Procédures légères
Utilisation du sang de lapin pour l’étude des interactions entre les moustiques vecteurs et les arbovirus de type Zika
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Proposés à l'adoption à la fin du projet, quatre lapins mâles sont ponctionnés à la veine marginale de l'oreille tous les quinze jours pendant deux ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Chaque prélèvement suppose un quart d'heure en cage de contention le temps d'obtenir une vasodilatation, puis une dizaine de minutes d'aiguille, et laisse un hématome que le porteur dit se résorber avant le prélèvement suivant. Leur sang sert à préparer les repas infectieux de moustiques femelles gorgées sur membrane artificielle avec les virus Zika et de la dengue. Le porteur retient le lapin parce que son sang donne selon lui de meilleurs taux d'infection que le sang de bœuf, et parce que la position de La Réunion rend l'acheminement de sang commandé à un fournisseur coûteux et risqué pour la chaîne du froid.
Objectifs
Les maladies à transmission vectorielle représentent un défi majeur en matière de santé publique et de développement économique. L’objectif de ce projet est d’examiner le rôle des moustiques vecteurs dans la dynamique de transmission des arbovirus . A cet effet, la compétence vectorielle des moustiques échantillonnés sera examinée. Les expériences pour mesurer la compétence vectorielle seront réalisées en laboratoire confiné de niveau 3 , avec les virus Zika et le virus de la dengue. Nous effectuerons des infections expérimentales par gorgement des femelles de moustiques sur membranes artificielles. Le repas de sang infectieux sera composé d’un mélange de sang de lapin, de virus et d’ATP (Adénosine Triphosphate) utilisé comme phagostimulant.Différents tests effectués par un consortium de laboratoire de recherche travaillant sur ZIKA ont démontré que l'origine du sang utilisé affecte l'infection viral et la dissémination.Ces résultats démontrent que le sang de lapin a une efficacité optimale (en comparaisant avec du sang de boeuf) de l'infection e de la dissémination du virus ZIKA. Pour le projet nous utiliserons deux lapins KBL(NZW) mâles de 11 semaines que nous ponctionnerons toutes les semaines à tour de rôle car l'idéal c'est d'espacer de deux semaines les prélèvements pour chaque lapin en ne dépassant pas 10% du volume totale (environ 6ml pour un lapin de 1kg) ,l'animal ne subissant aucune contrainte notable due à une telle perte de sang.La ponction de la veine marginale de l'oreille est la méthode à choisir chez le lapin. La vasodilatation,si elle est nécessaire,sera provoquée par l'application d'une substance légèrement irritante qui sera enlevée de l'oreille après le prélèvement de sang.Avant chaque prélèvement nous appliquerons du désinfectant au niveau du site de prélèvement ainsi qu'un anesthésiant local ;Les lapins seront hébergés dans une animalerie agréée , et mis dans des cages adaptées avec un enrichissement comprenant mélange de fourrage ainsi que cube de bois.Lors des prélèvements les lapins seront disposés dans des cages de contention adaptées et seront manipulés par du personnel compétent.
Bénéfices attendus
Les maladies à transmission vectorielle représentent un défi majeur en matière de santé publique et de développement économique. La Réunion et les îles du sud-ouest de l’Océan indien (SOOI) ont été victime ces dernières années d’émergences épidémiques de nombreuses arboviroses d’importance médicale.Les bénéfices attendus sur ce projet sont multiples : Comprendre tous les mécanismes d'infections du virus ZIKA du vecteur à la population humaine, mettre en place des méthodologies pour inhiber le virus au sein du vecteur , mettre en place des méthodes thérapeutiques pour réduire les symptômes de la maladie.
Procédures
Maintien du lapin dans une cage de contention bien qu'adaptée pendant une quinzaine de minutes le temps de la vasodilatation et prélèvement Introduction d"une aiguille de 22 à 24G pour le prélèvement sanguin qui dure environ 10 minutes . Ces prélèvements se feront sur chaque lapin tous les 15 jours pendant 2 ans (à raison de 2 groupes de lapins sur la durée totale du projet)
Impact sur les animaux
Les nuisances sont les suivantes : Maintien du lapin dans une cage de contention bien qu'adaptée pendant une quinzaine xde minutes le temps de la vasodilatation et du prélèvement Introduction d"une aiguille de 22 à 24G pour le prélèvement sanguin et dans une moindre mesure perte de volémie même si le volume prélevé à chaque prélèvement ne dépassera pas 10% du volume total ce qui ne devrait pas entrainer une perte de volémie nuisible pour l'animal.Une réaction de retrait du lapin liè à l'introduction d'une aiguille qui sera limitée par l'application de Lidocaine , un anesthésiant local, au niveau du site d'injection Apparition d'un hématome au niveau du site de prélèvement qui aura le temps de se résorber en 15 jours vu que nous alterneront les prélèvements sur chaque lapin d'une semaine à l'autre.
Devenir
Les animaux auront subis peu de contrainte et pas de modification physiologique nous proposerons par le biais de notre SBEA les animaux à l'adoption.cela déjà été réalisé par le passé avec une adoption de 100% des animaux (lapins)
Remplacement
les essais d'infection réalisées sur d'autres sangs ont montré un trés faible taux d'engorgement des moustiques en effet d'aprés les comparatifs d'infection et de dissémination virale selon le sang utilisé , les résultats démontrent que le sang de lapin a une efficacité optimale (en comparaison avec du sang de boeuf) de l'infection de de la dissémination du virus ZIKA.De plus la situation géographique complexifie nettement l'acheminement régulier ( coût exorbitant, ainsi que risque de non respect de la chaîne du froid) de sang de lapin issue d'établissement agrée fournisseur d'animaux de laboratoire et produits biologiques découlant.
Réduction
Le nombre de lapins a été limité à 2 au vue du besoin en sang pour ce projet.
Raffinement
Les prélèvements pour chaque lapin en ne dépassant pas 10% du volume totale (environ 6ml pour un lapin de 1kg) et se feront tous les 15 jours pour chaque lapin ,l'animal ne subissant aucune contrainte notable due à une telle perte de sang. Nouds appliquerons sytématiquement de la lidocaine,un anesthésiant local, sur le site de prélèvement pour éviter toutes génes ou douleurs. Les lapins seront hébergés dans une animalerie agréée , et mis dans des cages adaptées avec un enrichissement comprenant mélange de fourrage ainsi que cube de bois. Lors des prélèvements les lapins seront disposés dans des cages de contention adaptées et seront manipulés par du personnel compétent.Ils auront accés à l'eau ainsi qu'a la nouriture ad libidum.Une surveillance quotidienne par les zootechniciens sera effectué.La perte de volume est compensée en quelques heures par un transfert de liquide de l'espace extra-cellulaire vers l'espace intra-vasculaire, ainsi que par une excrétion diminuée d'urine et par le fait de boire davantage.
Choix des espèces
D'aprés les comparatifs d'infection et de dissémination virale selon le sang utilisé , les résultats démontrent que le sang de lapin a une efficacité optimale (en comparaison avec du sang de boeuf) de l'infection de de la dissémination du virus ZIKA.De plus la situation géographique de l'île de la Réunion complexifie nettement l'acheminement régulier ( coût exorbitant, ainsi que risque de non respect de la chaîne du froid) de sang de lapin issue d'établissement agrée fournisseur d'animaux de laboratoire et produits biologiques découlant. Les lapins seront commandés au stade jeunes adultes afin d'être assez matures pour supporter sans effets secondaire les prélèvements et seront maintenus en vie pendant deux ans car au-delà les animaux commencent à viellir et à développer potentiellement des maladies liées à leur âge avancé.
Évaluation de vaccins basés sur la levure contre les mammites bovines
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Dix vaches en tarissement reçoivent des immunisations intramusculaires, sous-cutanées et directement dans la mamelle, puis une infection par Staphylococcus aureus par la même voie, avec jusqu'à quatre lavages intramammaires et une à deux prises de sang par semaine. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance légère, le porteur listant des hématomes, des phlébites et des mammites non infectieuses de moins de vingt-quatre heures. Il écrit par ailleurs que ses essais antérieurs de vaccins à base de levure de boulanger "ne causent aucune réaction adverse chez le bovin". Les dix vaches sont tuées, une espèce destinée à l'alimentation humaine ayant reçu des formulations sans autorisation de mise sur le marché ne pouvant, indique-t-il, être ni relâchée ni adoptée.
