pour réhydrataion est réalisée en post opératoire et avant le réveil. Chaque mâle vasectomisé recevra au total 3 injections. Les injections d'analgésique et celle pour induire l'anesthésie sont rapides et se font sous contention manuelle sur animaux vigiles. L'injection d'anti-inflammatoir et de réhydratation se fait pendant l'anesthésie.

Impact sur les animaux

Les procédures peuvent entraîner chez les animaux un stress léger et transitoire lié aux manipulations et aux contentions nécessaires à la réalisation des injections. Lors de l’administration des différents produits utilisés dans cette procédure en étant vigiles (hormones, analgésiques, anesthésiques), les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée correspondant au moment de l’introduction de l’aiguille (sauf pour les injections réalisées sous ). Par ailleurs, lors des interventions chirurgicales, une plaie est créée et peut, dans de très rares cas, présenter une inflammation ou une infection. Enfin, il arrive exceptionnellement qu’en période post-opératoire certains animaux mordillent leurs fils de suture, ce qui peut fragiliser la cicatrisation.

Devenir

Les donneuses d'embryons seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mèresporteuses, dès lors qu'il y a eu chirurgie de transfet d'embryons, elle seront mises à mort au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. Les mâles vasectomisés sont mis à mort lorsque leurs performances d'accouplement diminuent (nombre de BVs par accouplement) au bout de 10 mois au plus tard. On évite d'utiliser des animaux agés ou ayant subi une procédure modérée pour une réutilisation en formation par exemple.

Remplacement

le recours à l’animal vivant pour la décontamination et l'archivage de lignées transgéniques est indispensable puisqu'il s'agit de produire des embryons.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utilisés ainsi que l’amélioration de leur bien-être constituent une préoccupation permanente dans la mise en œuvre de ces procédures. La superovulation de jeunes femelles permet d’augmenter significativement le nombre d’embryons produits par individu et, par conséquent, de réduire de manière importante le nombre d’animaux donneurs nécessaires. Le tri des femelles en œstrus, destinées à devenir mères porteuses, contribue également à diminuer le nombre de femelles et mâles maintenus en stock tout en améliorant l’efficacité des gestations. Par ailleurs, la souche sélectionnée pour les mères porteuses est reconnue pour ses bonnes capacités maternelles et la qualité des soins apportés aux portées. Ce choix permet d’augmenter le taux de succès des transferts embryonnaires et ainsi de limiter le nombre d’animaux requis. Enfin, le nombre d’animaux utilisés est ajusté en fonction de chaque procédure et des spécificités de chaque lignée génétique. Dans ce contexte, il n’est pas possible d’appliquer une approche statistique standardisée, les besoins étant déterminés au cas par cas selon les résultats obtenus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans cette étude maîtrise ces gestes techniques, qui sont réalisés en routine depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Après les injections, les femelles sont maintenues sous surveillance afin de détecter toute manifestation externe de souffrance ou d’inflammation. Lors de la chirurgie de vasectomie ou de transfert d’embryons, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à la procédure. Un gel ophtalmique est systématiquement appliqué sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dessèchement et tout dommage cornéen. De plus, les animaux sont placés sur une plaque chauffante afin de limiter les pertes de chaleur liées à l’anesthésie. Après l’intervention, les animaux opérés restent sous observation jusqu’à leur réveil complet, dans leur cage placée sur une platine chauffante maintenue à 37 °C. Les souris sont hébergées en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, et bénéficient d’un enrichissement de leur environnement (matériel de nidification, croquettes de nourriture déposées au fond de la cage). Le bien-être des animaux est suivi conformément au tableau de scoring en vigueur dans l’animalerie.

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle d'expérimentation animale car elle est de petite taille, son génome est parfaitement connu et elle a un taux de reproduction très rapide. Elles sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Elle est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les mâles vasectomisés sont de jeune adultes qui après vasectomie seront utilisés pour les croisements et production de femelles pseudo-gestantes. Ils seront utilisés jusqu’à environ 8 mois afin maintenir des performances élevées. Les mères porteuses sont de jeunes adultes qui sont utilisées durant 3-6 mois. Ce sont d’excellentes mères (choix de souches non consanguines ou hybrides) qui peuvent donner naissance et prendre soin de grandes portées, ce qui permet de réduire significativement le nombre de mères porteuses utilisées. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements de stimulation hormonale pour la superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées)

Filmés trente minutes dans un bac pour classer leurs performances de nage, traités par un antalgique, endormis, puis injectés dans la cavité abdominale avec un vaccin, 270 killis turquoise d'Afrique sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces poissons vieillissent vite, six mois de vie en captivité, et le porteur attend chez eux une perte de pigmentation, une émaciation, une baisse de la prise alimentaire et des changements de comportement qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation. Les individus sont observés entre 2 et 6 mois, par groupes de 6 à 10, pour relier des populations immunitaires à la perte de mobilité au cours du vieillissement. Tous sont tués et disséqués à l'issue, afin d'extraire les cellules immunitaires de leurs organes.

