Procédures légères
Dépletion des pericytes corticaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau, 320 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre un niveau léger. Toutes reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre jours, et une partie subit une chirurgie terminale de quinze minutes sous anesthésie pour le prélèvement d'organes. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un léger retard de croissance chez les jeunes et rendre les femelles stériles, effets qu'il rapporte sans en tirer de conséquence sur le protocole. Il affirme le recours à la souris "essentiel", sans expliquer comment le nombre de 320 animaux a été établi pour les quatre stades de développement étudiés.
Objectifs
La forme familiale primaire de calcification cérébrale (PFBC) consiste en une calcification progressive des vaisseaux sanguins cérébraux provoquant leur dégénérescence. Les anomalies génétiques responsables de cette maladie ont principalement été trouvées sur la voie Pdgfb. Les modèles murins génétiques ciblant la voie Pdgfb reproduisent partiellement le phénotype de la maladie. Dans ces modèles murins génétiques, la perte totale soit du Pdgfb, soit de son récepteur, entraine la mort des souris avant la naissance, alors que la maladie humaine apparait après plusieurs mois de vie. Une altération partielle de cette voie, par des mutations ciblées soit du Pdgfb ou de son récepteur reproduisent une partie des anomalies de la maladie humaine. Cependant, ils présentent le désavantage de mélanger des mécanismes physiopathologiques différents (développementaux, inflammation, vieillissement), qui empêche une compréhension fine de cette maladie. Nous proposons ici de développer une nouvelle approche pharmacologique à différents stades de développement précis pour décortiquer les différentes composantes cellulaires impliquées à chaque stade. L’efficacité du traitement sera évaluée par le taux de perte des pericytes (une population cellulaire particulière présente sur les vaisseaux sanguins) sur le réseau capillaire cortical comme dans les autres modèles murins déjà étudiés. Ce projet nécessitera un total de 320 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la PFBC et dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentiels sur de nombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra 1 injection intrapéritonéale par jour pendant 4 jours, dont le volume et concentration dépend de l’âge étudié. Une partie des animaux sont soumis à une chirurgie terminale sans réveil pour le prélèvement d’organe, qui dure 15minutes.
Impact sur les animaux
En fonction de l’âge d’administration, et en se basant sur les données connues sur les modèles génétiques, les souris pourraient éventuellement souffrir d’un léger retard de croissance (injections aux stade jeunes) et une stérilité chez les femelles (injections chez les jeunes et les adultes)
Devenir
mise à mort pour des analyses post mortem des cerveaux
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Une première procédure a pour objectif d’établir la dose optimale sans utiliser trop d’animaux. Pour chaque stade développemental étudié, elle sera effectuée sur seulement 6 animaux/dose/protocole (temoin ou molécule effective). Ce nombre permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en vérifiant que l’effet obtenu est suffisamment robuste. Cela nous permettra de conclure sur la dose optimale à utiliser pour la suite de l’étude. Pour la suite, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.
Raffinement
Pour vérifier la bonne tolérance des animaux à l’injection répétée du produit chimique, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place adaptée à l’âge étudié. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux évitant l'euthanasie des animaux. Pour la la chirurgie terminale sous anesthésie générale et antalgique efficace évite toute sensation douloureuse chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, injection intraperitonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme 4 stades de développement seront étudiés entre 5 et 60 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base d’études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent qu’il existe dès la naissance une altération du réseau vasculaire cérébral en absence de pericytes, mais que les mécanismes mis en jeux dans leur élimination/ remplacements pourraient être différents une fois passée la période développementale postnatale.
Elevage de lignées murines necessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de l’immunothrombose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Une biopsie d'oreille ou de queue de 2 mm au maximum, sur animal vigile, contention comprise en moins de cinq minutes : c'est l'unique acte que subissent les 440 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Deux des trois lignées élevées présentent un phénotype dommageable, avec des temps de saignement allongés, ce qui conduit le porteur à prélever à l'oreille plutôt qu'à la queue. Le projet consiste à entretenir ces lignées génétiquement modifiées pour des travaux ultérieurs sur la thrombose, 50 souris étant déclarées réutilisées dans d'autres projets. Pour les autres, le porteur écrit qu'elles servent à la "formation interne à l'équipe" ou sont "rétrocédées à d'autres équipes", sans dire combien ni à quelles fins.
Objectifs
L'objectif essentiel de cette demande de projet est d'assurer la préservation des souches de souris dans un environnement sans pathogènes, visant ainsi à garantir la reproductibilité de nos expériences tout en cherchant à minimiser le nombre d'animaux utilisés. L’utilisation de nos souches génétiquement modifiées nous permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la thrombose. La thrombose étant une réaction physiopathologique à un dérèglement ayant lieu dans un vaisseau sanguin, ce vaisseau provoque la formation d’un caillot qui est responsable d’une mauvaise irrigation des membres inférieurs ou d’organes tels que le cerveau, mettant en jeu la survie de l’individu. La compréhension de ces mécanismes dans des modèles précliniques in vivo est essentielle pour la découverte de molécules efficaces, présentant peu d’effets secondaires, pouvant traiter la thrombose.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'exercer un contrôle sur la population animale, offrant ainsi la possibilité de restreindre leur nombre au strict minimum pour résoudre nos hypothèses sur la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la thrombose et la thrombose associée au cancer. Notre production locale d’animaux est adaptée à nos besoins. Nos trois souches de souris genetiquement modifiées nous permettent d’évaluer différentes voies de propagation et initiation de la thrombose.
Procédures
Les animaux sont soumis à une seule biopsie d'oreille ou de queue (maximum 2 mm dans les deux cas) par animal. ce geste est effectué sur des animaux vigiles. La procedure dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée au prélèvement d'une biopsie de 2 mm maximum. Une seule biopsie est réalisée par animal, le geste est effectué par du personnel compétent et dure 2 à 5 minutes maximum, contention incluse. Le saignement pouvant découler du prélèvement est contrôlé grâce à l'utilisation de sites de prélèvement faiblement vascularisés.
Devenir
Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont utilisés pour de la formation interne à l’équipe ou rétrocéder à d’autre équipes. Les animaux de génotype d’intérêt nous permettent d’évaluer différentes voies de propagation et initiation de la thrombose. L’étude de ces voies a fait l’objet d’une autre demande de projet.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. À ce jour, il est : 1) impossible de reproduire un vaisseau sanguin contractile et activable ; 2) impossible de mettre en contact le vaisseau avec la totalité des cellules figurées du sang dans des conditions natives 3) impossible de produire des lignées cellulaires sanguines stables in vitro avec les modifications génétiques qui nous intéressent.
Réduction
Nous veillons à produire un nombre suffisant d’animaux pour maintenir nos lignées dans un statut sanitaire sans pathogènes, en les amplifiant selon nos besoins expérimentaux futurs. Les différents lots d'animaux ont eté estimé en fonction des projets en cours et déjà validés par le ministère en incluant la composante maintient des lignées murines. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont utilisés pour de la formation interne à l’équipe ou rétrocéder à d’autre équipes avant euthanasie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 maximum dans des cages de portoir ventilé avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Un cycle circadien est appliqué dans les locaux d'hébergement. Un enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton est ajouté dans toutes les cages. Les animaux reproducteurs sont 3 par Cages (Un male pour deux femelles d’un âge supérieur à 7 semaines) pour les trois lignées. une lignée ne présente pas de phénotype dommageable et elle est utilisée en temps qu’hétérozygotes pour visualiser certain globules blancs. Deux autres lignées ont un phénotype dommageable car nous adaptons le site de prélèvements des biopsies pour réaliser le génotypage. Ces deux lignées présentent des temps de saignement modérément allongés par rapport à des animaux wild type mais ne mettent pas leur vie en danger. Nous prélevons donc au niveau des oreilles qui sont bien moins vascularisées que la queue de sorte à ce que le saignement soit le plus faible possible. Les points limites sont la présence de dermatites associées avec une perte de pilosité et une perte de fertilité. De manière générale les couples reproducteurs sont reformés tous les 6 à 8 mois pour deux souches. Concernant la derniere lignée: les males peuvent êtres stériles à partir de la 25 -ème semaine de vie, les couples sont donc renouvelés entre deux à trois fois par an.