Objectifs
Limiter l’usage des antibiotiques représente un enjeu sociétal prioritaire. Dans ce contexte, la vaccination joue un rôle important dans la réduction de l’incidence et la sévérité des infections. Des alternatives aux vaccins privilegiant la réponse humorale demeurent un besoin dans la lutte contre certaines maladies animales, notamment les mammites à Staphylococcus aureus chez les ruminants. Les mammites sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Les vaccins actuels contre ces infections sont peu efficaces et des nouvelles approches vaccinales doivent être proposées. Des analyses in vivo récemment mises en place par notre équipe montrent que l’administration par les voies systemique (intramusculaire) et locale (intramammaire) de vaccins à base de la levure du boulanger (Saccharomyces cerevisiae - SCe) inactivée par la chaleur ne cause aucune réaction adverse chez le bovin. De plus, cette plateforme vaccinale a permis l’induction d’une réponse lymphocytaire antigène-spécifique dans le sang et la glande mammaire de vaches laitières. Basé sur ces observations, le présent protocole a pour but d’évaluer l’efficacité in vivo d’un vaccin contre les mammites à S. aureus.
Bénéfices attendus
Les vaccins actuels contre les mammites, basés sur des approches traditionnelles (bactéries inactivées), sont peu efficaces et ce constat est attribué à leur incapacité à déclencher une réponse immunitaire à médiation cellulaire (modulée par les lymphocytes). Les connaissances apportées par ce projet contribueront au développement de nouveaux vaccins contre les mammites dans le cadre du programme jeune chercheur de l’ANR. Ces vaccins exploiteront la levure du boulanger comme vecteur d’antigènes et cela permettra la production de vaccins plus sûrs, moins coûteux et stockables sans chaine de refroidissement. A long terme, cette stratégie pourra être utilisée pour la mise en place de vaccins contre d’autres maladies des animaux de rente, contribuant à la réduction de l’usage d’antibiotiques au sein des élevages.
Procédures
Prélèvement sanguin : une, éventuellement deux prises par semaine. Une période de repos d’au moins 5 jours sera instituée avant un nouveau prélèvement. Immunisation par la voie intramusculaire : 1 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation ou Infection par S. aureus par la voie intramammaire : 1 fois pour infection ou 2 fois maximum pour immunisation espacées d’au moins 4 mois, le cas échéant. L’intervention dure moins 5 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation par la voie sous-cutannée : 2 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Stimulation et lavage intramammaire. 4 fois (maximum) espacées d’au moins 15 jours. L’intervention dure moins 10 minutes par animal
Impact sur les animaux
Hématomes et inflammation locale suite aux immunisations ou à l’infection. Phlébites suite aux prélèvements sanguins. Mammites non infectieuses de courte durée (< 24h) suite aux stimulations locales et aux lavages. La contention peut engendrer du stress et les différentes injections ou lavage intramammaire peuvent engendrer une douleur pour l’animal si réalisées par une personne peu expérimentée.
Devenir
S’agissant d’individus d’une espèce destinée à l’alimentation humaine ayant subi des traitements avec des formulations dépourvues d’une autorisation de mise sur le marché, l’ensemble des animaux sera mis à mort. Etant donné que les animaux seront maintenus au sein d’une plateforme de recherche en infectiologie, le replacement ou adoption de ces animaux n’est pas envisageable.
Remplacement
Les cellules bovines ne peuvent pas être remplacées par celles d’une autre espèce ou par une lignée cellulaire commerciale. De plus, bien souvent les résultats de protection contre l'infection obtenus avec l’immunisation des rongeurs ne sont pas transposables aux ruminants.
Réduction
Notre équipe a précédemment observé qu’un animal sur quatre ne présente pas une réponse immunitaire mesurable suite à des immunisations avec l’ovalbumine et d’autres antigènes. Ainsi, un collectif de six animaux par groupe, répartis en deux protocoles, représente le minimum pour obtenir des résultats se prêtant à des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. Concrètement, les analyses sur les échantillons sanguins et de sécrétion mammaire stimulés ex vivo/in vitro seront réalisées avant et après les immunisations ou stimulations in vivo la glande mammaire. De plus, 2 quartiers non-stimulés seront utilisés comme témoins pour les analyses.
Raffinement
Les prises de sang et les immunisations ne nécessiteront qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Pour les immunisations, l’infection et lavages intramammaires, les animaux seront retenus en groupe de 3 ou 4 dans la salle de traite, pour une période courte (inférieure à 30 min). Suite aux immunisations et lavages, les animaux seront surveillés pour la présence de signes systémiques et locaux de réaction adverse. Pour cela, l’état général et la température corporelle des animaux, ainsi que la présence d’hématomes et d’inflammation sera évalué au moins 1 fois par jour pendant la période d’une semaine après chaque administration. Le cas échéant, ces signes seront traités avec un anti-inflammatoire non stéroïdien approuvé pour l’usage chez le bovin. En cas de mammite infectieuse suite aux administrations intramammaires, les quartiers affectés seront soumis à un traitement antibiotique à spectre large. Enrichissement du mileu: pierre de sel, brosse de grattage, tapis de couchage, paille Enrichissement social : confinement en groupe et visite régulière des animaliers Une récompense positive (céreales) sera fournise aux animaux après les prélèvements et lavages intramammaires.
Choix des espèces
Les infections mammaires des bovins sont fréquentes en élevage. Elles sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Des vaccins plus efficaces contre ces infections doivent être mis au point. Le choix de l’espèce cible pour la mise en place de ce protocole est justifiée par l’observation que les résultats de protection contre l'infection obtenus avec des modèles murins sont peu transposables aux bovins. Les expérimentations seront réalisées sur des vaches en tarissement car ces animaux correspondent à la catégorie ciblée par notre approche vaccinale en cours de développement.
Etude de l’hétérogénéité de la réponse vasculaire (chez la souris C57BL/6J) pour prédire le risque de complications aux tissus sains après radiothérapie : impact du débit de dose.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Irradiées au thorax entier à 18 Gy sous anesthésie, jusqu'à trente minutes pour le débit de dose le plus faible, 1 056 souris mâles sont ensuite gardées une semaine, un mois, trois mois ou six mois avant d'être tuées pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que ce modèle provoque une fibrose à partir de trois mois et une mortalité de 20 à 25 %, et 180 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Celles qui perdent plus de 20 % de leur poids par rapport aux témoins sont mises à mort. L'objectif est de relier les réponses obtenues sur cellules en culture à celles observées in vivo, et le porteur écrit que le modèle prédictif ainsi construit pourrait à terme limiter le recours à l'expérimentation animale, ce qui suppose ici d'en irradier plus d'un millier.
Objectifs
L’objectif de ce nouveau projet est d’utiliser des mesures d’hétérogénéité de la réponse vasculaire pour prédire le risque de complications aux tissus sains après radiothérapie mais aussi d’établir des liens entre les réponses in vitro et in vivo pour valider la prédiction du risque de complications post-radiothérapie. Pour y parvenir, de nombreuses modalités d’irradiations en lien avec la clinique ont déjà été testées in vitro. Ainsi, nous souhaitons collecter et utiliser les données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo avec différentes modalités d’irradiations (variation d’énergie et/ou de débit de dose). La méthodologie développée permettra également de recueillir de nouvelles et nombreuses données sur les forts débits de dose. Enfin, à moyen et plus long terme, ce modèle de prédiction de risque pourra, grâce à sa méthodologie déclinable, être mis au service de l’expertise lorsque l’Institut est sollicité pour répondre à des problématiques de radioprotection, mais pour lesquelles il ne dispose pas de données biologiques et/ou scientifiques solides sur lesquelles s’appuyer pour donner son avis.
Bénéfices attendus
La méthodologie développée permettra de recueillir de nouvelles et nombreuses données in vivo sur les débits de dose. Ces données serviront également à établir des liens entre les réponses in vitro et in vivo pour valider la prédiction du risque de complications post-radiothérapie. Enfin, à moyen et plus long terme, ce modèle de prédiction de risque pourra, grâce à sa méthodologie déclinable, être mis au service de l’expertise de notre Institut, lorsqu’il est sollicité pour répondre à des problématiques de radioprotection, mais pour lesquelles il ne dispose pas de données biologiques et/ou scientifiques solides sur lesquelles s’appuyer pour donner son avis. Enfin ce modèle prédictif pourrait permettre à terme de limiter le recours à l’expérimentation animale, évaluant ainsi in vitro les risques associés à une nouvelle modalité d’irradiation inconnue.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et irradiés localement (thorax entier) sous anesthésie (pendant 30 minutes maximum pour le débit de dose le plus faible qui sera testé). Ils seront par la suite maintenus 1 semaine, 1 mois, 3 mois ou 6 mois en groupe dans des cages d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie. Au temps d’analyse défini, les animaux seront sédatés profondément pour être euthanasiés avant de procéder au prélèvement des poumons. Une partie des animaux seront imagés au micro-CT (sous anesthésie volatile : isoflurane) juste avant de procéder à l’euthanasie (groupes d’animaux servants à l’analyse histologique). Cet acte d’imagerie durera 10 minutes maximum. Aucune autre manipulation ou prélèvement ne sera effectué au cours de l’étude.
