Procédures légères

9 156 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune recevant par gavage une suspension bactérienne en trois minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur précisant que les animaux ne peuvent être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" puisque l'objectif est de prélever l'estomac ou l'intestin. Il attend de l'infection gastrique aucune souffrance et de l'infection intestinale un inconfort léger épisodique, sur la foi de son expérience et de celle de ses collègues. Le même résumé annonce 9 156 souris au titre du "cas pessimiste" où chaque souche mutante et chaque temps d'observation feraient l'objet d'expériences indépendantes.

Objectifs

Le répertoire des récepteurs de l’immunité innée inclus des protéines capables de reconnaître virtuellement tous les différents composants de la paroi bactérienne. Cette détection de ces composants de paroi permet à l’hôte et aux bactéries d’établir une symbiose bénéfique aux deux partenaires. Cet équilibre est rompu dans le contexte d’une bactérie pathogène. De nombreux pathogènes ont développé des stratégies d’échappement à l’hôte en modifiant ou masquant leur surface au système immunitaire inné. Nous avons fait dans le passé la preuve de principe en étudiant certains mécanismes de modification de certains composants de la paroi bactérienne qui permettent au pathogène d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire inné de l’hôte. Néanmoins, il reste encore à découvrir beaucoup de nouveaux mécanismes de régulation de la paroi bactérienne permettant à des pathogènes d’échapper à la surveillance de l’hôte. Nous étudions ces mécanismes dans deux pathogènes du tractus gastrointestinal : responsable de pathologies gastriques sévères comme le cancer de l’estomac, et responsable de gastroentérites et souvent associé à des maladies chroniques inflammatoires de l’intestin. Ainsi, nous étudierons la capacité de souches mutantes pour des gènes impliqués dans la modification et/ou régulation de la paroi bactérienne à coloniser leur niche naturelle (estomac et intestin). Grâce à ces nouvelles connaissances, nous espérons pourvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces fonctions importantes pour la survie de ces deux pathogènes dans leur niche.

Bénéfices attendus

La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignées murines mutantes, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité, permettant par la suite, en fonction des résultats obtenus sous ce projet, des études mécanistiques approfondies de la réponse immunitaire de la souris face à l’infection de l’estomac par l’une des bactéries étudiéesi. Ces nouvelles connaissances permettraient d’améliorer les stratégies vaccinales contre cette bactérie qui pour l’instant ne sont pas efficaces. De plus, le fait de se focaliser sur des mutants du métabolisme de la paroi chez cette bactérie nous pourrons identifier des cibles prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette bactérie. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme.

Procédures

L’administration des suspensions bactériennes par gavage sur animal vigile est très rapide (3 min par individu).

Impact sur les animaux

Le gavage entraine un inconfort et une douleur légère de courte durée. Suivant la littérature, l’infection de l’intestin par les souches pathogènes de l’une des 2 bactéries étudiées peut entrainer épisodiquement un inconfort léger de la souris avec de la diarrhée. Néanmoins, nous n’avons jamais observé avec nos souches de d’inconfort ou de diarrhée. Par contre, l’infection de l’estomac par l’autre bactérie étudiée n’entraine aucune souffrance pour la souris suivant notre expérience et celle de nos collègues nationaux et internationaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour toutes les procédures, l’objectif final est de prélever certains organes pour l’observation de la colonisation bactérienne de l’estomac ou de l’intestin. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts.