Choix des espèces
Le modèle murin est le plus adapté pour notre thématique de recherche qui, est un modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose. En effet, la formation d’un thrombus dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme aussi bien au niveau moléculaire que cellulaire. Le genotypage est realisé en même temps que le sevrage et l'indentification des animaux pour 2 de nos souchesà la troisieme semaine de vie de l'animal. Pour lla troisieme seul les couples reproducteurs sont genotypés. Un accouplement pouvant etre mis en place entre la 7 eme et la 15 eme semaine de vie de l'animal, le genotypage sera realisé à ce moment.
Étude pilote sur l’effet de la couleur et de l’ultrastructure de la peau des ectothermes sur la thermoregulation par absorption de radiation infrarouge
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Capturés dans des populations semi-naturelles entretenues par le laboratoire, puis acclimatés deux semaines en terrarium individuel, 10 lézards vivipares adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une seule biopsie de peau dorsale de 1,5 mm sous anesthésie locale, d'une minute environ, avant trois semaines de surveillance puis un retour dans son enclos d'origine. Le porteur anticipe un stress lié à la capture et à la manipulation, une douleur localisée et un risque d'infection. Il revendique un raffinement face à l'usage courant du domaine, qui consiste à tuer les animaux pour prélever leur peau, et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible, les modèles informatiques manquant précisément des données que ce projet doit produire.
Objectifs
Ce projet a pour but de réaliser une étude pilote pour : 1. Évaluer et mettre au point une méthode pour réaliser des biopsies de la peau des lézards sans mise à mort, 2. évaluer et mettre au point les méthodes de microscopie électronique qui permettront d’analyser les échantillons prélevés et 3. évaluer la variation naturelle existante au niveau de la structure de la peau des lézards afin de développer des études futures. L’objectif de ce projet est de raffiner la procédure de prélèvement qui a pour finalité l’étude de l’adaptation des espèces au changement climatique à travers des changements de la structure et de la couleur de leur peau. Cette question fait partie d’un intense débat au sein de la communauté scientifique qui vise à prédire si et comment la coloration des espèces animales sera affectée par le changement climatique et pourrait en partie aider les espèces les populations naturelles à s’adapter à celui-ci.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote aidera au développement des projets futurs pour comprendre l’adaptation des espèces ectothermes (c'est à dire espèces à "sang froid") au changement climatique. La coloration externe des animaux, particulièrement les mélanines - pigments qui colorent la peau des humains et de la plupart des animaux -, est supposée jouer un rôle clé dans l’efficacité d'absorption de la chaleur du soleil (radiation infra-rouge). En produisant des couleurs plus ou moins foncées, les mélanines sont supposées affecter la vitesse à laquelle les radiations solaires sont captées. Cette hypothèse est centrale pour comprendre comment la coloration peut aider les espèces à s’adapter au changement climatique et quelles seront les conséquences à moyen et long terme du changement climatique sur la biodiversité et les écosystèmes. Bien que la coloration animale soit supposée être sous sélection du réchauffement du climat, le sens de la réponse, à savoir si des températures plus chaudes favoriseraient plutôt des individus de couleur claire que foncée, est fortement débattu. Au centre de ce débat, il existe un manque de compréhension sur comment les mélanines et d’autres composantes de la peau influencent l’absorption de chaleur, ce que le projet proposé peut aider à comprendre grâce à un développement méthodologique.
Procédures
Les animaux seront soumis une seule fois à un prélèvement de la peau dorsale, par biopsie, avec anesthésie locale. La durée estimée est de 1 minute.
Impact sur les animaux
Nous estimons que la procédure pourrait entrainer un stress lié à la capture et la manipulation des animaux, une douleur légère et localisée pendant et après la biopsie de peau, et un risque d’infection à cause du prélèvement des échantillons de peau. En prévision et afin de limiter ces dommages potentiels, nous avons conçu l’étude en laissant un temps d’acclimatation pour réduire le stress (deux semaines après la capture), en minimisant la surface de peau échantillonnée (1.5 mm de diamètre), en utilisant de l’anesthésie locale durant la procédure, du matériel stérile pour la biopsie de la peau, et des soins (désinfection de la peau avant et après la biopsie et application de cicatrisant , et une période de 3 semaines pour contrôler la récupération des animaux avant de les relâcher). Ces mesures seront couplées à des stratégies de réduction du stress lors de l’hébergement des lézards dans l’animalerie avant et après la procédure (i.e., bonnes conditions d’hébergement, accès à la nourriture, l’eau, et abris).
Devenir
À la fin de l’étude et une fois leur état de santé vérifié, tous les individus seront relâchés dans leurs populations semi-naturelles d’origine.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’un modèle animal pour cette étude. Un modèle non-animal potentiel consisterait à utiliser des modèles informatiques pour prédire comment la structure de la peau peut changer avec différentes températures ambiantes. Cependant de tels modèles ne sont pas réalisables pour le moment, car les informations nécessaires à leur développement manquent et dépendent de la collecte de données, telles que celles qui seront obtenues grâce à la procédure proposée ici. Un autre modèle potentiel serait de collecter des échantillons de peau sur des animaux morts de cause naturelle. Cependant cette approche n’est pas faisable étant donné que la structure de la peau se dégrade rapidement après la mort et qu’elle est détruite par les méthodes de préservation communément appliquées (conservation dans l’éthanol, formol ou congélation). Bien qu’aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne puisse être appliquée, la procédure que nous proposons de tester dans notre étude pilote n’est pas la procédure communément suivie pour étudier la structure de la peau des ectothermes, qui implique de tuer les animaux avant de collecter leur peau. Nous proposons ici de collecter un petit échantillon de peau par biopsie, une procédure plus légère et beaucoup moins invasive déjà appliquée avec succès sur des reptiles dans une étude récente.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’individus nécessaires à cette étude (N=10) pour pouvoir tester les différentes méthodes de microscopie et estimer la variabilité des traits étudiés. Trois échantillons seront initialement utilisés pour raffiner la méthode de fixation qui permettra d’obtenir des coupes de bonne qualité et exploitables avec les 3 méthodes de microscopie que nous souhaitons utiliser (microscopie par transmission électronique, microscopie électronique à balayage et microscopie RAMAN). Les 4 restants seront traités ultérieurement avec la méthode sélectionnée, et nous aurons ainsi un total de 5 échantillons d’individus différents pour estimer la variation naturelle des différents paramètres à mesurer pour réaliser des études futures à partir de la moyenne et la variance des traits.