Impact sur les animaux
La dose de 18 Gy en thorax entier induit une fibrose caractérisée à partir de 3 mois environ post-irradiation. Ce modèle d’irradiation thorax entier à la dose de 18 Gy a été au préalable très bien caractérisé au sein du laboratoire. La mortalité observée sur ce modèle d’irradiation se situe entre 20 et 25 %. La sénescence et la fibrose radio-induites sont des processus nécessitant un délai suffisamment long pour se développer et s’installer. Aussi il est donc primordial de fixer des temps d’analyses jusqu’à 6 mois post-irradiation pour chacune des situations d’irradiations envisagées. Il conviendra donc de surveiller les animaux tout au long de l’expérience, a fortiori sur les points les plus tardifs pour détecter tout signe de détresse respiratoire ou de souffrance animale. Si tel était le cas, les animaux concernés seront euthanasiés.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale pour étudier la réponse endothéliale dans leur environnement tissulaire. Le recours à l’expérimentation pour mener à bien ce projet est indispensable. Le but de cette étude est de conforter des données obtenues in vitro sur des cellules endothéliales afin d’implémenter un modèle de prédiction de devenir cellulaire suite à l’irradiation. A terme, si un tel modèle peut être établi il pourra devenir un outil d’alternative à l’expérimentation animale.
Réduction
Pour effectuer des tests statistiques sur des données histologiques des groupes de 8 animaux sont nécessaires afin d’en retirer une information robuste. Pour les analyses par cytométrie en flux spectrale des groupes de 8 animaux suffiront, car chaque analyse sera réalisée sur des dizaines de milliers de cellules (minimum 5 x 104 cellules par point), ce qui augmente significativement la puissance statistique. Les matrices de données générées par cytométrie en flux spectrale seront analysées par des outils statistiques de pointe dédiés et développés en collaboration avec le mathématicien/biostatisticien du service.
Raffinement
Concernant les conditions d’hébergement des animaux, des enrichissements seront placés dans les cages (tubes pour rongeurs, caches, copeaux, cotons,…). De l’eau dans des biberons ainsi que de la nourriture sous forme de croquettes seront disponibles ad libitum. Cet hébergement se déroulera dans des conditions de température et d’humidité régulées et contrôlées. Durant la totalité de l’expérience (arrivée des animaux jusqu’à l’euthanasie), un suivi quotidien des animaux sera assuré avec une attention particulière qui sera portée à tout signes comportementaux et cliniques montrant une souffrance animale (absence de mobilité, prostration, détresse respiratoire, …). Si ces signes anormaux sont observés, une euthanasie des animaux concernés sera réalisée. Concernant les irradiations, les souris seront maintenues endormies sous anesthésie volatile (isoflurane) durant chaque irradiation de manière à garantir leur sédation ainsi que leur immobilité. Puis les animaux seront pesés une fois par semaine afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % par rapport au groupe témoin correspondant. Si tel était le cas, une euthanasie des animaux concernés sera réalisée.
Choix des espèces
Ce projet fera appel à des souris mâles âgées entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’un stade adulte (animaux de poids suffisant), classiquement utilisé dans les modèles d’irradiation localisées et permettant de se prémunir d’une hétérogénéité liée à l’âge. L’irradiation thorax entier de souris mâles est également un modèle pré-clinique parfaitement maîtrisé au sein du laboratoire depuis de très nombreuses années. Il sera néanmoins intéressant de poursuivre ultérieurement cette étude sur des souris femelles lors d’un futur projet.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 383 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune passe neuf séances de quinze minutes de mesure de pression artérielle par manchon à la queue. Un tiers subit quatorze jours d'hypoxie intermittente, avec perte de poids et baisse de la prise alimentaire les premiers jours. Les deux autres tiers portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut conduire à des sténoses ou des anévrismes, et une partie est hébergée jusqu'à 24 mois pour l'étude du vieillissement, isolée quand les congénères meurent de vieillesse. Le porteur annonce que ces travaux permettront de proposer la stratégie thérapeutique la plus appropriée pour trois maladies humaines. Les organes vitaux, eux, sont prélevés sur chaque souris au cours d'une procédure sans réveil.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, motsclefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
Fourniture de spécimens issus de toutes espèces pour le développement de méthodes analytiques, caractérisation de modèles et développement de techniques d’analyses de laboratoire.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Chiens : 80
Cochons : 100
Moutons : 10
Bovins : 50
Poules : 2750
Prélèvements sanguins en vigile, biopsies cutanées au punch répétées jusqu'à quatre fois, aspirations à l'aiguille fine, écouvillonnages des muqueuses oculaires, buccales, nasales, anales et vaginales : 3 070 animaux non-humains subissent ces actes, dont 2 750 poules étourdies puis saignées à mort pour un prélèvement total, 80 chats, 80 chiens, 100 cochons, 50 bovins et 10 moutons. Au bout du compte 2 800 sont tués, 190 réutilisés dans d'autres procédures et 80 chats et chiens proposés à l'adoption, les actes infligés aux animaux réveillés étant déclarés d'un niveau de souffrance légère. L'objet du projet est de fournir du sang et des tissus aux laboratoires pour leurs tests in vitro et la libération de lots pharmaceutiques. Le porteur écrit que le nombre d'animaux est fixé par les laboratoires selon leurs "besoins" et qu'il n'est "actuellement pas possible" de le réduire, sans indiquer ce qui commande ces volumes.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’effectuer la fourniture de sang et de tissus nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider les tests in vitro, la production de sous-produits sanguins comme par exemple la production de plasma pour son utilisation comme véhicule pour un médicament, mai aussi le prélèvement de tissus et de sang pour la caractérisation et le développement de méthodes analytiques et de modèles expérimentaux sains (obtention de valeurs de référence). Mais aussi d’être en adéquation aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération de lot. Les procédures seront effectuées sur des animaux en attente d’étude, ne participant pas une procédure expérimentale.
Bénéfices attendus
Ces prélèvements garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement. Ces tests permettent la libération de lots pharmaceutiques et immunologiques qui protègent efficacement les animaux contre les maladies, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal.
Procédures
Tous les animaux sauf les poulets sont soumis à des prélèvements sanguins en vigile. L’acte technique est inférieur à 1 minute. Les poulets sont étourdis pour le prélèvement total. L’acte est inférieur à 3 minutes. Les chiens chats peuvent être soumis à des biopsies cutanées punch sous anesthésie. L’acte technique est inférieur à 5 minutes et ne peut être répété plus de 4 fois. Les chiens, chats peuvent être soumis à une aspiration à l’aiguille fine en vigile pour des prélèvements de cellule de la peau. L’acte technique est inférieur à 5 minutes et ne peut être répété plus de 4 fois. Enfin tous les animaux sauf les poulets peuvent être soumis à des écouvillons au niveau des muqueuses (conjunctives, auriculaires, buccales, nasales, anales, vaginales). Cet acte technique s’effectue en vigile et est inférieur à 3 minutes. Plusieurs écouvillons peuvent être effectués
Impact sur les animaux
Un stress est attendu chez les animaux lié aux manipulations ainsi qu’une douleur légère de courte durée liée aux prélèvements
Devenir
Tous les animaux peuvent être réutilisés sauf les poulets qui subissent un prélèvement total et terminal après étourdissement. Les chiens, chats peuvent être adoptés si la SBEA identifie un adoptant sérieux
Remplacement
La réalisation des techniques d’analyses de laboratoire in vitro nécessite la production de sang et de tissus. Actuellement, cette production n’est possible qu’à partir d’un animal. Aucun modèle in vitro alternatif n’a pu être mis au point pour ce type de production.
Réduction
Les animaux concernés sont issus ou en attente de tests libératoires de techniques de contrôles ou de protocole R&D. Dans quelques cas rares, les ovins, bovins peuvent être commandés spécifiquement pour la production de sang afin de répondre aux demandes du laboratoire. Les chats et chiens sont systématiquement des animaux réutilisés. Les porcs peuvent être commandés spécifiquement, dans ce cas se sont des surnuméraires de notre colonie. Les poulets proviennent de lots témoins de libération de tests de contrôle qualité, ils sont pratiquement toujours réutilisés. Le nombre d’animaux est fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins et du type de techniques d’analyses nécessaire. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.
