Procédures légères

Un rat par stagiaire et par protocole d'anesthésie, soit 610 rats sur cinq ans, dans des travaux pratiques classés en souffrance légère. Chaque binôme dispose de deux animaux, l'un endormi par injection de kétamine et de xylazine, l'autre par inhalation d'isoflurane, la profondeur de l'anesthésie étant vérifiée par pincement de la patte. Aucun n'est tué dans le cadre du projet. Les rats sont remis en stabulation puis réutilisés, le porteur précisant que ce sera pour des manipulations hors procédure ou pour des procédures sans réveil, et il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est adaptée parce que le suivi de l'anesthésie et du réveil demande "un système nerveux intègre d'un animal vivant".

Objectifs

Les laboratoires de recherche privés ou académiques comptent dans leur rangs de nombreux personnels qui interviennent directement dans la mise en oeuvre de projets scientifiques utilisant des animaux vivants. Ces projets ont pour but d’améliorer à la fois nos connaissances mais aussi la santé humaine ou animale. L’objectif de ce projet, intégré dans une formation agréée chirurgie selon les principes de la directive 2010/63/UE et du décret du 1er février 2013 sur l’expérimentation animale, est d’assurer les compétences des agents pratiquant ou concevant des procédures chirurgicales sur animaux vivants, sur la base de travaux pratiques (TP) chez le rat adulte (Sprague Dawley mâle ou femelle). Du fait des requis pour la formation, aucune méthode alternative non-animale n’est ici adaptée car en effet l'anesthésie nécessite un animal vivant. Les personnels seront formés, lors d’un TP (durée 4h) au cours duquel 2 populations de rats seront anesthésiés. Chaque binome aura a disposition 2 rats qui subiront pour l'un , une anesthésie par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine. et pour l'autre, une anesthésie par inhalation du mélande Air/isoflurane. Les objectifs de ce TP anesthésie sont de pratiquer et gerer les différents protocoles d'anesthésie par injection et inhalation qui comprennent les suivis pré anesthésique ( controles prés-anesthésiques, sédation, inhibition parasymapthique...), per anesthésique (contrôles cardiovasculaire, respiratoire , temperature) et du reveil. Les animaux ne seront pas mis à mort à la fin du projet. Le nombre total d’animaux pour mener à bien ce projet est estimé à 610 rats sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre aux futurs applicateurs ou concepteurs de procédures chirurgicales de maitriser les protocoles pré-per- et post anesthésiques.

Procédures

1 injection systémique préanesthésique de xylazine et d'atropine 20 minutes avant l'anesthésie générale réalisée par injection systémique de kétamine (durée maximale de 1h avant reveil) sur 305 rats 1 injection systémique préanesthésique d'atropine et de carprofene 20 minutes avant l'anesthésie générale réalisée par inhalation air/isoflurane (durée maximale de 1h avant reveil) sur 305 rats

Impact sur les animaux

Dans le cas de l'anesthésie par injection , l'animal subira une injection systémique d'un sedatif (xylazine) plus un parasympatholytique (atropine) qui sera suivie d'une injection de kétamine. Dans le cas de l'anesthésie par inhalation gazeuse , l'animal subira une injection systémique d'un parasympatholytique (atropine) qui sera suivie de l'inhalation du mélange air/isoflurane 2%. Le contrôle de la profondeur d'anesthésie et l'analgesie sera verifée par le reflexe de pincement de la patte. Pour chaque injection, l'animal subira une piqure d'aiguille (douleur légère) lors d'une contention manuelle de quelques secondes (

Devenir

Les rats ne seront pas mis à mort mais remis en stabulation et re utilisés pour des manipulations hors projet/procedures ou dans des procédures sans reveil.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est ici adaptée car en effet l'anesthésie et le suivi du reveil nécessite un système nerveux intégre d'un animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au maximum : 1 animal par participtant /procédure et suffisant lors des travaux pratiques pour l'apprentissage de l'anesthésie dans le cadre de la formation spécifique des personnels concevant ou appliquant les procedures expérimentales chirurgicales.

Raffinement

Les deux procédures sont realisées sous anesthésie générale avec pré-anesthésie et analgésie. Les animaux sont remis en stabulation apres constat du retour des comportements et des parametres physiologiques au niveau avant procédure sous contrôle veterinaire référent.

Choix des espèces

espece utilsée dans les procedures chirurgicales des laboratoires et permettant un apprentissage des procedures d'anesthésie

220 souris porteuses d'une invalidation du gène col4a3 vont être utilisées dans un élevage classé en souffrance légère, expédiées à quatre ou cinq semaines vers un autre établissement où l'expérimentation aura lieu. Celles qui ne portent pas la mutation sont gardées pour maintenir la lignée, et les homozygotes non transférées sont mises à mort avant six semaines, avant que la maladie rénale ne se déclare. Le porteur indique que ces souris développent une perte auditive vers six à huit semaines puis une fibrose rénale vers dix semaines, tout en écrivant qu'elles ne devraient pas en souffrir pendant la période d'élevage. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose ne peut s'étudier que sur "organisme entier" et conclut qu'il faut recourir à l'expérimentation animale.

Objectifs

La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus (durcissement et perte d’élasticité) constatée après agression desdits tissus. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. L’objectif de cet élevage est de produire des souris déficientes de manière homozygote pour le gène col4a3. En effet, le gène col4a3 code pour la chaîne α3 du collagène IV, un composant majeur de la membrane basale des glomérules (unités fonctionnelles du rein). L’invalidation de ce gène chez les souris conduit au développement d’une glomérulonéphrite progressive sur un temps court (environ 10 semaines). Cette déficience permettra d’obtenir des animaux mimant phénotypiquement le syndrôme d'Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale qui seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cet élevage est l’obtention de souris déficientes pour le gène col4a3 qui seront des modèles de fibrose spontannée utilisés dans le cadre d’un projet plus large visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).

