Procédures légères

Les souris de ce projet portent une mutation qui leur fait développer une sclérose latérale amyotrophique, avec des difficultés motrices et des crises d'épilepsie que le porteur classe comme phénotype dommageable. 3 000 d'entre elles vont être utilisées, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 400 un niveau léger. Chaque animal subit une biopsie de la queue vers sept jours, une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, jusqu'à deux électromyogrammes de vingt minutes avec un risque d'automutilation, et jusqu'à treize tests de démarche répartis sur douze mois, les souris non traitées perdant leur motricité en fin d'étude. Les animaux injectés sont tués pour des analyses post-mortem, ceux de l'élevage dont le génotype ne convient pas également, les autres passant en "utilisation continue" dans les autres projets de l'équipe.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique pour la maladie de Charcot sur un modèle de souris de la pathologie. Ce projet sera divisé en 2 axes, le premier concernant l’élevage de la lignée de souris modèle de la pathologie et un second pour l’approche de thérapie génique et le suivi de l’efficacité.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour la sclérose latérale amyotrophique chez un modèle de souris de la pathologie. Si l’efficacité est avérée pour l’une des thérapies testées cela pourrait permettre de proposer des essais cliniques chez l’Homme, et donc à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladie de Charcot, pathologie pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif (8000 patients en France avec 1000 nouveaux cas par an en France).

Procédures

Un prélèvementde l’extrémité de la queue pour génotypage sera effectué une fois sur animal vigile de 7 à 10 jours et durera moins d’une minute par animal. - Les animaux ont une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale - les animaux subiront maximum 2 électromyogrammes (durée 20min) sous anesthésie et analgésie adaptée - les animaux seront soumis à des tests comportementaux repartis sur 12 mois pour analyser leur démarche (2 min) donc 13 fois maximum durée 2 min , leur exploration spontanée (20 min) deux fois maximum Un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux (sous anesthésie) avant leur euthanasie (durée 2 min) Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure. Les animaux pourront developper une atteinte motrice et presenter des crises d’épilepsie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique durant l’anesthésie - un stress de l'animal lors des contentions et des manipulations, changements de pièces pour les tests comportementaux, la prise de sang - une perte de motricite en fin de vie pour les souris non traitées en fin d’etude - un leger picotement au niveau de la patte lors de l’electromyogramme et un risque d’automutilation - Un léger picotement lors des injections intrapéritonéales - un leger picotement lors de la prise de sang terminale – Les animaux utilisés dans ce projet ont un phenotype dommageable se traduisant par des difficultés motrices et des crises d’épilepsie.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 6 mois maximum. Les animaux non porteurs des genotypes d’intérêt seront euthanasié. Les autres animaux de génotype souhaité seront en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la maladie de charcot incurable à l’heure actuelle chez l’Homme. Les modèles in vitro ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaires de cette approche ; elle nécessite à présent d’être validée dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 15 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 3000 souris sera nécessaire pour ce projet afin de générer les lots expérimentaux nécessaires ainsi que pour nos autres projets de recherche. Nous adapterons notre production à nos besoins expérimentaux et pourront donc générer moins de 3000 animaux.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation et allaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et des soins adaptés. Le change (de la litière, abreuvement, nourriture) est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. Nous incluons dans notre étape d’injection uniquement des animaux en bonne santé, avec la mise en place de gel ophtalmique et la prévention de l’hypothermie en plaçant les souris sur un tapis chauffant. Un suivi rapproché est effectué au réveil. Le prélèvement pour le génotypage est limité à environ 1 mm à l'âge de 7-10 jours environ (moins de sensibilité à le douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Les prises de sang sont réalisées sous anesthésie et les electromyogrammes sous anesthésie et analgésie. Les tests de comportement sont réalisés en vigile par du personnel formé. Nous injectons un analgésique avant le produit euthanasiant

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique pour la maladie de Charcot sur un modèle de souris de la pathologie. Les souris ont entre 4 et 12 semaines pour l’évaluation de notre approche thérapeutique et seront suivies jusqu’à 12 mois maximum. Pour l’elevage les reproducteurs sont utilisés entre 6 semaines et 6 mois.

