Procédures légères

Confirmer in vivo des observations déjà obtenues in vitro, parce que les rapporteurs des revues le réclament systématiquement à la publication : 1 050 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit deux injections intrapéritonéales d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle, puis est mise à mort au plus tard vingt-quatre heures après la seconde pour disséquer les ovaires et les oviductes et récolter les ovocytes. Le porteur compte environ vingt-cinq ovocytes par femelle et une souris par lot d'expérience, soit 210 souris par an sur cinq ans. Il indique privilégier la maturation in vitro, qui donne davantage d'ovocytes, et recourir par ailleurs à la levure et au xénope pour certaines questions.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes qui régulent la méiose dans l’ovocyte de souris. La méiose consiste en deux divisions successives conduisant à la formation des gamètes. En particulier, dans l’ovaire, les ovocytes sont immatures et sont arrêtés en début de méiose. Une stimulation hormonale induit la maturation méiotique et l’ovulation. Les ovocytes matures sont arrêtés en fin de méiose et sont ovulés dans l’oviducte où ils pourront potentiellement être fécondés par un spermatozoïde. Le plus souvent, au laboratoire, nous prélevons des ovocytes immatures dans l’ovaire et nous induisons la maturation méiotique des ovocytes in vitro afin d’obtenir des ovocytes matures. Cette stratégie nous permet de suivre les différentes étapes de la méiose mais a l’inconvénient de s’éloigner des conditions physiologiques in vivo. C’est pour cela, que nous avons besoin de confirmer certaines de nos observations dans des ovocytes matures in vivo, prélevés dans l’oviducte après ovulation. Cette stratégie nécessite de faire une hyperstimulation ovarienne des souris afin de stimuler la maturation des ovocytes et l’ovulation. La procédure décrite dans ce projet inclut : 1) l'hyperstimulation ovarienne par injection d'hormones sur des souris femelles 2) la mise à mort des souris injectées pour dissection des oviductes et collecte des ovocytes. Nous utilisons des souris non modifiées ou des souris génétiquement modifiées. Aucune des souris que nous utilisons ne présentent de phénotype dommageable. Dans tous les cas, les souris ne seront injectées que dans le but de stimuler la maturation des ovocytes et l'ovulation. Aucune manipulation autre que les injections d’hormones et mise à mort ne sera réalisée sur les souris.

Bénéfices attendus

Même si la maturation in vitro des ovocytes présente des avantages indéniables tels qu’une facilité de synchronisation, et l’accessibilité à toutes les étapes de la méiose, on ne peut pas exclure un effet de la culture in vitro sur différents aspects de la méiose que nous étudions. Les ovocytes matures in vivo après stimulation ovarienne sont de meilleure qualité et dans un état plus physiologique que les ovocytes qui ont maturé in vitro. Ainsi, la stimulation ovarienne nous permettrait de confirmer dans des ovocytes matures in vivo, les observations obtenues après maturation in vitro, afin d’exclure tout effet de la culture in vitro sur nos interprétations. Cette confirmation devient essentielle et est systématiquement réclamée par les rapporteurs lors de la publication de nos données.

Procédures

Les souris seront soumises à 2 injections intrapéritonéales à 48h d’intervalle. Elle seront systématiquement mises à mort maximum 24h après la 2e injection pour la dissection des ovaires et des oviductes. Aucun accouplement, et aucune gestation n'est prévu après les injections.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale d’hormones est une procédure légère. les effets indésirables sont: -le stress dû à la contention -la douleur induite par l’introduction de la seringue. En cas de signes de douleurs persistants comme la prostration de l'animal, l’animal sera immédiatement mis à mort. A noter qu'aucun accouplement ni gestation ne sera réalisé après la procédure de stimulation ovarienne, le but n'étant pas ici d'augmenter la taille de la portée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issu de la procédure car après stimulation ovarienne, les oviductes seront prélevés afin de collecter les ovocytes matures qui ont été ovulés.

Remplacement

La méiose est spécifique des cellules germinales et peut être observée uniquement dans les gamètes (ovocytes ou spermatozoïdes). Pour étudier la méiose femelle, nous sommes donc obligés d’utiliser des ovocytes issus d’animaux car il n’existe pas de lignées cellulaires méiotiques. Nous utilisons la levure comme modèle alternatif non animal, et le xénope comme modèle non mammifère, pour adresser certaines questions spécifiques. Notamment les approches protéomiques qui nécessitent une quantité importante de protéines sont réalisées dans la levure. Cependant la maturation méiotique dans la levure est différente de celle des mammifères et certaines questions ne peuvent pas être étudiées dans la levure ou dans le xénope. Ainsi, certains de nos résultats nécessitent d’être confirmées dans un modèle animal plus proche de l’homme comme la souris.