Raffinement
Dans ce projet, un stress lié aux manipulations ainsi qu’une douleur légère de courte durée liée aux prélèvements sont attendus chez les animaux. Une anesthésie (locale ou générale) sera pratiquée avant la biopsie cutanée. Pour éviter un inconfort de l'animal pendant et après le prélèvement par biopsie, une analgésie adaptée pourrait être pratiquée avant/pendant/après l'opération. Des points limites généraux liés à l'espèce sont appliqués (Respiration agonique, perte de poids et absence de réaction aux stimulis pour les carnivores et animaux de production et respiration bec ouvert et cou tendu, cachexie ou absence de réaction aux stimulis pour les poulets). Les différents prélèvements ne seront pas cumulés sur les animaux. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
La production de globules est actuellement irréalisable sur un modèle In vitro. Il faut passer par le modèle in vivo. Les globules rouges et blancs produits entrent ensuite dans les contrôles in vitro réalisés permettant la libération d’un lot. L'obtention d'un spécimen de sang permet aussi d'évaluer les valeurs usuelles chez l'animal sain, de développer des modèles analytiques. Pour avoir les valeurs d'une espèce, nécessité de travailler in vivo sur l'espèce cible. Dans le cas d'une biopsie ou d'un prélèvement par écouvillon, un modèle produit in vitro n'offre pas la complexité d'un spécimen prélevé in vivo (microbiome, interaction des différentes cellules). Le ou les spécimens ainsi récoltés pourront servir dans le cadre de caractérisations (de la flore commensale par exemple) ou de créations de nouveaux modèles. Les prélèvements de sang et de tissus récoltés sont spécifiques et liés à l’espèce. Le stade de développement n'a pas d'incidence sur la fourniture de specimens. Les prélèvements s'effectuent sur des animaux adultes et présents dans l'établissement utilisateur. Les porcs seront âgés d’au moins 8 semaines et les bovins seront âgés d’au moins 1 mois. Les ovins sont âgés entre 2 et 9 mois. Les chiens et les chats doivent être âgés d’au moins 8 semaines. Les poulets sont âgés de 1 jour d’âge à 70 jours. Les porcs seront âgés d’au moins 8 semaines et les bovins seront âgés d’au moins 1 mois. Les ovins sont âgés entre 2 et 9 mois. Les chiens et les chats doivent être âgés d’au moins 8 semaines. Les poulets sont âgés de 1 jour d’âge à 70 jours.
Elevage de la lignée murine MeCP2-T158M, modèle du Syndrome de Rett pour en étudier le phénotype et le développement de stratégies thérapeutiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris de cette lignée portent une mutation du gène Mecp2 qui provoque chez elles une baisse de mobilité, des tremblements, une altération du rythme respiratoire et, chez les mâles, la mort vers treize semaines. 1190 souris vont être utilisées pour maintenir cette lignée modèle du syndrome de Rett, 595 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 595 un niveau sévère. La seule procédure décrite est un prélèvement de bout de queue pour le génotypage, le porteur ajoutant que "les souris sont déclarées en procédure légère" alors que la moitié de l'effectif est comptée en souffrance sévère. Toutes sont tuées vers quarante jours, avant l'apparition des signes, aucune ne pouvant être donnée ni transférée en raison de son phénotype.
Objectifs
Le syndrome de Rett (RTT) est un trouble du spectre autistique (TSA) causé par des mutations du gène MECP2. Plus de vingt ans de travaux ont permis d'établir que MeCP2 est une protéine jouant un rôle essentiel dans la physiologie neuronale et les comportements. Compte tenu de l'origine génétique du RTT et de la preuve de concept de sa réversibilité chez des souris à l’âge adulte, des efforts considérables ont été déployés pour concevoir des approches thérapeutiques visant à réexprimer MeCP2. Depuis que le lien entre MECP2 et RTT a été identifié, des milliers de mutations de MECP2 ont été découvertes. Or, le modèle le plus utilisé par la communauté scientifique est une souris totalement dépourvue de MeCP2. Un cas de figure qui n’est pas retrouvé chez l’homme. Il devient donc crucial d’étudier les modèles qui portent des mutations de MECP2 retrouvées chez les patientes pour développer des stratégies qui corrigent la pathologie dans ces contextes. Les souris porteuses de différentes mutations RTT peuvent présenter des symptômes communs mais parfois distincts, ce qui suggère que certaines mutations peuvent modifier des mécanismes spécifiques. La souris que nous voulons étudier porte une mutation de MECP2 qui est associée chez les patientes à une évolution clinique sévère et représente environ 10 % de tous les cas. Les souris qui portent cette mutation ont une durée de vie plus courte, une réduction du poids du cerveau, une altération de la coordination sensorimotrice et de l'équilibre, une réduction de la mémoire, une anxiété plus élevée et des troubles respiratoires. Notre équipe a pour projet d’importer ces souris, rendues disponibles via le Jackson Laboratory.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse au syndrome de Rett (RTT), une maladie du spectre autistique sévère et à son traitement. Nous souhaitons établir une lignée de souris qui porte une mutation de MECP2 très fréquente chez les patientes RTT pour tester ultérieurement l’impact d’une thérapie génique optimisée afin d’étudier les améliorations sur le plan comportemental, cellulaire et génétique. A ce jour des compagnies pharmaceutiques recrutent déjà des patientes Rett pour des essais cliniques de thérapie génique, hélas ces études ne tiennent pas compte du fait que toutes les mutations de MECP2 ne se valent pas et que l’impact du traitement peut varier d’une patiente à l’autre. Nous pensons qu’il est donc urgent d’étudier les effets de mutations spécifiques de Mecp2 et de la thérapie génique dans ce contexte. Une meilleure compréhension des des effets spécifiques de certaines mutations et l’élaboration de thérapies innovantes permettra de proposer cette approche thérapeutique chez les patientes porteuses de ces mêmes mutations.
Procédures
Prélèvement de bout de queue pour genotypage.
Impact sur les animaux
Le phénotype des souris qui seront étudiés ici est décrit dans la littérature de manière explicite et est connu de notre groupe. La progression de la pathologie est graduelle et se caractérise par 1) Apparition des symptômes (mâles: 6 semaines ; femelles : ± 20 semaines) incluant une baisse de la mobilité, du positionnement des pattes arrières, des tremblements, et une altération du rythme respiratoire (ces symptômes sont mesurés lors d’une évaluation hebdomadaire). 2) Perte de poids chez les mâles (par rapport aux sauvages, dès 4 semaines). Gain de poids (par rapport à leur naissance jusqu’à 6 semaines puis stagnation ± jusqu’au décès). 3) Réduction de la survie chez les mâles : décès autour de 13 semaines (une vigilance quotidienne est apportée autour de cette période). En bref, la pathologie se déclare plus tôt chez les souris mutantes mâles que chez les souris mutantes femelles qui bénéficient d’une autre copie (saine) du gène Mecp2. Les souris seront soumises à des procédures de gravite légère (génotypage, étude observationnelle). Environs 50% des animaux produits porteront les génotypes qui causent le développement d’un phénotype Rett. Toutefois, toutes les souris produites dans le cadre de la DAP d’élevage seront euthanasiées avant qu’elles ne déclarent des signes aux alentours de 40 jours. La notation de la sévérité des phénotypes Rett sera utilisée pour appréhender au mieux la date d’apparition des phénotypes.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées. Seules les mâles hémizygotes et femelles hétérozygotes ont le potentiel de développer le phénotype Rett mais seront euthanasiées dès l’apparition du phénotype. Les souris sauvages des 2 sexes ne présenterons pas de phénotype dommageable. Les souris sont déclarées en procédure légère. Compte tenu du phénotype dommageable des souris 'Rett' aucune d’entre elles ne peut faire l’objet d’un don ou d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal est nécéssaire pour pouvoir étudier le comportement, la physiologie, mais aussi l’impact de la pathologie sur la morphologie et l’expression de gènes chez des cellules intégrées à des reseaux et un organisme vivant et donc soumise à un degré de complexité biologique ne pouvant pas etre atteint (à ce jour) par des méthodes in vitro, in cellulo, ou d’organoides.
Réduction
Des tests statistiques seront utilisés pour définir le nombre de souris suffisant pour dégager un résultat significatif à notre étude. En fonction de la distribution des données afin de comparer les différents groupes d’animaux entre eux. Les animaux produits dans le cadre de l’élevage seront euthanasiés avant qu’ils ne déclarent des signes de la pathologie aux alentours de 40 jours.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance, le stress et la détresse des animaux, des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental. Le transfert des animaux hors de la cage pour étude observationnelle se fera par méthode manuelle en plaçant les souris dans le creux de la main pour réduire le stress lié à la manipulation. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par des chercheurs et zootechniciens qualifiés, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (rafle de maïs, matériel de nidification + maison dans les cages d'accouplement + bâtons à ronger) assurant un accès constant à la nourriture et à l’eau de boisson. Les mâles hémizygotes étant viables mais non fertiles nous raffinons notre schéma de reproduction afin de ne maintenir que des cages de reproduction composées de femelles hétérozygotes.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse au syndrome de Rett, un trouble du spectre autistique et à son traitement. Nous souhaitons ici étudier les effets d’une mutation spécifique du gène Mecp2 pour ensuite tester une série de stratégies de thérapeutiques sur leur capacité à améliorer les symptômes de la pathologie. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra la mise en place de nouvelles thérapies originales pour les patientes porteuses d‘une mutation qui engendre un tableau clinique sévère. L’étude nécessite donc l’étude de modèles comparables à la pathologie humaine. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation d’un modèle souris mutantes. La souris réunie la capacité à travailler sur un modèle génétiquement modifié et chez qui nous pouvons étudier le comportement, la physiologie, mais aussi l’impact de la pathologie sur la morphologie et l’expression de gènes avec un degré de complexité biologique ne pouvant pas être atteint (à ce jour) par d’autres modèles ou méthodes.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur la contraction vésicale induite par des agents contractants chez le rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Les uretères sectionnés après ouverture de l'abdomen, un cathéter poussé dans la vessie par les voies naturelles et un autre dans la veine jugulaire, puis des agents contractants injectés pour faire se contracter la vessie : l'intervention dure une trentaine de minutes. 600 rats vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, pour tester des candidats médicaments contre l'hyperactivité vésicale. Le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires des molécules confiées par ses clients, ce qui l'empêche d'anticiper les nuisances. Ces procédures sont pourtant déclarées d'un niveau de souffrance léger, seule catégorie renseignée pour les 600 animaux.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez le rat, l’effet de candidats médicaments, sur l’amplitude des contractions vésicales induites par un agent contractant en dose unique ou en doses croissantes, mais aussi sur l’augmentation de la salivation, effet secondaire observé chez les patients traités par des médicaments contre l’hyperactivité vésicale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’hyperactivité vésicale.
