Procédures légères

Biopsie de la queue sur tous les souriceaux, six à huit injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, une à deux chirurgies intracrâniennes de quarante minutes à une heure trente, et la coupe des moustaches pendant les périodes d'enregistrement : 1 656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Une partie l'est plus tôt, faute de porter le génotype recherché. Le projet cherche à comprendre comment l'activité neuronale et l'exercice physique, volontaire ou avec apprentissage moteur, favorisent la production de myéline. Sur la réduction, le porteur écrit limiter le nombre d'animaux "au strict minimum" sans donner de calcul, et l'effectif de 1 656 ne reçoit aucune justification chiffrée.

Objectifs

La myéline est une substance isolante qui entoure les prolongements des neurones du cerveau. Dans certaines maladies, la myéline peut être attaquée et détruite par les cellules du système immunitaire. A terme, les prolongements des neurones dénudés de myéline finissent par mourir. Cependant, bien que la capacité régénérative du cerveau soit limitée, une régénération de la myéline est possible dans certaines maladies comme la sclérose en plaques. Malheureusement, cette régénération est incomplète. Le but de ce projet est de déterminer comment l'activité neuronale et l’exercice physique favorisent la production de myéline quand celle-ci est diminuée dans le cerveau. Nous étudierons la capacité à produire de la myéline en réponse à une augmentation de l'activité neuronale et à un type d'entrainement physique qu'il soit simple (exercice volontaire) ou complexe (apprentissage moteur) sur des modèles présentant une baisse de myéline.

Bénéfices attendus

A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant une meilleure production de la myéline peut être très important pour développer des thérapies non-invasives dans des maladies comma la sclérose en plaques.

Procédures

Tous les souriceaux sont soumis à une biopsie caudale afin d'effectuer un génotypage. Nous prévoyons sur un premier groupe d'animaux un traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies. Celles-ci durent entre 40 min et 1h30. Ces animaux seront imagés lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Leurs moustaches seront coupées pendant la période d'enregistrement. Un autre groupe de souris recevra le même traitement alimentaire et seront injectées 8 fois. Dans un troisième groupe d'animaux, nous prévoyons le même traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et une chirurgie. Leur moustachese seront coupées pendant la période d'enregistrement lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Enfin, les animaux restants recevront 7 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (nuisance légère), la coupe des vibrisses (nuisance légère), les anesthésies (nuisance légère) et les chirurgies intracrâniennes (nuissances modérées) vont induire un stress et une possible douleur. Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention et une douleur légère liée à la biopsie de la queue.

Devenir

Certains animaux sont mise à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau.

Remplacement

Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet du comportement animal sur la myéline en temps réel.

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux sera réalisée en limitant ce nombre au strict minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifiquement fiable. Les expériences seront arrêtées si des analyses intermédiaires permettent d’atteindre la significativité statistique. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés, pour comparaisons multiples ou données suivies selon les cas.

Raffinement

Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge a quel il est possible de tatouer les coussinets des phalanges. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, leur diaphragme et leur cœur, 1 880 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de la mutation humaine de la dystrophie myotonique de type 1, activée par un antibiotique ajouté à la nourriture, elles reçoivent une à quatre injections intraveineuses sous anesthésie, deux prélèvements sanguins, des mesures de force d'agrippement, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. Une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie profonde sert à mesurer la force musculaire, la mise à mort suivant immédiatement, avant tout réveil. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe de douleur même après plusieurs mois d'induction du phénotype, et renvoie le bénéfice attendu, un médicament, à un éventuel passage ultérieur en essai clinique.