Réduction

Afin de réduire le recours aux injections et de minimiser la souffrance des animaux, nous privilégions la maturation d’ovocytes in vitro, qui nous permet aussi d’obtenir une quantité plus importante d’ovocytes et de limiter le nombre de souris utilisées. Cette procédure de stimulation ovarienne ne sera utilisée que ponctuellement pour confirmer certaines observations et dépend donc des résultats obtenus préalablement in vitro. Le nombre de souris femelles nécessaire dépend du nombre d’ovocytes collectés/femelle. Le nombre moyen d'ovocytes/femelle collectés dans l'oviducte après stimulation ovarienne est de 25 ovocytes/femelle. Pour qu'une expérience soit interprétable, nous avons besoin d’environ 10-20 ovocytes/lot donc 1 souris/lot. Un lot correspond par exemple à un lot d'ovocytes contrôles, un lot d'ovocytes exprimant une mutation, ou un lot d'ovocytes traités avec un inhibiteur. Nos expériences incluent 2 à 4 lots donc 2 à 4 souris. Chaque expérience devant être répétée 4 fois, nous devront utiliser 8 à 16 souris par expérience. Le nombre d’expérience nécessitant cette procédure est variable et difficile à estimer. En se basant sur les expériences prévues pour l’année à venir, nous estimons avoir besoin de 192 souris (une douzaine d’expériences). 64 souris swiss, 64 souris C57Bl/6, 64 souris transgéniques. Après majoration de 10% pour palier aux éventuels échecs de la stimulation ovarienne, nous estimons avoir besoin de 210 souris/an. Pour réduire le nombre de souris, nous optimisons au maximum l’utilisation des ovocytes, en réalisant plusieurs expériences sur le même lot d’ovocytes (par exemple, une fixation sur ovocyte entier et un étalement chromosomique, ou plusieurs marquages protéiques). Les tests préalables aux expériences : efficacité des inhibiteurs, test de concentration des inhibiteurs, test d’anticorps, sont évidemment réalisés sur des ovocytes matures in vitro.

Raffinement

Seules les injections d’hormones peuvent affecter le bien-être des animaux et induire du stress lors de la contention. Cette procédure sera réalisée par un manipulateur expérimenté pour limiter ce stress et les souris injectées seront soumises à une surveillance accrue afin de détecter le moindre signe de douleur après l’injection comme la prostration. En cas de signe de douleur, l’animal sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère qui est à la fois très proche de l’Homme et dont les gamètes sont facilement accessibles pour étudier la méiose. La maturation méiotique dans l’ovocyte est très similaire à celle de l’ovocyte humain, permettant d’extrapoler nos interprétations à l’Homme. Les souris femelles sont utilisées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines car c’est à cet âge qu’elles produisent le plus grand nombre d’ovocytes.

Une biopsie d'oreille au sevrage est le seul geste décrit, alors que les souris de cette nouvelle lignée perdent progressivement leur masse musculaire jusqu'à un éventuel changement de démarche vers douze mois. 276 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever les muscles et les observer en imagerie cellulaire. Le projet porte sur la réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement, avec des analyses fixées à deux, six et douze mois. Le porteur annonce n'attendre aucun signe de stress ni de souffrance aux âges retenus, tout en prévoyant des pesées deux à trois fois par semaine et des prises de température rectale jusqu'à l'atteinte des points limites.

Objectifs

Au cours du vieillissement, les lésions dans l'ADN s'accumulent et vont être responsables de l'augmentation du risque de mutations génétiques, de dysfonctionnements cellulaires, ainsi que de diverses maladies liées à l'âge telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et d'autres conditions de santé associées au vieillissement. Les mécanismes de réparation de l’ADN sont encore très peu connus et investigués dans les cellules du muscle squelettique. L’objectif de ce projet est d’avoir une meilleure compréhension de ces mécanismes de réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement à travers un nouveau modèle murin. Pour l'ensemble de ce projet, un maximum de 276 souris seront nécessaires.

Bénéfices attendus

Ce nouveau modèle murin sera pour l’heure un modèle unique pour pouvoir étudier des aspects encore peu explorés de certaines voies de réparation de l'ADN dans le muscle squelettique, et permettre une meilleure compréhension de protéines structurantes de l'ADN dans des conditions normales et pathologiques, et de déterminer leur implication dans ces mécanismes de réparation à l’ADN pour à plus long terme envisager de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une petite biopsie d’oreille (=1mm) sera réalisée au moment du sevrage pour pouvoir effectuer l’identification génétique de chacune des souris. Le temps du geste par animaux et < 1min.