Raffinement
Nous avons implémenté plusieurs mesures d’amélioration durant les différentes phases du projet. D’une part, les conditions dans lesquelles les animaux sont hébergés, dans les mésocosmes (prairies humides clôturées pour pouvoir faire les suivis des individus) ainsi que dans l’animalerie avant et après la procédure, sont optimales pour l’espèce et offrent des éléments indispensables à la diminution du stress. La taille des enclos correspond à la biologie de l’espèce. Des pierriers et des tas de bois, pour se cacher et thermoréguler, ainsi que des points d’eau sont présents dans chaque enclos. La majorité de la surface des enclos est constituée de zones végétales denses ressemblant à des zones humides, caractéristiques de l’habitat naturel de l’espèce. Un système d’ombrage permet de réduire la température lorsque celle-ci devient trop importante. Les enclos sont arrosés 30 minutes par jour pour éviter tout stress hydrique. Les lézards utilisés dans ce projet (10 individus) seront ramenés au laboratoire et maintenus individuellement dans des terrariums de taille supérieure à celle requise pour cette espèce et offrant les éléments indispensables à la diminution du stress des animaux (source de chaleur et d’UV, zone humide et fraiche, abris). Chaque lézard sera nourri avec 2 grillons par jour, grillons régulièrement enrichis en vitamines. La santé des animaux sera surveillée avec des observations quotidiennes (activité des animaux) et des mesures hebdomadaires (suivi du poids). Ces conditions de captivité sont optimales. Durant la procédure proposée, les mesures d’amélioration comprennent l’utilisation d’anesthésique local, de matériel de biopsie stérile (et spécialement conçu pour la biopsie de peau) et de désinfectant, ainsi que le suivi de la cicatrisation de la peau pendant au moins trois semaines suivant la biopsie. Les lézards seront exclus de la procédure s’ils présentent des points incluant une apathie forte, des défauts de mues importants, ou une perte de masse de 25 à 30 % associée à une diminution d’appétit.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est le lézard vivipare Zootoca vivipara (Jacquin 1787). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis trente ans dans les populations naturelles. Cette espèce est intéressante pour comprendre l’écologie de vertébrés ectothermes comme les reptiles ou les amphibiens terrestres, une majeure partie de la biodiversité. Dans le monde, 20% des reptiles sont menacés d’extinction, pourtant leur écologie reste peu étudiée et comprise. Il devient donc urgent de mieux comprendre le comportement de ces espèces à l’aide de modèles solides. L’espèce Zootoca vivipara est optimale car son écologie est bien connue et son génome est séquencé, ce qui en fait un modèle unique pour l’écologie fondamentale et appliquée des vertébrés ectothermes. L’espèce n’est pas menacée en Europe (classée comme espèce à préoccupation mineure par l’Union Internationale de la Conservation de la Nature) même si elle est sensible aux dégradations de son milieu, et plusieurs études montrent que les populations naturelles de cette espèce sont en péril à cause de changement climatique. Les individus utilisés seront des adultes uniquement (2 ans et plus) afin de réduire les sources connues de variation de couleur associée à l’âge.
Production de sérum et collecte de tissus pour développer des outils immuno-sérologiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunisés une ou deux fois par injection dans l'abdomen sous anesthésie, puis saignés par ponction dans le cœur sous anesthésie profonde, 80 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet vise à fabriquer du matériel de référence, sérums et organes, pour mettre au point des tests de détection des virus qui circulent chez les chauves-souris européennes. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue en dehors de la vaccination et de la ponction cardiaque, et affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine". La ponction est terminale, les organes sont prélevés dans la foulée.
Objectifs
De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. les virus de la rage et Ebola), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite.
Bénéfices attendus
L’approche expérimentale réalisée au cours de ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris, réservoir de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.
Procédures
Les hamsters seront immunisés une ou deux fois par voie intra-péritonéale (volume de 0.5mL- animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)
Impact sur les animaux
Hormis la phase de vaccination, et la ponction cardiaque sous anesthésie générale, aucun nuisance ou effets indésirables ne sont attendus.
Devenir
Mise à mort pour collecte de sang et tissus
Remplacement
Suite à l’émergence de nouvelles espèces virales chez les chauves-souris européennes, il est nécessaire de se préparer pour mieux appréhender les prochaines émergences qui pourraient toucher les animaux sauvages et/ou domestiques et qui pourraient potentiellement être transmises à l’Homme, d’autant plus que le franchissement de la barrière d’espèces existe, comme cela a déjà été montré avec le chat ou la fouine pour les lyssavirus. Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules primaires et d’organoïdes. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumons, cerveau, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.
Réduction
Le nombre de hamsters a été déterminé de façon à obtenir les volumes nécessaires de sérum pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement des organoïdes qui à moyen terme permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront uniquement immunisés par des suspensions non pathogènes (virus inactivés ou protéine virale vectorisée)
Choix des espèces
Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées d’intérêt ont démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia: EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent chez ces souris une maladie hépatique rare, la glycogénose de type Ia, avant leur transport vers un second établissement où elles passent quatre jours isolées dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. 23 souris sont concernées, 12 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 11 un niveau léger. Le porteur qualifie cet isolement de "léger stress" et écrit qu'aucune souris ne sera mise à jeun, tout en indiquant que ces animaux peuvent tomber en hypoglycémie, se prostrer, voir leur température chuter et en mourir, ce qu'il a observé chez moins de 2 % de l'élevage. Aucune n'est tuée à l'issue : toutes sont gardées en vie et pourront servir à un autre projet si le vétérinaire juge la gravité réellement subie inférieure ou égale au niveau modéré.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSDIa sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 8 semaines dans le premier établissement utilisateur. Après transfert par un transporteur agréé dans le deuxième établissement, ces souris seront ensuite isolées pendant 4 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis 2 demi-journées, avec remise avec leurs congénères entre chaque période, et enfin 24h) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure. Les souris pourront être utilisés dans un autre projet, après validation du niveau de sévérité de l’ensemble de la procédure subi par chaque animal par le vétérinaire désigné du deuxième établissement.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un léger stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis du responsable du suivi du bien-être animal sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Les souris transgéniques et leurs contrôles (souris saines) seront gardées en vie et pourront être utilisées pour un autre projet si leur état de santé le permet, et si la gravité réelle subie par l’animal est classée au maximum en niveau modérée. Les souris supplémentaires de l’élevage (mâles ou femelles) pourront être utilisées dans un autre projet ou pour la reproduction.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de glycogénose de type Ia nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémie.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation animale, ces souris ne seront pas mises à mort et seront utilisés pour un autre projet.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel et par l’odorat. L’enrichissement et la litière de la cage d’origine seront conservés lors de l’isolement. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Analyse du potentiel anti-leucémique d’inhibiteurs de la famille BCL-2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un traitement administré cinq jours par semaine pendant toute la vie de l'animal, des prises de sang chaque semaine sous anesthésie et une ponction de moelle dans le tibia : 13 112 souris vont être utilisées, toutes tuées et autopsiées à l'issue. 1 242 d'entre elles sont engagées dans des procédures classées sévères, 11 800 dans des procédures légères, le reste en gravité modérée. Les souris reçoivent par injection des cellules de leucémie humaine puis des inhibiteurs de deux protéines de survie cellulaire, le porteur rappelant qu'une version antérieure de ce blocage faisait chuter les plaquettes sanguines et provoquait des hémorragies. La lignée retenue est immunodéficiente au point d'accepter des cellules humaines et développe peu de tumeurs spontanées, ce qui rend selon lui la croissance des greffes rapide et les résultats reproductibles.
Objectifs
La leucémie est un cancer caractérisé par la prolifération excessive et le blocage de la différenciation des cellules immatures du sang, Selon la cellule d’origine à partir de laquelle la maladie se développe et selon la vitesse de ce processus, on peut distinguer différents types de leucémies dont les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL). Parmi les LAL, on distingue deux sous-types : les LAL-B et les LAL-T. Les leucémies affectent enfants et adultes, et malgré le fait que dans les dernières années beaucoup de progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des LAL-T pédiatriques et 50% des LAL-T de l’adulte. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées pouvant améliorer la survie des patients leucémiques. Les protéines que nous étudions dans ce projet sont des acteurs essentiels de la survie des cellules en général et des cellules leucémiques en particulier. Afin d’éradiquer les cellules cancéreuses il est donc important d’interférer avec leur survie. L’objectif est donc de tester des inhibiteurs de ces protéines pour empêcher la survie des cellules leucémiques inoculées aux animaux. Le but est de trouver des traitements ciblés permettant la mise en rémission de patients résistants ou ayant rechuté.