Objectifs

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse et fonte musculaire, problème de relaxation), cardiaques (trouble du rythme) et neurologiques, particulièrement invalidantes. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et en essais cliniques chez l’homme. L’utilisation de modèles animaux qui reproduisent des symptômes moléculaires et fonctionnels de la maladie est cruciale pour ces études. Un nouveau modèle murin de la DM1 qui exprime la mutation humaine et reproduit les symptômes musculaires a été caractérisé. Ce modèle qui combine les qualités des deux modèles précédemment les plus utilisés va devenir une nouvelle référence pour les études préclinique de composés thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle pour évaluer plusieurs nouvelles approches thérapeutiques innovantes développées par le laboratoire. L'objectif à long terme reste d'identifier un composé thérapeutique capable d'aller en essai clinique chez l’homme et à terme devenir un médicament.

Bénéfices attendus

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l’adulte (1 personne sur 8000 en moyenne au niveau mondial) et est très invalidante. Il n’y a encore aucun médicament pour cette maladie. L’attente des patients pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est la validation de composés thérapeutiques innovants, développés dans notre laboratoire, qui permettraient une amélioration des symptômes spécifiques à la maladie dans le modèle murin, pour ensuite passer à des essais chez l’homme et avoir un médicament spécifique. Les composés évalués dans ce projet pourraient à terme bénéficier, en théorie, à tous les patients atteints de DM1. Par ailleurs, ce projet va également permettre de valider ce nouveau modèle murin comme modèle de référence pour l’évaluation d’approches thérapeutiques qui profitera ainsi à toute la communauté scientifique DM1 et donc accélérer le développement et à la validation d’autres médicaments pour la maladie.

Procédures

Les animaux feront l'objet d'injections en intraveineuse, sous anesthésie. Il y aura, selon les procédures, entre 1 et 4 injections espacées de 2 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Les souris feront également l'objet de prélèvements sanguins. Cette intervention de moins de 5 min se fera deux fois, un début et en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Une partie des animaux fera l'objet d'évaluations fonctionnelles non-invasives (mesure de force d’agrippement, échographie cardiaque, électrocardiogramme, mesure de respiration). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force nécessitant une intervention chirurgicale d’environs 15 min sous analgésie et anesthésie profonde. Cette mesure sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil.

Impact sur les animaux

En présence d’inducteur dans la nourriture, les souris vont développer un phénotype, très similaire à celui des patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d’activité. Cependant nos études montrent que les souris ne montrent pas de problème à se déplacer ou à se nourrir. De plus les souris ne montrent pas de signe de douleur même après plusieurs mois d’induction. Donc les nuisances ou effets indésirables qu’elles pourraient expérimenter seront surtout liés à ce phénotype DM1, que nous cherchons à obtenir, similaire à celui des patients et aux procédures dont elles feront l’objet (pour l’identification à l’animalerie d’élevage ou les procédures du projet). A cause des actes dont elles feront l’objet, les souris pourraient ressentir une gêne au point d’injection/prélèvement, et une détresse légère lors des manipulations (comme la mesure du poids chaque semaine à partir du début du protocole ou la contention pour les injections). Les animaux pourraient également subir un stress thermique dû à l’anesthésie ainsi qu’éventuellement une petite hémorragie temporaire suite au prélèvement sanguin. Concernant les effets indésirables dus au traitement, des versions similaires aux composés qui seront évalués dans cette étude ont déjà tété injectées dans des modèles murins d’autres pathologies musculaires et n’ont pas montré de signes évidents d’effets secondaires délétères.

Devenir

Tous les animaux qui entreront dans ce projet (soit un maximum de 1880 souris) seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des organes atteints. Dans le cas du modèle murin de la maladie que nous étudions (Dystrophie myotonique de type 1), nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles, du diaphragme et du cœur, ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever ces organes. Ces marqueurs moléculaires sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyses de marqueurs sanguins pour déceler une éventuelle toxicité.

Remplacement

Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie (Dystrophie Myotonique de Type 1 ou DM1) sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutique nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation humaine DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés montrant une forte efficacité sans effet délétère seront injectés dans un premier temps en intramusculaire puis par voie intraveineuse dans les souris DM1.

