Procédures légères

Toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant un mois, elles subissent des immobilisations de 45 minutes trois fois par jour, des expositions à une lumière intense, douze heures sur litière mouillée, douze heures sur plan incliné et douze heures avec des billes, protocole destiné à provoquer un état dépressif. Le porteur détaille les tests infligés tous les deux jours, labyrinthe en croix surélevé, open field, interaction sociale, test de Porsolt, anhédonie et discrimination olfactive, répétés deux à trois fois. Il annonce enfin une injection intrapéritonéale d'un psychédélique dont il écrit que l'effet est "inconnu chez l'animal", en notant seulement qu'il provoque des hallucinations chez l'être humain.

Objectifs

Le projet a pour objectif de déterminer des facteurs de vulnérabilité à la dépression induite par le stress chronique chez la souris. Le projet consistera à évaluer des traits comportementaux d'un lot de souris avant et après une période de stress chronique. Ceci permettra d'identifier des sujets manifestant un état dépressif ou des sujets résilients, de déterminer d'éventuels traits comportementaux prédictifs de la vulnérabilité à la dépression, de caractériser les profils neurochimiques des souris en relation avec les manifestations comportementales observées. Par ailleurs, ce projet nous permet d'envisager une approche thérapeutique personnalisée de la dépression.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux identifier les vulnérabilités à l'état dépressif (et éventuellement des facteurs prédictifs), de mieux comprendre les substrats neurochimiques à l'origine de l'état dépressif et donc de mieux cibler les traitements pharmacologiques.

Procédures

Procédure de stress chronique sur 1 mois (répétition de stmulation sur 1 mois : imobilisation: 3x 45 mn lumière intense : 3 x 30 mn litière mouillée: 12h plan incliné: 12h billes 12h Batterie de tests comportementaux (1 test toutes les 48h) : labyrinthe en croix surélevé: 5 mn open field: 10 mn interaction sociale: 6 mn Porsolt test 6 mn Anédonie: 30 mn Discrimination olfactive: 2 fois 5 mn. Répétition de la batterie de test: 2 fois pour expérience 1. 3 fois pour les autres expériences. Injection aigüe intrapéritonéale d'un psychédélique.

Impact sur les animaux

Effets du stress chonique mis en oeuvre pour induire un état dépressif: perturbation mentale et comportementale. Effet de l'injection de psychédélique: stress lié à l'injection. Peut être effet de la molécule (inconnu chez l'animal, hallucinations chez l'humain).

Devenir

Notre étude comporte une analye de paramètres neurochimiques sur le tissu cérébral. Pour prélever le cerveau, il est nécessaire de préalablement euthanasier les animaux sans utilisation de chimie.

Remplacement

Ce projet ne peut en aucun cas être remplacé par une approche in vitro dans la mesure où ce sont les manifestations comportementales que nous étudions.

Réduction

Des données pharmacologiques issues du laboratoire et de la littérature permettront l’administration d’une dose unique efficace sans devoir utiliser d’animaux supplémentaires pour effectuer une courbe dose-réponse. Concernant les effectifs, une étude antérieure a montré que le traitement statistique des données comportementales dans nos conditions nécessitaient 12 animaux par groupe minimum ce qui justifie les effectifs prévus dans ce projet.

Raffinement

Conditions d'hébergement: Les animaux seront hébergés en cages collectives avec enrichissement du milieu (tunnel, matériel de nid, bâton à ronger) par groupe de 4 pour maintenir les contacts sociaux. Habituation aux conditions expérimentales : Les animaux seront manipulés délicatement quotidiennement pour éviter le stress des effets de la manipulation par les expérimentateurs (deux maximum). Une habituation à la salle d'expérimentation sera effectuée avant les tests comportementaux. Etat de santé : Pendant toute la période expérimentale, les animaux seront suivis quotidiennement pour leur état général (pelage, autophagie, fèces, morsures éventuelles) et ils seront pesés chaque semaine pour suivre l'évolution du poids corporel (une perte de 10% du poids sera considérée comme signe de mal être et l'animal sera retiré de la procédure). S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. Un fichier de suivi du bien-être des animaux sera réalisé (fichier type joint).