Bénéfices attendus
Les patients atteints de LAL-T sont traités par des agents chimiothérapeutiques pendant un temps long qui provoquent des effets secondaires importants. De plus, les patients qui sont résistants à la phase d’induction de chimiothérapie et ceux qui rechutent ont un pronostic vital très sombre et il n’existe pas de traitement permettant de prolonger leur survie dans l’attente d’une greffe par exemple. Il est donc essentiel de trouver de nouveaux traitements ciblés. De plus, les patients normalement mis en rémission par la chimiothérapie pourraient aussi bénéficier de ces nouveaux traitements ciblés si ces nouvelles molécules sont plus efficaces et moins toxiques. Nous avons précédemment montré que l’inhibition à la fois des protéines d’intérêt altérait profondément l’expansion des cellules leucémiques in vivo mais que cet effet thérapeutique était associé à une diminution du taux de plaquettes sanguines provoquant des hémorragies . Nous disposons actuellement d’un inhibiteur de BCLx dont la délivrance est ciblée exclusivement aux cellules leucémiques, ce qui devrait empêcher sa toxicité. Si les expériences in vivo démontrent ses propriétés anti-leucémiques soit seul, soit en combinaison avec l’inhibiteur de BCL2, ou avec un traitement chimiothérapeutique, il pourrait rapidement représenter une offre thérapeutique sérieuse pour les patients atteints de LAL-T.
Procédures
Dans un premier lot, les cellules leucémiques sont injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (durée du geste : inférieure à 20sec). Des prises de sang sur animal anesthésié sont faites 2 semaines après l'injection (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Lorsque les animaux développent la leucémie, ils sont traités 1 fois par injection intraveineuse (durée du geste < à 20 sec). Des prises de sang hebdomadaires sont réalisées sur animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie < à 5 minutes). Dans un autre lot les cellules leucémiques sont injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (durée inf 20 sec). Des prises de sang sur animal anesthésié sont faites 2 semaines après l’injection (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Lorsque les animaux développent la leucémie, ils recoivent un 1er traitement par voie intra-veineuse sur animaux vigiles et un second traitement par gavage (durée de chaque geste inf à 10 sec). Une partie des animaux recevra ce traitement 5jours par semaine pendant 3 semaines. Une autre partie des animaux recevra ce traitement 5 jours par semaine pendant toute sa vie. Une dernière partie de ces animaux recevra ce traitement 5 jours par semaine pendant 3 semaines et recevra en plus une chimiothérapie à raison de 2 injections le 1er jour du traitement puis une injection par jour pendant 4 jours consécutifs. Ce traitement sera répété 2 fois. Le suivi de la leucémie se fait par une prise de sang hebdomadaire sur animaux anesthésiés et une ponction de moelle dans le tibia des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie inférieure à 5 min) sera réalisé à la fin du premier traitement pour les animaux traités en continu et pour les animaux traités par chimiothérapie. Dans un dernier lot, les cellules leucémiques sont injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Des prises de sang sur animal anesthésié sont réalisées 3 semaines (durée de l’anesthésie < à 5 minutes). Lorsque les animaux développent la leucémie, ils sont traités 1 fois par injection intra-veineuse sur animaux vigiles (durée du geste inf à10 sec).
Impact sur les animaux
Suite à l’injection de cellules leucémiques, les souris vont développer une leucémie . Le développement de la leucémie s’accompagne de signes cliniques associés tels que respiration altérée, poils hirsutes . Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements non irritants par injections intraveineuses ou injections dans l’abdomen seront celles liées à la piqûre elle-même (gène de courte de durée). L’administration des traitements par gavage entrainera un stress de courte durée lié à la contention de l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux traités par les différents agents seront mis à mort et autopsiés afin d’analyser en détail les différents organes.
Remplacement
Il existe plusieurs méthodes pour identifier le caractère potentiellement « anti-leucémique » d’une drogue, comme l’utilisation de lignées in vitro et de cellules primaires ex-vivo. Un panel d’inhibiteurs de BCLX et BCL2 a été préalablement testés dans ces conditions afin d’identifier les meilleurs d’entre eux. La leucémie est un cancer caractérisé par la prolifération excessive et le blocage de la différenciation des cellules immatures du sang, localisées dans la moelle osseuse. Ce micro-environnement complexe ne peut pas être mimé par les expériences in vitro, ni même par les systèmes de co-culture. L’impact thérapeutique des composés ne peut donc qu’être adressé in vivo au sein d’un environnement complexe qui récapitule au mieux le développement de la leucémie chez l’Homme.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux à utiliser, nous adapterons le nombre des animaux par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en limitant au maximum ce nombre. Chaque expérience sera réalisée une seule fois sur chaque xénogreffe.. La première procédure permettra de choisir la meilleure dose de traitement à utiliser pour la suite du projet afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. A noter que seuls les traitements ayant donné des bons résultats in vitro seront testés sur les animaux Des ponctions de moelle, à l’image des myélogrammes réalisés chez les patients, en sortie de traitement seront réalisées afin de mesurer les propriétés anti-leucémiques des agents testés sans avoir à mettre à mort les animaux. De cette façon nous pourrons mesurer les effets a court terme et à long terme (courbe de survie) au sein de la même expérience. Les expériences comprendront un nombre minimum pour être statistiquement valable.
Raffinement
Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Outre le prélèvement de sang qui permet une mesure objective de l’envahissement par les cellules leucémiques, les souris seront pesées régulièrement. Les souris seront mises à mort dès l’apparition des points-limite tels que décrits dans la grille de score (perte de mobilité, charge tumorale maximale atteinte avec baisse de l’intensité des marqueurs). Nos expériences précédentes montrent que sur une large partie des xénogreffes (mais pas toutes), la baisse des marqueurs permet de suivre l’évolution de la charge tumorale et en plus de réaliser des courbes de survie en anticipant les stades moribonds. Tous ces signes cliniques sont décrits dans une grille de score afin d’éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté biologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes de tumeurs humaines utilisant des souris très immunodéficientes. En effet, celles-ci permettent l’expansion de cellules humaines primaires saines et /ou cancéreuses permettant l’élaboration de modèle pour l’étude pré-clinique de composés pharmacologiques sélectionnés. L’utilisation de tels modèles permet d’étudier l’importance de l’environnement, les cellules saines du stroma dans les processus cancéreux. De plus, le modèle murin choisi est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. Les souris NSG arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats.
Évaluation de probiotiques administrés pendant la période périnatale pour contrebalancer les effets négatifs du sevrage précoce et la sensibilité aux infections.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Tester cinq souches probiotiques candidates conduit ici à sevrer précocement des souriceaux, puis à les infecter par un germe intestinal ou extra-intestinal. 1 054 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal est gavé sous contention vingt et une ou vingt-deux fois, isolé dans un pot en plastique pour recueillir ses excréments jusqu'à huit fois, saigné à la joue, et pour une partie d'entre eux piqué dans l'œil sous anesthésie. Le porteur annonce une perte de poids, un pelage hérissé, une posture voûtée et des diarrhées liées aux infections, et justifie l'usage des rongeurs par l'impossibilité de reproduire les communications entre organes sur des cultures cellulaires.