Réduction

Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas les symptômes d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles (études fonctionnelles et analyses moléculaires sur plusieurs organes comme les muscles et le cœur). Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite. Nos études précédentes, ainsi que l’utilisation d’un logiciel de statistiques, nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Ensuite les groupes seront comparés grâce à des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, un maximum de 1880 animaux sera utilisé.

Raffinement

Finalement, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour /nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès illimité à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements suivants : carré de lanière kraft, rouleau en carton, bâtonnet en bois ou abri en carton. Si un animal se retrouve isolé (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage...), il bénéficiera de deux enrichissements et il sera vérifié par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) pour valider ses conditions d’hébergement. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites (spécifiques à chaque protocole mis en place) ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids importante seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Par ailleurs au cours des différentes procédures, tout acte le nécessitant sera accompagné d’une anesthésie et d’un traitement préventif de la douleur. De plus, une surveillance accrue des animaux sera effectuée pendant une à deux heures après chaque acte.

Choix des espèces

L’efficacité d’une approche thérapeutique pour la Dystrophie Myotonique de Type 1 (DM1) doit être validée sur un modèle animal de cette pathologie. A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrits pour la maladie. Cependant seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes (physiologiques et moléculaires) similaires à ce qui est observé chez les patients. L’étude des différents modèles murins a permis la compréhension de plusieurs symptômes observés chez les patients. Dans ce contexte, le modèle murin DM1, utilisé pour ce projet, présente un énorme avantage : il a la mutation humaine qui ne s’active qu’après l’ajout d’un inducteur (ici un antibiotique : la doxycycline) dans la nourriture. Les souris ne présentent donc pas de symptômes pendant les périodes d’élevage. Quand on active la mutation, à l'âge adulte, les souris développent un phénotype similaire à ce qui est observé chez les patients DM1 : caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction et qui donne son nom à la maladie), de la faiblesse musculaire et de forts défauts moléculaires dans plusieurs organes. Aucune mortalité n’est observée. Pour le projet, les souris seront utilisées à l’âge adulte, quand tous les organes, et surtout les muscles, sont bien développés et que la croissance est terminée.

Pour mesurer si l'exercice physique améliore la tolérance d'un antipsychotique, 214 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un groupe reçoit une injection quotidienne de phencyclidine pendant quatorze jours, censée reproduire des symptômes de schizophrénie, puis de l'aripiprazole dans l'eau de boisson, deux séances d'imagerie sous anesthésie générale et un mois de tests comportementaux. Parmi eux, l'inhibition du réflexe de sursaut place chaque souris une trentaine de minutes dans un dispositif qui lui inflige trente sursauts mesurés. 118 souris pourront être réutilisées dans d'autres protocoles, les 96 autres étant tuées par perfusion-fixation pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La schizophrénie est une pathologie psychiatrique fréquente (1% de la population), qui regroupe des troubles multiples, liés à la pathologie elle-même, au style de vie des patients mais aussi aux traitements et au caractère chronique de leur prise. Hormis les troubles directement liés à la pathologie, le style de vie des patients fait souvent empirer la situation (sédentarité, hygiène négligée, troubles du sommeil, mauvaise alimentation…). S’ajoutent à cela les effets indésirables et inévitables des traitements, qui sont généralement des traitements à vie. De façon très intéressante, la plupart de ces problèmes peuvent être en partie contrebalancés par l’activité physique, reconnue pour être un moyen non-pharmacologique très puissant pour améliorer la santé, non seulement physique mais aussi mentale. De plus en plus d’études révèlent que l’activité physique stimule les fonctions cérébrales en augmentant notamment le nombre de cellules gliales, de neurones, de synapses, et de dendrites, et de vaisseaux sanguins. De tels effets sont associés à une amélioration de la cognition et à une augmentation de la résistance au stress, aussi bien chez l’homme que chez l’animal. L’objectif de ce projet est d’une part, d’approfondir dans des modèles murins de schizophrénie l’impact d’un protocole d’entraînement physique sur l’efficacité et la tolérance d’un traitement chronique par l’aripiprazole (antipsychotique le plus prescrit en France) et d’autre part d’appréhender les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces modulations physiologiques. Il s’organise en 2 parties. La première vise à développer un système innovant de suivi de l’activité physique volontaire chez des souris ne nécessitant pas d’isoler les animaux. Il sera d’abord testé chez des souris saines puis chez un modèle animal de schizophrénie (délétion du gène de la sérine racémase), connu pour son hyperactivité. La seconde partie est dédiée au traitement chronique, soit par l’aripiprazole, soit par l’entraînement physique ou les deux, d’un modèle animal de schizophrénie induit par l’administration subchronique de phencyclidine.