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale la plus adaptée à nos travaux (avec le rat). Le profil neurochimique des souris fait l'objet de multiples travaux dans l'équipe ainsi que les modifications par des agents pharmacologiques susceptibles d'être utilisés dans le traitement de la dépression. Les animaux seront des souris jeunes adultes agées de 2/3 mois à leur arrivée au laboratoire. Cet âge correspond à des animaux dont le développement est achevé et pas encore dans les perturbations liées à l'âge. On parle donc d'adultes jeunes.

Pour établir le profil pharmacocinétique de médicaments vétérinaires en développement, 300 chiens et 300 chats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit la substance sous contention de moins de dix minutes, une ou plusieurs fois, subit des prélèvements sanguins répétés et peut être hébergé seul jusqu'à 72 heures pour la collecte des urines et des selles. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de déterminer ce profil chez l'espèce de destination, et rappelle que la réglementation impose de tester le produit sur l'espèce à laquelle il est destiné. Aucun de ces 600 individus n'est tué dans le cadre du projet, tous devant être réutilisés, replacés en élevage ou adoptés, devenir rare dans ce corpus.

Objectifs

L’objectif du projet (ou protocole cadre) est de définir les conditions de réalisation des études de pharmacocinétique chez le chien et le chat dans le respect du bien-être animal et de la règle des 3Rs (Remplacement, Réduction et Raffinement). Ce projet permet ainsi d'établir le profil pharmacocinétique du produit en développement et évaluer sa biodisponibilité. Plusieurs études de pharmacocinétique pourront être requises pour répondre à l’ensemble de ces questions selon l’état d’avancement du développement du produit. Le profil pharmacocinétique (PK) et/ou la biodisponibilité de substances médicamenteuses dans divers tissus, organes et/ou fluides de l’organisme seront étudiés.

Bénéfices attendus

Les études pharmacocinétiques, en particulier en conjonction avec les données pharmacodynamiques, sont importantes pour soutenir des schémas posologiques des voies d'administration et des formulations galéniques efficaces et sûrs. De plus, des études pharmacocinétiques peuvent être utilisées pour établir des schémas posologiques en fonction de diverses variables de population (par exemple, l'âge, la race, l'état pathologique...). Enfin, les études pharmacocinétiques peuvent également mettre en évidence d'éventuelles interactions médicamenteuses, soit entre le ou les principes actifs et ceux des produits administrés de manière concomitante, soit entre les principes actifs destinés à une association fixe.

Procédures

Les gestes décrits ci-dessous sont réalisés selon les procédures en vigueur sur le site de l’établissement utilisateur, selon la voie et la durée définies et justifiées dans le plan d‘étude, selon les recommandations des lignes directrices, de la littérature. Lors de chaque geste, toute altération de comportement/état est immédiatement reportée au vétérinaire qui examine l’animal et décide de le maintenir ou non dans l’étude et de le traiter. L'administration des substances actives pourra être réalisée sur animal vigile de façon unique ou répétée selon les bonnes pratiques vétérinaires. Ce geste nécessite une contention de l’animal pendant une période inférieure à 10 minutes. Un à 32 animaux sont inclus par étude. Le nombre de groupes et le nombre d‘animaux par groupe dépend de l’objectif de l’étude et du nombre de composés à tester. Il est précisé dans le plan de l’étude conduite dans le cadre de ce projet. Les prélèvements sanguins nécessitent une contention légère ne visant qu’à restreindre les mouvements de l’animal pour sa sécurité et celle des manipulateurs. La durée de cette contention n'excède pas 5 minutes. Les volumes totaux de sang prélevés par procédure suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal et un temps de repos suffisant entre deux prélèvements est déterminé. L’animal peut être hébergé en box ou en cage individuel(le) en fonction des besoins de l'étude pour la réalisation de prélèvement de selles ou d'urine. La durée de cet hébergement individuel sera défini dans le plan d’étude et ne pourra excéder 72 heures. La réglementation européenne sera respectée pour la contention et l’hébergement des animaux.