Capturés par piégeage dans les zones de pullulation d'Auvergne, 170 campagnols terrestres vont être utilisés en captivité puis tués, 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 120 un niveau modéré. Ils ingèrent des comprimés d'alginate contenant des peptides destinés à les rendre stériles, après une mise à jeun la veille, et subissent des prélèvements de sang, de salive et de sécrétions vaginales sous anesthésie, hebdomadaires pour deux des douze lots. Le porteur compte la captivité elle-même parmi les nuisances, ces animaux étant sauvages, et les met à mort pour récupérer un maximum de sérum et examiner leurs organes reproducteurs. L'effectif dépendra de l'efficacité des campagnes de piégeage et des pics de pullulation, et le porteur indique qu'aucune approche statistique n'est développée dans ce projet.

Objectifs

Les pullulations importantes et l’expansion des aires de colonisation du rongeur fouisseur nuisible Arvicola terrestris scherman (ATS ou campagnol terrestre) dans les éco-systèmes agronomiques et touristiques de moyenne montagne, sont des problèmes de plus en plus cruciaux en Auvergne, comme en Franche Comté et dans d’autres pays voisins en Europe. Afin de compléter les outils existant dans la lutte contre les pullulations d’Arvicola terrestris, nous développons depuis 2018 des vaccins immunocontraceptifs qui pourraient limiter les capacités reproductrices de ce rongeur nuisible. Cette demande s’inscrit dans la phase 3 du projet. Pendant la phase 1, des séquences peptidiques immunogènes ont été sélectionnés sur les antigènes spermatiques déterminés suite à des immunisations avec des spermatozoïdes entiers de campagnols par voie sous-cutanée. Lors de la phase 2, les animaux ont été immunisés avec les peptides individuels déterminés lors de la phase 1, par voie sous-cutanée et aussi gastrique (gavage) qui sera la voie utilisée sur le terrain. Ces tests d’immunogénicité ont été associé à la recherche d’une formulation appétente pour les rongeurs dans leur habitat naturel, aboutissant à l’obtention de comprimés de biopolymères d’alginate que les campagnols ingèrent. Lors de la phase 3 qui débutera en 2024, les objectifs principaux nécessitant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales seront : 1- de déterminer la nature finale et la concentration des peptides à administrer ainsi que la fréquence d’administration pour obtenir une immunisation efficace (production d’IgA mucosales dans les fluides biologiques [salive et serum] et dans les sécrétions des tractus génitaux mâles [épididymes, vésicules séminales, prostate] et femelles [sécrétions des cornes utérines et de l’épithélium vaginal]) ; 2- de continuer à développer la forme galénique pour la rendre plus appétente (si possible) et résistante aux conditions d’humidité rencontrées sur le terrain ; 3- de comprendre les mécanismes immunitaires responsables de l’effet contraceptif observé.

Bénéfices attendus

Les pullulations importantes et l’expansion des aires de colonisation du rongeur fouisseur nuisible Arvicola terrestris scherman (ATS) dans les écosystèmes agronomiques et touristiques de moyenne montagne sont des problèmes de plus en plus cruciaux en Auvergne, comme en Franche Comté et dans d’autres pays voisins en Europe. Les incidences économique, écologique et environnementale sont très importantes et la situation préoccupante. Malgré une surveillance accrue et une lutte chimique raisonnée, mais non conforme aux exigences de la réglementation européenne, le constat est fait qu’il est nécessaire de mieux articuler les stratégies de lutte et de développer de nouveaux outils. Le projet proposé consiste en la mise au point d’un vaccin contraceptif efficace pour juguler les pullulations cycliques du rongeur fouisseur nuisible ATS. L’enjeu réside dans l’obtention d’un maximum de spécificité d’espèce associé à une grande efficacité. Si un tel vaccin contraceptif peut être développé, il sera une alternative à la lutte chimique utilisée à ce jour. Ce projet s'inscrit dans la lutte contre un rongeur sauvage nuisible.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, des prélèvements vaginaux et des prélèvements salivaires, tous effectués sous anesthésie générale. Pour 10 lots sur 12, il s’agira d’un prélèvement initial et d’un prélèvement terminal en fin de procédure. Pour 2 lots sur 12, il s’agira de prélèvements hebdomadaires nécessitant une injection intrapéritonéale pour les prélèvements de salive (permettant de déclencher une hypersalivation) chez les mâles (sang et salive pour les mâles, sang et prélèvements vaginaux pour les femelles) et d’un prélèvement terminal. Les mises à jeun la veille de la prise des comprimés ainsi que l'hébergement en captivité seront également des nuisances puisque ce sont des animaux sauvages.