Remplacement

Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre à la question scientifique du rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence. Des systèmes cellulaires ou d’organoïdes ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire. De plus, avec ces systèmes in vitro, il y a absence complète de l’environnement complexe de : 1) l’estomac notamment l’acidité produite par les cellules pariétales qui ont un impact très fort sur la survie de l’une des 2 bactéries étudiée ; 2) de l’intestin, notamment, la production d’acides biliaires ou la compétition avec la flore commensale qui impactent fortement la capacité de l’autre bactérie étudiée à coloniser cette niche. Ainsi, le comportement de mutants dans des systèmes cellulaires ne reproduit pas le stress rencontrer dans le tractus gastrointestinal.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utiles à ce projet a été débattue avec les biostatisticiens. Nous utiliserons ici 9156 souris sur une période de 5 ans dans le cas pessimiste où chaque souche mutante et chaque temps d’observation ferait l’objet d’expériences indépendantes. Lorsqu’une expérience permettra l’observation de plusieurs mutants en même temps, ou de plusieurs temps avec une même souche mutante, un seul groupe contrôle sera produit.

Raffinement

Durant les deux semaines précédant toute expérimentation, les expérimentateurs rendront visite aux souris pour les habituer aux manipulations avant toute procédure expérimentale. Pendant le protocole, les expérimentateurs rendront visite tous les jours aux souris lors des deux premières semaines d’infection. Après les 15 premiers jours, si aucun signe visible de détresse est observé, les visites se feront deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. En cas de diarrhée, nous mettrons du gel hydrique dans les cages à dispositions des souris. En cas

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans la continuité des précédents projets menés au laboratoire. C’est le modèle pour lequel nous avons le plus d’outils moléculaires pour étudier la réponse de l’hôte à l’infection. De plus, nous avons à notre disposition des modèles murins génétiquement modifiés, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité qui permettrons une suite en cas de résultats intéressants avec certains des mutants à tester. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront âgées de 5 ou 6 semaines. Cet âge défini est basé sur nos précédents projets internes et externes qui ont fait appel au modèle murin.

1 180 souris albinos vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une chirurgie de quinze minutes provoque sur un œil une néovascularisation de la cornée, dont le porteur indique qu'elle peut aller d'une vision floue à une perte totale de la vision pendant quatorze jours au plus, puis des collyres sont instillés deux fois par jour et l'œil est imagé sous anesthésie générale pendant quarante-cinq minutes. Des tests de cinq minutes doivent évaluer la douleur et l'inconfort oculaires, sans que le porteur précise lesquels, et l'objectif est de mettre au point un traitement en collyre qui éviterait aux malades les injections dans la cornée. Il affirme qu'aucun modèle ex vivo, in vitro ou in silico ne reproduit la formation de ces vaisseaux, et conclut que l'expérimentation animale est "indispensable" et le modèle rongeur "la seule approche scientifiquement valable".

Objectifs

La néovascularisation pathologique de la cornée est une affection grave causée par le développement anormal de vaisseaux sanguins dans la cornée, et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. Malgré les progrès réalisés, qui ont permis le développement de thérapies, les options pour traiter la néovascularisation cornéenne restent limitées. L'administration topique de médicaments existants, dont la pénétration cornéenne est limitée, n'est efficace qu'à des doses qui risquent d'endommager la structure cornéenne. Il est donc important de développer des traitements topiques efficaces afin de traiter convenablement la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, notre objectif est de développer un agent administré par voie topique et capable d’inhiber le développement de vaisseaux sanguins dans la cornée (néovascularisation cornéenne pathologique), sans recourir à des procédures invasives ni induire d’effets indésirables sur la structure cornéenne. Nous évaluerons l’efficacité de plusieurs composés à l’aide de deux modèles murins de néovascularisation cornéenne qui reproduisent fidèlement les manifestations cliniques observées chez l’homme. Nous suivrons l’évolution de la néovascularisation cornéenne chez des souris sur plusieurs jours après instillation des différents composés. Une analyse détaillée de la cornée sera effectuée afin d’identifier et de confirmer l’effet des molécules testées, grâce à plusieurs tests d’imagerie. L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules administrées directement par voie topique, ainsi que d’analyser la réponse inflammatoire associée à la néovascularisation cornéenne.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de développer une série de molécules anti-angiogénique pour une administration topique visant à traiter la néovascularisation cornéenne pathologique, une affection grave causée par le développement de néovaisseaux dans la cornée et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. En effet, la néovascularisation cornéenne est la deuxième cause de perte de vision, touchant plus de 1,4 millions de personnes chaque année dans le monde. Nos résultats contribueront à la recherche fondamentale et pourront être adaptés à des ligands peptidiques ciblant d'autres domaines thérapeutiques. Nous souhaiterions améliorer le traitement de la néovascularisation cornéenne pathologique en évitant les injections dans le stroma cornéen ou l'espace sous-conjonctival. Cela constituera un avantage décisif pour la santé et une amélioration du confort des patients, avec une meilleure acceptabilité du traitement et moins d'effets secondaires.