Objectifs
Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée de microorganismes (bactéries, champignons, virus…) influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). Aujourd'hui, il y a une tendance dans les populations humaines occidentalisées à avancer la fin de l’allaitement (sevrage) du nourrisson ce qui a un impact sur la primocolonisation et qui pourrait avoir un impact direct sur la santé du nouveau-né. Au cours du développement précoce du nouveau-né, des perturbations dans les interactions entre le microbiote et l'hôte pourraient nuire de manière irréversible et durable à la maturation du système immunitaire, prédisposant l'hôte à développer des maladies inflammatoires et une altération de la fonction de la barrière intestinale. Cette fonction correspond à la capacité de la muqueuse intestinale à confiner des éléments indésirables (typiquement des bactéries pathogènes) dans la lumière intestinale tout en conservant sa capacité d’absorption des nutriments. Dans ce contexte, des interventions ciblées au tout début de la vie pourraient constituer des stratégies faciles à mettre en œuvre et à contrôler pour compenser les perturbations du microbiote dues à ces sevrages plus précoces. Dans ce projet, nous nous proposons d´utiliser un modèle de souris de sevrage précoce et d’étudier la capacité d’une supplémentation avec différents probiotiques candidats (5 candidats en tout), c’est-à-dire des microorganismes ayant des effets santé bénéfique, à restaurer le microbiote intestinal. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons soumettre les souris ayant subi un sevrage précoce à une infection. Cette infection sera causée soit par un pathogène intestinal soit par un pathogène extra-intestinal (2 pathogènes différents).
Bénéfices attendus
Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de 5 bactéries potentiellement probiotiques à améliorer la récupération du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liées au sevrage précoce. Il s’agit donc d’améliorations de connaissances fondamentales et des perspectives potentielles d’utilisation de bactéries probiotiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par le sevrage précoce.
Procédures
Contentions et gavage sur animal vigile: 21 contentions et gavages pour 969 souris + 1 contention avec gavage pour 486 souris (les animaux subiront donc ce geste 21 ou 22 fois, selon les cas) ; chaque contention/gavage dure environ 15 secondes. Prélèvement de fèces : 1 fois pour 1063 animaux + 7 fois pour 486 souris (les animaux subiront donc ce type de prélèvement 1 fois ou 8 fois selon les cas) ; chaque prélèvement dure quelques minutes. injections : 1 fois pour 483 animaux vigiles et 1 fois pour les mêmes animaux anesthésiés. Contention et piqûre réalisées en 15-20 secondes environ Prélèvement de sang : sur animal vigile, 969 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des infections. Les principaux symptômes visibles attendus sont : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée. L’une des infections pourrait en outre générer des altérations du transit intestinal, de type diarrhée légère. Le sevrage précoce peut engendrer chez les souriceaux un retard dans leur prise de poids. Par ailleurs, un stress temporaire lié à l’hébergement individuel des mères peut survenir en fin de gestation. Il y aura besoin de contention pour certaines manipulations qui peuvent générer un inconfort et un stress transitoires pour les animaux. Il y aura des administrations qui nécessiteront une anesthésie et une piqûre au niveau de l’œil. L’anesthésie nécessite une piqûre qui génère une brève douleur. La piqûre au niveau de l’œil étant réalisé sur animal anesthésié ne génère pas de nuisance particulière. Par ailleurs, nous isolerons les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des fèces individuellement. Cet isolement dure quelques minutes et peut générer un léger stress. Enfin, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang à la joue. Cette opération nécessite une contention et une piqûre, ce qui peut occasionner un stress et une douleur brève.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. La survie des animaux (souriceaux puis adultes) est incompatible avec les différents prélèvements et procédures effectués.
Remplacement
Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes.
Réduction
Les bactéries testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver , pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre) et des hamacs en plastique. Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques seront aussi utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines, incluant les études sur le microbiote intestinal de par leurs similitudes fonctionnelles. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée (12 souriceaux en moyenne). Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte.
Développement d’immunothérapies antigène-spécifique pour la maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Issues d'un élevage de lignées transgéniques dont une partie sera tuée en fin de période reproductive sans qu'aucun prélèvement ne soit réalisé, 4 930 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles développent une maladie neurodégénérative et des troubles cognitifs, avec un risque d'agressivité et de blessures entre congénères que le porteur signale. Chacune subit une biopsie avant sept jours de vie sur animal vigile, puis des injections répétées pendant sept mois, jusqu'à douze prises de sang et une batterie de tests cognitifs de cinq à vingt minutes. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" et présente comme une mesure de remplacement le fait de n'avoir retenu que trois candidats vaccins sur huit après criblage in vitro.
Objectifs
L'implication de l'immunité dans les troubles neurodégénératifs est un domaine qui émerge fortement et qui est désormais considéré comme une voie très prometteuse pour le développement d'immunothérapies innovantes modifiant la progression de ces pathologies, en particulier dans la maladie d'Alzheimer (MA) et les autres Tauopathies. Il est clairement établi que l’inflammation locale au niveau du système nerveux central est une caractéristique associée à la neurodégénérescence, notamment dans la MA et d'autres tauopathies, et joue un rôle complexe dans la physiopathologie de la maladie. Outre cette inflammation locale, des preuves de plus en plus nombreuses mettent aujourd'hui en évidence un rôle des acteurs périphériques du système immunitaire dans la pathophysiologie de la MA et des tauopathies. Des résultats préliminaires suggèrent fortement une réactivité de ces cellules contre les protéines Tau pathogènes. Le projet a ainsi pour objectif de développer des stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire réactif contre les protéines pathogènes, afin d’en contrôler son activité et limiter les mécanismes qui contribuent à l’émergence des processus neurodégénératifs. L’induction d’une tolérance immunitaire spécifique est alors recherchée pour agir de façon ciblée et ne pas perturber le fonctionnement normal du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Les maladies neurodégénératives et plus spécifiquement la Maladie d’Alzheimer (MA) ont un impact considérable sur le secteur de la santé et le secteur médico-social, en raison du coût important de la prise en charge et de la prévalence élevée de cette maladie, qui touche environ 7 millions de personnes en Europe. Avec le vieillissement de la population, le nombre de personnes concernées par cette forme de démence va largement augmenter. La prise en charge de ces patients constitue aujourd’hui un coût de plus de 20 milliards d'euros par an pour la France. Aucune thérapie actuelle ne parvient à enrayer significativement cette pathologie, qui conduit à une destruction irréversible des neurones. Nous pensons qu’il y a un réel intérêt à développer cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche se différencie des autres stratégies d’immunothérapie actuellement testées en clinique, qui visent à induire l’élimination active des dépôts protéiques. A noter toutefois, qu’un précédent essai a été suspendu en raison de cas de méningo-encéphalites chez certains patients. Notre approche cherche au contraire à induire une tolérance face à ces dépôts et limiter ainsi l’inflammation associée à la réactivité contre ces protéines pathogènes. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles utilisés développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps, s’apparentant aux symptômes de la Maladie d’Alzheimer. Pour constituer les cohortes d’étude, les animaux devront être identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie effectuée de manière précoce sur animal vigile (geste d’environ 1 minute). Les traitements seront administrés par injection répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou sous-cutanée dès l’âge jeune adulte (3 mois) pour une période de 7 mois à raison d’une injection quotidienne pendant 5j et/ou toutes les 2 semaines, tous les mois ou tous les 3 mois, selon le protocole. Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les 4 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement), à l’exception de la phase initiale où 2 prélèvements seront réalisés à 2 semaines d’intervalle. Les animaux seront prélevés entre 1 et 12 fois sur la durée du traitement (période de 12 mois). Les animaux seront finalement soumis à des tests cognitifs pour évaluer l’effet thérapeutique des thérapies proposées et évaluer leur impact sur les fonctions cognitives. Ces tests comportementaux durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 5 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de thérapie prévue, afin de réaliser des prélèvements pour des analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge, source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). La biopsie effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 7 jours permettant l’identification génétique des animaux peut être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Les traitements mis en œuvre impliquent des injections au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou de la base de la queue (sous-cutané) de manière répétée au cours du temps. Ces injections pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire à la bonne réalisation de l’administration et une douleur de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille (piqûre). De même, plusieurs prélèvements de sang seront nécessaires et potentiellement générateurs de stress et de douleur. Un risque de saignement prolongé existe mais reste peu probable. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédent l’euthanasie des animaux pour les prélèvements implique une injection intrapéritonéale pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes et jamais testées dans le cadre des maladies neurodégénératives. Il est donc indispensable d’avoir recours à un modèle expérimental in vivo chez la souris pour appréhender l’efficacité thérapeutique des traitements envisagés. Ces études ne peuvent être en aucun cas remplacer par des modèles in silico ou in vitro. Toutefois, ce modèle animal sera utilisé uniquement pour des vaccins ou des stratégies thérapeutiques ayant été validés in vitro et ayant démontré des effets. Ainsi, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous pré-sélectionnerons et utiliserons un nombre limité de candidats vaccins. Sur les 8 candidats envisagés, seuls les 3 « meilleurs », sélectionnés sur la base des tests in vitro, seront retenus pour les études in vivo. Cette stratégie s’inscrit dans un principe de remplacement, en limitant les tests in vivo autant que faire se peut et de les remplacer si possible par des approches alternatives.