Devenir

Les animaux portant le génotype d’intérêt (col4a3 KO et contrôles col4a3 WT) seront expédiés et utilisés dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Les animaux ne portant pas la mutation de manière homozygote et les animaux col4a3 WT non expédiés ne présentent pas de phénotype dommageable, ils seront utilisés pour maintenir l’élevage

Remplacement

Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein du laboratoire demandeur pour la lignée générée ont permis d’obtenir de nombreux résultats. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 220 animaux au phénotype dommageable est nécessaire pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (4 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux mutés de manière homozygote pour le gène col4a3 et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 6-8 semaines seront suivis quotidiennement à partir du sevrage réalisé à 3-4 semaines et ce jusqu'à leur envoi à 4-5 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation : une observation individuelle sera réalisée chaque jour de la semaine selon les critères d’une grille de score. En fonction du score total, des mesures seront mises en place et, notamment, chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront mis à mort avant 6 semaines soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.

Choix des espèces

Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Les souris déficientes pour col4a3 vont notamment être particulièrement adaptées pour l’étude la fibrose rénale car il s'agit d’un modèle mimant le syndrôme d’Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale. Des souris adultes, en âge de procréer pour maintenir l’élevage, seront utilisées. Les animaux envoyés pour expérimentation auront un âge de 4-5 semaines (avant les premiers signes d’expression du phénotype dommageable et du commencement de la fibrose rénale).

Élevés au sol jusqu'à quarante-deux jours avec huit régimes alimentaires différents, 84 poulets de chair subissent une unique prise de sang au sinus occipital, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur reconnaît que l'aiguille peut provoquer une douleur, un hématome et, si elle est enfoncée trop profondément, des lésions cérébrales. Tous sont tués aussitôt après, pour la collecte de leur contenu digestif et de leurs tibias. L'effectif inclut quatre poussins supplémentaires au titre d'une mortalité attendue de 5 %, et l'équation mathématique testée ici est présentée comme un moyen futur de réduire le recours aux animaux non-humains.

Objectifs

L’alimentation des animaux est un élément déterminant de la durabilité des systèmes d’élevage avicoles. Dans ce contexte, de nombreuses études sont menées pour définir des régimes alimentaires au plus proche des besoins des animaux. Ici, nous souhaitons nous intéresser particulièrement au besoin en calcium et en phosphore des animaux, important chez la volaille de chair pour la minéralisation des os et des coquilles chez la poule pondeuse. En effet, les stocks de minéraux et surtout de phosphore sont une ressource limitée sur Terre et dont les rejets ont un impact négatif sur l’environnement. Bien définir les besoins des animaux pour ces constituants a donc des enjeux multiples. Notre étude se focalise ici sur la volaille de chair. Notre objectif est donc d’évaluer la réponse du poulet de chair en finition (dernier stade d’élevage) à la quantité de phosphore disponible dans son aliment en termes de performances de croissance, de minéralisation des os et de digestibilité. Pour cela, nous utiliserons plusieurs aliments divergeant par leur concentration en phosphore et en calcium. Nous souhaitons aussi utiliser cette expérience pour valider un modèle mathématique prédisant la fraction de phosphore, dans l’aliment, absorbable par l’animal en fin de croissance.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des résultats directement valorisables en termes de recommandations alimentaires pour le poulet de chair en finition, tout en permettant d’évaluer la validité d’un modèle mathématique développé pour prédire le phosphore digestible des aliments. En fin de compte, si cette équation atteint un niveau de validation satisfaisant, elle permettra de réduire l’utilisation des animaux en expérimentation animale pour traiter ce type de problématique, en favorisant le recours à un modèle in silico.

Procédures

Les 84 animaux de ce projet seront soumis à une unique prise de sang réalisée sur un animal vigile, d'une durée inférieure à une minute.

Impact sur les animaux

La réduction des teneurs en phosphore dans les régimes les moins riches peut entraîner un ralentissement de la croissance en raison d'une diminution de la consommation alimentaire. La prise de sang effectuée au niveau du sinus occipital peut causer de la douleur en raison de l'introduction d'une aiguille sous la peau et peut même provoquer des lésions cérébrales si l'aiguille est introduite trop profondément. Elle peut également entraîner la formation d'un hématome. La contention des animaux durant la prise de sang est susceptible de provoquer un léger stress dû à la manipulation des individus.

Devenir

À l’issue des prises de sang, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre la collecte de leur contenu digestif et de leurs tibias, afin d'évaluer à la fois dans quelle mesure l'intestin absorbe les minéraux des aliments et le lien avec la minéralisation des os.

Remplacement

La validation d’un modèle mathématique sous la forme d’une équation prédictive de la réponse du poulet de chair au phosphore digestible demande de confronter les résultats de celui-ci à des données enregistrées chez l’animal dans un cadre expérimental contrôlé. À ce jour, seule l’expérimentation animale permet de répondre à ce critère.

Réduction

Au total, 84 animaux sont requis pour ce projet. Nos effectifs ont été calculés sur la base de données publiées dans des journaux scientifiques reconnus. Nous avons estimé que 84 animaux répartis en 8 régimes alimentaires sont nécessaires pour estimer la réponse du poulet de chair à différentes teneurs en calcium et en phosphore. Il est important de noter que notre effectif total inclut un taux de mortalité des poussins de 1 jour de 5 %, ce qui représente 4 animaux supplémentaires.

Raffinement

Raffinement des procédures : Afin de réduire les risques de lésions cérébrales pouvant être associées à la réalisation d’un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu’il positionnera sur son aiguille afin d’éviter toute possibilité d’enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d’injection évite l’arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera effectué pour limiter également la formation d’un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d’une contention appropriée par l’un, pendant que le second réalisera la prise de sang. Ceci permettra de limiter les mouvements erratiques des animaux susceptibles d’engendrer un échec de la prise de sang. L’ensemble du personnel affecté à cette tâche sera composé de personnes habituées à la contention et à la prise de sang sur volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Le prélèvement au sinus occipital permettra de laisser à disposition les veines alaires qui seront utilisées pour l’administration de l’euthanasiant à la suite de la prise de sang. Raffinement de l’hébergement : Les animaux seront élevés au sol avec une litière en copeaux de bois en groupes sociaux pendant toute la durée de l’expérience. Des boîtes en carton offrant des cachettes aux poussins et des perchoirs aux poulets en croissance seront mises à disposition des animaux afin de diversifier leur environnement de vie. Des balles en plastique seront ajoutées dans les parquets pour stimuler un comportement de jeu.