Procédures

Les chirurgies seront effectuées une seule fois par animal sous anesthésie générale et injection d’analgésique, à raison de 15 minutes par animal. L’instillation sera effectuée deux fois par jour, par animal, sur différentes durées chez des souris naïves et dans des modèles de néovascularisation cornéenne. L’instillation sera effectuée sur animal vigile, à raison d’une seule minute par animal. Les tests de comportement, qui permettront d’évaluer la douleur et l’inconfort oculaires, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de cinq minutes par animal. Les examens d’imagerie in vivo, qui permettront de prendre des images de la cornée et de suivre l’évolution de la néovascularisation cornéenne, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de quarante-cinq minutes par animal. Ils seront effectués sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer un stress transitoire. Les procédures d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie générale, présentent un faible risque d’irritation de la surface oculaire. L’induction d’une néovascularisation cornéenne entraînera une diminution de la qualité visuelle, pouvant aller d’une vision floue à une perte totale de la vision. Cette atteinte unilatérale sera toutefois limitée à un seul œil tout en restant limité dans le temps maximum 14 jours, l’œil controlatéral restant intact. Les procédures sur la cornée sont susceptibles de provoquer des douleurs.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem étant nécessaires, les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés de manière règlementée en fin de procédure. En effet, les techniques fonctionnelles et d’imagerie utilisées sur l’animal vivant ne permettent actuellement qu’une analyse incomplète et partielle des mécanismes impliqués dans la néovascularisation cornéenne et doivent donc être complété par des analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction et l’analyse de la néovascularisation cornéenne, ainsi que de la réponse inflammatoire associée, nécessitent l’utilisation d’un organisme entier. À ce jour, aucun modèle ex vivo ou in vitro ne permet de reproduire de manière fiable la formation de néovaisseaux cornéens ni d’en étudier les mécanismes. Par ailleurs, ce projet vise à évaluer les propriétés anti angiogéniques de composés synthétiques développés par nos collaborateurs, ce qui requiert des études in vivo pour examiner à la fois leur toxicité et leur efficacité. L’expérimentation animale est donc indispensable. Une revue de la littérature confirme également l’absence de modèle in silico pertinent pour répondre à ces problématiques. Afin de comprendre précisément les effets anti angiogéniques sur la néovascularisation cornéenne et l’inflammation associée, l’utilisation d’un modèle rongeur demeure la seule approche scientifiquement valable.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 1180 animaux dans ce projet d’une durée de 5 ans. L’estimation du nombre d’animaux à inclure dans les procédures s’appuie sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables et des tests statistiques de puissance. Ces analyses nous permettent de réduire et d’estimer le nombre d’animaux par lot ou conditions expérimentales nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes en tenant compte de la variabilité inter-individus. Lors de l’analyse de nos résultats, nous effectuerons un premier test statistique permettant de tester la distribution de nos échantillons suivi de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (maison en carton, bâton en bois à ronger, pas de coton car induit des inflammations du segment antérieur de l'œil), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22 degrés Celsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour puis 12h nuit. Un système d’étiquetage associé à des pastilles visuelles indiquant les actes expérimentaux permettra d’assurer un suivi rigoureux du bien-être des animaux. Pour éviter toute souffrance les procédures expérimentales se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire pour les actes qui le nécessitent. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et, en l’absence de rétablissement selon le temps défini pour respecter le bien-être animal, l’animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

