Procédures légères

581 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger. Chacune reçoit sous anesthésie générale une administration de médicament directement dans la trachée ou dans une veine, puis un prélèvement de sang, avant d'être tuée pour que ses organes soient dosés. Aucun animal n'est infecté, le projet mesurant seulement où se dépose la poudre inhalée et à quelle concentration, les retombées annoncées contre la grippe et la Covid-19 restant à distance de cette étape. Le porteur indique avoir déjà évalué les formulations sur un impacteur multi-étages qui reproduit approximativement l'appareil pulmonaire, mais juge le passage chez l'animal "incontournable" faute d'y retrouver le mucus et les échanges gazeux.

Objectifs

Les infections virales respiratoires telles que la grippe ou la Covid-19 restent l’une des principales causes de décès dans le monde et l’émergence de nouvelles souches virales continue d’être une préoccupation majeure. Il n’existe actuellement aucun médicament efficace contre les coronavirus et le virus de la grippe A. La vaccination constitue pour l’instant la stratégie préventive la plus efficace. Cependant, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin associée à la dérive génétique des virus et à la réticence actuelle des populations à l’égard des vaccins peut compromettre cette stratégie. Par conséquent, il est nécessaire de développer des médicaments antiviraux innovants pour traiter et soigner les personnes infectées. Les virus n’ont pas de métabolisme propre et ne sont pas capables de se reproduire sans l’aide d’une cellule étrangère qu’ils infectent et dont ils utilisent la machinerie pour se multiplier. Ces cellules deviennent des usines à virus et sont détruites lors de la libération des nouveaux virus. L’objectif global du projet est d’explorer une nouvelle stratégie qui au lieu de cibler le virus lui-même, s’appuie sur les médicaments modulant le métabolisme cellulaire des cellules hébergeant le virus pour renforcer la réponse immunitaire innée et empêcher la croissance virale. Des liens essentiels entre le métabolisme et l’immunité ont été découvert récemment. Donc interférer avec les voies métaboliques en utilisant des médicaments pour empêcher la croissance virale est une stratégie intéressante pour développer des antiviraux dirigés contre l’hôte. L’équipe a montré que certains métabolites des cellules inhibent fortement l’infection par le virus de la grippe A et du SARS-CoV-2 in vitro et in vivo. Sur la base de cette découverte, une série d’analogues sélectifs et plus puissants que les molécules naturelles ont été conçus et synthétisés. Des poudres sèches pour inhalation pour administrer ces composés (molécules naturelles et analogues) directement dans les voies respiratoires ont été développées. La voie pulmonaire est hautement souhaitable car elle permet de délivrer des doses plus élevées au site même de l’action du médicament et de réduire les potentiels effets indésirables systémiques. L’objectif de ce projet est maintenant d’évaleur la pharmacocinétique et la biodistribution de ces poudres in vivo sur un modèle animal sain.

Bénéfices attendus

La crise du Covid-19 a mis en évidence l’importance des maladies virales émergentes dans un contexte de mondialisation des flux, notamment des personnes. Cette crise sanitaire a souligné l’absence de traitement efficace contre les infections virales aiguës transmises par l’air, responsable de la majorité des infections virales mortelles. Nous parvenons actuellement à contrôler le SRAS-CoV-2 et la grippe A grâce à la vaccination mais des épidémies avec de nouveaux variants ou de nouveaux virus se produiront certainement dans les années à venir. L’impact humain, social et économique de médicaments antiviraux innovants est donc considérable. Le développement de formulations sous forme de poudre sèche pour délivrer localement par inhalation les antiviraux dans les poumons permettrait une administration aisée et ciblée des tissus respiratoires, lieu de l’infection et de diminuer les effets secondaires systémiques potentiels.

Procédures

Chaque souris subira sous anesthésie générale une administration de médicament soit par voie intratrachéale (dans les poumons) soit par voie intraveineuse et un prélèvement de sang sous anesthésie générale à la fin de la procédure. La durée de ces gestes n’excèdera pas une minute chacun.