Réduction
Le projet impliquera un total de 4930 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux dont notamment des pathologies neurodégénératives. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre de ce projet, les souris seront utilisées soit à l’âge de 2 à 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie, soit à l’âge de 10 mois, stade où les troubles cognitifs sont observés.
Amélioration du vieillissement en bonne santé par une reprogrammation partielle in vivo et l’élimination de cellules sénescentes.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Une souris qui perd plus de 20 % de son poids maximal, peine à se déplacer ou échoue aux tests de réflexes est retirée de l'étude et tuée. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à neuf mois pour des analyses tissulaires et moléculaires. La moitié porte une mutation progéria qui les fait vieillir prématurément : perte de poids et de mobilité après six mois, courbure de la colonne vertébrale, mort entre quarante et cinquante-cinq semaines. Le porteur décrit un protocole sans chirurgie, les deux traitements passant par les croquettes et l'eau de boisson, et écrit choisir de tuer ces souris à neuf mois pour "éviter les nuisances liées à un vieillissement prématuré", nuisances que la lignée elle-même produit.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'utiliser la reprogrammation cellulaire comme stratégie pour retarder les effets du vieillissement, et notamment la perte des capacités régénératrices de l'organisme avec l’âge. En 2006 et 2007, il a pu être montré que les cellules adultes de souris et d'humains peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes. En 2016, il a été démontré que ce mécanisme de reprogrammation appliqué de façon transitoire améliore la santé et prolonge l’espérance de vie losqu’il est réalisé sur des souris progéria, qui vieillissent prématurément. Des expériences menées par notre équipe ont permis d’affiner cette stratégie in vivo. En effet, de 2018 à 2021, trois étudiants ont rédigé et publié leur thèse de doctorat, sur cette reprogrammation partielle in vivo. L’ensemble de ces travaux a notamment fait l’objet d’une publication en 2022. D’autres études plus récentes de l’équipe nous indiquent qu’une reprogrammation unique, trop tardive, ne permet pas d’augmenter la longévité et son effet sur les tissus est mitigé. Pour cette raison, nous faisons l’hypothèse, que l’accumulation de cellules sénescentes liée à l’âge, pourrait être un frein a l’effet de cette reprogrammation partielle, et proposons un projet combinant cette reprogrammation avec une sénolyse. L'objectif spécifique de notre projet sera donc de combiner ou non, chez les souris, un traitement visant à éliminer les cellules sénescentes avec la reprogrammation des cellules.
Bénéfices attendus
La reprogrammation cellulaire est un processus capable de ramener les cellules vers un état juvénile. Chez les souris, la reprogrammation a permis une amélioration de l’état de santé et de l’espérance de vie. La reprogrammation représente donc une stratégie innovante et prometteuse dans le développement de thérapies ciblant les maladies du vieillissement. Chez l’Homme comme chez la souris, a été constatée une accumulation de cellules dites sénescentes dans les différents tissus. Ces cellules sénescentes ont perdu leur capacité à proliférer et provoquent un état inflammatoire lié à l’âge dans les tissus. Des données du laboratoire montrent que la reprogrammation de souris agées présente une efficacité réduite. Notre hypothèse est que les cellules sénescentes réduisent l’impact positif de la reprogrammation. Nous envisageons donc de combiner la reprogrammation avec un traitement visant à supprimer les cellules sénescentes. Ce projet apportera de nouveaux éléments quant à l’utilisation combinée d’agents sénolytiques (qui suppriment les cellules sénescentes) et de la reprogrammation comme stratégie thérapeutique destinée à réduire l’impact des maladies liées à l’âge et améliorer l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
Lors de cette étude, l’état de santé des animaux sera étroitement surveillé. Le suivi du poids des animaux sera un critère important dans l’évaluation de leur état. Ainsi les animaux seront fréquemment pesés. Pour limiter au maximum les interventions, les deux traitements pharmacologiques prévus seront administrés par l’alimentation. La molécule destinée à supprimer les cellules sénescentes sera incorporée aux croquettes et la molécule permettant la reprogrammation sera dilluée dans l’eau. Il n'y aura aucun geste technique particulier lié à autre chose que de la surveillance des animaux (contention pour l'identification des animaux et la pesée). Les animaux seront transferé vers l'animalerie d'experimentation autours de 4 mois et les traitement seront inclu dans la nourriture et la boisson et euthénasié a 9mois sans autre gestes.
Impact sur les animaux
La moitié des souris de l’étude possèdent une mutation dite progéria. Ce caractère conduit à un vieillissement accéléré des animaux. Ces animaux connaissent les nuisances dûes aux grands âges de façon prématurée. De plus, ils meurent de façon précose à un âge situé entre 40 et 55 semaines. Après l’âge de 6 mois, une fragilité croissante liée à l’âge conduit à une diminution progressivement du poids et de la mobilité. Ces animaux ont également tendance à développer une lordose (coubure de la colonne vertébrale). Les démarches expérimentales ne comprennent pas de chirurgies susceptibles de causer de l'inconfort aux animaux. De plus, aucun effet indésirable n’est attendu sur les traitements passants par l’alimentation.