L’utilisation des souris est ici justifiée par la similitude de leur système visuel (caractéristiques anatomiques, cellulaires, et génétiques fondamentales) avec celui de l’homme. Dans ce projet, les souris albinos ont été spécialement choisies à cause de l’hypopigmentation des structures de leurs yeux, permettant une meilleure visualisation et étude de la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, afin d’éviter les effets liés au vieillissement pouvant fausser les analyses.

Tuées pour prélever leur cerveau, ou tuées faute de pouvoir être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique, 1 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un dixième d'entre elles développe une accumulation de liquide dans le cerveau, et toutes sont plus petites et plus légères que les souris sans cette modification. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage sur animal éveillé, une injection de traceur fluorescent sous anesthésie brève et, pour une partie, un prélèvement sanguin. Le porteur retient la souris parce que son génome est modifiable et que la barrière cérébrale y est complète dès la troisième semaine, et fixe l'examen à un et trois mois, avant l'apparition des signes de vieillissement.

Objectifs

Le syndrome de Down, aussi appelé trisomie 21, est la cause génétique la plus fréquente de déficience intellectuelle. Il est dû à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire, en totalité ou en partie. Les personnes porteuses de trisomie 21 présentent également un risque très élevé de développer une maladie d’Alzheimer précoce. Le cerveau est protégé par une barrière naturelle appelée barrière hémato-encéphalique. Cette barrière agit comme un filtre très sélectif : elle contrôle strictement ce qui peut passer du sang vers le cerveau afin de maintenir son bon fonctionnement. Elle est formée par différents types de cellules qui travaillent ensemble au sein d’une structure appelée unité neurovasculaire. Lorsque cette barrière est endommagée, des substances normalement exclues du cerveau peuvent y pénétrer, ce qui peut perturber son fonctionnement. Une altération de cette barrière est observée dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer. Des travaux récents suggèrent que la barrière hémato-encéphalique pourrait également être fragilisée chez les personnes atteintes de trisomie 21 et de maladie d’Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore si ces altérations apparaissent très tôt au cours de la vie en raison de la trisomie elle-même, ou si elles sont une conséquence plus tardive des mécanismes liés à la maladie d’Alzheimer. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène en étudiant si la barrière hémato-encéphalique est déjà altérée dès les premières étapes de la vie dans la trisomie 21. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées reproduisant les principales caractéristiques génétiques de la trisomie 21. Grâce à des méthodes complémentaires bien établies, nous chercherons à déterminer si la barrière protectrice du cerveau laisse passer des molécules anormalement et à identifier les changements affectant les cellules qui assurent son bon fonctionnement.

Bénéfices attendus

Jusqu’à présent, la recherche sur la barrière protectrice du cerveau dans la trisomie 21 s’est surtout intéressée aux périodes tardives de la vie, lorsque les lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer sont déjà bien installées. En revanche, ce qui se passe très tôt dans la vie, bien avant l’apparition de ces lésions, reste largement méconnu. Cette absence de données rend difficile la compréhension de ce qui déclenche réellement la maladie, par opposition à ce qui en est une conséquence. Dans la trisomie 21, plusieurs facteurs liés à la présence d’un chromosome supplémentaire, comme une inflammation chronique, des perturbations du métabolisme ou des réactions immunitaires anormales, pourraient fragiliser dès le plus jeune âge la barrière qui protège le cerveau. Une telle fragilité précoce pourrait, à long terme, favoriser l’apparition de troubles neurologiques. Malgré l’hypothèse largement admise selon laquelle un dysfonctionnement de cette barrière pourrait jouer un rôle clé dans l’apparition précoce et l’évolution rapide de la maladie d’Alzheimer chez les personnes atteintes de trisomie 21, aucune étude n’a jusqu’à présent examiné de manière approfondie l’état de cette barrière dans des modèles animaux représentatifs de la trisomie 21. Ce projet est donc le premier à s’intéresser à l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dès le début de la vie dans un modèle de souris de la trisomie 21. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc, à court terme, de pouvoir révéler un potentiel problème jusqu’ici insoupçonné dans la circulation sanguine du cerveau et ainsi ouvrir la voie à de nouvelles recherches pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. A plus long terme, cela pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement.