Procédures
Les animaux seront traités par des candidats médicaments via des gestes classiques (per os, intrapéritonéal, sous-cutané ou autre) ou via l’implantation de cathéter lors de la chirurgie. Ces gestes sont rapides (environ 1 min) et seront réalisés par du personnel compétant pour limiter le stress des animaux et réduire le temps de manipulation. Les animaux seront anesthésiés (sans réveil) et au minimum un cathéter veineux sera implanté dans une veine jugulaire. D’autres cathéters pour administrer les composés à tester pourront être implantés (intragastrique, intrapéritonéale…). Après une laparotomie, les uretères seront sectionnés, un cathéter vésical sera inséré via les voies naturelles et fixé au méat urinaire. Dans son ensemble, la chirurgie durera environ 30 minutes. Ensuite, la vessie sera perfusée avec du liquide physiologique pour atteindre une pression particulière et des agents contractants seront administrés afin de provoquer des contractions vésicales. Les animaux recevront plusieurs séries d’administration de produits contractants pour pouvoir évaluer un effet moyen des candidats médicaments. De plus, de la salive sera récupérée à différents temps à l’aide d’une pipette par exemple (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées (jusqu’à 3 semaines), prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress et une douleur.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés car ils seront sous anesthésie irréversible sans réveil.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’hyperactivité vésicale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Ce modèle est déjà établi dans notre laboratoire. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 12 animaux par groupe est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables). Nous pensons réaliser 2 études par an pour ce modèle.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale sans réveil avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et l’utilisation d’antalgique pour diminuer la douleur. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit chez le rat dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation de la glycémie chez le lapin en vue d’un test pyrogène
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un lapin qui échoue deux fois au prétest est tué, faute d'être éligible à l'essai. 21 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, 15 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 un niveau léger. Chacun est privé de nourriture pendant 24 heures et d'eau pendant 9 heures, maintenu en contention jusqu'à six heures, injecté puis ponctionné cinq fois à l'oreille en trois heures, et hébergé seul parce qu'une pharmacopée américaine l'exige. Tout cela sert à calibrer la dose de glucose à injecter lors d'un test pyrogène sur l'insuline, un test réglementaire libératoire, et le porteur consacre au remplacement une seule phrase, celle qui affirme qu'il faut se placer en conditions réelles de test.
Objectifs
Le scientifique doit réaliser des tests pyrogènes lapins pour mettre à disposition de patients des médicaments de type insuline. Le test pyrogène lapin que le scientifique doit réaliser est requis par la loi (test libératoire dans l’autorisation de mise sur le marché du produit). L’insuline étant un produit induisant une hypoglycémie chez le lapin durant le test pyrogène, le scientifique et l’établissement utilisateur prévoient d’injecter du glucose aux lapins pour contrer cet effet. L’objectif de cette demande d’autorisation de projet est de supporter la mise en place d’un protocole visant à : quantifier la déplétion glycémique faisant suite à l’injection d’insuline IV aux lapins (et cela dans les mêmes conditions qu’un test pyrogène lapin), identifier la posologie de glucose à injecter pour contrer cette déplétion physiologique lors du test pyrogène (i.e. raffinement du test pyrogène d’insuline en routine).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir raffiner le test pyrogène d’insulines en routine. L’objectif final est donc de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients.
Procédures
Les principales interventions auxquelles les animaux vont être soumis : prétest : Administration à tous les lapins incluent en prétest (maximum 21 lapins) de NaCl 0.9% (10 ml/Kg en intraveineuse (IV)) (durée maximum 3min / injection. Note : maximum 2 prétest par animal – donc chaque lapin qui intégrera le test aura eu au maximum 2 injections de NaCl 0.9% en amont). Test : Administration de produits en intraveineuse (IV) et en sous cutanée (SC) pour tous les lapins incluent en test subissant les injections (maximum 15 lapins) (dose max IV : 3ml/Kg, dose max SC : 6.66ml/Kg – durée de l’injection maximum 3 minutes. Note : les animaux utilisés sur ce test seront naïfs et donc ils n’auront pas subi de test en amont, en fonction du groupe auquel appartiendra le lapin, il se verra injecter en test : soit « rien », soit « du glucose », soit « du glucose et de l’insuline »). Les prélèvements répétés : prélèvements de sang pour tous les lapins incluent en test subissant des prélèvements (maximum 15 lapins – sauf pour le T0 où ça sera maximum 21 lapins) : des prélèvements au niveau de l’oreille seront réalisés aux temps suivants (volume prélevé à chaque temps de 0.5ml) : T0 (i.e. avant l’injection) ; T30min (+/- 15 minutes) ; T60min (+/- 15 minutes) ; T120min (+/- 15 minutes) ; T180min (+/- 15 minutes (durée d’un prélèvement maximum 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour l’animal lors de chaque prétest sont (maximum 21 lapins) : mise à jeun alimentaire et hydrique (respectivement maximum de 24 heures et de 9 heures) ; une injection de NaCl 0.9% (10mL/Kg intraveineuse (IV) – durée de 3min/injection) et une contention (maximum 6 heures). Les principales nuisances pour l’animal lors du test sont : mise à jeun alimentaire et hydrique (respectivement maximum de 24 heures et de 9 heures – maximum 21 lapins) ; une injection de produits en intraveineuse (IV) et en sous cutanée (SC) (dose max IV : 3ml/Kg, dose max SC : 6.66ml/Kg – durée de l’injection maximum 3 minutes - maximum 15 lapins) ; cinq prélèvements répétés (volume de prélèvement maximum : 0.5mL au niveau de l’oreille - durée d’un prélèvement est de maximum 5 minutes - maximum 15 lapins sauf pour le prélèvement initial où ça sera maximum 21 lapins) et une contention (maximum 6 heures – maximum 21 lapins).
Devenir
Tous les animaux entrant dans ce projet seront euthanasiés : soit en cas de détection d’un signe clinique, soit à la fin de la réalisation de l’essai, soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives et n’est donc pas éligible pour l’essai.
Remplacement
Il est nécessaire de se mettre en condition de test pyrogène (in vivo) dans le cadre de ce projet pour simuler les conditions réelles du test sur le médicament.
Réduction
Le scientifique s’est engagé à ce que le design proposé (i.e. 5 groupes de 3 lapins) corresponde au nombre d’animaux minimum nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs fixés. Les objectifs fixés sont de quantifier la déplétion glycémique faisant suite à l’injection d’insuline IV aux lapins et d'identifier la posologie de glucose à injecter pour contrer cette déplétion physiologique lors du test pyrogène (raffinement du test pyrogène d’insuline en routine).
Raffinement
Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. L’hébergement des lapins par deux a été étudié mais cette option n’a pas été retenue pour la raison suivante : la pharmacopée USP Test Pyrogène indique « House the rabbits individually ». Il s’agit donc d’un requis réglementaire. Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Par conséquent, l’enrichissement (balle de foin et balle plastique) est alterné afin de permettre une stimulation optimale des animaux. Également, des zones de repos en plastique sont présentes dans les cages. Enfin un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Concernant les prélèvements plusieurs lieux de prélèvements sont autorisés : oreille droite et gauche et sang veineux et artériel. De la colle chirurgicale ou un coton tenu par une pince à linge sera utilisée pour favoriser l’hémostase. Les gestes techniques sont faits par des techniciens animaliers qualifiés équipés d’équipements individuels de protection comprenant combinaison stérilisée, gants en nitrile (ou similaire), lunette et masques (type FFP2). Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée. Des points limites sont mis en place pour ce projet. En cas de détection d’un signe clinique sévère, l’animal sera immédiatement euthanasié sans attendre la fin du test.