Choix des espèces

Le projet s’inscrit dans une thématique d’alimentation minérale de précision pour le poulet de chair. À ce titre, nous avons choisi de travailler directement sur notre espèce cible. Nous avons donc fait le choix d'utiliser ici des poulets domestiques de leur naissance à 42 jours, ce qui correspond à la durée d’élevage classique d’un poulet de chair en France.

Réformés de la compétition ou de l'élevage et destinés à la boucherie, 100 chevaux vont être hyperimmunisés contre des agents infectieux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit des injections d'antigènes toutes les trois à quatre semaines pendant environ douze mois, puis est saigné trois fois par semaine, jusqu'à 1 % de son poids vif par prélèvement, sur dix à douze mois. Quand leur hématocrite descend sous un seuil fixé avec le vétérinaire, leurs globules rouges leur sont réinjectés pour que les saignées continuent. Soixante-dix sont annoncés comme réutilisés et trente comme replacés, ceux qui ne peuvent l'être étant mis à mort, et le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace aujourd'hui cette production à l'échelle "industrielle".

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccinations satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques pour la mise à disposition de thérapeutiques efficaces. Le projet vise à développer et à produire des traitements contre des maladies infectieuses émergentes (par exemple COVID-19, grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF)). L’objectif de ce projet est de produire, à partir de chevaux hyperimmunisés, des plasmas qui sont ensuite utilisés pour la fabrication pharmaceutique d’anticorps polyclonaux purifiés. Les anticorps de ce projet seront induits contre différents types d’antigènes spécifiques (protéines virales et/ou toxines (bactériennes, animales ou végétales) et/ou bactériennes).

Bénéfices attendus

Les fragments d’anticorps hautement purifiés (fragments F(ab’)2 apportent une solution thérapeutique sûre à des problématiques majeures de santé publique pour lesquelles il n’existe pas d’autre solution. Le projet vise plus particulièrement à développer des produits destinés au domaine de la bio-défense au sens large, mais aussi des thérapeutiques pour le traitement des maladies infectieuses émergentes. Ce projet nécessitera l’utilisation de 100 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront globalement de produire des plasmas qui donneront in fine l’équivalent de 135000 à 215000 traitements individuels contre les risques bio-défense et les maladies infectieuses. La production de plasma par cheval étant assez importante, une partie de ces plasmas sera utilisée pour la mise au point de développement de nouvelles thérapies (développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme). Une autre partie constituera une banque de plasmas pour répondre à des besoins de stocks stratégiques.

Procédures

Deux ensembles de gestes techniques sont effectués chez tous les chevaux du projet. Tous les gestes techniques sont réalisés sur le cheval vigile : → Gestes associés à la technique d’hyperimmunisation: des injections de petits volumes sont effectuées par voie intra-dermique ou sous-cutanée et intra-musculaire toutes les 3 à 4 semaines en moyenne pendant environ 12 mois. La durée de l’injection est de 2 à 10 secondes par animal. → Gestes associés aux prélèvements de sang pour la production des plasmas: • des prélèvements de sang (1% du poids vif maximum) par voie veineuse (à la veine jugulaire) d’une durée de 10 minutes par animal sont réalisés 3 fois par semaines toutes les 3 à 4 semaines sur une période moyenne de 10 à 12 mois une fois que le titre d’anticorps spécifique a atteint le plateau maximum. • Si l’hématocrite du cheval prélevé a atteint un seuil bas prédéfini avec le vétérinaire désigné, il y a ré-administration des globules rouges par voie intraveineuse d’une durée de 20 minutes par animal (technique de « plasmaphérèse ») au maximum 3 fois par semaines toutes les 3 à 4 semaines sur une période moyenne de 10 à 12 mois.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d’effet indésirable attendu associé aux administrations des antigènes car les chevaux utilisés pour le projet suivent un parcours d’habituation avant d’être intégrés dans une procédure d’hyperimmunisation. Une nuisance potentielle attendue, mais rare en pratique, est la baisse d’hématocrite consécutive à la répétition dans le temps des prélèvements sanguins de volumes importants, qui ne dépassent cependant pas les normes réglementaires pour le bien-être animal (1% du poids au maximum).

Devenir

En fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Compte tenu de la variabilité biologique (plusieurs types ou plusieurs variants) des cibles, il est essentiel que les thérapeutiques développées dans le cadre de ce projet aient des efficacités de neutralisation indépendantes des types ou des variants. Cet objectif ne peut être atteint que par la production d’anticorps polyclonaux spécifiques provenant de plusieurs chevaux (synergie d’une réponse polyclonale naturelle avec le mélange de différentes réponses polyclonales individuelles = « polyclonalité polyvalente »). La production en grand volume d’anticorps polyclonaux pour de tels produits pharmaceutiques n’est possible que par l’hyperimmunisation d’animaux de grande taille : bovins ou chevaux. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue pour remplacer industriellement la production d’anticorps polyclonaux avec des titres élevés. Un mélange de plusieurs monoclonaux ne peut remplacer aujourd’hui la « polyclonalité polyvalente » recherchée car cela supposerait la production simultanée de plusieurs dizaines d’anticorps monoclonaux différents.