Impact sur les animaux

La perte de la protéine d'interêt ne devrait pas générer d’effet indésirable avant plusieurs mois. D’après nos études précédentes, le modèle ne devrait pas présenter d’atteinte de points limites sur les points de cinétique définis. Notre étude sera placée à 2, 6 et 12 mois. Les effets attendus sont une perte lente et progressive de la masse musculaire qui entrainera petit à petit une perte de poids et qui pourra très progressivement emmener à un éventuel changement dans la démarche des souris vers l’age de 12 mois. D’après notre expérience au laboratoire sur le modèle de vieillissement prématurés nous ne nous attendons pas à avoir des signes de stress, de souffrance ou de comportement anormal aux ages définis. Cependant une surveillance sera mise en place et adaptée tout au long du protocole afin de détecter tout signe de souffrance qui entrerait alors dans un point limite.

Devenir

Mise à mort afin de collecter les muscles pour analyses approfondies d'imagerie cellulaire.

Remplacement

Des cellules seront isolées et immortalisées à partir des animaux homozygotes de la nouvelle lignée murine afin de réaliser des expériences sur cellule quand cela est possible. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas une étude au-delà de quelques jours ce qui n’est donc pas suffisant pour observer certains phénotypes, mécanismes ou encore l’effet de certains traitements. De plus la ½ vie des protéines d'intérêts dans des cellules musculaires est très longue, réduisant l’apparition et le niveau des phénotypes observables par rapport à la durée de vie de cellules en culture et augmentant l’hétérogénéité des résultats, voir l'absence de conclusion. D’autre part, le modèle murin reste l’unique moyen pour étudier fonctionnellement le muscle dans son entité au cours du vieillissement et pour évaluer les mécanismes impliquées dans de telles voies de signalisation.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal mais suffisant pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une collaboration avec un laboratoire spécialiste des mécanismes de réparation de l’ADN sur tissu permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les effectifs d’animaux par groupe sont adaptés à chaque groupe. Des tests de comparaisons de moyennes ou de rang seront utilisés pour comparer deux groupes. Le personnel est formé à ces analyses. Les animaux seront traités par petite cohorte ce qui permettra si les résultats statistiques le permettent d’utiliser moins de souris. Dans la mesure du possible, les autres muscles seront collectés pour des études parallèles afin d’exploiter au maximum chacune des souris pour des études parallèles.

Raffinement

Une surveillance régulière et progressive des animaux sera réalisée par l’expérimentateur pour détecter les signes cliniques et/ou physiques précoces du phénotype. Les animaux seront pesés une fois par mois jusqu’à 11 mois, puis toutes les semaines jusqu’à la détection d’un phénotype. Enfin, ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine jusqu’à l’atteinte des points limites. En même temps que les pesées, une prise de température rectale sera mesurée et permettra de détecter de manière précoce et concomitante à la pesée toute altération de l’état général de la souris. À l'aide de ces deux paramètres, les premiers signes d’un phénotype et d’un vieillissement pourront être détectés précocement et une observation et une vigilance plus accrues des cages concernées seront alors mises en place. Au cours de ces surveillances, nous porterons également nos observations sur le comportement social et la capacité de la souris à se déplacer correctement. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront alors mis à mort immédiatement en cas de signes de souffrance et leurs tissus collectés. Les animaux seront toujours à plusieurs par cage afin de maintenir l’aspect social et chaque cage sera dotée d’un environnement enrichi. Si toutefois des souris devaient se retrouver seules dans la cage, il est prévu d’apporter un enrichissement renforcé et adapté, comme par exemple avec l’ajout de dômes en carton pour veiller au bien-être de la souris.

Choix des espèces

Malgré des différences entre la symptomatologie chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutique. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie est extrêmement proche de celui de l’Homme. Le modèle murin se révèle donc être un système idéal et indispensable pour étudier le rôle de gènes sur le plan moléculaire, cellulaire, tissulaire et fonctionnel au sein d’une entité. Pour répondre à notre problématique, des souris agées de 2 à 9 mois seront utilisées pour la reproduction dans une première procédure. Passé cet âge les souris deviennent trop âgées. Elles seront euthanasiées à l’issue de cette procédure. A cet age le phénotype dommageable ne devrait pas être survenu. Toutefois les souris seront attentivement surveillées. Dans une 2ème procédure, des souris contrôles et mutantes seront utilisées à l’age de 2 mois, 6 mois et 12 mois afin de pouvoir évaluer l’importance de la signalisation de réparation de l’ADN dans le muscle, l’implication de notre protéine d’intérêt dans cette signalisation et le tout au cours du vieillissement.