Objectifs

Aujourd’hui, les personnes âgées de plus de 60 ans représentent 1/4 de la population française et pourraient en représenter 1/3 en 2050. Si l’espérance de vie en France après 50 ans s’avère élevée, le nombre d’années vécues en bonne santé reste inférieur à celui de plusieurs pays de l’UE. Il est donc urgent d’intervenir pour ralentir cette progression défavorable et améliorer la qualité de vie au cours de l’avancée en âge. Dans ce contexte, l'OMS a identifié 5 domaines, la mobilité, la vitalité, les capacités neurosensorielles, le psycho-social et la cognition, qui doivent être préservées ou restaurées chez la personne âgée pour promouvoir son "bien vieillir". L’objectif de ce projet est de caractériser les modifications du système immunitaire associées à la perte de mobilité spontanée, une des grandes fonctions à préserver pour vieillir en bonne santé, en utilisant un modèle animal présentant un vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu au cours du vieillissement. Nous pourrons évaluer quelles populations immunitaires sont associées à la diminution de la locomotion. Les outils développés dans ce projet pour cartographier les réponses immunitaires avec l’âge seront mis à disposition de la communauté scientifique. A plus long terme, les résultats permettront d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de proposer de nouvelles approches d'immunomodulation afin de préserver la mobilité et favoriser le "bien vieillir".

Procédures

Nous utiliserons des poissons mâles pour caractériser les populations immunitaires modifiées avec la perte de mobilité associée au vieillissement. Les principales populations identifiées chez le mâle seront testées chez les femelles. Puis, nous évaluerons la réponse à une vaccination chez les poissons en comparant les réponses immunitaires induites par l'injection intrapéritonéale de vaccin contenant ou non un composé pro-inflammatoire. Les poissons seront traités par un antalgique avant d’être endormis pour prévenir la douleur liée à l'injection et réduire l’angoisse associées à cette intervention. Les poissons injectés seront également traités par un antalgique après l’injection. Les poissons seront filmés au préalable (trois jours à une semaine avant la vaccination) pendant 30 min dans un bac pour enregistrer les mouvements de nage spontanés et permettre de classer les individus âgés en fonction de leur performance physique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent l’injection du vaccin et les conséquences de la vaccination. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).

Devenir

Au terme des procédures, tous les animaux (n=270) seront mis à mort et disséqués afin de récupérer différents organes pour extraire les cellules immunitaires ou pour procéder à des analyses histo-pathologique et transcriptomique.

Remplacement

Le processus de vieillissement est très variable d'un individu à l'autre. Pour mieux comprendre ces différentes trajectoires de vieillissement à l'échelle individuelle, il est nécessaire d'étudier l'évolution des fonctions, comme la mobilité, chez des organismes vivants. Les individus âgés nous permettront d’étudier les réponses immunitaires dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement in vivo. Le Turquoise Killifish est un modèle unique et indispensable pour étudier, de manière intégrée, à l'échelle de l'organisme entier, les réponses immunitaires en fonction de la qualité du vieillissement des individus.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’individus, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les poissons sont observés aux âges extrêmes de la vie (2 mois à 6 mois) et leur capacité de locomotion est évaluée. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques et fonctionnels généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 à 10 individus au total seront constitués pour mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction). Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles pour un même individu.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire) ou l'amaigrissement (creusement de la partie ventrale du poisson). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à un suivi du poids sur 1 semaine. Si la perte de poids est trop importante, le protocole expérimental sera interrompu. La surveillance du poids se poursuivra jusqu'à stabilisation ou atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort de l'individu.

Choix des espèces

Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce de choix, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur en terme de tissus et de cellules présents. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un vieillissement systémique, là aussi comparable à celui des rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d’une exploration fonctionnelle in vivo couplée à des études biologiques intégrées et à la caractérisation de sous-populations cellulaires ex vivo. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.