Impact sur les animaux

Les souris peuvent subir un inconfort modéré et transitoire pendant et après l’administration des formulations. Un léger stress peut être induit au moment de l’anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes et le sang pour des dosages des médicaments.

Remplacement

La performance aérodynamique des formulations a été évaluée in vitro à l’aide d’un impacteur multi-étages qui permet une modélisation approximative de l’appareil pulmonaire. Cette technique permet de répondre à des exigences réglementaires et de déterminer la quantité de poudre qui atteint les différents segments du poumon, notamment d’évaluer la fraction respirable d’un médicament inhalé qui correspond aux particules les plus suceptibles de se déposer dans les alvéoles pulmonaires (particules

Réduction

Une étude pilote sur un petit nombre d’animaux permettra d’affiner les différents paramètres de la pharmacocinétique et de valider le modèle. Le nombre de formulations testés in vivo dans ce projet a été limité à trois grâce à des études préliminaires in vitro pour réduire le nombre d’animaux. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide du logiciel GPower qui est un outil permettant de calculer des analyses de puissance statistiques et de définir le juste nombre d’animaux à inclure dans une étude afin de pouvoir exploiter les résultats de façon statistiquement fiable. Les animaux seront alloués aux groupes expérimentaux par randomisation. Les données obtenues à partir de chaque animal seront maximisées. Les organes seront prélevés et congelés pour des études ultérieures.

Raffinement

L’ administration de poudre dans les poumons ou l’injection de la substance active sous sa forme soluble ainsi que les prélèvements de sang s’effectueront sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Les volumes d’air administrés ne dépasseront pas le volume courant des poumons. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure qui dure 24h et des points limites adaptés seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi de tubes en cartons et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid.

Choix des espèces

La pharmacocinétique se fera sur des souris afin de pouvoir comparer nos résultats avec des études déjà effectuées sur cette souche par les équipes partenaires du projet. Nous utiliserons des souris entre 7 et 15 semaines car leur appareil respiratoire aura atteint sa taille adulte et leur système immunitaire dont les cellules peuvent interférer avec les composés administrés sera mature.

Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.

Objectifs

Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.

Bénéfices attendus

L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.

Procédures

Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.

Remplacement

L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.

Réduction

L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).

Raffinement

Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.

Rendus à leur élevage à l'issue d'un unique prélèvement, 16 bovins subissent une intubation oro-ruminale de vingt minutes au maximum pour recueillir du contenu de leur rumen. Le geste peut provoquer une toux, qui cesse au retrait de la sonde, et relève d'un niveau de souffrance léger, aucun produit ne leur étant administré. Le contenu prélevé alimente des tests de fermentation en éprouvette destinés à mesurer l'effet de plantes ou d'extraits végétaux sur la production de méthane. Ces essais répondent à la sollicitation d'acteurs de l'industrie agroalimentaire, l'objectif affiché étant de réduire les émissions des bovins tout en maintenant leur productivité.

Objectifs

Le méthane (CH4) émis par les ruminants est le principal responsable des émissions de gaz à effet de serre provenant de l'agriculture. Il provient en grande partie des fermentations par le microbiote ruminal. Réduire les émissions de méthane constitue un défi environnemental majeur et donne lieu à des initiatives politiques. Lors de la 26ème conférence des Parties (COP26) sur le climat qui s'est tenue en 2021, l'Union Européenne a lancé en partenariat avec les États-Unis l'engagement mondial concernant le méthane, dans le cadre duquel plus de 100 pays se sont engagés à réduire leurs émissions de méthane de 30 % d'ici à 2030 par rapport aux niveaux de 2020. Dans cette optique, des recherches sont activement menées pour trouver des stratégies permettant de réduire les émissions de méthane des bovins, tout en maintenant leur productivité et leur santé. Certaines solutions nutritionnelles pourraient moduler la structure et la composition du microbiote ruminal, ainsi que les processus de fermentation, limitant ainsi le méthane produit. Nous avons été contactés par plusieurs acteurs de l’industrie agroalimentaire pour tester la capacité de différentes plantes ou extraits de plantes à réduire la méthanogenèse. Les premières étapes de sélection des produits seront réalisées in vitro, lors de différents tests de fermentations. L’objectif de chaque test sera de mesurer et comparer, in vitro, l’effet de différents produits, à différentes doses, sur la cinétique de production de méthane d’un écosystème ruminal.