Bénéfices attendus

Ce projet préclinique s’inscrit en parallèle d’un essai clinique visant à démontrer les effets bénéfiques de l’activité physique adaptée chez les patients souffrant de schizophrénie. Les données recueillies chez l’animal permettront d’apporter des arguments scientifiques supplémentaires sur les bienfaits de l’activité physique sur le cerveau et sur la prévention des effets secondaires des antipsychotiques. La réalisation de ce programme permettra d’affiner la connaissance des mécanismes d’une part, sous tendant les effets bénéfiques de l’activité physique sur les altérations comportementales, anatomiques, électrophysiologiques et neurobiologiques en lien avec la schizophrénie et d’autre part, d’approfondir les mécanismes d’action synergique entre une telle activité physique et un traitement pharmacologique dans ce contexte. Il permettra enfin de développer de nouveaux outils pour le suivi d’activité physique (roues), avec des applications potentielles dans d’autres pathologies.

Procédures

Dans la première partie du projet, les animaux seront soumis à un suivi d’activité dans les roues durant 3 semaines. Dans la seconde partie du projet, les animaux seront soumis à environ 3 mois de suivi, avec 3 semaines d’induction du modèle, 7 semaines de traitements et 1 mois de tests comportementaux. Le modèle consiste en l’injection sous cutanée (durée : 1 minute) quotidienne d’un psychotrope durant 14 jours consécutifs. Le traitement consiste en l’administration d’un antipsychotique dans l’eau de boisson avec ou sans activité physique (roue). Pendant cette période, 2 sessions d’imagerie d’une heure maximum seront réalisées (anesthésie générale). Des séries de tests comportementaux seront ensuite réalisés, dont une majorité directement dans la cage d’hébergement (Intelllicage). L’inhibition du réflexe de sursaut sera évaluée en une seule session d’une durée d’environ 25 min pour chaque souris. La sociabilité de l’animal sera évaluée lors d’une session de 10 minutes. Enfin, une partie des souris seront mises à mort par la méthode de perfusion/fixation qui dure environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Pour les 2 parties du projet, l’utilisation d’isoflurane par voie inhalée pour l’anesthésie est à prendre en considération par son effet relativement désagréable durant quelques instants au niveau des muqueuses, et par la perte de connaissance qu’il induit. Pour la seconde partie du projet, s’ajoutent les nuisances liées au modèle animal et aux évaluations. Pour le modèle "PCP", outre les aspects stressants des injections quotidiennes de phencyclidine (PCP) (durée d’injection : environ 1 minute), ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie. Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Le traitement antipsychotique n’a pas d’effet aigu notable et l’imagerie est réalisée sous anesthésie générale (1 heure maximum par session). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement lié aux tests comportementaux qui seront réalisés. Les évaluations comportementales en Intellicage sont en majorité des tests d’activité spontanée qui ne sont pas décrits pour induire un stress marqué. Seuls les tests d’impulsivité et la limitation temporelle de l’accès à l’eau peuvent induire un certain stress mais pas de douleur. Pour les autres tests, celui de l’inhibition du réflexe de sursaut peut aussi générer un stress. En effet, les animaux sont placés pour une durée d’environ 30 minutes dans le dispositif et les sons diffusés entraînent des sursauts qui sont mesurés (30 essais).