Impact sur les animaux

Généralement, la tolérance des produits est déterminée avant d’initier les études de pharmacocinétique. Aucun effet secondaire sévère n’est donc attendu dans les études de pharmacocinétique. Dans le cas où les données de tolérance sont limitées chez l’espèce cible, le dessin expérimental va être adapté avec une administration progressive et un suivi vétérinaire renforcé. Les phases de traitement et de prélèvement pourraient occasionner du stress ou une baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/prélèvement. Si la période de prélèvement oblige les animaux d’être hébergés individuellement pour éviter des contaminations et permettre la récolte de selles ou d’urine sur une durée déterminée sans intervention, la durée n'excèdera jamais 3 jours et les animaux auront un contact visuel, auditif et olfactif avec les congénères ainsi que des interactions avec le personnel formé et compétent.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisé dans le cadre de ce projet pourra être soit réutilisé, replacé ou adopté car la sévérité des procédures envisagées est au maximum de modérée et n'implique pas la mort de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives pour déterminer le profil pharmacocinétique d’un produit dans différents fluides et tissus chez l’animal de l’espèce cible en fonction des voies d'administration. Selon le type de molécules en développement, et couplées aux résultats d’études pilotes, des études de PK/PD (pharmacocinétique / pharmacodynamie) et des modélisations seront conduites pour permettre de définir les conditions expérimentales optimales pour les études de pharmacocinétique ultérieures.

Réduction

Le nombre d’animaux varie selon qu’il s’agit d’une étude pilote (pour une preuve de concept et selon le stade du développement du projet dépendant du niveau de connaissance disponible au moment de l’étude ainsi que le type de molécule testée) ou d’une étude règlementaire devant répondre aux guidelines en vigueur. Un dessin expérimental en cross-over sera suivi autant que possible pour limiter le nombre d’animaux à inclure dans chaque étude. Il est également possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas selon la finalité de l’étude (pilote, règlementaire, évaluation du nombre d’animaux pour une étude de bioéquivalence…), et s’il est considéré que le nombre d’animaux inclus permet d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le développement futur du produit dans le cas d’une étude pilote, ou de décrire précisément les caractéristiques pharmacocinétiques du produit dans le dossier de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) dans le cas d’une étude règlementaire. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique au produit testé dans le cadre de ce projet. Grâce à une approche de modélisation PK/PD (pharmacocinétique / pharmacodynamie), les données PK pourront permettre la sélection du niveau de dose et de l'intervalle de dosage et ainsi remplacer les études de détermination de dose standard habituellement effectuées in vivo (et ainsi donc, limiter l’utilisation d’animaux dans des études ultérieures).

Raffinement

Le projet ne comportant pas de phase pouvant induire une douleur/souffrance/angoisse excessive, aucune médication n’est envisagée. Les conditions d’hébergement permettent aux animaux d’avoir a minima des contacts visuels, auditifs et olfactifs, il n'y a donc pas d'isolement mais un hébergement individuel. Lorsque ce dernier est nécessaire pour atteindre l’objectif de l’étude, les périodes sont les plus courtes possibles et des périodes de regroupement des animaux, de sociabilisation et de jeux avec l’humain sont également prévues. Les animaux disposent d’une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques et ont accès ad libitum à l’eau. Ils sont observés au moins 2 fois par jour pendant toute leur durée d’hébergement sur le site. En cas d’altération de comportement ou de toute observation laissant suspecter une atteinte du bien-être ou de la santé de l’animal, un vétérinaire examinera l’animal afin de poser un diagnostic qui permettra de prendre la décision adéquate pour protéger l’animal avec si nécessaire l'administration d'un traitement et, si besoin, en le sortant de l’étude. En cas de traitement, la voie d’administration, la dose et la durée du traitement seront définies par le vétérinaire. Il assure le suivi de l’animal jusqu’à son rétablissement complet. L’animal malade et/ou nécessitant un suivi spécifique pourra être mis à l'écart des autres animaux pour une meilleure surveillance. Il sera hébergé conformément aux procédures standards en vigueur au sein de l’Etablissement Utilisateur (EU) afin de lui permettre d'exprimer ses besoins physiologiques. Dans le respect de l’atteinte de l’objectif de l’étude, la fréquence des traitements et des prélèvements ainsi que les volumes administrés et les volumes de sang prélevés sont toujours minimisés pour éviter tout stress aux animaux. Des temps spécifiques de récupération sont prévus entre deux prélèvements sanguins en fonction du volume prélevé.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les objectifs de l’étude détermineront l'âge des animaux utilisés, allant du jeune animal à l’animal adulte. En effet, le devenir du médicament dans l’organisme (absorption, distribution, métabolisme et excrétion) est lié à l’état physiologique et physiopathologique de l’animal, à des facteurs exogènes, aux interactions médicamenteuses… et l’âge reste l’une des principales causes de variabilité pharmacocinétique. Avec l’âge, la maturité des organes cibles se modifie ; chez le nouveau-né, le métabolisme et l’excrétion se font lentement avant normalisation dans les mois suivants, traduisant une sensibilité des organes cibles possiblement très différente de celle de l’adulte. Chez l’animal âgé, le métabolisme est ralenti et la fonction rénale diminuée. Le poids corporel de l’animal est très différent selon l’âge de l’animal et est donc également à prendre en compte lors de la détermination de la dose. Cela impose de tester le futur médicament dans la tranche d’âges de l’espèce cible visée pour l’utilisation du futur médicament pour ajuster la posologie afin d’éviter des problèmes de toxicité ou d’inefficacité. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique au produit testé dans le cadre de ce projet.