Devenir
Au terme de l’unique procèdure prévue, l’ensemble des individus sera euthénasié à l’âge de 9 mois afin de réaliser un large panel d’analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Bien que la reprogrammation a permis une amélioration de l’état de santé et de l’espérance de vie chez la souris, des travaux menés par l’équipe tendent à démontrer elle se heurte à des niveaux de sénescence tissulaire élevés chez les souris agées. Le grand nombre de cellules sénescentes serait donc susceptible d’inhiber les effets positifs de la reprogrammation. Ce projet vise donc à rétablir l’effet thérapeutique de la reprogrammation en supprimant les cellules sénescentes au sein des différents organes et donc leur action de blocage présumée. De plus, cette étude a pour objectif d’analyser les changements cellulaires et moléculaires mis en place par les traitements au sein même des multiples organes et tissus. Un intérêt particulier sera donné au suivi des cellules sénescentes et l’impact de leur disparition sur les différentes niches de cellules souches adultes. Ainsi pour avancer, ce type d'analyse nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'à l'heure actuelle, aucun modèle in vitro n'est capable de représenter la complexité de l’ensemble des mécanismes physiologiques lié à la sénescence et au vieillissement. Aussi, dans le cadre de ce projet, une étude sur l’organisme entier est nécessaire
Réduction
Les travaux de thèse réalisée en 2021 par l’équipe ont démontré pour la première fois qu’il existait une différence de la réponse à la reprogrammation in vivo entre les mâles et les femelles. Afin d’optimiser au mieux l’utilisation de tous les animaux produits, nous allons réaliser nos tests à la fois sur les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous utiliserons aussi en contrôles « jeunes », les individus non-progériques issus des mêmes croisements.Le nombre d'animaux par groupe est fixé à 8 par sexe pour les analyses tissulaires et moléculaires, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs d’après nos analyses. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus, il s’élève à 4 (un groupe contrôles de 16 animaux non-traités, un groupe de 16 individus traités uniquement en sénolytiques, un groupe de 16 individus traités uniquement en reprogrammation, un groupe de 16 individus combinant les deux traitements. Cette configuration étant la même pour les animaux progéria ainsi que pour les non progéria, soit 128 animaux au total.
Raffinement
Nous utilisons un modèle de souris conduisant à un viellissement prématuré afin d'accélérer l'étude du des processus du vieillissement. Nous choisissons de sacrifier ces souris à l'âge de 9 mois pour éviter les nuisances liées à un vieillissement prématuré. Ces résultats seront ensuite comparés à ceux d'une étude précédente pour évaluer les différences et les similitudes. Pour administrer les traitements, nous les mélangeons à la nourriture des souris, ce qui limite les interventions directes sur les animaux. Nous surveillons régulièrement les souris pour détecter tout signe de douleur ou d'anomalie. Des indicateurs tels que l'isolement, la perte d'appétit ou des difficultés de déplacement peuvent indiquer des problèmes de santé. Si une souris perd plus de 20% de son poids maximal ou montre des signes de difficulté à se déplacer ou à manger, nous la retirons de l'étude pour éviter qu'elle ne souffre davantage. Nous réalisons également des tests de réflexes pour évaluer la santé des animaux. Si une souris échoue à ces tests, cela peut indiquer un problème de santé grave, et elle est alors retirée de l'étude. En résumé, nous prenons toutes les mesures nécessaires pour garantir le bien-être des souris tout en réalisant nos recherches sur le vieillissement.
Choix des espèces
La souris à vieillissement accéléré permet de suivre sur une courte durée les variations physiologiques au cours du vieillissement. Ces animaux présentent un état vieillissant au bout de 6 mois et décèdent autours de 9 à 10 mois environ. Afin d’étudier l’impact de la sénescence sur la reprogrammation, les expérimentations et analyses seront réalisées sur des animaux adultes. De plus, les périodes utilisées sont en accord avec les résultats précédemment obtenus au laboratoire lors d’études antérieures. Ainsi, les traitements seront réalisés sur des animaux dont les signes de vieillissement commencent à se manifester. Enfin, les analyses histologique et moléculaire de notre différent groupe seront réalisées à l’âge de 9 mois conformément à nos études précédentes afin d’être comparables.
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude de la maladie du foie gras chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées dans un élevage de lignées transgéniques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Vers trois semaines, chacune subit une coupe de l'extrémité de la queue aux ciseaux et la pose d'une bague métallique à l'oreille sous contention, le porteur indiquant que l'incision peut provoquer une légère perte de sang. Le sort des souris dépend ensuite du génotypage : les reproductrices sont tuées par dislocation cervicale ou au dioxyde de carbone parce qu'elles ne peuvent plus être utilisées dans les expériences, d'autres sont tuées entre deux et six mois pour prélèvement, une partie passe vers deux mois dans des procédures expérimentales. Le bénéfice annoncé, des médicaments contre les atteintes cardiaques des patients atteints de foie gras, reste au conditionnel, quand le porteur affirme que le recours aux souris transgéniques est "obligatoire".
Objectifs
Le projet s’intéresse à la maladie du foie gras dont 127 millions d’individus sont atteints en Union Européenne, et à ses conséquences sur d’autres organes, notamment le cœur. Afin d’étudier l’action du foie malade sur le cœur, nous avons mis en place des modèles murins. Nous souhaitons étudier quel acteur de la maladie du foie gras impacte sur le coeur et sa réparation en cas d'infarctus. Pour cela, nous devons effectuer l'élevage de nos souris, leur identification et leur génotypage (détection des mutations de ADN) afin de déterminer si elle présente la mutation recherchée ou non. L’objectif de ce projet est d’identifier (bague à l'oreille) et de génotyper par une méthode invasive (biopsie de queue) des animaux génétiquement modifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre la mise à disposition des lignées de souris transgéniques nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie du foie gras et son impact sur le cœur. À terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment les problèmes de foie affectent la régulation du cœur en difficulté. Ils pourraient permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les voies mises en causes, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des atteintes cardiaques chez les patients souffrant de foie gras.
Procédures
Vers 3 semaines de vie, les souris auront un prélévement de queue à l'aide de ciseaux préalablement désinfectés pour savoir si les souris sont mutées ou non. En même temps, les souris seront brièvement maintenues en contention et baguées à l’oreille grâce à une pince dédiée et à un tag métallique numéroté (100 à 999).
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Les mutations des souris n’entrainent pas de nuisances ou d’effets indésirables chez la souris.
Devenir
A la fin de la procédure : - les souris mis en accoupplement seront euthanasiés par dislocation cervicale ou mis dans une enceinte avec augmentation progressive du niveau de CO2; car elles ne peuvent être utilisées pour des expérimentations - les souris qui serviront pour prélévement post-mortem seront euthanasiés par dislocation cervicale entre 2 et 6 mois de vie. - certaines souris de la procédure seront maintenus en vie et mis en procédures expérimentales vers l'age de 2 mois.
Remplacement
Nous commencerons pas des expériences avec des cellules en culture. Mais il n’est pas encore possible de se passer totalement des modèles animaux afin de voir un effet du foie total malade sur le coeur. A ce jour, l'utilisation de souris transgéniques reste obligatoire. Les interactions entre le foie et le coeur sont des phénomènes complexes que les cellules en cultures seules ne peuvent reproduire. Seuls ces modèles animaux nous permettront de comprendre l’impact d’atteinte hépatique sur le remodelage et la réparation tissulaire consécutifs à une affection cardiaque.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l'équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est définit au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, au moment du sevrage, nous determinerons si les souris sont mutées ou non, afin d'anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour les autres procédures expérimentales.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées en groupe. Les installations (ventilation, température et lumière) ainsi que les cages (nourriture, eau, enrichissement) sont vérifiées quotidiennement afin de réduire la détresse des animaux. De plus, un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé afin de vérifier leur bien-être. Les animaux sont euthanasiés par des procédures appropriées si leur état se dégrade soudainement. En ce qui concerne le prélévement d'un morceau de queue : nous utilisaterons des techniques de prélèvement minimisant la douleur (cprélèvement d'un petit segment de la queue (1-2 mm) chez les jeunes souris, ce qui réduit la douleur et le stress).
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles transgéniques pour nos molécules d’intérêt existant, l’utilisation du modèle murin est légitimée. Concernant les gènes étudiés ici, il y a plus de 90% de gènes similaires entre l’homme et la souris. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les animaux seront utilisés après le sevrage soit à minimum 21 jours. Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux. Les souris seront mises en accouplement à l’âge adulte (au moins 8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle, et au maximum 15 semaines au début de l’accouplement.