Devenir

Les animaux de la première partie du projet pourront tous être réutilisés, de même que les 10 « souris stimulus » utilisées dans le test de sociabilité de la seconde partie du projet. Les autres animaux de la seconde partie du projet seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’échantillons biologiques.

Remplacement

Dans la mesure où le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau, facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés, il y a absolue nécessité de réaliser des études comportementales (in vivo). Par ailleurs, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu en imagerie (réduction du volume de certaines structures cérébrales de 10% par exemple) et pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les données seront comparées par des tests non-paramétriques et/ou paramétriques en fonction de leur distribution. La première partie du projet contiendra des mâles et des femelles, afin d’évaluer les différences d’activité entre les sexes mais pour la seconde partie du projet, un seul sexe sera testé (mâles) afin de limiter le nombre de groupes d’animaux. Il est indéniable qu’une comparaison mâle / femelle serait idéale, cependant, cette étude est une preuve de concept et la pathologie cible, la schizophrénie, connue pour présenter des symptômes plus graves chez les patients masculins. Le suivi longitudinal par imagerie IRM permettra aussi de réduire le recours aux méthodes ex vivo.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés régulièrement durant la durée totale du projet afin de les habituer au contact humain. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en permettant de faire de l’activité physique. Le traitement à l’aripiprazole sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage. L’utilisation du système Intellicage permettra de réaliser des tests directement dans la cage d’hébergement en groupe, ce qui réduit le stress des animaux par rapport aux méthodes standards (isolation des animaux pour un suivi individuelle des performances). Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces, l’imagerie et la mise à mort.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, la sérine racémase ainsi que les cibles pharmacologiques des traitements sont présentes chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP et récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques pour l’aripiprazole) et sont caractérisées par une activité fonctionnelle similaires dans les 2 espèces. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), à un âge auquel les grands systèmes physiologiques sont matures. Cela correspond à l’âge d’apparition de la pathologie chez les patients.

Des souriceaux nouveau-nés reçoivent sous la peau un antagoniste de l'ocytocine qui perturbe leur tétée, puis sont tués deux à trois heures plus tard. 496 souris vont être utilisées dans ce projet sur le syndrome de Prader-Willi, 280 dans des procédures déclarées de souffrance légère et 216 de souffrance modérée, avec séparation des souriceaux de leur mère pendant quatre heures pour standardiser leur motivation à téter. Le porteur qualifie chaque injection de nuisance de moins de trois secondes, sans revenir sur le trouble de la tétée qu'il attend de l'atosiban, et les effectifs annoncés dans son texte, 504 souriceaux et 40 femelles, dépassent les 496 individus déclarés dans le tableau des gravités. Les souriceaux sont tués pour le génotypage et la conservation d'organes, les 40 femelles reproductrices le sont parce qu'elles auront environ huit mois et cinq portées derrière elles.

Objectifs

Ce projet porte sur la compréhension des déficits de tétée chez des souris modèles d’une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW) et le rôle d’une hormone, l’ocytocine (OT), comme effet thérapeutique. En effet, il a été montré que l’ocytocine est impliquée dans l’initiation ou le maintien de l’activité de tétée, qu’il y a un dysfonctionnement de cette activité chez les souris modèles Magel2 et que l’administration d’ocytocine rétablit une activité de tétée normale chez ces souris modèle. Ces études précliniques sur souris modèle ont engendré des essais cliniques chez des bébés atteints du SPW qui ont montré une stimulation de l’activité de tétée en présence d'OT. Des travaux précédents suggèrent enfin que chez la souris, l’effet de l’ocytocine est différent entre la première tétée et les tétées suivantes. Les objectifs de ce projet sont donc de caractériser 1) les déficits physiologiques et comportementaux de tétée chez les souriceaux mutants à la naissance, lors de la première tétée et après la première tétée, 2) comment une tétée normale peut être restaurée chez les souriceaux mutants après une administration exogène d’OT juste après la naissance et 3) comment un antagoniste de l’OT peut perturber la tétée chez des souriceaux contrôles. Dans cette étude, nous utiliserons 40 femelles contrôles qui seront réutilisées 3 voire 4 fois pour générer des portées de souriceaux, à l’aide de 10 mâles contrôle et 10 mâles Magel2 au phénotype contrôle (allèle maternel muté mais silencieux). Au total 504 souriceaux et les 40 femelles adultes seront inclus dans une des 4 procédures expérimentales de ce projet.