Procédures

Pour identifier les souris porteuses de la modification génétique d’intérêt, un très petit prélèvement de tissu sera réalisé pour tous les animaux (une seule fois, d’une durée inférieure à une minute, animal vigile). En cas de problème technique rare, un second prélèvement pourrait être effectué chez ces mêmes animaux, à l’âge adulte et à l’état éveillé, également d’une durée inférieure à une minute et réalisé une seule fois. Une partie des animaux recevra une injection d’une molécule permettant de vérifier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, elle sera effectuée sous anesthésie générale de très courte durée (une seule injection d’une durée inférieure à 1 minute, durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Une partie des souris aura également un seul prélèvement sanguin (durée inférieure à cinq minutes, animal vigile).

Impact sur les animaux

La biopsie pour identifier le patrimoine génétique des animaux peut causer une douleur passagère et un petit risque de saignement. Les souris utilisées dans cette étude présentent une modification génétique spécifique et, dans 10 pourcents des cas, une accumulation de liquide dans le cerveau, appelée hydrocéphalie. Ces souris sont aussi plus petites et plus légères que les souris ne présentant pas cette modification génétique. Lors des manipulations nécessaires aux injections et aux prélèvements, les souris peuvent ressentir un stress léger et passager. Une douleur brève peut également être ressentie au moment de la piqûre. Les injections peuvent entraîner un inconfort temporaire et un faible risque de saignement. Dans de rares cas, une irritation ou une atteinte de l’œil peut survenir. Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection, celle-ci peut entraîner quelques effets secondaires, comme une légère baisse de la température corporelle, une sécheresse des yeux, et dans de très rares cas, des problèmes respiratoires ou cardiaques. Toutefois, cette anesthésie générale sera très courte et présente donc des risques moins importants. Les prélèvements de sang peuvent occasionnellement provoquer un saignement persistant.

Devenir

Une partie des souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser des cerveaux dans le but de répondre à notre question scientifique. Toutes les autres souris seront euthanasiées car elles ne pourront pas être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique spécifique.

Remplacement

Il n'existe malheureusement pas d'alternative à l'utilisation d'animaux pour ces recherches. Pour étudier comment le cerveau est protégé et comprendre quand cette protection devient défaillante, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris. La barrière qui protège le cerveau ne dépend pas d’un seul type de cellule, mais du travail coordonné de plusieurs cellules différentes (cellules des vaisseaux sanguins, cellules de soutien, neurones et cellules immunitaires). Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de façon fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’injection de substances fluorescentes de tailles différentes permet de vérifier si cette barrière joue correctement son rôle de filtre. En observant si ces substances restent dans les vaisseaux sanguins ou si elles passent anormalement dans le tissu cérébral, il est possible de déterminer si la barrière est fragilisée et dans quelle mesure. Après ces injections, l’analyse du cerveau est indispensable pour visualiser précisément où ces substances se sont accumulées et pour étudier les changements affectant les cellules qui composent les vaisseaux du cerveau. Ces observations sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles de la barrière protectrice du cerveau et, à terme, pour améliorer la prévention et le traitement des maladies neurologiques.