Réduction

Ce projet inclut plusieurs éléments visant à réduire le nombre de chevaux nécessaires pour chaque cible thérapeutique du projet : • Utilisation d’adjuvants commerciaux permettant une présentation plus efficace de l’antigène et favorisant la mémoire immunitaire, se traduisant par des titres spécifiques élevés. • Utilisation d’un calendrier d’injections optimisant le niveau moyen des titres d’anticorps spécifiques et maintenant le plateau de production d’anticorps le plus longtemps possible • Impact des titres élevés d’anticorps permettant d’augmenter le rendement de purification et donc de réduire indirectement le nombre de chevaux nécessaires à la production des lots de produit thérapeutique. • Le nombre de chevaux utilisés pour un projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Pour chaque nouvelle indication du projet : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. Après cette étape pilote, le volume de plasma nécessaire pour la production des lots thérapeutiques sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement de chaque produit du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés dans des box en groupes sociaux de maximum 12 chevaux fixes dans le temps présentant une aire paillée et une aire d’exercice ouvertes sur l’extérieur. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire qui assure par ailleurs un suivi régulier. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Les contacts répétés avec l’homme contribuent à l’enrichissement. De multiples essais d’accessoires variés n’ont pas été concluants. Ce projet met en œuvre des procédures maîtrisées qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Une amélioration notable par rapport aux projets autorisés précédemment depuis 2017 est l’utilisation d’adjuvants très bien tolérés chez le cheval. Des procédures optimisées sont en place pour l’habituation des chevaux aux injections et aux prélèvements de sang pour réduire le stress lors des opérations de production. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

Le cheval est une espèce animale qui produit en général des titres élevés d’anticorps et qui permet, compte tenu de sa grande taille, de récolter une quantité importante de plasma (respectant pour chaque prélèvement un maximum de 1% du poids vif). Il présente très peu de risques zoonotiques, ce qui limite fortement les problématiques de biosécurité virale dans les plasmas. Les chevaux utilisés pour ce projet sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’anticorps spécifiques est optimale. Ce sont des animaux de réforme (capacité compétition, infertilité…) destinés initialement à la boucherie.

Neuf prises de sang à la veine de la queue en neuf mois, chacune doublée d'un prélèvement de bouse par fouille rectale au cornadis : 56 vaches vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées dans le troupeau. Ces mesures doivent alimenter une base de données nationale sur le méthane que les bovins rejettent en digérant, et valider des indicateurs plus simples à prélever en ferme. Le porteur justifie le choix de l'espèce par le poids des élevages bovins, près de la moitié des émissions agricoles françaises de gaz à effet de serre, face à l'objectif européen d'une baisse de 30 % du méthane d'ici 2030. Réduire le nombre de bovins élevés n'est pas évoqué.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de contribuer à la création d’une base de données nationales incluant des données phénotypiques de bovins de methane entérique obtenues avec un outil de mesure de reference commun à tous les partenaires du projet, et des prédicteurs des émissions de methane (spir fécale, abondance naturelle isotopique, …). Les prédicteurs issus des matrices prélevées sur les animaux du projet permettront de valider les modèles de prediction construits.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet est d’ordre environmental en réduisant de 30% les émissions de methane issues du tube digestif des ruminants d’ici 2030. Le methane contribue à hauteur de 50% aux émissions de gaz à effet de serre à l’échelle d’une ferme.

Procédures

Au cours des 9 mois d'expérimentation (stabulation et pâturage), les animaux seront soumis à 9 reprises à des prélèvements de sang. L'ensemble de la manipulation avec prélèvements (contention + prélèvement) sur un animal durera moins de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Différents prélèvements peu invasifs sont prévus tout au long de l'essai pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des vaches. Il s'agit notamment de prises de sang, effectuées à la veine caudale, de prélèvements de fèces par fouille rectale. Ces prélèvements seront réalisés au cornadis et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation, qui sera toutefois effectuée par du personnel compétent et habitué à ces procédures. La fréquence de prélèvements sera limitée au minimun nécessaire soit 1 prelèvement de chaque matrice en simultané sur le même animal lorsqu’il est au cornadis toutes les 3-4 semaines.

Devenir

Les procédures mises en oeuvre sur les animaux étant de classe légère, les animaux seront gardés en vie et replacés dans le troupeau à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Les expérimentations porteront sur la réponse individuelle zootechnique (ingestion, croissance) et digestive (émissions entérique de méthane, paramètres fermentaires et microbiens) des bovins (vaches allaitantes avec leur veaux) conduits en stabulation ou au pâturage. La mise en place des prédicteurs issus de matrices faciles d’accès sur le terrain pour une utilisation à grande échelle contribue à réduire les contraintes des animaux expérimentaux.

Réduction

D'un point de vue statistique, un calcul de puissance sur la base de données acquises dans de précédentes expérimentations portant sur les émissions de méthane entérique a permis de calculer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour pouvoir mettre en avant des différences de réponses zootechniques d'une part et en terme d'émissions de méthane entérique. Afin de ne pas remettre en cause la validité statistique des tests prévus, un effectif de minimum 22 vaches par lot est nécessaire. Pour pallier quelque éventuel problème pouvant affecter le nombre d'animaux (impossibilité de réaliser un prélèvement, maladie...) à inclure dans les analyses qui suivront l'expérimentation, nous recruterons deux lots de 28 vaches.

Raffinement

Les conditions de logement des animaux en stabulation répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Lors de la saison de pâturage, les animaux seront logés en extrieur, ce qui correspond à leur besoin "normal", tout en leur assurant un confort optimal. Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. En cas de souffrance ou de douleur prolongée à l'issue des prélèvements, les animaux concernés recevront un analgésique en vue d'en atténuer l'intensité.

Choix des espèces

L’objectif de l’Union Européenne de réduire de 30 % les émissions de méthane d’ici 2030, puis d’atteindre la neutralité « carbone » en 2050, nécessite de faire porter les efforts sur l’ensemble des gaz à effet de serre et des secteurs d’activités. En France, l’agriculture représente 19% des émissions de gaz à effet de serre dont près de la moitié provient des élevages bovins lait et viande. Les émissions de méthane entérique, coproduit de la digestion de la cellulose par les ruminants, représentent environ 50% des émissions de gaz à effet de serre d’une exploitation bovine. Le méthane entérique des bovins représente donc près de 5% des gaz à effet de serre totaux français. Les élevages bovins lait et viande sont ainsi confrontés aux objectifs de décarbonation des activités.