7 324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales, une partie ensuite des injections intraveineuses ou directement dans la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines au maximum, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires sur trois semaines et une mesure de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine. Le projet vise à suivre les vésicules émises par les tumeurs et à comprendre comment elles agissent sur les cellules immunitaires, des applications thérapeutiques n'étant évoquées que comme une possibilité ouverte à cinq ans. Le porteur annonce dix souris par groupe expérimental comme règle générale, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 7 324 animaux du projet.

Objectifs

Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques. Ces vésicules sont sécrétées par toutes les cellules, mais lorsqu’elles sont sécrétées par les cellules tumorales, elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Bon nombre d’études dans ce domaine reposent sur l’utilisation de modèles de culture cellulaire très éloignés d’un contexte physio-pathologique. L’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, est donc une étape cruciale pour comprendre comment les tumeurs communiquent avec notre système immunitaire grâce à ces vésicules extracellulaires. Notre projet de recherche vise à suivre in situ ces vésicules extracellulaires, afin d'étudier leur capacité à interagir avec les cellules du système immunitaire et à en moduler la fonction, de comparer le devenir de différents types de vésicules extracellulaires émises par les cellules tumorales, et d’analyser le mode d’action de ces vésicules dans les cellules réceptrices. Une dernière étape consistera à moduler in vivo la sécrétion de ces vésicules de tumeurs pour moduler leurs effets sur le système immunitaire. Ces travaux permettront d’analyser le rôle de ce mode particulier de communication entre les tumeurs et le système immunitaire. Ils pourraient ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses ciblant spécifiquement ce mode de communication. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre cellules cancéreuses et système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Dans le contexte des immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer, il est essentiel de mieux comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le système immunitaire. Ce projet étudie la communication entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire grâce au développement de nouvelles méthodes de suivi de vésicules extracellulaires. Il a pour objectif d'identifier le type de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires issues des tumeurs et de comprendre le mode d’action de ces vésicules. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques en identifiant les types de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires. Notons que ces vésicules s’accumulent dans les fluides corporels, elles peuvent donc être aisément ciblées par des stratégies thérapeutiques basées sur des protocoles d’injection .

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées à tous les animaux vigiles (1 fois par expérience, durée du geste inférieure à 10 sec). Certains animaux sont ensuite traités selon 3 protocoles: soit directement dans l’eau de boisson, soit par injections aux animaux vigiles (2 injections à 24h d’intervalle – durée du geste inf à 10sec) soit par eau de boisson et injections. Certains animaux reçoivent un produit préparé au laboratoire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10sec), et d’autres par voie intra-tumorale, ou un produit commercial par voie intra-tumorale, 2 fois par semaine au long de l’expérience (maxi 9 semaines). Des prélèvements sanguins à raison d’1 prélèvement/sem pendant 3 sem) sont réalisés sur une partie de ces animaux (durée de chaque prélèvement inf 20sec – animaux sous anethésie légère). Les animaux sont observés et le développement de la tumeur est mesuré par pied à coulisse 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 20 sec).

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’injection sont limitées à la piqure elle-même : douleur légère immédiate, durée brève. La supplémentation de l’eau de boisson avec de la(Vitamine H, ne devrait pas avoir d’effet sur la quantité d’eau bue par les animaux. Aucun effet délétère n’est attendu y compris en cas de surdosage. Les nuisances attendues lors des injections de « traitement » ou des prélèvements sanguins seront celles liées aux piqures elles-mêmes (douleurs légères immédiates de courte durée)

Devenir

Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus.