Choix des espèces
Le scientifique souhaite pouvoir réaliser des tests pyrogène lapin pour un médicament de type insuline. Pour éviter des signes cliniques liés à un état hypoglycémique chez l’animal – du glucose devra être injecté en parallèle. L’objectif de ce projet est de quantifier la déplétion glycémique faisant suite à l’injection d’insuline IV aux lapins. Également – il permettra d’identifier la posologie de glucose à injecter pour contrer cette déplétion physiologique. De fait le lapin est l’espèce requise pour atteindre les objectifs de ce projet. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.
Evaluation de nouveaux anticoccidiens sélectionnés in vitro comme stratégie de contrôle de la coccidiose chez le poulet de chair
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Valider chez le poulet douze substances déjà sélectionnées in vitro : 192 poulets de chair vont être utilisés pour cela, tous tués à 28 jours, 144 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 48 un niveau léger. À 21 jours, chaque animal est maintenu jusqu'à trente secondes pour recevoir à la seringue un millilitre d'une solution contenant le parasite Eimeria, qui lèse l'intestin. Perte de poids, apathie, tremblements et démangeaisons sont annoncés. Le porteur détaille l'enrichissement des cages, clochettes et petites balles, pour des poussins élevés en batterie dès leur premier jour, et vise l'homologation d'un additif alimentaire face à la résistance croissante aux anticoccidiens en élevage.
Objectifs
Les coccidioses sont les affections parasitaires les plus dommageables en filière avicole, du point de vue économique et du bien-être et de la santé des animaux. Cette pathologie est causée par Eimeria, un parasite qui infecte l’intestin et y crée des lésions. Les conséquences de la coccidiose sont importantes: diminution de l’ingestion, une inflammation des tissus, des diarrhées hémorragiques, le développement d’autres maladies intestinales. Les Eimeria forment des spores (oocystes) selon un cycle de vie défini en « utilisant » les cellules épithéliales de l’intestin. Ces oocystes sont ensuite excrétés via les fientes qui sont le principal vecteur de transmission entre les animaux. Actuellement, les méthodes destinées à contrer la coccidiose reposent principalement sur l’utilisation de produits chimiques anticoccidiens et sur le développement d’une immunité contrôlée par addition d’antibiotiques ionophores dans l’aliments. Ces stratégies sont restées efficaces tant que de nouveaux médicaments étaient régulièrement introduits. Mais aucun nouveau produit n’ayant été proposé depuis l’an 2000, la sensibilité à tous les médicaments existants a diminué, favorisant l’apparition de souches plus virulentes du parasite. La résistance aux anticoccidiens est une préoccupation majeure pour les producteurs de poulets de chair. De plus, la demande de la société en faveur d’animaux élevés sans antimicrobiens, d’aliments exempts de résidu et l’utilisation prophylactique de produits chimiques anticoccidiens étant en croissance constante, il est nécessaire d'identifier de nouvelles molécules anticoccidienne. Un précédent projet qui consistait à produire des parasites d’Eimeria en vue de l’évaluation in vitro de l’efficacité de nouvelles substances montrant des propriétés anticoccidiennes a permis d’identifier et de sélectionner 12 candidats comme solution nutritionnelle sur 70 testées. La sélection in vitro s’est fait en comparaison avec les performances de la salinomycine, autorisée jusqu’en 2027 en tant que coccidiostatique dans les aliments pour poulets d’engraissement. Les substances atteignant 80% de l’efficacité de la salinomycine sur différentes étapes du cycle de reproduction des parasites ont été sélectionnées. Ce projet a pour but de valider in vivo les propriétés anticoccidiennes des substances identifiées in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo l’efficacité anticoccidienne de substances sélectionnées in vitro. L’effet avéré d’une ou de plusieurs de ces substances in vivo permettra de répondre à une attente sociétale en développant une solution pouvant être classée en tant qu’additif alimentaire et de faire face aux résistances des solutions actuellement disponibles. Le nombre d’animaux est réduit à la stricte nécessité de conduire l’étude de confirmation et valider in vivo l’effet anticoccidien sur la réduction de l’excrétion des oocystes de 12 substances sélectionnées in vitro. Sur la base des résultats obtenus, les meilleures substances pourront être séléctionnées pour optimiser la dose d'inclusion.
Procédures
Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoin nutritionnel pendant 28 jours. L'aliment contenant les substances à tester est distribué de jour 18 à jour 28, soit pendant 10 jours. A 21 jours d’âge, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml de solution d'infestation sera réalisée sur chaque animal de la cage. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progressivement en fonction de la déglutition de l'animal.
Impact sur les animaux
Signes cliniques pouvant apparaitre pour les groupes d'animaux revevant l'aliment supplémenté avec les substances à tester :perte de poids, apathie, tremblement, démangeaison.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements biologiques.
Remplacement
Pour réduire le recours à l’expérimentation animale, 70 molécules ont été testées in vitro au travers de différentes approches afin de prendre en compte les différentes étapes du cycle de développement multiphasique des parasites. Ces méthodes in vitro sont spécifiques du mode d’action des molécules testées et permettent d’évaluer un spectre assez large des premières étapes du cycle de vie du parasite dans l’organisme. Les tests in vitro ont permis de sélectionnés 12 substances d’intérêt potentiel pour leur efficacité anticoccidienne. Ces méthodes alternatives utilisées en première intention doivent cependant être confirmer in vivo afin de prendre en compte toutes les interactions physiologiques complexes qui ont lieu in vivo lors de l’ingestion des additifs chez le poulet. Sur la base des connaissances acquises in vitro, le développement d’un additif alimentaire avec une activité anticoccidienne supposée implique de connaitre son efficacité et son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné.
Réduction
Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats obtenus dans d’autres études sur l’excrétion des parasites en présence d’anticoccidiens connus. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale nécessaire au bien-être des animaux et d’obtenir des données scientifiquement robustes. Des observations et des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d’informations possibles par animal.
Raffinement
L’inconfort, le stress de la contrainte lors du maintien des animaux dû au gavage, sont réduits par une manipulation empathique, délicate et compétente des animaux par les applicateurs de la procédure, un gavage unitaire de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL et par une surveillance minutieuse quotidienne des animaux à l’aide de la grille d’observation. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en l’introduction d’une période d’adaptation de 8 jours (J0-J8) ou les animaux sont mis en groupe afin de favoriser l’apprentissage à l’alimentation, à l’abreuvement et aux interactions sociales, à la mise en place de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux ne se coincent pas les pattes dans les mailles de la grille et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture, notamment pendant la première semaine. L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est raffiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (clochettes, petites balles), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les anticoccidiens recherchés constituent une solution contre la coccidiose aviaire des poulets de chairs (Gallus gallus domesticus) en élevage et sont destinés à être incorporés dans les aliments distribués aux volailles (poulet de chair). Notre modèle d’étude sera donc le poulet de chair (Gallus gallus domesticus). Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 28 jours.
Évaluation de l’effet des émotions positives sur la résilience des porcs suite à une infection par Escherichia coli dans des groupes aux niveaux de bien-être contrastés.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Soixante porcelets reçoivent une souche d'Escherichia coli après le sevrage et développent fièvre et diarrhée pendant les quatre semaines suivantes. 132 cochons sont concernés au total, 120 porcelets dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 12 truies un niveau léger, avec dix prises de sang et quinze prélèvements de fèces par porcelet. La moitié des animaux est maintenue dans des conditions dites conventionnelles pour servir de point de comparaison, dans un projet qui se donne pour objet de mesurer l'effet du bien-être sur la résistance à la maladie et de nourrir de futures grilles de labellisation. Les porcelets sont tués à 67 jours en moyenne, les truies partant à l'abattoir commercial trois jours après le sevrage, ce que le formulaire enregistre comme un retour à l'élevage.