étude du rôle de la fonction mitochondriale dans l’obésité et l’insulinorésistance chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Treize prélèvements de sang par microcoupure de la queue sur chaque animal, deux mises à jeun de seize puis six heures, un gavage et une injection intrapéritonéale. 1 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer les prélèvements, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. La lignée porte un phénotype dommageable, et les souris nourries au régime gras montent jusqu'à 45 grammes et deviennent moins actives, pour l'étude d'une protéine mitochondriale liée au diabète. Le porteur retient la souris parce que les gènes de l'obésité et du diabète sont conservés entre souris et humain, et parce que la proximité du centre d'explorations fonctionnelles facilite le travail.
Objectifs
Récemment, il a été établi que de petites structures présentes dans les cellules appelées mitochondries sont impliquées dans la mise en place et dans la progression du diabète. Nous avons identifié une molécule/protéine qui joue un rôle majeur dans le fonctionnement des mitochondries. Notre objectif est donc d'étudier comment cette molécule fonctionne et comment elle est affectée sous différents régimes alimentaires chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait définir une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité et les complications du diabète en ciblant ce gène cible ou son activité.
Procédures
- Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par animal. - Mise à jeun, 16h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal. - Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 10s, 13X par animal.
Impact sur les animaux
•Elevage : La lignée murine utilisé dans ce projet est une lignée présentant un phénotype dommageable. •Régime riche en graisse : les animaux vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. •Injection intrapéritonéale : Causant une douleur légère due à la piqûre. •Microcoupure à la queue : Causera une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. •Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. •Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Pour réaliser les tests nécessaires et les techniques que nous souhaitons mettre en œuvre dans ce projet, les modèles in vivo sont indispensables. Le choix de la cible de notre protéine d'intérêt a été déterminé partir d'observations sur des cohortes humaines et confirmé sur des cultures cellulaires. Cependant l'étude in vitro seule ne permet pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour définir la réponse globale d’un animal à une situation physiopathologique. Les procédures expérimentales que nous souhaitons mettre en place ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. En plus, les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mis à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure est en place.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité et du diabète de type 2. Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes qui n'impliquent pas l'utilisation d'animaux vivants. Les souris sont faciles à manipuler et la proximité du centre d’explorations fonctionnelles nous permet d'utiliser ce modèle dans des conditions d'élevage optimales. Les animaux seront mis à l'accouplement à partir de l'âge de 56 jours, qui correspond à l'âge de la maturité sexuelle. Les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront âgées de 8 à 10 semaines au début du processus. Cet âge correspond à la maturité sexuelle des souris, donc à une stabilisation hormonale. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales sont de souris adultes.
Caractérisation des connexions synaptiques de deux régions du cerveau, le thalamus associatif et l’epithalamus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour prélever le cerveau, 4 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 545 en souffrance sévère. Presque toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours pour le génotypage, un groupe une chirurgie cérébrale d'environ une heure, et un sous-groupe des tests comportementaux de quinze à quatre-vingt-dix minutes. Le porteur indique exposer certains animaux à un stimulus provoquant "un état de peur inévitable", et un lot à des stimuli dont la peur persiste plusieurs jours, sans nommer aucun de ces tests. Les géniteurs sont tués quand ils ne sont plus en âge de procréer, et les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées faute d'usage.
Objectifs
L’objectif de notre étude est de mieux comprendre le fonctionnement de régions complexes du cerveau des mammifères, tel que l'(épi)thalamus. En effet, il a été montré que des défauts de fonctionnement de ces structures contribuent à plusieurs états cérébraux anormaux (anxiété, dépendance aux drogues, états de coma etc) qui pèsent lourdement sur notre société. Afin de progresser dans la connaissance de ces mécanismes, nous utiliserons le modèle murin; celui-ci est en effet idéal puisque les circuits neuronaux de la souris sont proches de ceux de l’homme. Des traceurs ou des virus permettant l'expression de protéines activables à la lumière seront injectés dans le cerveau afin de pouvoir par la suite étudier les connexions des régions d'intérêt. Des analyses sont aussi prévues pour examiner comment la manipulation des synapses détermine in vivo le comportement des souris. Notre hypothèse est que les changements dans la connectivité synaptique des circuits (épi)thalamiques sous-tendent les fonctions cérébrales anormales associées à l'anxiété, à la dépression et à la toxicomanie, et donc que la modulation spécifique de ces connexions pourrait être ciblée pour le développement de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Nous visons à comprendre des mécanismes fondamentaux de fonctionnement de régions du système nerveux central, qui sont impliquées dans plusieurs états cérébraux anormaux. Cette connaissance pourrait nous amener à comprendre aussi comment certaines pathologies se manifestent, en donnant des outils pour développer des approches thérapeutiques.
Procédures
Presque la totalité des es souris utilisées pour ce projet seront soumises à une biopsie de la queue pour le génotypage, faites vers 6 jours. Un groupe des souris utilisées pour ce projet sera soumis à une procédure chirurgicale d'une durée d'environ 1 heure par animal. Un sous-groupe sera soumis une fois à des tests comportementaux d'une durée comprise entre 15 et 90 minutes, pour étudier les états d'anxiété et de stress des animaux.
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue pour le génotypage n'entraine qu'une douleur légère et de courte durée. De plus, un groupe de souris sera soumis à une procédure chirurgicale qui pourrait engendrer une douleur d’intensité modérée. Certains animaux seront exposés à un stimulus stressant important engendrant un état de peur inévitable. Ces tests sont nécessaires au déroulement de notre projet qui vise précisément à étudier les modifications des circuits synaptiques suivant l'exposition à des conditions de stress et d'anxiété de brève durée. Un lot d'animaux sera exposé à des stimuli provoquant une peur qui persiste plusieurs jours.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement du cerveau pour des études post mortem. Les géniteurs seront mis à mort lorsqu'ils ne seront plus en âge de procréer. Également, les souris avec génotype sans intérêt seront euthanasiées parce qu'on ne pourra pas les utiliser ni pour les manipulations expérimentales ni pour la reproduction.
Remplacement
Afin de mieux comprendre le rôle de l'intégration entre l'inhibition et l'excitation dans le fonctionnement des régions du thalamus associatif et de l'épithalamus, il est indispensable d'analyser le comportement et l'activité des connexions synaptiques dans un cerveau pleinement développé. La souris adulte est donc une espèce appropriée pour ce type d'études. En effet, nos procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et est réduit au minimum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Typiquement, une souris pourra être soumise à plusieurs test comportamentaux, ainsi reduisant le nombre d'animaux. Similement, dans certains cas les tranches aiguës préparées pourront être utilisées pour des études morphologiques, ainsi réduisant le nombre d'animaux sacrifiés spécifiquement pour ça.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des cages, dans des conditions d’hébergement contrôlées. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages et fournis ad libitum. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l’animal (anesthésie, analgésie, suivi post-opératoire). Des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s). Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité quotidiennement, par du personnel qualifié y compris les expérimentateurs, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce à des moyens pharmacologiques appropriés.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour quatre raisons : - la taille de l’animal qui permet son installation sur les postes d'injection stéréotaxiques et l'utilisation de tranches aigües du cerveau sur des postes d'éléctrophysiologie. - la disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet. - nos études précedentes ont été validées sur des souris. Par soucis de reproductibilité nous souhaitons poursuivre avec la même espèce. -Finalement, il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Nous utiliserons pour nos études des souris adultes (plus de deux mois d’âge), vu notre intérêt à étudier des structures synaptiques pleinement développées.