Impact sur les animaux

L'hébergement en captivité constituera une nuisance modérée, la mise à jeun la veille de la prise des comprimés une nuisance légère, les différents prélèvements (salive, sang, vaginal) nécessitant une anesthésie représenteront des nuisances modérées.

Devenir

A l’issue des procédures d’immunisation, les animaux sont mis à mort de manière à pouvoir prélever un maximum de sérum immun, mais aussi pour étudier les effets des immunisations sur les organes reproducteurs ainsi que sur les organes du système immunitaire muqueux commun. Ces organes seront utilisés pour des quantifications moléculaires, de l’histologie et de la détection des processus immunitaires mis en œuvre par des techniques d’immunofluorescence.

Remplacement

Il n’est pas possible actuellement de substituer l’utilisation d’animaux pour étudier la réponse immunitaire comme celle évaluée dans ce projet (réponse déclenchée par ingestion d’un cocktail de peptides immunogènes ayant des effets sur les muqueuses des tractus reproducteurs mâle et femelle).

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par sexe et par groupe afin de pouvoir conserver une bonne mise en évidence vis-à-vis de la variabilité des réponses immunitaires inter-individuelles. Aucune approche statistique n'est développée dans ce projet. Le nombre d'animaux utilisés sera dépendant de l'efficacité des campagnes de piégeage et variera en fonction des saisons ainsi que des pics de pullulation dans la région Auvergne, caractéristiques de cette espèce. En fonction de notre capacité d'hébergement et de ces contraintes, nous estimons qu'un maximum de 170 animaux seront utilisés dans le cadre de ce projet. De plus, les animaux utilisés pour un des objectifs du projet (évolution de la forme galénique) pourront être réutilisés dans les procédures d’immunisation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés individuellement dans des cages placées dans des armoires ventilées pour mimer l’habitat naturel de ces rongeurs et leur permettre une activité normale. Les campagnols recevront une nourriture comprenant des végétaux frais (carottes et salades principalement). Les cages comprennent des cachettes et du matériel leur permettant de faire leur nid. Ils sont manipulés avec précaution par un personnel formé à l’élevage d’animaux de la faune sauvage. Notre projet ne doit pas provoquer de dommages physiques sur les animaux. Cependant, si des animaux tombent malades ou sont blessés accidentellement, ils seront pris en charge, tant que les soins, eux-mêmes, ne génèrent pas un stress trop important chez ces rongeurs qui peuvent être facilement effrayés par les manipulations. Si le traitement n’est pas possible, nous procèderons à l’euthanasie si la souffrance se maintient.

Choix des espèces

Le projet concerne une espèce sauvage classée comme nuisible par arrêté préfectoral n°2015-155. La spécificité de la réponse immunitaire ainsi que des molécules impliquées dans la reconnaissance des gamètes nécessite de travailler sur l'espèce cible dans son entier. Les animaux doivent être sexuellement matures. Nous utiliserons donc des animaux au stade adulte ayant un poids supérieur à 70 grammes

Injectées dans le cerveau et parfois équipées de fibres optiques lors d'une chirurgie d'une heure, 768 souris enchaînent jusqu'à vingt et une sessions de tests de trente minutes : vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. 192 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 576 autres un niveau modéré, et des séances de restriction hydrique complètent le dispositif. Le porteur affirme que la vaporisation de e-liquide "n'a pas d'effets nuisibles", alors que le projet vise précisément à mesurer l'imprégnation en nicotine et la vulnérabilité aux propriétés addictives des arômes. Toutes les souris sont tuées à l'issue de leur procédure, une partie après un transport vers un second établissement pour une dernière mesure électrophysiologique.