Réduction

Sur une période de quatre ans, ce projet utilisera au maximum 1085 souris. Ce nombre a été soigneusement calculé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les souris utilisées seront élevées au sein du laboratoire tout au long du projet. L’élevage sera géré de façon raisonnée, avec pour objectif de ne produire que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Tous les paramètres ont été pris en compte, comme la proportion de souris réellement porteuses du gène étudié, la nécessité d’obtenir autant de mâles que de femelles, ou encore les difficultés de reproduction propres à cette lignée. Dans nos lots expérimentaux nous inclurons des souris mâles et femelles, ainsi que des animaux jeunes et adultes, afin de tenir compte des différences naturelles liées à l’âge et au sexe. Nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 15 à 20 animaux, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables sans multiplier inutilement le nombre de souris. Les résultats que nous obtiendrons seront ensuite analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées dans des conditions strictement conformes à la réglementation. Les animaux provenant d’un élevage extérieur disposeront d’une semaine d’adaptation après leur arrivée avant d’être utilisés pour la reproduction. Les souris auront accès librement à l’eau et à la nourriture. Elles vivront également dans un environnement adapté à leur bien-être, avec du matériel pour faire un nid, ronger et se cacher. Elles seront observées quotidiennement et, au moindre signe anormal, l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire seront immédiatement informés afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée. Des mesures préventives seront mises en place pour réduire tout impact des procédures expérimentales sur les animaux. Cela comprend la formation du personnel, la surveillance constante des animaux, et des méthodes pour les habituer à la manipulation avant les expériences. Pour identifier les souris nécessaires à l’étude, un très petit prélèvement est réalisé chez des animaux très jeunes. Ce geste est conçu pour être le moins invasif possible et permettre une cicatrisation rapide. Les souris sont surveillées juste après le prélèvement, puis un peu plus tard, afin de s’assurer de leur bon état. Le choix d’utiliser uniquement des mâles porteurs des modifications génétique d’intérêt comme reproducteurs permet à la fois de faciliter la prise en charge des portées par les mères et de limiter le nombre d’animaux présentant des fragilités liées à leur génétique. Afin de réduire au maximum le stress et toute douleur lors des injections, les souris sont placées sous anesthésie générale de courte durée. Pendant toute la procédure, leur état est étroitement surveillé. Des mesures simples seront mises en place pour assurer le confort des animaux, comme le maintien de leur température corporelle et l’application d’un gel protecteur sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et de limiter les irritations après l’injection. Après l’intervention, les animaux sont surveillés attentivement pendant leur réveil dans un environnement chauffé.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté pour étudier le syndrome de Down et ses effets sur le cerveau. En effet, la souris est un modèle bien connu et largement utilisé pour modéliser les pathologies humaines. Notamment, son génome est parfaitement connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi un modèle de souris génétiquement modifiées possède une copie supplémentaire d’une grande partie des gènes du chromosome correspondant au chromosome humain 21, et il reproduit plusieurs caractéristiques importantes du syndrome de Down. Cette lignée de souris permet d’étudier très tôt dans la vie l’intégrité et la perméabilité de la barrière qui protège le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique, ainsi que les modifications des vaisseaux sanguins et l’inflammation dans le cerveau. Chez les souris, cette barrière cérébrale est pleinement développée dès la troisième semaine après la naissance. Les signes liés au vieillissement ou à la maladie d’Alzheimer, comme la perte de certaines protéines et de neurones, ou l’accumulation de molécules toxiques dans le cerveau, n’apparaissent qu’après neuf mois. C’est pourquoi nous étudierons les souris génétiquement modifiées à 1 et 3 mois. Cette approche nous permettra de savoir si les premières altérations de la barrière cérébrale apparaissent avant les autres signes caractéristiques de la maladie, et de déterminer si ces changements vasculaires et au niveau de la barrière peuvent servir de marqueurs précoces du syndrome de Down. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leur modification génétique très tôt.