107 souris vont être utilisées pour créer une lignée dont les lymphocytes B sont privés d'une protéine du métabolisme, ce qui les rend plus vulnérables aux infections, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune est suivie trois jours par semaine depuis sa naissance et hébergée en cage ventilée pour limiter le risque infectieux que le projet lui a créé. Toutes sont tuées pour que leur moelle osseuse soit prélevée. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, identifier de nouveaux mécanismes du développement des cellules B, et l'effectif de 107 souris n'est adossé à aucun calcul rendu explicite.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment le métabolisme de la cellule permet le bon développement des lymphocytes B du sang, c’est à dire un type des cellules du système immunitaire qui protège l’organisme humain contre les infections. Cet objectif repose sur des résultats préliminaires, ayant indiqué qu’ACLY, une protéine qui régule le métabolisme de la cellule, pourrait permettre le développement des lymphocytes B. L’objectif est de vérifier cette hypothèse grâce aux souris dans lesquelles la protéine ACLY va être inactivée de façon très spécifique dans les cellules B. Pour se faire, les souris génétiquement modifiées seront croisées entre elles afin de générer les souris qui inactivent la protéine ACLY dans les lymphocytes B.

Bénéfices attendus

Ce projet fera progresser les connaissances scientifiques car il permettra d'identifier des nouveaux mécanismes qui expliquent le développement des cellules B su sang

Procédures

Ce projet consiste à créer une nouvelle lignée des souris qui pourraient avoir une susceptibilité accrue aux infections

Impact sur les animaux

Nuisances légères liées au risque potentiel d’infections accrues en cas d’exposition des souris aux agents pathogènes.

Devenir

Les animaux seront mises à mort car la moelle osseuse doit être prélevée et analysée

Remplacement

Les objectives du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement des cellules B du sang se fait dans la moelle osseuse. Cela nécessite la présence d’un micro-environnement qui joue un rôle clef dans le développement de ces cellules du système immunitaire.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: - utiliser une stratégie d’élevage que nous permettra de générer seulement les souris avec les modifications génétiques souhaitées et éviter ainsi de générer des souris qui, n’ayant pas la bonne modification génétique, ne nécessitent pas d’être analysées. - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets - effectuer une étude statistique et des expériences préliminaires qui permettra de déterminer le nombre des souris à utiliser pour obtenir l’information scientifique en évitant la répétition de l’expérience. Cela permettra de réduire au minimum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Nous veillerons à optimiser l’hébergement afin de minimiser le risque qu’une baisse des cellules B puissent rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Pour cela nous allons héberger les souris dans des cages ventilées, qui permettrons de réduire la rencontre avec d’éventuelles micro-organismes. Nous allons aussi réaliser un suivi des souris dès la naissance 3 jours par semaine (lundi, mercredi et vendredi) afin de vérifier qu’il n’ y a pas des signes cliniques liées aux phénomènes infectieux et/ou des signes précoces de souffrance.

Choix des espèces

Le système immunitaire des souris est assez proche de celui des humains. De plus, chez la souris il est possible d'étudier des lignées génétiquement modifiées qui permettent d'étudier finement les mécanismes de développement et de fonctionnement du système immunitaire. Au cours des dernières années, la communauté scientifique a généré deux lignées génétiquement modifiées en utilisant la souris (espèce Mus musculus). Le croisement de ces lignées permettra d’inactiver la protéine ACLY de façon très spécifique dans les cellules B du système immunitaire. Ces deux lignées, qui proviennent de notre élevage, seront croisées dans notre animalerie. Les souris femelles et mâles ainsi générées seront analysées une fois qu’elles auront entre 8 et 12 semaines, c’est à dire l’âge adulte correspondant à un système immunitaire mature.

380 sars à tête noire, capturés au stade larvaire dans les zones portuaires où ils viennent grandir, sont exposés au cuivre pendant trois semaines, 360 d'entre eux répartis à quinze par aquarium de trois litres, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun passe ensuite quinze minutes dans un bassin à deux arènes, où l'on mesure une seule fois le temps qu'il passe près de congénères plutôt que près de saupes. Tous sont tués par surdosage d'anesthésique, l'arrêt des battements du cœur vérifié à la loupe binoculaire, avant les mesures de croissance, de pigmentation et d'expression de gènes. Le bénéfice annoncé est d'améliorer la protection des écosystèmes côtiers où vit cette espèce, et le porteur qualifie le recours à ces larves d'"incontournable".