Objectifs

La nicotine possède la caractéristique étonnante de n’avoir que peu d’effets euphorisants comparée à la cocaïne ou le cannabis. Pourtant, elle induit très vite une consommation soutenue et abusive malgré les conséquences négatives. La spécificité des fumeurs est d’être hypersensibles aux stimuli sensoriels associés au tabac (l’odeur ou encore le goût de la fumée, le contexte environnemental) car ceux-ci acquièrent une forte valeur attractive à force d’associations. Les fumeurs sont attachés à « leur » marque de cigarette. L’importance des stimuli olfactifs dans les effets addictifs des produits du tabac est particulièrement soulignée dans le contexte récent avec l’explosion du vapotage, utilisant des e-cigarettes (e-cig) et e-liquides avec de multiples arômes développés pour rendre le produit attrayant et spécifique. Dans ce contexte, est faite la proposition de développer un projet de recherche préclinique ambitieux qui repose sur une combinaison d'interventions cérébrales dans un modèle comportemental in vivo innovant d'addiction au vapotage avec des investigations anatomiques et fonctionnelles du système olfactif mis en jeu lors du vapotage. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

D’un point de vue santé publique, les objectifs de ce projet apporteront de nouveaux éléments essentiels pour la réflexion sur l’innocuité supposée de l’usage de la e-cigarette et des e-liquides aromatisés. Ces informations sont cruciales dans le contexte où, spontanément, la e-cigarette est conseillée dans l’optique d’une réduction des risques et les usagers la considèrent comme moins nocive que la cigarette conventionnelle sans connaitre le risque addictif lié à l’usage chronique (Déclaration haut conseil scientifique).

Procédures

Selon les procédures, les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales (injection intracérébrale +/- implantation de fibres, 1h), et à divers tests comportementaux (maximum 21 sessions de 30 minutes environ selon les groupes) : test de vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. Pour une partie des animaux une procédure chirurgicale et des mesures électrophysiologiques seront réalisées dans un autre Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquelles des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place. Les animaux sont également soumis à la vaporisation de e-liquide qui permet une imprégnation en nicotine, mais cela n'a pas d'effets nuisibles et les chambres de conditionnement sont ventilées en temps réel pour permettre l'évacuation de la vaporisation en quelques secondes. Certains animaux seront soumis à des injections de façon quotidienne durant la durée des tests comportementaux. Le transport des animaux d’un établissement à un autre peut être source de stress. La contention des animaux lors de la connection/déconnection des fibres peut être source de stress, même si les animaux sont au préalable habitués au geste. Les séances de restriction hydriques peuvent également engendrer un stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés. Une partie des animaux sera transportée dans un autre établissement afin de réaliser une dernière procédure avant euthanasie.

Remplacement

Nous utilisons le modèle animal pour modéliser la pathologie humaine de l'addiction au vapotage. Notre projet repose ainsi sur une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal et impliquant le fonctionnement du système nerveux dans son intégrité. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser le nombre minimal de souris nécessaires pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'expérience, plusieurs tests sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cage collectives (10/cage maximum) dans un milieu enrichi (litière de cellulose, carrés de cellulose et papier ouaté). La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement par le zootechnicien. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable du projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites fixés. Avant toute procédure, les animaux connaissent une période d’acclimatation de minimum 7 jours, durant laquelle ils sont délicatement manipulés (handling) de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé conformément à la charte de transport établit par l’Université de Bordeaux (distance de 50m, cages de transport adaptées et opaques, mesures d’hygiène respectées).