1 800 souris vont être utilisées pour une biopsie d'oreille de cinq secondes chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le geste est pratiqué sur animal vigile maintenu en contention, avec un second prélèvement sur la même oreille si l'analyse génétique échoue. La procédure elle-même ne tue aucune souris, et leur sort dépend ensuite du résultat du génotypage : entrée dans un projet de recherche, maintien dans les colonies d'élevage, ou mise à mort pour prélever des tissus ou faute de correspondre aux caractéristiques attendues. Le porteur affirme qu'aucune méthode n'est aussi performante que la biopsie d'oreille et présente le génotypage comme une "nécessité" pour valider et entretenir ces lignées.

Objectifs

La thématique générale de mon projet de recherche est la compréhension des mécanismes de régénération des cellules souches pulmonaires. Pour cela, j’étudie les mécanismes de dérégulation que sont la fibrose et le cancer. Ce projet nécessite le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Chaque animal, identifié par application d'une boucle d'oreille, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour mon projet de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; -sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.

Procédures

Une biopsie de l’oreille (durée : 5 secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement sur la même oreille pourra être envisagé.

Impact sur les animaux

Les biopsies d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère et dans de très rares cas un léger saignement. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress. S

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche ; b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.

Remplacement

Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. les plans d’élevage en amont, sont définis afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.

Raffinement

Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.

Choix des espèces

Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et miment les pathologies humaines. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 21 jours.

Pour vérifier si la mutation d'un gène repérée dans deux familles de personnes scoliotiques déforme la colonne vertébrale, trois lignées de poissons-zèbres mutants sont créées. 780 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, répartis sur trois générations par lignée. Chacun subit sous anesthésie un prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale pour identifier sa mutation, et 180 d'entre eux passent trois séances de micro-scanner à huit, douze et seize semaines, avec un transport pouvant durer trente minutes avant chaque séance. Les 600 autres sont tués dès la lignée stabilisée, et les 180 restants après la dernière imagerie, le retour à l'aquarium principal étant exclu pour raison sanitaire.

Objectifs

La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3% des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage exomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).

Procédures

EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.

Devenir

Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.

Remplacement

Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.

Réduction

Nous n’avons pas de résultats préliminaires nécessaires pour effectuer des tests statistiques. Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons/aquarium. Nous élèverons 20 poissons pour la première génération (F0), puis 120 poissons (homozygotes, hétérozygotes et les sauvages à identifier) pour la deuxième generation (F1), 120 poissons (homozygotes et hétérozygotes à identifier) pour la troisième génération (F2). Nous avons besoin de 3 générations, de ce fait nous aurons au total 260 individus (20 F0 + 120 F1 + 120 F2) pour chaque lignée. Nous aurons 780 (260 x 3) individus pour les trois lignées de mutants (3 gènes homologues à celui de l’Homme chez le poisson-zèbre). La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Ce nombre permettra d’effectuer des analyses statistiques comparatives ainsi qu’une analyse de variabilité inter-observateurs avec une puissance suffisante (score kappa de Fleis attendu : >0.8 ; alpha

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux une densité de 20 poissons/aquarium de 3.5L sera appliquée. Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une mise à mort.

Choix des espèces

Le modèle poisson-zèbre partage 71% de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Nous analyserons les images issues du scanner micro-CT avec un logiciel dédié. Grâce à ces images, nous mesurerons les courbures de la colonne vertébrale des mutants par comparaison avec celle de poissons sauvages. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte

Porteuses d'une mutation qui reproduit une maladie neurodégénérative pédiatrique, les souris de ce projet servent à explorer l'accumulation de fer dans leur cerveau. 2 720 vont être utilisées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger : 1 360 subissent un prélèvement de sang à la queue, 1 280 une injection intrapéritonéale de piégeurs de fer ou d'inhibiteur, 560 un gavage. Le porteur qualifie de léger chacun de ces gestes, y compris l'injection de fer, et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine. Toutes sont anesthésiées puis tuées à l'issue, pour les analyses d'immunologie et les cultures cellulaires.

Objectifs

Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des sucres provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de cahines de sucres partiellement dégradés dans un compartiment de la cellule appelé lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux ayant un effet délétaire dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris mutante. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose et identifier les populations cellulaires touchées dans ce contexte.