Objectifs

La majorité des poissons marins ont un cycle de vie découpé en deux parties, composé d’une phase en pleine mer dîte pélagique, où les larves se dispersent et grandissent, suivie d’une phase plus sédentaire, en milieu côtier, où poissons juvéniles et adultes continuent leur croissance. La transition écologique des larves pélagiques aux juvéniles côtiers, ou recrutement larvaire, est primordiale pour le renouvellement des populations de poissons. En milieu marin, les changements climatiques et les pollutions affectent principalement les milieux côtiers où se déroule le recrutement larvaire. Dans certaines zones littorales, la baisse des stocks de poissons est plus la conséquence d’un échec du recrutement larvaire que d’une surmortalité des populations adultes mais les mécanismes biologiques à l’origine des échecs de recrutement larvaire restent méconnus. Nous avons démontré que le recrutement larvaire des poissons marins s’accompagne d’une métamorphose des larves en juvéniles, sous contrôle des hormones thyroïdiennes. Nous faisons l’hypothèse que les stress environnementaux et anthropiques peuvent agir en tant que perturbateurs endocriniens sur les larves de poissons, perturbant leur métamorphose, c’est-à-dire la mise en place des modifications physiologiques, morphologiques et comportementales nécessaires à la survie en tant que juvéniles, causant in fine un échec du recrutement larvaire. Dans un projet récent, nous avons pu révéler différentes concentrations de cuivre dans des zones portuaires de recrutement larvaire du sar à tête noire, Diplodus vulgaris. Dans ce contexte, notre objectif est d'évaluer expérimentalement la toxicité du cuivre sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, à travers des mesures de différents biomarqueurs : 1/ comportementaux (préférences visuelles, vis-à-vis de poissons de la même espèce – conspécifiques – et d’une autre espèce, la saupe Sarpa salpa), 2/ morphologiques (croissance, pigmentation), et 3/ physiologiques (expression de gènes de la métamorphose, taux d’hormones thyroïdiennes). Ce projet permettra d’identifier le potentiel de perturbateur endocrinien d’un polluant commun des zones littorales françaises (le cuivre) sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, afin d’améliorer les mesures de conservation et de protection de ces écosystèmes côtiers.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier le potentiel de perturbateur endocrinien d’un polluant commun des zones littorales françaises (le cuivre) sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, afin d’améliorer les mesures de conservation et de protection de ces écosystèmes côtiers. D. vulgaris a un fort intérêt économique (pêche récréative) et écologique (espèce représentative). Ce projet permettra également de mettre en place une corrélation entre mesures comportementales et mesures physiologiques dont l’objectif est, à terme, de se restreindre aux mesures comportementales et ainsi réduire le nombre d’échantillons biologiques nécessaires aux futures études dans ce domaine.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé. Après exposition à différentes concentrations de cuivre (pour une durée de 3 semaines) les poissons seront transférés individuellement dans un aquarium de choix (aquarium composé de deux arènes identiques, 1 et 2, circulaires, de 30 cm de diamètre, et reliées par un couloir de 5 cm par 5 cm). Dans cet aquarium de choix, les préférences pour des signaux visuels de congénères (signaux présentés dans l'arène 1) versus des signaux visuels de poissons d'une autre espèce (Sarpa salpa, non prédatrice, signaux présentés dans l'arène 2) seront évaluées durant 15 min via une comparaison du temps passé dans chacune des deux arènes. Une seule mesure comportementale sera réalisée par poisson, avant leur euthanasie par surdosage d’anesthésique (balnéation jusqu'à l'arrêt complet des mouvements operculaires et vérification de l’arrêt des battements cardiaques effectué sous loupe binoculaire). Toutes les autres mesures (morphologiques, pigmentaires et physiologiques) seront réalisées sur les poissons après cette euthanasie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié à l'exposition des individus aux polluants. On peut faire l’hypothèse d’un changement de comportement alimentaire et d’une perturbation du développement larvaire avec des retards de croissance et d’apparition du patron de pigmentation, ou à l’inverse, d’une métamorphose plus précoce. Le changement d’aquarium pour les tests de préférence (expérience d’écologie comportementale) peuvent également être source de stress pour les poissons mais sera minimisé par un transfert à l’aide d’un bécher.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de l’élevage afin de procéder aux différentes analyses de morphologie et de biologie moléculaire.

Remplacement

L'étude écotoxicologique comprend des mesures 1/ comportementales (préférences visuelles dans un aquarium de choix), 2/ morphologiques (croissance, pigmentation), et 3/ physiologiques (expression de gènes de la métamorphose, taux d’hormones thyroïdiennes). Il s’agit donc de mécanismes non modélisables car s'appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d'accéder à ce type de données. Par conséquent, il n'existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet et l'utilisation du modèle animal est incontournable.

Réduction

La planification du design expérimental a été faite afin de réduire le nombre d’individus échantillonnés pour l’ensemble des conditions testées permettant une analyse statistique pertinente, c’est-à-dire des triplicats pour chacune des concentrations de cuivre testées (3x4 = 12 aquariums de 3L chacun), et ce dans deux duplicats techniques (2 pédiluves d’expérimentation), soit un total de 24 aquariums contenant chacun 15 larves, soit un total de 360 larves de D. vulgaris exposées. Nous avons pu réduire notre échantillonnage à ce nombre en adaptant notre protocole afin de combiner les mesures comportementales, morphologiques/pigmentaire, et de biologie moléculaire sur les mêmes individus, au lieu d’utiliser 3 groupes d’individus pour ces trois types de mesure. Nous appliquons donc une réduction par 3 du nombre d’animaux prévus dans le cadre de cette experience. Dans le cas où des animaux mourraient durant l’exposition, ces individus ne seront pas remplacés. De plus, ce projet permettra de mettre en place une corrélation entre mesures comportementales et mesures physiologiques dont l’objectif est, à terme, de se restreindre aux mesures comportementales et d’ainsi réduire le nombre d’échantillons biologiques nécessaires aux futures études dans ce domaine.

Raffinement

Les individus seront élevés selon le protocole développé et maîtrisé au sein de notre service d’aquariologie. Ce protocole a été développé pour que le bien-être des individus soit optimal, permettant une bonne croissance et une bonne survie. Notamment, une attention particulière et quotidienne sera portée tout au long de ce projet sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera assuré par un personnel compétent 7J/7J pour l’observation et le soin des animaux. La durée d’exposition a été réduite à 3 semaines, car même si l’ensemble des étapes du recrutement larvaire et de la métamorphose de cette espèce peut prendre jusqu’à 3 mois, nous avons décidé de nous focaliser sur des biomarqueurs dont les principaux changements larves/juvéniles ont lieu dans les 3 premières semaines, afin de réduire la durée d’exposition au cuivre des individus de notre expérience. Bien qu’il n’existe à ce pas encore de grille de scoring officiellement établie chez les poissons, nous examinerons attentivement le comportement de nage afin de déceler tout comportement inhabituel, comme une difficulté de l’individu à contrôler la flottaison, à maintenir son équilibre ou ses trajectoires de nage. Ce comportement individuel sera comparé aux comportements de nage des autres individus de l’expérience.