Choix des espèces

Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. Nos travaux considèrent la souris in vivo, et mettent à profit différents protocoles comportementaux irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain, ce qui permet de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre des comportements spécifiques liés à la toxicomanie. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 56 jours, soit l’âge adulte. Nous choississons ce stade dévelopemental qui correspond à une maturation complète du cerveau.

Ces souris sont créées pour vérifier si une double modification génétique les rend malades, sans que soit connue l'incidence des atteintes ni le délai de leur apparition. 232 vont être utilisées, 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 42 un niveau modéré. Le porteur anticipe des malformations possibles, absence d'un rein ou des deux gonades, insuffisance rénale, déshydratation, stérilité, et encadre le suivi par deux grilles d'observation et des points limites précoces. Les croisements courent sur trois générations, 190 souris reçoivent une injection, 42 sont déclarées réutilisées dans un projet ultérieur sur le développement embryonnaire, et le résumé indique par ailleurs que tous les animaux seront mis à mort.

Objectifs

Dans ce projet, nous allons créer des animaux avec des caractéristiques spéciales et vérifier s'ils présentent des problèmes de santé sur trois générations. Si nous ne remarquons aucun problème majeur qui pourrait les faire souffrir ou mettre leur vie en danger, nous continuerons à les élever et à vérifier pendant trois générations. Si encore sur la 3ème génération leur état de santé reste le même, certains de ces animaux seront utilisés pour une étude sur la prolifération des cellules. Les autres animaux seront utilisés dans un projet futur pour examiner comment un certain gène affecte le développement des embryons. Nous avons calculé que nous aurons besoin de 232 animaux au total.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales sévères représentent un enjeu majeur de santé publique. A titre d’exemple, l’incidence sur la malformation rénale concerne un nouveau-né sur 500 en Europe. Au-delà des nouvelles connaissances sur les mécanismes d’action du gène en question, nos travaux contribueront à une meilleure compréhension et prise en charge des pathologies humaines qui ont pour l’origine des malformation congénitales.

Procédures

- Accouplements naturels de mâles et de femelles provenant de 2 lignées à phénotype non dommageables (10 secondes) plusieurs fois. A partir du sevrage : - Prélèvement par earpunch pour le génotypage (30 secondes). -Pesée 2 fois par semaine (20 seconds) jusqu’à l’âge de 2 mois puis 1fois/semaine jusqu’au 3ème mois puis 1 fois/mois jusqu’au 6ème mois. - Autre intervention : 1 injection sur 190 animaux vigiles (20 secondes par injection).

Impact sur les animaux

Dans l’état actuel de nos connaissances nous ne savons pas si les animaux vont avoir des problèmes de santé. C’est la raison pour laquelle nous envisageons de faire cette évaluation. Nous ne connaissons pas l’incidence de maladie sur ce modèle de souris ni le temps que cela peut prendre à se manifester. Les animaux pourraient développer des malformations (exemple : absence d’un rein ou des 2 gonades. Si ces malformations sont moins majeures, elles peuvent engendrer des dysfonctionnements des organes uro-génitaux comme l’insuffisance rénale, la déshydratation ou la stérilité. La contention cause du stress et la piqure cause une légère douleur.

Devenir

A terme d’observation sur 3 générations, et l’analyse de prolifération cellulaire, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Nous avons les outils et l’expertise d’étudier certaines fonctions de notre gène d’intérêt dans une boîte de pétri et nous le réalisons à chaque étape que nous le pouvons. Toutefois, ce gène a un rôle important dans la formation de plusieurs organes pendant la formation de l’embryon. Par conséquent pour mieux comprendre le fonctionnement de ce gène, il est nécessaire de l’étudier dans sa globalité en occurrence dans un organisme vivant.

Réduction

En nous appuyant sur la littérature et notre propre expérience, nous prévoyons l’analyse de 4 portées issus de 4 couples indépendants au cours de 3 générations pour évaluer le phénotype de la lignée générée dans ce projet. Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été établi en nous appuyant sur les probabilités génétiques et des schémas d’accouplement optimisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour l’analyse de la prolifération cellulaire que nous envisageons a été déterminé par des calculs statistiques basé sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistiques.