Bénéfices attendus

Les produits testés lors des tests de fermentation in vitro dans ce projet, pourraient permettre de réduire les émissions de méthane par les bovins tout en maintenant leur productivité et leur santé.

Procédures

Chaque animal ne subira qu'un seul prélèvement de contenu ruminal par intubation oro-ruminale de 20 minutes maximum.

Impact sur les animaux

L'intubation oro-ruminale pour le prélèvement de contenu ruminal peut parfois provoquer une toux qui cesse alors dès le retrait de la sonde.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie et resteront dans leur élevage à l'issu de cette prodécure, car leur santé ne devrait pas être affectée. Aucun produit ne leur sera administré au cours de ce projet, ils ne subiront qu'un prélèvement de contenu ruminal.

Remplacement

Afin de pouvoir réaliser les tests de fermentation in vitro, du contenu ruminal de bovin est nécessaire. En effet, il n'est pas possible de reproduire la complexité de l'écosystème ruminal sans partir d'un échantillon prélevé sur des animaux vivants.

Réduction

Ces essais menés in vitro permettent d'utiliser un nombre réduit d'animaux en comparaison d'essai in vivo qui nécessiteraient des cohortes bien plus importantes. Etant donné les variations inter-individuelles de l'écosystème ruminal bovin, du contenu ruminal de trois animaux est nécessaire pour la préparation de chaque inoculum. Quatre animaux seront donc inclus dans chaque test de fermentation, au cas où un animal ne pourrait pas être prélevé. Cependant si les trois premiers bovins peuvent être prélevés, le quatrième ne sera pas utilisé.

Raffinement

La collecte de contenu ruminal est un geste couramment pratiqué dans la médecine vétérinaire qui ne nécessite pas d'analgésie ou de sédation. Pendant le prélèvement, les animaux seront pris au cornadis comme ils en ont l'habitude lorsque des gestes techniques doivent être réalisés (par exemple administration de vermifuges ou prophylaxie). Pratiquer le prélèvement dans un environnement où les animaux ont l’habitude d’être manipulés permet d’éviter une source de stress supplémentaire. De plus, pour éviter un stress trop important de l'animal, le prélèvement sera stoppé au bout de 20 min même si la quantité de contenu prélevé n'est pas suffisante. Ces prélèvements seront réalisés par un vétérinaire formé à l'expérimentation animale et ayant l'habitude de travailler sur bovin. Il utilisera une sonde souple d’un diamètre adapté à l’œsophage, et d’une longueur permettant d’atteindre le rumen en laissant une partie assez longue à l’extérieur pour suivre les éventuels mouvements de la tête de l’animal sans le contraindre.

Choix des espèces

Les essais doivent nécessairement être conduits avec des bovins, car il s'agit de l'espèce cible du produit testé et la composition du microbiote ruminal est propre à chaque espèce. Les animaux utilisés seront adultes car à ce stade physiologique la fermentation ruminal est bien implantée et fonctionnelle.