Les souris qui s'isolent, cessent de bouger, s'automutilent ou maigrissent jusqu'à la cachexie sont mises à mort. 192 souris porteuses de mutations liées à des maladies neurodégénératives et neuromusculaires humaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale de quinze minutes sans réveil. Chacune passe huit sessions de tests entre 3 et 17 mois, une mesure de force musculaire répétée trois fois, un test d'agilité et d'endurance en trois essais de cinq minutes, trente minutes d'activité ambulatoire et un test d'équilibre et de motricité fine, avec l'apparition attendue d'ataxie, de tremblements et de faiblesse musculaire. Les pistes thérapeutiques annoncées restent au registre de l'espoir. La dégradation locomotrice, elle, fait partie du protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier le phénotype locomoteur et la force musculaire dans des souris modèles de maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires génétiques. Ces maladies sont dues à des anomalies de l’ADN qui entrainent une perturbation du fonctionnement des neurones et des muscles squelettiques des patients, conduisant à des altérations de leur locomotion et de leur mouvements (perte d’équilibre, tremblements, faiblesse musculaire, etc.). Nous souhaitons donc générer des modèles de souris pour ces maladies pour ainsi étudier leur phénotype locomoteur et leur force musculaire, via une batterie de tests non invasifs. La compréhension de l’effet de ces mutations sur le fonctionnement du cerveau et des muscles squelettiques nous permettra ainsi de mieux comprendre ce type de maladie chez l’homme et, ainsi, espérer découvrir des pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier des maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires génétiques. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la complexité et l’ensemble des symptômes neurodégénératifs, la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion typiques de ces pathologies et à l’échelle d’un organisme entier. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier ces maladies. Le développement et l’analyse de ces nouveaux modèles animaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes et de tester la pertinence de pistes thérapeutique pour ces maladies.

Procédures

1 – L’injection d’analgésique requiert moins d’une minute. Chaque animal sera injecté une première fois à l’âge de deux mois puis tous les deux mois pour l’analyse de la force musculaire. 2 – L’injection de produits anesthésiques requiert moins d'une minute. Chaque animal ne sera anesthésié qu’une seule fois (à l’âge de deux mois). 3 – Les injections de vecteurs viraux requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. Chaque animal ne sera injecté qu’une seule fois (à l’âge de deux mois). 4 – Les tests locomoteurs sont organisés en sessions avec une mesure de la force musculaire (répétée trois fois, environ 8 minutes total par animal), un test d’agilité et d’endurance (3 essais de 5 minutes chacun), un test d’activité ambulatoire (30 minutes par animal) et un test d’équilibre et de motricité fine (3 essais de 5 min/ animal). Ces sessions seront répétées tous les deux mois et donc chaque souris sera testée 8 fois (la première session de tests à l’âge de 3 mois et la dernière à 17 mois). 5 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 6 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée tous les deux mois et donc chaque souris sera testée 8 fois (de l’âge de 4 mois a 18 mois). 6 - La chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil dure 15 minutes et résulte en la mort de l’animal

Impact sur les animaux

L’injection de produit analgésique peut induire une légère douleur passagère au moment de l’administration et un léger stress lié à la contention de l’animal. De même, l’injection de produits anesthésiques, bien que réalisée sous analgésie, peut induire un léger stress lié à la contention de l’animal. La mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie et analgésie. La chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil induit un stress et une douleur de courte durée au moment de l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie et une dépression cardiorespiratoire. Les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’activité locomotrice de ces animaux sont classiques, non invasifs et sans douleur, mais peuvent induire un léger stress causé par la manipulation des animaux. Enfin, nous souhaitons étudier des maladies neurodégénératives et neuromusculaires touchant les adultes, et ceci en modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices, de faiblesse musculaire et/ ou de signes neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.) chez ces souris.

Devenir

L’ensemble des souris seront mises à mort à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but l'étude de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives causées par des mutations génétiques. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de ces mutations et notamment leurs effets sur la locomotion, la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces mutations à l’échelle de l’organisme entier ; des modèles cellulaires ou in vitro ne peuvent pas reproduire ces troubles de la locomotion et de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de ces maladies.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les temps et méthodes d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux chacun permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la présence de la mutation (comparaison des souris exprimant la mutation génétique versus des souris contrôles). Compte tenu de notre projet d’analyser les conséquences de mutations responsables de plusieurs maladies à inclusions intranucléaires à la fois sur les muscles squelettiques et les neurones du système nerveux central, nous estimons que l’étude de 192 animaux sur 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Afin de prévenir toute douleur, la procédure expérimentale se fait sous anesthésie et analgésie. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront mis à mort avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. A ce titre, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. De même, des points limites ont été définis, et si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté, etc.), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. Toutefois, en cas de douleur forte et de dépassement des points limites (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.), les animaux seront mis à mort rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour l'études de mutations génétiques responsables de pathologies à l’échelle de l’organisme entier. Notre objectif est d'étudier des mutations responsables de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives génétiques, et plus précisément leur rôle sur l’apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ou cellulaire ne peut mimer ou refléter toute la complexité de ces mécanismes biologiques. Nous allons étudier le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris sevrées et adultes (>2mois), car les mutations que nous étudions conduisent à des maladies de l’adulte (>40 ans). Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après l’étude de la littérature et afin de reproduire l’aspect progressif des maladies que nous étudions.

Jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures, répétés deux fois, et une chirurgie de trente minutes pour injecter un produit dans le liquide céphalo-rachidien: 405 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 365 tués à l'issue et 40 réutilisables ailleurs s'ils n'ont reçu aucun produit. Les produits injectés sont choisis parce qu'ils provoquent une hydrocéphalie, une accumulation de liquide dans les ventricules cérébraux, que le porteur décrit comme survenant sans signes cliniques visibles chez le rat. L'objet du projet est de repérer des marqueurs précoces de cette toxicité, pour sécuriser plus tard l'évaluation de candidats médicaments dans un autre projet. Le rat est retenu parce que la voie intrathécale y est réalisable, contrairement à la souris, parce que l'hydrocéphalie s'y observe comme chez l'être humain, et parce que les études réglementaires ultérieures utiliseront la même espèce.

Objectifs

Les troubles neurologiques constituent désormais la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour garantir que le médicament atteigne les cellules cibles dans le cerveau il est nécessaire de l'administrer par voie intrathécale (IT au niveau des lombaires) directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Cependant, l’administration de certains ASOs par voie IT pendant le développement clinique chez l’Homme peut provoquer des effets indésirables structurels détectables par imagerie par résonance magnétique (IRM), notamment l’hydrocéphalie, caractérisée par une accumulation de LCR dans les ventricules cérébraux (et en conséquence une augmentation de leur taille). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie IT de produits de référence (provoquant une hydrocéphalie) chez le rat. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel la voie IT est réalisable (au contraire de la souris). Un suivi de deux semaines post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que l’hydrocéphalie. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permet de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. L’objectif de ce projet est d’identifier des marqueurs précoces de la toxicité retardée (hydrocéphalie) observée suite à l’administration au niveau des lombaires de thérapies d’ores et déjà connues en clinique ciblant les pathologies du système nerveux central. Ce projet permettra également de pouvoir corréler les résultats des analyses histologiques et protéiques aux modifications cérébrales pouvant être observées par IRM. La détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) de ces produits de référence permettra in fine de renforcer le profil de sécurité des candidats médicaments en développement dans des études ultérieures. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments, dans le cadre d’un autre projet afin de sécuriser à terme l’utilisation de ces thérapies chez les patients

Procédures

Chirurgie : - A l’administration unique de produits de référence par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique –durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire et lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang de faible volume : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum durant l’étude sur animal vigile, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de quelques secondes - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec) - A une administration terminale d’une dose létale d’euthanasiant sous sédation (durée 10 sec) - Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie (durée 10 min)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Les produits de référence administrés peuvent induire une hydrocéphalie sans apparition de signes cliniques (contrôle positif) et peuvent provoquer une nuisance légère pour l’animal. Conséquences directes des actes expérimentaux : • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR), ou préalable à l’euthanasie) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du produit de référence (d’une durée d’environ 30 minutes) et de la phase post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et une douleur liée à l’administration (moins de 10s) (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang : la contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) • Prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec, degré de sévérité sans réveil)

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour analyse histologique ou pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée dans le cadre du projet et qui n’ont pas reçu de produit de référence /véhicule du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du même groupe par exemple.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une hydrocéphalie. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de l’hydrocéphalie pouvant être observée avec les ASOs administrés par voie intrathécale (IT). Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).

Réduction

Les produits de référence ont été sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et étudiés via des études vivo de sécurité en imagerie IRM de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 12 par temps de prélèvement (3 points envisagés au total par produit de référence ou véhicule).. Ce choix est dicté pour assurer la fiabilité des données face à diverses sources de variabilité. Par groupe, 8 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre d'animaux a été déterminé empiriquement, s'appuyant sur l'expérience interne des équipes pour la réalisation des analyses ex vivo complexes envisagées. Il est indispensable pour obtenir des résultats robustes et compenser l'hétérogénéité liée à l'injection intrathécale (diffusion du produit de référence variant d'un sujet à l'autre) ainsi que les variabilités interindividuelles. Ainsi, le nombre d'échantillons produit permettra de garantir des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) prédictifs d'une toxicité retardée, assurant ainsi la solidité de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez le rat et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement de LCR et d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (contrôle positif induisant des anomalies cérébrales, contrôle négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleurs conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. Bien que l’utilisation de produits de référence dans ce projet n’induisent pas de signes cliniques, l’utilisation de la grille éthique pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. De plus, un suivi post injection à 1h et 3h sera assuré dès le réveil de l’animal utilisant une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les administrations IT se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les études d’une durée supérieure à 1 semaine, une puce électronique d’identification couplée à un capteur de température pourra permettre le suivi de la température corporelle de manière non invasive. Tous les animaux sont hébergés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé chez le rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des produits de référence de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - L’hydrocéphalie, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs en intrathécale, est observée à la fois chez le rat et chez l’humain - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent le rat. De plus, les résultats obtenus pourront être corrélés aux études de sécurité réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.