Raffinement

L’élevage des animaux est maintenu à l’état hétérozygote pour prévenir l’apparition du phénotype dommageable. Outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, de les héberger en permanence avec leur congénère de même portée, de les surveiller au quotidien, nous avons établis 2 grilles d’observation selon lesquels, les personnels formés et compétents noteront la moindre anomalie susceptible de compromettre leur état de santé, leur comportement et leur bien-être et prévoyant des points limites précoces et adaptés. Les accouplements seront programmés afin d’optimiser la surveillance des animaux au cours de laquelle des scores critiques pourraient être atteints (avortement spontané, risques de dystocie). Un vétérinaire dédié de manière permanente à notre animalerie est disponible à toutes nos requêtes sur l’état de santé de nos animaux et plus particulièrement de ceux sous la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Le modèle de souris mutante pour le gène étudié dans ce projet mime fidèlement la pathologie humaine résultant du dysfonctionnement de gènes humains homologues. Les stades du développement : Depuis la naissance jusqu’ à l’âge de 6 mois, période nécessaire et suffisante pour évaluer le bien-être de la lignée génétiquement modifiée créée dans ce projet. Les femelles âgées de 8 semaines à l’optimum de leur maturité sexuelle pour la production d’embryons objets de l’étude.

2 130 souris pour une seule maladie provoquée par l'alimentation, 1 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 750 un niveau léger, toutes tuées. Chacune peut recevoir une injection intrapéritonéale par semaine pendant 24 semaines, subir trois microcoupures de la queue, une biopsie de la pointe de la queue à dix jours, un gavage et deux jeûnes de six et quinze heures. Le régime riche en graisse les fait grossir jusqu'à 45 grammes et les rend moins actives, effet recherché puisque le projet reproduit la stéatose hépatique liée à l'obésité et au diabète de type 2. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées à trois ou quatre semaines de vie, et le porteur justifie l'ensemble en une phrase, les modèles in vivo étant "indispensables" pour analyser la signalisation entre organes.

Objectifs

La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Nous allons soumettre des modèles de souris à différents régimes induisant des dommages au foie pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir une nouvelle approche thérapeutique dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications. Il apportera des connaissances fondamentales nécessaires au développement de thérapies ciblées sur les macrophages hépatiques. Des médicaments pourraient être developpés pour inhiber/activer spécifiquement les voies métaboliques spécifiques des macrophages révélées par ce projet. Considérant que la stéatose hépatique touche environ 1 être humain sur 4, les bénéfices de ce projet sont importants.

Procédures

-Microcoupure à la queue : 3X,5 seconds. -Biopsie de l'extrême pointe de la queue à l’âge de 10 jours: 1X, 5 seconds. Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par semaine, pendant 24 semaine et 7X pendant une semaine. - Mise à jeun, 15h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal.

Impact sur les animaux

Régime riche en graisse: les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure et possible nécrose ou irritation. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage. - Biopsie de l'extrême poite de la queue à l'age de 10 jours pour génotypage: douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les différentes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet. Les animaux dont le génotype n'est pas conforme seront également mis à mort à l'issue du génotypage (3-4 semaines de vie).

Remplacement

Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et d’analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Le nombre de souris est reduit a son minimum. De nombreux tissus seront collectes apres mise a mort, afin d'approfondir les etudes moleculaires et cellulaires. Chaque souris generera donc de nombreuses informations. De plus nous avons determine un nombre de souris par groupe en fonction de donnees de la litterature et grâce à l’utilisation d’un outil statistique adapté.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Pour limiter les nuisances/effets indésirables par exemple Injection intrapéritonéale, nous utiliserons d’une aiguille fine pour gavage un sonde souple. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les personnel seront formé à ces techniques.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. Dans la littérature, les modèles murins sont largement utilisés dans les études sur l’obésité. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes uniquement.

Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.

Objectifs

Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.

Bénéfices attendus

Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.

Procédures

Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.

Impact sur les animaux

1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire

Devenir

L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.

Choix des espèces

Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.