Choix des espèces

Le sar à tête noire, Diplodus vulgaris, a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. En effet, il s’agit d’un modèle pertinent écologiquement pour l’étude du développement larvaire d’un poisson méditérranéen caractéristique de milieux pouvant être sujet à la toxicité des polluants métalliques. Les zones portuaires constituent un secteur de nourricerie pour les D. vulgaris où l’exposition à de multiples facteurs de stress anthropiques est présente. Ces informations ont pu être confirmées par les suivis et mesures effectuées dans un précédent projet de recherche. Nous travaillons sur la période de transition larve - juvénile chez cette espèce et devons donc capturer ces jeunes stades de vie en milieu naturel, au moment du retour des larves dans les habitats côtiers.

Le cheval étant l'espèce visée par le vaccin en développement, sept chevaux adultes appartenant à l'établissement vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent trois injections sous-cutanées dans l'encolure sur quatre mois, puis subissent vingt-trois examens cliniques et échographiques et dix-sept prises de sang à la jugulaire étalées sur un an, sans sédation, tenus par un simple licol. Le produit, un vaccin ciblant l'interleukine-6 pour prévenir l'arthrose, a déjà été testé sur des souris et des lapins, et vient de passer un essai de phase I chez l'être humain sans effet indésirable rapporté, ce que le porteur juge insuffisant au motif que le cheval est une espèce "particulièrement réactive". Aucun des sept n'est tué : ils restent la propriété de l'établissement, vivent au pré avec leurs congénères et sont comptés comme réutilisables.

Objectifs

L’arthrose est une affection dominante chez le cheval. C’est en effet la principale cause de boiterie, et de baisse de performance ou d’arrêt de carrière des chevaux de course et de sport. D’autre part, chez le cheval on estime que 50 % des sujets de plus de 15 ans présentent des lésions d’arthrose. Cette affection a donc un impact majeur sur le bien-être des animaux. Actuellement la prise en charge de l’arthrose chez le cheval se fait principalement par des soins locaux par injections intraarticulaires (à base de stéroïdes, de thérapie biologiques ou cellulaires), et/ou par l’administration d’antiinflammatoires non stéroïdiens (AINS) par voie systémique. Une des limites de la thérapie locale est la difficulté de mise en place de ce traitement sur un cheval avec des lésions multiples. De plus l’emploi réitérés des antiinflammatoires stéroïdiens par voie intra-articulaire est reconnu comme favorisant la dégénérescence cartilagineuse. Quant aux thérapies biologiques ou cellulaires, leur coût, limite leur utilisation à un nombre réduit d’articulations. Enfin concernant l’emploi des AINS, leur administration au long cours n'est pas possible du fait des effets secondaires observés (ulcères gastriques, risque d’insuffisance rénale) et leur action est uniquement symptomatique. Les moyens permettant une prise en charge des lésions d’arthrose particulièrement lorsqu’elles sont multiples et sur le long cours restent donc limités. Dans ce contexte une société a adapté son vaccin ciblant l’IL-6 chez l’homme pour élaborer un produit spécifique au cheval. Le conjugué équin ainsi obtenu a été testé sur des souris et des lapins et une production d’anticorps anti-IL-6 équine (eIL-6) a été observée. Les résultats avec le conjugué équin étant très satisfaisants chez la souris et le lapin, les objectifs de ce projet sont dans un premier temps de confirmer sa tolérance chez le cheval, d’évaluer son immunogénicité sur cette espèce et de déterminer la dose optimale de conjugué à injecter. A plus long terme, l’objectif est de pouvoir obtenir une alternative thérapeutique pour la prise en charge de l’arthrose au long cours chez le cheval avec le développement d’un vaccin.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à terme est le développement d’une nouvelle thérapie, sous la forme d’un vaccin, pour lutter contre l’arthrose chez le cheval. Cette étude constitue une première étape de ce développement qui va permettre de valider la bonne tolérance et fonctionnalité de ce vaccin en évaluant la réponse immunitaire des chevaux injectés en contrôlant la production d’anticorps anti-IL 6 leur permettant de développer une action anti-inflammatoire propre. Cet effet anti-inflammatoire sera alors évalué pour la prise en charge de l’inflammation chronique du phénomène arthrosique grâce à un essai clinique versus placebo sur un effectif de chevaux atteints d’arthrose. Actuellement les thérapies les plus communément utilisées sont des injections intra-articulaires, soit à base de stéroïdes ou de thérapie biologique (à base de sérum autologue, ou chimique comme le gel polyacrylamide) ou cellulaire (à base de cellules souches mésenchymateuses). La limite des stéroïdes est qu’ils ne peuvent être utilisés de façon réitérée au risque d’avoir un effet délétère sur le cartilage articulaire. Quant aux thérapies biologiques leur coût, et la nécessité de répéter les injections ne permet pas de traiter à long terme un cheval avec plusieurs articulations affectées, ce qui est fréquent notamment sur les sujets âgés, pour lesquels l’arthrose touche 50% d’entre eux. Par ailleurs les traitements systémiques les plus utilisés reste les antiinflammatoires non stéroïdiens qui présentent des effets secondaires notables lors d’administration prolongée (ulcères gastriques risque d’insuffisance rénale). Dans ce contexte le vaccin évalué, représenterait une excellente alternative thérapeutique pour une prise en charge de l’arthrose au long cours chez le cheval.