Objectifs
En élevage, les porcelets présentent fréquemment des troubles digestifs après le sevrage, résultat d’un déséquilibre de la flore intestinale. Le stress lié à l’absence de la mère, au changement d’alimentation et d’environnement ainsi que la présence de multiples pathogènes sont autant de facteurs qui perturbent la physiologie digestive des porcelets, favorisant ainsi l’apparition de diarrhées. La bactérie Escherichia coli (E. coli) est très fréquemment impliqué dans ces pathologies. Les animaux affectés présentent des signes de diarrhées, mais aussi d’augmentation de la température, de déshydratation, une perte d’appétit et par conséquent de croissance. Il s’en suit une dégradation de leur état de bien-être en lien avec la dégradation de leur état de santé. Cela entraîne des répercussions économiques pour les éleveurs ainsi qu’une utilisation d’antibiotiques pour soigner les animaux, alors que les injonctions règlementaires et sociétales incitent à diminuer leurs usages afin d’éviter que les bactéries ne deviennent résistantes à ces antibiotiques. Le projet a pour objectif de déterminer si l’amélioration du bien-être des porcs peut avoir un effet bénéfique sur l’amélioration de la résilience face aux diarrhées chez le porcelet après le sevrage. Dans ce projet, la résilience est définie comme la capacité des porcelets à recouvrer rapidement un bon état de santé à la suite à d’une infection avec E.Coli. Pour répondre à notre question de recherche, les animaux seront placés dans des deux conditions d’élevage contrastées en matière de bien-être : une condition dite « conventionnelle » et une condition dite « enrichie ». Les animaux seront ensuite infectés ou non avec E. coli après le sevrage. Nous réaliserons un suivi de tous les individus afin de quantifier leur résilience à l’infection en fonction de leurs conditions d’élevage.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de vérifier si le bien-être améliore la résilience à la maladie, sujet encore assez peu étudié. Si les résultats du projet vont dans ce sens, des recommandations à destination des éleveurs pourront inciter à la transition des élevages vers des pratiques plus respectueuses du bien-être des animaux afin d’en tirer un bénéfice sur l’amélioration de la résilience des animaux face aux infections. Le projet devrait apporter des connaissances sur les indicateurs de résilience et de bien-être qui pourront être mis en pratique en élevage dans le cadre de grilles d’évaluation. Ces grilles pourraient à terme être utilisées dans le cadre de labellisations bien-être. En effet, la recherche s’est historiquement focalisée sur les effets délétères des pratiques humaines sur le bien-être des animaux domestiques ou captifs. Dans ce contexte, le projet permettra de pallier ce manque de connaissances sur les indicateurs de bien-être positif et leur fiabilité.
Procédures
La moitié des porcelets (60 animaux) sera infectée avec la bactérie E. coli, entraînant des troubles digestifs. Les animaux inoculés pourront montrer des symptômes modérés de fièvre et de diarrhée au cours des 4 semaines suivant l’inoculation. Tous les porcelets seront soumis à des prélèvements sanguins et des prélèvements de fèces sur animaux vigiles, à raison de 10 prélèvements sanguins et 15 prélèvements de fèces par porcelet sur la durée de l’expérience (10 semaines après la naissance des porcelets). Les durées d'intervention sont estimées à 30 secondes pour une prise de sang et 1 minute pour un prélèvement de fèces.
Impact sur les animaux
Bien que la souche d’E. coli utilisée soit modérément virulente, les expérimentations précédentes ont permis de définir une dose infectieuse permettant de reproduire les symptomes observés en élevage mais de manière réversible et sans mortalité associée pour les individus inoculés (60 porcelets). Le personnel est formé à réaliser les différents prélèvements biologiques (prise de sang, prélèvement de fèces). Les contentions qu’ils impliquent sont ponctuellement stressantes pour les animaux. Les tests comportementaux individuels peuvent engendrer du stress lié à l’isolement social, mais il s’agira d’un isolement visuel. Les tests seront conduits dans la même salle que l’enclos de vie, ce qui permettra aux animaux de garder un contact auditif et olfactif avec leurs congénères. Les durées d'isolement pour les 3 tests comportementaux sont respectivement 10, 5 et 5 minutes par individu.
Devenir
Les truies seront envoyées dans un abattoir commercial en dehors de l’établissement utilisateur trois jours après le sevrage de leurs porcelets. Les porcelets seront mis à mort en fin de projet, à 67 jours d’âge en moyenne.
Remplacement
Le projet concerne spécifiquement l’espèce porcine (évaluation du bien-être et trouble de santé associé à une infection spécifique de l’espèce). Le remplacement n’est pas envisageable et les animaux eux-mêmes sont nécessaires car le bien-être est un état complexe et dynamique d’un individu que l’on ne peut pas recréer en dehors de ce dernier.
Réduction
Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Le bien-être est propre à chaque individu. Il existe donc une forte variabilité interindividuelle qui nécessite l’implication d’un nombre suffisant d’animaux. Par ailleurs, il existe également une variabilité de réponse interindividuelle au modèle d’infection par E. Coli. Ce projet impliquera donc au total 12 truies et 120 porcelets. L’effectif de 120 porcelets est nécessaire pour effectuer des analyses statistiques suffisamment puissantes pour interpréter nos données.
Raffinement
La moitié des animaux impliqués dans le projet bénéficiera d’un milieu de vie enrichi, tandis que l’autre moitié sera maintenue dans des conditions proches de l’élevage conventionnel. Si l’on ne s’attend pas à un quelconque effet positif ou négatif sur les animaux en milieu dit « conventionnel », on s’attend à plus de bien-être en milieu dit « enrichi ». Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites préalablement définis dans le projet, les animaux seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Lors des prélèvements de sang ou de fèces, il est possible que du stress, lié à la contention ou à la manipulation des animaux, soit observé en début de procédure. A chaque session de prélèvement, une récompense sous la forme de friandise sera proposée aux porcelets une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet. Nous proposons du sirop de grenadine distribué oralement grâce à une seringue drogueuse.
Choix des espèces
Ce projet concerne directement l’élevage de porcs, affecté par la problématique des pertes de production liées à au troubles digestifs en post-sevrage et par les exigences des consommateurs en matière d’amélioration du bien-être des animaux d’élevage. Le projet permettra donc d’explorer les pistes pour lier ces deux problématiques et apportera une réflexion sur leur pertinence en élevage. Le porc est l’espèce cible. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions du projet. Le projet met en jeu des truies en phase de gestation et de lactation ainsi que des porcelets en phase de lactation puis de sevrage. Il a été montré que les conditions de stress et de bien-être autour de la naissance pouvaient affecter la descendance, il semble donc pertinent de démarrer le contraste de bien-être dès la dernière semaine de gestation. Concernant la période qui suit le sevrage, il s’agit d’une période sensible pour les porcelets engendrant du stress lié à la séparation de la mère, aux changements d’environnement et d’alimentation pouvant causer des troubles digestifs. Le moment est donc pertinent pour reproduire fidèlement la maladie et réaliser le suivi clinique des porcelets.
Caractérisation du rôle d’une nouvelle population de cellules cardiaques au cours du développement de fibrose lors de l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
8000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 5052 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 2948 un niveau modéré. Toutes subissent une biopsie de la queue pour le génotypage, mais seules 2948 entrent dans les expériences : 1920 reçoivent une ligature de l'artère coronaire gauche pour provoquer un infarctus, sous intubation et ventilation, 432 se voient implanter une mini-pompe sous la peau, les autres des injections quotidiennes. Le porteur attend de ce travail une nouvelle cible thérapeutique contre l'insuffisance cardiaque, aucun traitement du remodelage du cœur n'existant à ce jour. Plus de 5000 souris naissent donc, sont biopsiées puis tuées sans jamais entrer dans un protocole, un écart que le résumé ne justifie pas.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une pathologie qui touche le muscle cardiaque et qui correspond en l’incapacité du coeur à assurer son rôle de pompe. L'insuffisance cardiaque touche plus de 1,2 millions de personnes en France et est caractérisée par une lourde mortalité. Les causes de l’insuffisance cardiaque sont nombreuses mais les causes les plus fréquentes sont l’infarctus du myocarde ou le vieillissement. Dans ces deux cas, on observe une diminution de la fonction de contraction du cœur due à une augmentation de tissu cicatriciel, ce qui aboutira en une insuffisance cardiaque du fait de la perte de l’élasticité du cœur. Actuellement, il n’existe aucun traitement efficace pour limiter le développement de ce tissu cicatriciel cardiaque. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’une population de cellules du cœur pouvant être une potentielle nouvelle cible thérapeutique au cours du développement de l’insuffisance cardiaque. Pour cela, on étudiera deux modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, se rapprochant au plus de ce qui est observé chez l'Homme. Les résultats ainsi obtenus pourront donner un nouvel essor quant à la recherche et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre d’une insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier une potentielle nouvelle cible thérapeutique au cours de l’insuffisance cardiaque et plus particulièrement lors du remodelage délétère cardiaque, que ce soit suite à un infarctus du myocarde ou au vieillissement. En effet, l’insuffisance cardiaque touche plusieurs millions de personnes dans le monde et à ce jour, aucune thérapie ne permet d’améliorer ou de prévenir le remodelage délétère, et il est donc nécessaire de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Dans un premier temps, nous allons procéder en une biopsie de queue à toutes les souris produites afin de déterminer si elles possèdent les gènes d’intérêt souhaités (8000 souris au maximum). Parmi ces animaux, seuls 2948 seront étudiés et recevront des injections intrapéritonéales (1 injection par jour durant 4 jours ; environ 10 secondes par souris) et des échocardiographies sous anesthésie générale pour mesurer leur fonction cardiaque (environ 15 min). Une partie de ces souris (596 souris mâles et femelles) ne subiront pas d’acte chirurgical. Parmi ces 596 souris, 484 recevront des injections péritonéales supplémentaires (1 injection par jour durant 4 jours consécutifs ; environ 10 secondes par souris). Le reste des animaux sera opéré. Une première partie des souris subira une ligature de l’artère coronaire gauche induisant un infarctus du myocarde. Cette opération se fera sous anesthésie générale sur un total de 1920 souris (mâles et femelles) et durera environ 30 minutes. Pour cela, nous intubons et ventilons l’animal à l’aide d’un respirateur et leur injectons en sous-cutanée des médicaments avant et après l’opération (analgésiques et antalgiques) jusqu’à 72h post-opératoires. Une partie de ces animaux (720) recevra des injections intrapéritonéales supplémentaires (1 injection par jour durant 4 jours ; environ 10 secondes par souris). Enfin, le reste des animaux (432) subira un autre type de chirurgie : l’implantation d’une mini-pompe en sous-cutanée (environ 5 minutes par souris), qui permet la distribution de molécules de façon continue et contrôlée. Pour cela, nous intubons et ventilons l’animal à l’aide d’un respirateur et leur injectons en sous-cutanée des médicaments avant et après l’opération (analgésiques et antalgiques) jusqu’à 72h post-opératoires. Une partie de ces animaux (216) recevra des injections intrapéritonéales supplémentaires (1 injection par jour durant 4 jours ; environ 10 secondes par souris). A la fin du protocole, la fonction cardiaque des animaux sera de nouveau étudiée par échographie sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent être attendus. La biopsie caudale peut induire un stress aux animaux lors de leur préhension et une légère douleur au cours de l’acte. Au cours des injections, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la préhension et une légère douleur lors de l’injection. Il y a également les effets indésirables liés aux actes chirurgicaux (ligature de l’artère coronaire pour induire un infarctus du myocarde et pose de mini-pompes pour le modèle de l’hypertrophie cardiaque), telle qu’une douleur liée à l’opération et aux points de suture, bien que ces actes soient menés sous anesthésie générale. De plus, les modèles d’insuffisance cardiaque étudiés ici peuvent induire des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Cependant, il n’y a aucun effet indésirable lié à l’échocardiographie en elle-même du fait que ce soit une expérimentation non invasive.