Pour suivre où se répartissent dans le cerveau des molécules marquées par un fluorophore, 1 620 souris et 1 320 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 960 d'entre eux et modéré pour 980. Les souris et les rats reçoivent une injection dans le cerveau, à proximité de la moelle épinière ou dans une veine, avant six à dix acquisitions de deux minutes destinées à mesurer le signal fluorescent. Le porteur indique que les injections intracérébrales et intrathécales peuvent provoquer douleur, inflammation locale et baisse d'activité ou d'appétit pendant quelques jours, et que les animaux sont tués pour prélever encéphale et moelle épinière. Rien dans le texte ne nomme les molécules ou les formulations testées, ni ce à quoi elles sont destinées au-delà d'une mention des pathologies neurodégénératives, des tumeurs et des troubles neuroinflammatoires.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la biodistribution cérébrale de nouvelles molécules ou formulations marquées par un fluorophore après administration par différentes voies. L’objectif principal consiste à décrire leur répartition spatiale et temporelle dans le système nerveux central, afin de mieux comprendre leur diffusion, leur persistance et leur éventuelle élimination. L’analyse du signal fluorescent permettra une visualisation fine de la localisation des composés. Des examens histologiques seront ensuite réalisés afin de confirmer la distribution observée, d’identifier les structures anatomiques concernées et d’évaluer l’intégrité tissulaire au site d’injection et dans les régions avoisinantes. L’ensemble des données contribuera à identifier les paramètres influençant la distribution intracérébrale et à orienter l’optimisation des formulations.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser avec précision la diffusion et la persistance dans le système nerveux central de nouvelles molécules marquées après injection intracérébrale, intrathécale ou intraveineuse. Il fournira des informations essentielles sur la localisation spatiale des composés dans le temps, sur les paramètres influençant leur distribution, et sur la reproductibilité des procédures expérimentales. Ces résultats permettront d’optimiser les protocoles de délivrance intracérébrale et de comparer l’efficacité des différentes voies d’administration, tout en limitant les effets indésirables. Les connaissances acquises contribueront à mieux comprendre les mécanismes de transport et de diffusion des molécules dans le système nerveux central. Cette compréhension facilitera la sélection et l’optimisation de candidats thérapeutiques pour le traitement des maladies cérébrales, telles que les pathologies neurodégénératives, les tumeurs ou les troubles neuroinflammatoires. Elle pourrait ainsi soutenir le développement de stratégies de traitement plus ciblées, efficaces et sûres pour l’humain. Les méthodologies et outils développés pourront également servir de référence pour d’autres recherches précliniques, renforçant la base scientifique nécessaire à la translation vers des applications cliniques et favorisant l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux subiront une injection intracérébrale (30 minutes), à proximité de la moelle épinière (5 minutes) ou intraveineuse (2 minutes). A la suite de l'injection, plusieurs acquisitions (6 pour les procédures 1 et 2; 10 pour la procédure 3) pour mesurer le signal fluorescent seront effectuées. Chaque acquisition durera 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections intracérébrales et intrathécales peuvent entraîner une douleur ou une gêne transitoire, une inflammation locale légère et une diminution temporaire de l’activité ou de l’appétit pendant quelques heures à quelques jours. Les injections intraveineuses provoquent principalement un stress transitoire lié à la contention et à l’administration. Une légère perte de poids ou une réduction temporaire de la mobilité peuvent être observées. Les procédures sont réalisées sous anesthésie adaptée lorsque nécessaire (injection intrathécale et intracérébrale), avec surveillance post-interventionnelle et administration d’analgésiques si indiqué. Les animaux sont mis à mort avant le prélèvement des tissus pour analyses histologiques. Aucun effet permanent n’est anticipé. Le protocole respecte les principes des 3R afin de limiter au maximum la douleur, la durée des nuisances et le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la qualité scientifique des résultats.