Réutilisés jusqu'à trois fois, 8 lapins sont utilisés pour nourrir des tiques déposées sur leurs oreilles sous anesthésie, cinquante nymphes ou dix couples d'adultes par oreille, avec une collerette maintenue pendant le gorgement. 200 souris reçoivent chacune cinquante à cent larves et restent isolées jusqu'à sept jours avec un enrichissement appauvri, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souris sont tuées après la collecte des tiques, faute d'être réutilisables ou adoptables selon le porteur, alors que quatre lapins sont réutilisés et quatre adoptés. Sur le remplacement, il décrit des systèmes de gorgement artificiel jugés prometteurs mais pas encore prêts, avec 57 % de femelles pondeuses, et annonce une veille documentaire régulière.

Objectifs

Le but de ce projet est de maintenir une lignée de tique, afin de disposer de lignées de laboratoire au fond génétique commun. Ces tiques constituront un matériel pour : - Analyser la transmission de différents microorganismes aux animaux. En effet, bien que l'inoculation des microorganismes soit possible à la seringue, celle-ci reproduit de façon très imparfaite la transmission des agents infectieux par les tiques et ne permet pas de l’étudier. - Elles permettront également d’analyser les déterminants susceptibles de provoquer une attractivité plus importante des tiques chez certains individus.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de maintenir pour fournir des tiques possédant un fond génétique commun afin de réaliser plusieurs expériences dont les principaux axes sont les suivants : - Étude des déterminants favorisant l’attractivité des tiques. Chez les moustiques, une attractivité différentielle entre individu a été mise en évidence. En effet, certains individus sont plus « attracteurs » que d’autres définissant ce que l’on peut appeler une « peau à moustiques ». Les déterminants chimiques de cette attractivité sont en partie connus et seraient liés au microbiote cutané. Empiriquement, une attractivité différentielle entre individus est observée pour les tiques. Les déterminants de cette dernière demeurent inconnus. Un des buts de l’élevage est d’étudier les déterminants de cette activité in vitro en utilisant les tiques de l’élevage. - Mesure de la compétence vectorielle et analyse de la transmission des microorganismes. Les tiques hébergent différents microorganismes susceptibles d’être transmis à l’homme. Disposer de tiques de laboratoires dont le fond génétique est commun et maitrisé permet de savoir si ces microorganismes sont d’abord effectivement transmis lors du repas sanguin, c’est-à-dire si cette espèce est un vecteur compétent. Une fois la compétence vectorielle affirmée, nous nous intéresserons aux modalités de cette transmission (localisation des microorganismes lors des phases de diapause des tiques ou lors du repas sanguin), ainsi qu’aux déterminants permettant cette transmission. Pour cela les tiques seront nourri sur animaux porteur du microorganisme d’intérêt. Ces projets feront l’objet d’autorisations spécifiques séparées de la présente saisine.

Procédures

- Lapin : dépôt des tiques (50 nymphes ou 10 couples d’adultes/oreille) confection du manchon en tissu et fixation à l’aide d’un sparadrap médical. Gestes réalisés sous anesthésie générale (protocole décrit dans la procédure - Souris : dépôt des tiques (50 à 100 larves/individu) sur animal vigile. La durée de gorgement est de maximum 10 jours pour les lapins et de maximum 7 jours pour les souris.

Impact sur les animaux

Concernant les lapins les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin, des réactions inflammatoires locales à la piqure de tiques peuvent s’observer jusqu’à 4 semaines après le repas sanguin : - inconfort lié au port de la collerette - irritation du cou à cause du port de la collerette et irritation de la base des oreilles - au site de piqure, les tiques peuvent provoquer une réaction inflammatoire locale susceptible de démanger le lapin. - Les procédures peuvent induire de la fièvre. Concernant les souris, les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin et correspondent à des réactions locales inflammatoire à la piqure des tiques. A noter que lors du repas sanguin (5-7 jours) les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri. Un tunel transparent et un barreau à rongé seront néanmoins à leur disposition.

Devenir

Concernant les lapins, il n'ont pas été en contact avec des tiques porteuses de microorganismes, les lapins peuvent petre adoptés. De plus, ils ont été en contact avec l'homme pendant leur vie. Il font d'excellent candidats à l'adoption. Concernant les souris, elle ne peuvent être réutilisée et son difficilement adoptable, elles seront donc mise à mort.