Devenir
A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal (biopsie caudale, injections intrapéritonéales, échocardiographie, chirurgie pour induire un infarctus du myocarde ou une insuffisance cardiaque liée à une augmentation de la masse cardiaque), tous les animaux seront mis à mort dans le but de prélever le cœur et d’autres organes. Ceci nous permettra d’étudier la population de cellules d’intérêt à l’aide de différentes expériences, nous permettant de répondre aux différentes questions posées dans le cadre de ce projet.
Remplacement
Etant donné qu’il n’existe pas d’anticorps permettant de cibler spécifiquement nos cellules d’intérêt, nous ne pouvons pas étudier de façon simple ces cellules. De plus, actuellement, il n’existe pas de modèles cellulaires ou de modélisation permettant d’étudier l’insuffisance cardiaque due à un infarctus du myocarde ou au vieillissement et de conserver l’environnement moléculaire et protéique dans son ensemble.
Réduction
La physiopathologie ainsi que la cinétique des modèles étudiés (infarctus du myocarde et hypertrophie cardiaque) sont bien connues, ce qui permet de mieux définir la durée des expériences et les différentes étapes clés de l’évolution de l’insuffisance cardiaque et du développement du cicatriciel pour ces deux modèles. Le nombre d’animaux a été défini en fonction des différentes expériences nécessaires pour étudier le rôle des cellules et protéines d’intérêt au cours des différentes étapes de développement de l’insuffisance cardiaque. Nous avons également pris en compte la mortalité des souris durant les différents modèles. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous allons utiliser le même échantillon pour faire plusieurs analyses ainsi que les autres organes en plus du cœur. De plus, afin d’optimiser le dosage d’une molécule, nous allons mener une étude pilote sur un petit nombre d’animaux. Enfin, l'ensemble de nos résultats seront analysés puis comparés entre eux à l'aide de tests statistiques.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance post-opératoire accrue et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques dans la mesure du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. L'ensemble des chirurgies de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire.
Choix des espèces
Pour des raisons éthiques, la recherche clinique sur la fibrose chez l’Homme est limitée, d’où la nécessité de recourir aux modèles animaux pour élucider les mécanismes mis en jeu. Les modèles cellulaires existants ne permettent pas de mimer une insuffisance cardiaque et ainsi de conserver l’environnement moléculaire et protéique associé. La souris est largement utilisée en recherche biomédicale. Au-delà de l’aspect pratique (reproduction rapide, connaissance du modèle, coût modéré), la proximité de son génome avec le génome humain (80% d’homologie) en fait un modèle de choix. De plus, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’Homme et les populations de cellules sont également les mêmes. Donc, utiliser la souris comme modèle expérimental permettra de mieux comprendre le développement de fibrose et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. De plus, des études précédentes ont déjà été menées sur les souris étudiées dans ce projet au cours du développement embryonnaire, mais ce n'est pas le cas de leur fonction cardiaque au stade adulte. De ce fait, nous étudierons nos cellules d’intérêt au stade jeunes adultes.
Evaluation des effets des substances chimiques (toxicité aiguë) sur le poisson zèbre
- Protection de l’environnement
Déterminer la concentration d'un produit chimique qui tue la moitié d'un groupe de poissons en 96 heures : c'est l'objet de ces essais, pour lesquels 855 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés. 705 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 150 autres un niveau léger. Ils sont plongés dans une eau chargée du produit à tester, sans nourriture pendant les quatre jours de l'essai et sans aucun enrichissement du bac, celui-ci risquant de relarguer des substances. Les survivants exposés sont tués, seuls les témoins pouvant être adoptés, et le porteur indique disposer au laboratoire d'un essai de substitution sur embryons que les autorités ne reconnaissent pas.
Objectifs
La production de substances chimiques n’a cessé d’augmenter depuis le siècle dernier et s’est inéluctablement accompagnée de rejets incontrôlés dans l’environnement, occasionnant de lourdes conséquences environnementales et sur la santé humaine, comme l’ont malheureusement montré de trop nombreuses catastrophes sanitaires et écologiques. Il apparaît donc essentiel de recueillir les informations sur leurs propriétés intrinsèques avant leur mise sur le marché, afin d’évaluer leur dangerosité ou leur innocuité vis-à-vis de l’environnement. C'est dans ce contexte que seront menées des études d'écotoxicité, selon des procédures bien cadrées et spécifiques, afin de s'assurer de l'innocuité des produits chimiques testés sur l'environnement (avant leur mise sur la marché) ou au contraire de révéler leur toxicité. Il s'agira ainsi d'évaluer l'innocuité ou la capacité de substances à générer des effets de toxicité aigüe sur les poissons, dans le but de déterminer, si possible, la concentration létale médiane (CL50), c'est-à-dire la concentration qui tue 50% d’un groupe de poissons après une certaine période d’exposition (96 heures en général).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet rentrent dans le cadre de l'évaluation de l'impact des substances chimiques sur l'environnement, visant à réduire l'utilisation de substances dangereuses pour l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à différentes concentrations de la substance chimique à tester via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Cet essai visant à déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis des poissons, il est probable qu'un certain nombre d'individus meurent au cours de la procédure.
Devenir
Les poissons survivants exposés aux élément d'essai sont euthanasiés en fin de test car ils ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres essais. Les témoins peuvent être adoptés, tout comme les poissons en stabulation non utilisés pour les tests (le cas échéant).
Remplacement
Des essais alternatifs comme par exemple l'essai de toxicité sur embryons de poissons peuvent être mis en place au sein du laboratoire. Toutefois, les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (embryon) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Utilisation du nombre minimal d'individus recommandé (7 par traitement) par la ligne directrice utilisée pour l'essai. Possibilité de mutualiser les témoins négatifs si deux essais réalisés en parallèle. De plus, les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques peuvent être réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ceci permet de vérifier que le modèle poisson n'est pas plus sensible que les autres organismes testés sur la même susbtance (mico-algues et invertébrés) et de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Diverses stratégies d’enrichissement sont mises en place afin d’améliorer le bien-être des poissons au sein de l’environnement dans lequel ils sont hébergés avant les tests (nourriture variée et/ou vivante (exemple : daphnies, artémies…) ; environnement extérieur décoratif (couleur / poster représentation environnement marin ...)). Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Les poissons ne doivent pas être nourris durant l'essai (durée 4 jours). L'environnement n'est pas enrichi durant les tests, car non réalisable techniquement (de plus, aucun élément décoratif ne doit être ajouté afin d'éviter les relargages éventuels de matière), mais dans tous les cas la présence de témoins négatifs (non traités avec la substance) permet de vérifier tout comportement anormal qui ne serait pas lié à la substance à tester. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les poissons utilisés sont au stade juvénile (entre 1 et 3 mois).