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la validation des méthodes de suivi des vésicules extracellulaires dérivées de tumeur et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles. Le projet, centré sur l’étude d’un mode particulier de communication intercellulaire, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.

Réduction

1. Les tests in vitro nous ont permis de sélectionner les molécules d’intérêt, réduisant donc le nombre d’animaux à utiliser 2. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à notre modèle, notamment le taux d’obtention de tumeur par injection de cellules tumorales, et permettra l’analyse finale de groupes d’au moins 8 animaux. Il se base aussi sur nos connaissances de nos modèles tumoraux et prend en compte la quantité de matériel cellulaire nécessaire pour les 3 types d’analyses biochimiques post-mortem prévues. Toutes les lignées tumorales génétiquement modifiées seront au préalable validées in vitro.

Raffinement

Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle. Les souris seront suivies tous les 3 jours pour surveiller leur état général. Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. En cas d’atteinte des points limite tel que décrit dans la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, et l'une des lignées développe des cancers de l'intestin par mutation d'un gène suppresseur de tumeur. 5 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des hormones thyroïdiennes en injection quotidienne pendant deux jours ou en continu dans l'eau de boisson, et la mise à mort intervient au plus tard huit mois après l'induction tumorale. Le porteur écrit choisir d'interférer le moins possible et, pour cela, de ne pas administrer de traitement contre la douleur, en se limitant à une surveillance quotidienne.

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des hormones thyroïdiennes sur la croissance de tumeurs chez la souris. Nous savons par nos travaux antérieurs que ces hormones influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous utiliserons des modèles de souris qui nous permettront une analyse détaillée de cette fonction. En parallèle, en collaboration avec des cliniciens nous évaluerons les retombés de nos travaux fondamentaux en clinique.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l’effet des hormones thyroïdiennes sur la croissance tumorale in vivo et de définir l’impact de l'altération de leur récepteur nucléaire dans ce même contexte. Les analyses cellulaires et moléculaires nous permettront d’acquérir des connaissances et de tester des cibles thérapeutiques potentielles pour bloquer la croissance tumorale.

Procédures

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dont les mutations seront induites expérimentalement et une des lignées de souris développera des cancers dans l’intestin. Pour étudier l’impact de l’hyperthyroïdie sur le développement tumoral les animaux recevront également un traitement aigu avec les hormones thyroïdiennes (une injection par jour, pendant 2 jours) ou subclinique (hormones thyroïdiennes dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure). Toutes injections de produits se feront en quelques seconds sur animal vigile.

Impact sur les animaux

La mutation du gène suppresseur de tumeur Apc induit la croissance tumorale dans l’intestin. La cinétique du développement tumoral est bien connue, permettant de maitriser le suivi des animaux et la mise à mort interviendra au plus tard 8 mois après induction tumorale, limitant la taille et l’agressivité des tumeurs. Il est possible que les phénotypes et la vitesse du développement tumorale varie d’un animal à un autre. On choisit d’interférer le moins possible et pour cela de ne pas effectuer de traitement pour soulager la douleur de l’animale, mais on veillera quotidiennement chaque animal. Les injections par voie intra-péritonéale induisent une douleur de classe légère. Elles seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries, mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Le traitement avec les hormones thyroïdiennes provoque une hyperthyroïdie légère, qui n’aura pas d’effets majeures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Notre but est de mener des analyses sur plusieurs tissus (tumeurs et organes) prélevés après la mise à mort de chaque animal.

Remplacement

Nous étudions la physiopathologie intestinale et plus spécifiquement les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (cancer) à des fins cognitives et dans le but d’établir une recherche translationnelle. Il est évident que l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire pour les observations de base et pour valider leur relevance dans la pathologie étudiée.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

L'expertise du laboratoire dans l'étude de la physiopathologie intestinale permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des dans des cages agrémentées disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, contrôle du site d’injection) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

La physiologie intestinale chez la souris est bien caractérisée et la souris reste le modèle animal de choix pour effectuer des expériences de modifications génétiques in vivo qui recapitulent la pathologie humaine. Spécifiquement, nous étudions les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Il s’agit de processus complexes qui impliquent non seulement les cellules épithéliales intestinales mais également les cellules du microenvironnement (stromale et immunitaire). Dans ce cadre, l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire. La souris est idéale car les processus précédemment cités sont très conservés entre l'Homme et la souris. Cela a une valeur translationnelle directe. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur des stades adultes. Nous utiliserons les animaux à des stades différents après altérations génétiques ou traitement hormonale (2 jours, un mois et deux mois), pour étudier les effets à court-terme (2 jours) ou a moyen-terme (un mois) sur l’altération de la physiologie intestinale et son rétablissement (2 mois) après traitement. Nous analyserons également la cinétique de l’induction tumorale dès les stades précoces (un mois et deux mois) jusqu’au développement des lésions précancéreuse et cancéreuses (3,5,6 et 8 mois).