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses (encéphale, moelle épinière). Ces prélèvements sont indispensables pour observer au microscope la distribution des composés. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Le projet applique le principe de Remplacement en utilisant les méthodes alternatives disponibles chaque fois qu’elles permettent d’atteindre les objectifs scientifiques. Les modèles in vitro tels que les cultures neuronales, les organoïdes cérébraux et systèmes microfluidiques reproduisant partiellement la barrière hémato-encéphalique, ainsi que les simulations in silico, sont utilisés pour évaluer la toxicité cellulaire, le passage transendothélial et présélectionner les molécules candidates. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité anatomique, vasculaire et dynamique d’un cerveau intact, ni la diffusion intégrée des molécules après injection intracérébrale, intrathécale ou intraveineuse. L’étude histologique nécessite également un organe complet pour corréler la localisation du marqueur fluorescent avec les structures anatomiques et évaluer l’intégrité tissulaire. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable pour obtenir des données fiables sur la biodistribution cérébrale intégrée, après sélection préalable des molécules par méthodes alternatives afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le principe de Réduction est appliqué afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec des résultats robustes et statistiquement interprétables. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique tenant compte de l’effet attendu sur le signal fluorescent et de la variabilité estimée. L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal des mêmes individus, limitant le recours à des groupes indépendants pour chaque point de mesure, et maximisant les données obtenues par animal. Des études pilotes et des simulations pharmacocinétiques in silico sont utilisées pour optimiser les doses, volumes et délais d’analyse et ainsi éviter des expérimentations exploratoires inutiles. Les tissus prélevés sont partagés pour analyses complémentaires validées afin de réduire le nombre d’animaux supplémentaires. Les analyses statistiques seront effectuées sur les données obtenues au cours du temps.

Raffinement

Conformément à la réglementation en vigueur, ce projet est conçu afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance, l’angoisse et toute nuisance durable infligées aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Les injections intracérébrales et intrathécales sont réalisées sous anesthésie adaptée et suivies d’analgésie post-procédure. Les animaux bénéficient d’une surveillance étroite de leur comportement, appétit, mobilité et état général avec des interventions rapides si nécessaire. Des soins post-opératoires, un environnement calme et enrichi, et un entraînement préalable des animaux à la manipulation contribuent à limiter le stress. Les pratiques expérimentales sont régulièrement réévaluées pour intégrer toute nouvelle technique de raffinement disponible, qu’il s’agisse de méthodes d’anesthésie, d’analgésie, de suivi non invasif ou d’enrichissement environnemental, garantissant ainsi l’amélioration continue du bien-être animal tout au long du projet.

Choix des espèces

Les rats et souris sont des modèles animaux largement utilisés en neurosciences en raison de leur anatomie cérébrale bien caractérisée (existence d'atlas), de leur taille adaptée aux injections intracérébrales, intrathécales et intraveineuses, et de la disponibilité de références physiologiques et pharmacocinétiques permettant d’interpréter la biodistribution des molécules. Leur système nerveux central partage des caractéristiques fonctionnelles et structurales essentielles avec celui de l’humain, ce qui rend les données obtenues pertinentes pour l’optimisation de stratégies de délivrance ciblée pour une ultérieure application clinique. Les deux espèces offrent la possibilité d’utiliser des outils d’imagerie et d’analyses histologiques précises, ainsi que de réaliser des suivis longitudinaux avec un nombre limité d’animaux. Leur utilisation permet également d’appliquer des études comparatives entre voies d’administration et formulations, tout en respectant les principes des 3R, notamment en limitant le nombre d’animaux nécessaires et en maximisant les informations obtenues par individu. Les espèces utilisées sont le rat et la souris, à un age de 4 – 12 semaines, correspondant à un cerveau mature et stable pour observer de manière fiable la biodistribution des molécules. Les stades plus jeunes, nouveaunés ou non sevrés, ne sont pas pertinents en raison de différences anatomiques et fonctionnelles du cerveau et du liquide cérébrospinal, rendant les données moins transposables. Les adultes permettent un maniement sûr, une meilleure tolérance aux injections et des analyses histologiques détaillées.