Procédures

- Des vaccins (piqure sous cutanée) seront réalisés à trois reprises sur les chevaux dans l'encolure : le premier jour, un mois plus tard et quatre mois plus tard. Chaque injection dure 1 à 2 secondes sur animal vigile, non sédaté et sans contention autre qu’un licol, celles-ci étant bien tolérées chez le cheval. - Des examens cliniques généraux (examen physique et dynamique, appétit, transit intestinal, auscultation cardiaque, respiratoire et prise de température) et des examens échographiques de chaque côté de l’encolure au niveau des sites d’injection seront réalisés à 23 reprises sur chaque cheval de l’étude durant sa durée (1 an). Il s'agit plus précisemment des jours J-10, 1, 3, 7, 14, 21, 28, 29, 31, 35, 42, 49, 56, 84, 112, 113, 115, 119, 126, 133, 140, 168 et 336. Chaque examen dure environ 10 minutes, il est réalisé sur animal vigile, non sédaté et sans contention autre qu’un licol. - Des prises de sang à la veine jugulaire de 10 mL à 30mL seront réalisées aux jours J-10, 1, 7, 28, 29, 35, 42, 56, 70, 112, 113 et 119, 126, 140, 154, 168 et 336 soit un total de 17 prélèvements pour réaliser les analyses sanguines sur le même prélèvement. Elles seront réalisées sur animaux vigiles non sédatés, ces actes étant très bien tolérés par les chevaux. Ces prélèvements sont très rapides, moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Lors d’essais de cette immunothérapie ciblant l’interleukine-6, réalisés sur d'autres espèces animales et l’Homme, aucun effet indésirable grave n’a été observé. Cependant, une induration au point d’injection du conjugué a été observée chez certains patients de façon transitoire. Par ailleurs, les contentions, et piqures cutanées dues à l’administration des doses de vaccin d’une part et les ponctions veineuses d’autre part, entrainent un stress d’une durée maximale de 15 minutes par jour de manipulation, comprenant la réalisation de l’examen clinique général, de l’échographie et d’une injection sous-cutanée et/ou prélèvement sanguin (le stress débute à l’entrée du cheval en salle d’examen et se termine lors de sa sortie). Néanmoins, ce stress est limité par le fait que les chevaux sont toujours manipulés par 2 et qu’ils sont habitués au personnel soignant, à la manipulation et à la réalisation d’échographies. Une brève douleur d’une seconde est ressentie au moment du passage de la peau par l’aiguille lors des administrations de vaccins et ponctions veineuses.

Devenir

Les 7 chevaux du protocole resteront dans l’Etablissement Utilisateur dont ils sont la propriété. Ils vivront au pré avec leurs congénères.

Remplacement

Nous souhaitons développer un vaccin qui, à terme, pourrait prévenir et limiter la progression de l’arthrose inflammatoire chez le cheval. Le modèle animal choisi ici constitue donc l’espèce cible de la thérapie. L’immunogénicité du vaccin et la capacité neutralisante des anticorps ont déjà été testés chez la souris et le lapin. La tolérance aux injections et la surveillance de survenue d’éventuels effets secondaires ont quant à eux déjà été évalués dans plusieurs espèces. De plus, la tolérance de la thérapie étudiée ici est déjà en cours de validation dans l’espèce humaine grâce à un essai clinique de phase I qui vient de se terminer et pour lequel aucun effet indésirable n’a été rapporté. Cependant, les résultats obtenus pourraient ne pas être transposables au cheval, puisqu’il existe des spécificités d’espèce et le cheval est une espèce particulièrement réactive. Il est donc nécessaire de réaliser une étude pilote pour obtenir une preuve de concept de la bonne tolérance et de l’immunogénicité de la thérapie dans l’espèce cible du produit à évaluer, avant d’envisager un essai clinique contrôlé et en aveugle sur des cas spontanés de chevaux souffrant d’arthrose.

Réduction

Le nombre de 3 chevaux par dose (10 μg et 50 μg), a été jugé être le nombre minimal pour lequel cette étude pilote permettra de conclure à une bonne tolérance et à une production systématique et suffisante d’anticorps, sans être due au hasard ou à l’individu, compte tenu des résultats déjà acquis dans les autres espèces dont l’homme. Aucune conclusion statistique ne sera réalisée dans cette étude pilote dont l’objectif est, en cas de résultats favorables pour chacun des 3 chevaux (absence d’effets indésirables aux injections et production d’un niveau satisfaisant d’anticorps) de poursuivre par le lancement d’un essai clinique. Il est important de noter que des doses plus élevées ont été testées dans d'autres espèces et n'ont montré aucun signe de toxicité. Par conséquent, nous nous attendons à une bonne tolérance, même à la dose "forte" (50 μg) de notre produit, sur les chevaux testés. Ainsi, en confirmant que les chevaux pilotes de la présente étude réagissent de la même manière que les autres espèces testées avec l’immunothérapie dont l'homme, la dose minimale (10 μg) sera selectionnée pour réaliser une étude d’efficacité de terrain contrôlée et en aveugle sur un effectif de chevaux dont le nombre sera évalué statistiquement. Cependant, si une tendance vers une différence de production d’anticorps était observée entre les deux lots, la dose la plus efficace en termes de génération d'anticorps neutralisants devra être validée dans une étude dédiée.

Raffinement

Les chevaux seront hébergés dans leur environnement naturel (pature avec abris) et en groupe avec leurs congénères. Les actes pratiqués sont tous de classe légère, et pour limiter le stress lors des examens et prélèvements sanguins, ils seront toujours manipulés par 2. Les chevaux appartenant à l'établissement utilisateur, ils sont habitués au personnel soignant, à la manipulation et à la réalisation d’échographies. Par ailleurs, en cas de réaction inflammatoire au niveau des stites d’injection des vaccins entrainant une douleur ou une raideur de l’encolure, des anti-inflammatoires seront adminisrtés et du froid sera appliqué localement. Aucune nouvelle injection de vaccin ne sera réalisée sur le cheval.

Choix des espèces

Le vaccin que nous souhaiterions tester a été développé à des fins de traitement chez des chevaux arthrosiques. Après deux études pilotes réalisées dans d'autres espèces, nous souhaiterions tester l’immunogénicité de notre vaccin chez le cheval. Il est donc nécessaire pour ce projet d’avoir recours au cheval. En effet les résultats obtenus sur d’autres espèces ne pourraient être transposables directement à l’espèce cible, puisqu’il existe des spécificités d’espèce sur le système immunitaire. Il est donc nécessaire dans le cadre de cette étude de travailler avec l’espèce cible du produit à évaluer. Les chevaux utilisés sont des adultes (≥ 3 ans). Le traitement étudié étant destiné à être utilisé chez l’adulte il est préférable pour cette étude de choisir des animaux de l’âge cible. Par ailleurs, pour la facilité des manipulations il est souhaitable d’avoir des chevaux débourrés donc adultes.