Préparer les futures missions lunaires et martiennes : 320 rats vont être utilisés pour cela, 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 280 d'un niveau modéré, tous tués à la fin pour prélever os, muscles et tendons. 160 d'entre eux sont suspendus par le train arrière pendant sept jours, 80 subissant ensuite quatre semaines de suspension partielle en harnais intégral, après sept semaines d'entraînement sur tapis roulant et grille d'escalade. Le porteur indique que cette position provoque une perte de poids et des bouchons d'urine et de semen chez les mâles, et prévoit des frottis vaginaux quotidiens chez les femelles ainsi que jusqu'à quinze injections intrapéritonéales. Les retombées annoncées pour les patients alités ou sédentaires restent au conditionnel, quand il qualifie déjà l'utilisation d'animaux non-humains d'étape "obligatoire" et "extrêmement enrichissante" sur le plan scientifique.

Objectifs

Ce projet est centré sur la mise au point et l’étude de moyens concrets de prévention des pertes de capacités physiques induites par une gravité plus petite que celle de la Terre (hypogravité), en vue de préparer les futures missions spatiales Lunaires et Martiennes. Une approche multidisciplinaire permettra, comme pour les expérimentations humaines réalisées par les agences spatiales française et européenne, d’avoir une approche globale du système locomoteur et d’optimiser au mieux les moyens de préventions. Pour mener à bien ce projet, une collaboration avec quatre laboratoires qui apporteront leurs expertises propres sera mise en place (système osseux, nerveux, musculaire et tendineux). L’expérimentation proposée sur le modèle rongeur devra permettre de mettre en place des recommandations pour une étude clinique humaine future et de proposer des hypothèses de travail pour des recherches en lien avec la sédentarité, mais également de mieux caractériser le modèle d’étude d’hypogravité dans différents domaines de la recherche biologique. Enfin, bien que ces expérimentations soient réalisées dans le cadre du domaine spatial, leurs résultats auront un impact important dans le domaine clinique sur Terre, que ce soit en rapport à des patients souffrant d’alitement prolongé, de sédentarité, de vieillissement, ou de diverse maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur (os et muscle) et l’apesanteur (ou inactivité) et l’hypogravité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est, dans l’espace mais également sur Terre dans le domaine clinique, un réèl problème en matière de santé publique. Ces expérimentations sont de fait à la fois une étape importante pour réaliser les objectifs de demain dans l’exploration spatiale, mais également un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine. De même, ces expérimentations se feront sur des rats males et femelles. Ces résultats pourraient donner lieu à des recommandations importantes lors d’immobilisation, de blessure, d’alitement prolongé dans le domaine clinique, ou encore au cours du vieillissement, ainsi que de mettre en lumière des différences physiologiques notables entre les sexes

Procédures

Les animaux expérimentaux seront soumis à des entrainements sportifs sur tapis de course (1 séance de 20-40 minutes tous les deux jours pendant 3 semaines) puis avec un harnais de suspension (1 séance de 20-40 minutes tous les deux jours pendant 4 semaines) ainsi que sur grille d’escalade (1 séance de 15 minutes tous les deux jours pendant 7 semaines). Parmi eux 160 animaux seront aussi suspendus par le train arrière à l’aide d’un harnais pelvien pendant 7 jours. S’en suivra une suspension partielle (hypogravité avec harnais intégral) de 4 semaines pour 80 animaux. Nous ferons des tests de motricité (2 fois 15 min), de force (2-3mn), de comportement d'exploration (20mn) et des IRM (appareil de résonnance magnétique comme en médecine humaine) (2 min) au total 5 fois maximum durant l’étude. Nous effectuerons des prélèvements de quelques gouttes de sang sur animal vigile par ponction à la queue (comme préconisé par les recommandations en éthique animale), toutes les 2 semaines pendant l’étude, soit 5 fois au maximum. Nous effectuerons des frottis vaginaux tous les jours pour les femelles (acte non invasif) ainsi que des injections intrapéritonéales (15 injections au maximum, incluant l’anesthésie) durant l’étude qui dure 11 semaines. Les séquences d'évènements seront les même que décrite plus haut.