Bénéfices attendus

Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la maladie étudiée. A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précisions aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. L’étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.

Procédures

1360 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 1360 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. 1280 souris vont avoir une injection non douloureuse de piégeurs de fer ou d’inhibiteur d’une molécule régulant le fer ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. C’est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes. 560 souris seront gavées avec un volume adapté avec un geste précis et professionnel durant 5 secondes. Toutes les 2720 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une mise à mort réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences associées (immunologie et culture).

Impact sur les animaux

Les modèles de souris à générer ne présentent aucun phénotype dommageable et sera surveillé et notifié si cas contraire observé. Les interventions sur l’animal sont traduites dans les 3 procédures par des actes induisant une douleur ou une gêne classée comme « légère ». L’injection du fer est une injection uniquegénérant chez la souris une douleur classée « légère ». Les traitements de chélation de fer ou d’inhibition d’hepcidine se font par gavage ou injection intrapéritonéale induisent chez la souris une douleur ou une gène classée « légère ». En fin d’expérimentation, les souris seront anesthésiées avec un mélange de kétamine 400mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg) -intrapéritonéal avec un matériel approprié est un acte induisant une douleur ou une gêne classée légère.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir etre exploiter et permettre la démonstration de nos hypothèses expérimentales.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui restent issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentielles. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un personnel compétent et habitué. Le gavage des animaux est un geste difficile qui est réalisé par un personnel formé et entrainé. Le comportement des souris sera évalué quotidiennement par un personnel compétent. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animal. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra la mise à mort de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.

Choix des espèces

Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborées sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche muté d’intéret est adaptée pour étudier la pathologie et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des âges assez précoces qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie avec ou sans apport en fer. A 2 mois ces animaux ont les 1ers influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation sur les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.

Un bout de queue de moins de deux millimètres est prélevé sur chaque souriceau, de préférence pendant sa première semaine de vie, sur animal éveillé ou sous anesthésie gazeuse selon son âge. 500 souris vont être utilisées sur cinq ans dans cette seule procédure, déclarée d'un niveau de souffrance léger, pour identifier celles qui portent le génotype recherché et les orienter vers d'autres protocoles. Le porteur résume les atteintes attendues en une ligne, une douleur passagère au moment du prélèvement. Sur le devenir des souris, il écrit seulement que la procédure vise à définir les animaux d'intérêt, sans dire ce qu'il advient de celles qui n'ont pas le bon génotype.

Objectifs

Afin de déterminer les animaux d'intérêt à inclure dans d'autres procédures, il est nécessaire de réaliser une identification génétique des souris présentes en élevage à l'animalerie. Pour ce faire, les souris subiront une biopsie de l'extrémité de la queue.

Bénéfices attendus

L'identification génétique nous permet de sélectionner les animaux à inclure dans les procédures expérimentales de recherche.

Procédures

Les souris subiront une biopsie au niveau de l'extrémité de la queue (

Impact sur les animaux

Une douleur passagère est attendue au moment du prélèvement.

Devenir

Cette procédure vise à définir les animaux d'intérêt pour d'autres protocoles de recherche.

Remplacement

Ce protocole étant préliminaire à des études autorisées utilisant des animaux transgéniques à des fins scientifiques, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des souris par une méthode alternatives.

Réduction

La procédure ne sera réalisée que sur des animaux dont le croisement d'origine permet d'obtenir le génotype d'intérêt. La vérification du génotype au cours de l'élevage nous permet de limiter les dérives génétiques. Le nombre d'animaux est défni en fonction de notre protocole actuel pour le maintien de l'élevage. Ce nombre sera réduit en fonction des portées obtenues.

Raffinement

Après leur naissance, les animaux resteront hébergés en groupe avec leur mère dans une cage bénéficiant d'un milieu enrichi (coton foisonnant, aspen brick, tube carton et dôme) jusqu'à leur sevrage. Le geste sera réalisé au cours des 2 premières semaines de vie des souriceaux pour limiter la douleur associée à ce geste. Après sevrage, les animaux seront hébergés en groupe et avec un milieu enrichi. Les souris seront vérifiées quotidiennement et différentes mesures seront mises en place pour assurer leur bien-être. Dans le cas où un point limite serai atteint, l'animal concerné sera mis à mort.

Choix des espèces

Nos protocoles d'étude impliquent une vérification du génotype concernant les modèles expérimentaux murins transgéniques. Le génotypage se fera jusqu'à la 3e semaines de vie. L'opérateur effectuera le génotypage préférentiellement lors de la première semaine de vie.