Bénéfices attendus

Les 3 objectifs permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi chez l'homme (SPW), d’identifier le rôle de l’ocytocine (OT) dans la tétée, d’argumenter l’intérêt d’utiliser l’OT dans le traitement de déficit de succion, de définir les conditions optimales pour traiter les souris modèles du SPW. Cette étude aura des retombées sur le traitement des patients PW.

Procédures

Les injections intrapéritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance malgré la durée très courte de cette intervention (

Impact sur les animaux

Les injections IP d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Les injections sous cutanée d’ocytocine ou d’atosiban sur souriceaux à P0 et P2, et le tatouage des souriceaux de la procédure 1 à P6 peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Concernant les injections d’atosiban (antagoniste de l’ocytocine) elles peuvent en plus provoquer une perturbation de la séquence de tétée (latence de saisie de la tétine, intensité et durée de la tétée) sachant que les animaux sont euthanasié 2-3 heures après l’injection.

Devenir

L’ensemble des souriceaux utilisés dans ce projet (procédure 1-2-3) seront euthanasiés car des prélèvements post-mortem seront réalisés pour le génotypage et la conservation d’organes potentiellement impliqués dans les mécanismes d’action de l’ocytocine. Les 40 femelles allaitantes servant de support à l’étude du comportement de tétée des souriceaux seront euthanasiés dans la mesure ou elles auront environ 8 mois en fin d’étude et auront eu déjà 5 portées.

Remplacement

Nous travaillons sur la physiologie et la physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW). Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur des modèles humains dans un cadre thérapeutique et des modèles souris (Magel2) en fonction des questions posées (faisabilité expérimentale) afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients atteints de ces troubles précoces de la succion.

Réduction

L'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance ou à P2. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour ces tests depuis plus de 10 ans, appuyée par des tests de Puissance montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe pour valider la démarche statistique, en particulier pour les variables analysées à l’aide de test paramétrique ou non paramétriques en fonction de la normalité de distribution des données. Une réduction du nombre d’animaux expérimentés sera dépendante des résultats que nous obtiendrons et qui conditionneront l’intérêt ou non de pratiquer les expériences proposées en procédure 3 avec injection l’OT. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée entre P0 et P2) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Le bien-être et la bonne santé des animaux adultes est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes). Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie seront isolés de leur mère pendant 4h (afin de standardiser leur motivation à téter). Pendant les 4 heures de séparation de leur mère les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux à P0 et P2 et lors du tatouage des animaux de la procédure 1 à P6, un antalgique local sera appliquée sur la peau 5 minutes avant le test pour diminuer la sensation de douleur.

Choix des espèces

Cette étude sur les mécanismes neurophysiologiques du comportement de tétée, nécessite d’évaluer des paramètres de comportement de tétée ainsi que des paramètres neuroanatomiques, donc d’étudier des mammifères, mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles d’animaux modèles de maladies rares chez l’homme (ici souris Magel 2 modèle du syndrome Prader-willi chez l’homme). A ce jour, les rongeurs sont les animaux les plus adaptés à ce type d’étude. Nous étudions l’activité de succion des souriceaux le jour de la naissance (P0) avant et après la première tétée pour mesurer d’éventuels troubles de ce comportement chez les animaux mutants, ainsi qu’à P2 puisqu’il a été montré qu’à ce stade, ces animaux sont les plus discriminants et les plus sensibles au contexte sensoriel (ici l’apport d’OT sur les muqueuses faciales) au cours de la tétée. Nous suivons également un lot de souriceaux durant les premiers 10 jours de vie (observation et prise de poids).