Impact sur les animaux

La principale nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera le stress lié à l’activité réduite par le modèle d’apesanteur (suspension du train arrière) qui peut aussi induire sur les premières 48h une perte de poids ainsi que des bouchons d’urine et de semen (pour les animaux mâles) dû à la position. Le modèle d’hypogravité (gravité paritelle) est de même susceptible de provoquer un stress lié à l’équipement (harnais de suspension). Les animaux seront aussi stréssés pendant les IRMs et légèrement fatigués lors de l’entrainement sur tapis roulant, pendant l’entrainement sur grille d’escalade, pendant l’évaluation de la force d’agrippement. Une faible douleur associée à une piqure d’aiguille sera attendue lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins. Un faible stress pour les animaux femelles sera associé au frottis vaginal (acte non invasif).

Devenir

Mis à mort pour prélévements d’organes et analyses détaillées des tissus d'intérêt (système osseux, musculaire et tendineux).

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets de l’apesanteur sur le corps entier. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats précliniques très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés aux moyens de trois axes de réductions. Le premier axe consiste à regrouper les procédures de 4 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 4 le nombre de rats qui aurait été classiquement employé. Cette centralisation permettra également d’obtenir des résultats bien plus fiables et reproductibles. Le deuxième axe consiste à réutiliser les données de différents groupes contrôles permettant là encore de réduire le nombre de rats de manière importante sans affecter la qualité des résultats. Enfin, le troisième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement en vue des effets attendus.

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation sont les suivantes : Les animaux sont préalablements habitués aux expérimentateurs (contact et jeux quotidiens) ainsi qu’aux tests physiques. Pour la course sur tapis roulant, l’animal est libre de cesser de courir. Pour les différents compléments alimentaires, ceux- ci sont directement intégrées à la nourriture pour éviter toute injection ou gavage. Les procédures de mise en apensanteur utilisant un harnais sont validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toutes complications. Grâce à un système d'axe mobile les animaux peuvent toujours se déplacer à l'aide de leurs pattes dans la cage durant toutes les phases. De plus, les rats sont deux dans une même cage pour éviter l’isolement social. Pour éviter le refroidissement, la température de la pièce sera de 24° et les animaux auront à disposition des copeaux pour réaliser leur nid. Chaque phase de l’étude possède également des points limites et critères d’arrêts stricts en cas d’évènements potentiellement néfaste pour les animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être etc. Les suivis quotidiens des animaux permettront d’identifier d’éventuels signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement. La vérification quotidienne des poids corporels et consommation de nourriture sera un paramètre intégré à nos protocoles. Aussi, lors des prélèvements sanguins sur animal vigile la queue sera chauffée dans l’eau tiède pour faciliter le prélèvement. De plus, une aiguille fine sera utilisée. Enfin, les animaux sont sédatés avant d’être euthanasiés par anesthésie terminale pour éviter tout stress.

Choix des espèces

Le rat est privilégié pour de nombreuses raisons. Les espèces de rats et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculaire et osseux. Les systèmes cellulaires sont similaires chez l'homme et chez le rat bien qu'il existe des différences subtiles entre les deux espèces. Le rat est une espèce qui nous permet de nous rapprocher, génétiquement parlant, de l’Humain. Ces études chez le rat nous permettront de tirer des conclusions qui pourront être étendues chez l'homme. Celles-ci sont par exemple utilisées lors des missions spatiales pour étudier les effets de la microgravité réèlle. De très nombreuses études ont employé ce modèle et témoignent de sa fiabilité. De plus différents protocole de simulation d’apesanteur et d’hypogravité d’ores et déjà été validés et largement employés, permettant également de pouvoir comparer nos résultats à des résultats pré-établis. Enfin, ces expérimentations se feront aussi sur des rats femelles, afin de combler le manque de résultats indéniable dans la littérature sur ce sexe. Les animaux seront utilisés entre 11 et 22 semaines d’âge. L’expérimentation commencera à 13-14 semaines, ce qui marque le point de maturité de croissance musculaire des rats.