Remplacement

Les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, bien qu'étudiés, ne sont pas encore commercialisés et présentent des limites qui empêchent le remplacement des hôtes animaux pour l'élevage de tiques. Des travaux, montrent que le nourrissage artificiel nécessite une grande expertise, avec des résultats variables avec seulement 57% des femelles qui ont pondu. Des recherches similaires confirment ces résultats sans pour autant détailler l'efficacité sur les générations successives ou le taux de développement des tiques. Les comparaisons entre les tiques nourries artificiellement et celles sur des hôtes animaux révèlent des taux de réussite inférieurs pour la reproduction et le nourrissage dans le cas d'un nourrissage artificiel. Une étude apporte une contribution significative en explorant tout le cycle d'Ixodes ricinus mais soulève des questions sur l'approche statistique utilisée et l'impact des antibiotiques sur le microbiote des tiques, un aspect crucial pour la conservation de lignées en laboratoire. En conclusion, bien que prometteurs pour certaines recherches, les systèmes de nourrissage artificiel ne sont pas encore prêts pour remplacer l'élevage sur animaux en laboratoire. Une veille scientifique sur le site de l’ECVAM concernant ce point sera régulièrement réalisée et présentée en SBEA.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés pour le maintien de l’élevage de tiques est minimisé au mieux. L’expérience des années précédentes sur l’élevage de tiques ainsi que l’expérience de nos collègues de Neuchatel nous permet d’estimer à 100 souris/an et 4 lapins par an pendant la durée de ce protocole. Afin de minimiser l'utilisation des lapins, ils seront utilisés 3 fois.

Raffinement

Durant la procédure, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 7 jours. Les lapins, quant à eux, suivent un entraînement bi-quotidien de 20 minutes incluant la contention, l'habituation à des manipulations et à la collerette, et l'introduction de récompenses pour encourager les comportements désirés. En outre, ils bénéficient de minimum une heure d'activité quotidienne dans un enclos de 1m² pour leur bien-être physique. Pour le dépôt des tiques, une sédation est administrée aux lapins. Cette approche assure le bien-être animal tout en facilitant les procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et les nymphes de tiques. Les lièvres ou les lapins sont piqués par des tiques (toutes les stases, y compris les femelles) dans la nature. Le lapin de laboratoire constitue donc une bonne alternative pour le repas sanguin des stases nymphales et adultes et les souris permettent le gorgement à la fois des nymphes et des larves. A noter que nous allons privilégier les lapins pour les stases nymphales car ces derniers sont réutilisés et adopté au terme des procédures. Cela limite donc le nombre de souris. Age pas d’impact. Nous pourrons utiliser les animaux disponibles à l’animalerie

3 000 lapereaux subissent une biopsie de tissu, répétée une fois à une semaine d'intervalle, pour trier ceux qui portent la modification génétique permettant de produire un médicament dans le lait de lapines. Ils relèvent d'un niveau de souffrance léger, la biopsie provoquant une douleur légère et un stress transitoire à la préhension, sur des animaux âgés de cinq à douze jours. Le remplacement de la biopsie d'oreille par un prélèvement de follicules pileux est à l'étude dans l'établissement, sans être assez avancé pour arrêter les biopsies. Les lapereaux reconnus non transgéniques sont tués au plus tard au sevrage, le porteur invoquant un risque de modification génétique partielle ou non détectable, tandis que les transgéniques sont gardés pour la reproduction et la traite.

Objectifs

Notre objectif est de produire des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et nous produisons ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet a pour objectif de génotyper des lapereaux que nous créons par transgénèse ou par croisements, afin de déterminer ceux qui portent la modification génétique souhaitée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de connaitre le statut génétique des animaux que nous générons pour notre objectif final : produire des protéines recombinantes pour soigner l’Homme, dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet participe donc à la production de protéines médicaments dans le lait de lapines pour soigner des maladies rares humaines.

Procédures

Les lapereaux subiront un prélèvement minime de tissu (1 à 2 fois selon les résultats, à 1 semaine d’intervalle).

Impact sur les animaux

La nuisance attendue sur les animaux est la douleur, légère, due à la biopsie, ainsi qu’un stress léger et transitoire lors de la préhension pour biopsie.

Devenir

Les lapereaux déterminés comme non transgéniques seront euthanasiés, au plus tard au moment du sevrage, car il subsiste toujours un risque de modification génétique partielle ou non détectable dans ces animaux. Les lapereaux transgéniques seront gardés pour être mis en reproduction, pour obtenir du lait des femelles. Leur matériel génétique sera cryoconservé sous forme de sperme ou d'embryons.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques permet de produire des protéines de structure complexe, compatible avec leur utilisation chez l’humain comme médicament. Le médicament que nous avons produit à partir de nos lapines transgéniques est plus efficace et plus sûrs que « concurrents » car il n’est pas dérivé du plasma humain, n’entraine pas une surexposition du corps à de trop fortes concentrations car son élimination est rapide, ne contient pas d’autres protéines que celle souhaitée ni de virus ou protéines potentiellement dangereux. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines similaires à celles de l’Homme, (en quantité et qualité) ce qui est permet une meilleure efficacité du traitement auprès des patients, ce qui n’est pas le cas des protéines produites par des bactéries ou des levures. Nous travaillons actuellement sur le remplacement de la biopsie d’oreille par le prélèvement de follicules pileux mais nos travaux ne sont pas encore finis. Nous n’avons pas testé à ce stade assez d’échantillons pour pouvoir arrêter les biopsies d’oreilles.

Réduction

Pour l'optimisation de la production des protéines, nous avons mis au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous testons tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir présélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule. Cela nous permet de diminuer le nombre total d’animaux utilisés et de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Lorsqu’une portée nait, il ne nous est pas possible de réduire le nombre d’animaux à génotyper, car nous sommes dans l’attente d’obtenir un ou des animaux transgéniques. En revanche, nous sommes très attentifs à ne pas créer inutilement des portées à génotyper, préférant garder des animaux transgéniques dont nous n’avons pas besoin sur le moment, plutôt que de générer une nouvelle portée si le besoin apparaissait plus tard. Il s’agit ici d’une gestion raisonnée, mais aucune approche statistique n’est utilisée.

Raffinement

Les lapins sont surveillés quotidiennement et des points limites précoces sont strictement appliqués. Ils reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher, un de leur comportement naturel. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Depuis quelques mois, nous avons abandonné l’identification par tatouage. Tous les lapereaux sont contrôlés au minimum une fois par jour, le matin après le passage de la mère dans le nid pour l’allaitement de sa portée. Nous vérifions si les lapereaux ont bu le lait de leur mère par la présence d’ une poche de lait dans leur abdomen. S’ils n’ont pas bu ou pas assez, nous préparons de l’allaitement artificiel ou leur donnons du lait d’une autre lapine afin de les complémenter. Nous pouvons également faire adopter les lapereaux issus de trop grandes portées par une femelle ayant eu une portée plus petite.

Choix des espèces

Pour la production de protéines recombinantes dans le lait, le lapin a été choisi par notre société car : - courte période de gestation (30 jours), - maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), - important volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), - synthèse de protéines complexes et en quantité importantes par la glande mammaire (glycosylation et gamma carboxylation similaires à celles de l’Homme). Les animaux seront utilisés très jeunes : le prélèvement invasif aura lieu entre 5 et 12 jours de vie. Il est impératif de savoir rapidement si un animal est transgénique dans le but de planifier ou non de nouvelles procédures ou des accouplements.