Procédures légères

79 950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une biopsie d'oreille au poinçon de deux millimètres ou une prise de sang, contention comprise, en une trentaine de secondes. Aucun anesthésique ni analgésique n'est prévu, le porteur estimant la douleur aiguë mais limitée à deux secondes environ. Ces prélèvements servent au génotypage de lignées de souris immunodéficientes élevées en vue d'être utilisées dans d'autres projets, et le porteur indique qu'une méthode non invasive sur poils ou salive sera privilégiée quand elle sera au point. Une partie des souris est gardée vivante selon les génotypes recherchés et les besoins de reproduction, les autres sont tuées faute de génotype utile, en fin de reproduction, ou parce qu'aucune procédure ne les attend.

Objectifs

Il concerne donc toutes les méthodes de prélèvements invasives d’échantillons en vue des génotypages (biopsies oreilles ou prélèvements sanguins) ainsi que l’hébergement de souris immunodéficientes. Le génotypage des animaux est indispensable afin de définir le génotype de chaque individu, ce qui permettra par la suite d’identifier les animaux qui seront utilisés en reproduction ou à des fins scientifiques dans le cadre de projets/procédures de recherche autorisés. A terme, lorsque la technique de génotypage sur échantillon de poils ou salivaire sera mise au point et que cela sera possible techniquement, une méthode non-invasive sera privilégiée.

Bénéfices attendus

Pouvoir fournir des animaux d’intérêts de lignées de souris génétiquement altérées qui seront utilisés dans les différentes procédures expérimentales des projets autorisés. De manière à atteindre les objectifs scientifiques dans les domaines de l’inflammation, du cancer et de l’infectiologie.

Procédures

Biopsies oreilles : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague) Prélèvements de sang : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague)

Impact sur les animaux

Les nuisances pouvant être causées aux animaux sont : - le stress lié à la contention (environ 30 secondes) - la douleur, aigue mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille (environ 2 secondes) ou au point de ponction pour le prélèvement sanguin (environ 2 secondes)

Devenir

Les animaux sont gardés en vie, en fonction des procédures expérimentales en cours, des génotypes d’intérêts ainsi que des besoins en reproduction. Les animaux mis à mort concernent les animaux ayant un génotype ne présentant pas d’intérêt, arrivant en fin de reproduction, n’étant pas inclus dans une procédure expérimentale.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal est incontournable dans certains projets des équipes de l'institut. En effet, la nature des travaux qui sont menés imposent le choix du modèle murin, dans la mesure où les processus développementaux étudiés ne peuvent être abordés dans leur complexité physiopathologique dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro.

Réduction

Une gestion raisonnée des accouplements est mise en place au sein du service de zootechnie. Nous adaptons au mieux le schéma de reproduction en fonction de la spécificité de chaque lignée et/ou des besoins expérimentaux. Cela ayant pour objectif de limiter au maximum la production d’animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Le personnel étant formé et sensible au bien-être animal et les animaux habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. De plus, toutes les mesures sont prises lors des gestes techniques afin de minimiser au maximum les dommages causés aux animaux. Le matériel est adapté à l’espèce et la taille ou le volume de prélèvement est minimisé (poinçon de 2 mm pour la biopsie d’oreilles et volume de 50µl pour le sang). Tous ces éléments font qu’il n’est pas prévu d’utiliser d’anesthésiques volatils, d’analgésique et/ou anesthésique local.

Choix des espèces

Le modèle murin offre plusieurs avantages : 1) sa génétique est bien connue ce qui permet une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques et développementales fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu et est à maints égards semblable au système immunitaire humain. Les animaux seront prélevés au sevrage soit entre 21 et 27 jours pour les biopsies d’oreilles et à partir de 28 jours pour les prélèvements sanguins.

Tuées à l'issue pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques du cerveau, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris portent des mutations humaines qui leur font surproduire une protéine toxique et développer les marques précoces de la maladie d'Alzheimer, hyperactivité neuronale puis plaques séniles. Elles reçoivent une injection quotidienne dans l'abdomen, dès le quatorzième jour après la naissance et jusqu'à l'âge de trois mois, d'une molécule dont une première étude préclinique a déjà été menée sur le même modèle. Le porteur indique que la revendication a été brevetée et attend de ces travaux qu'ils confirment une stratégie susceptible d'"intéresser les industriels pharmaceutiques".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans cette efficacité et nous souhaitons également tester d'autres inhibiteurs de la même famille afin de confirmer que ce traitement pourrait se révéler être une nouvelle stratégie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer et intéresser les industriels pharmaceutiques. Les molécules testées diffusent dans le cerveau et peuvent être injectées par voie périphérique à l'animal. Dans ce projet, nous allons étudier les effets d'un traitement quotidien sur les marqueurs précoces de la pathologie (hyperactivité neuronale) et intermédiaires (présence des plaques séniles et inflammation).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un candidat médicament sur la mise en place de la maladie d'Alzheimer. Cette revendication a été brevetée et une première étude pré-clinique réalisée sur ce même modèle animal a évalué la pertinence de cette approche. Pour valider cette stratégie thérapeutique nous devons poursuivre l'étude des mécanismes associés à l'efficacité thérapeutique chez la souris et tester l'efficacité d'autres substances de la même famille.

Procédures

Les animaux recevront une injection quotidienne d'une substance pharmacologique au niveau abdominal. L'injection dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’injection peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des études biochimiques ou immunohistochimiques.

Remplacement

Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.

Réduction

Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

L’injection dans l'abdomen peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et une gêne pour l’animal. Pour prévenir cela, nous utilisons des seringues microfines pour induire le moins de lésion et de douleur possible. Les seringues sont changées tous les deux animaux pour prévenir l'émoussement des aiguilles. Le côté d'injection (doite-gauche) sera alterné chaque jour. Les animaux sont habitués à la préhension la semaine précédent le début des injections. A l’issue de la procédure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. Lors des expériences de perfusion intracardiaque, une couverture analgésique et anesthésique est mise en place pour éviter tout ressenti douloureux. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Les animaux transgéniques sont stabulés à l’animalerie depuis leur naissance.

Choix des espèces

Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces (sans symptomes). Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront injectés dès 14 jours post-natal et jusqu’à 3 mois post-natal.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de mutations reproduisant la maladie de Willebrand, elles subissent un ou deux prélèvements sanguins sous anesthésie profonde, puis une endoscopie de quinze à vingt minutes, également sous anesthésie profonde, avant que leurs organes ne soient prélevés. L'objectif est de comprendre comment se forment les malformations vasculaires de l'intestin responsables de saignements chez les patients, un travail dont le porteur situe les retombées thérapeutiques "à plus long terme". Des souris âgées de 18 à 24 mois figurent parmi celles utilisées, et l'effectif de 400 repose sur la littérature et sur l'expérience de l'équipe, sans calcul détaillé.

Objectifs

La maladie de Willebrand (MW) est la maladie hémorragique la plus fréquente mais reste assez méconnue. Elle touche homme et femmes et affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. La maladie empêche d’arrêter les saignements. En fonction des différents défauts, les patients ont des formes plus ou moins sévères de la maladie. Certains sous-types de la MW sont associés une fréquence accrue de malformations vasculaires dégénératives intestinales susceptibles de saigner. Les saignements parfois impossibles à traiter ou récidivants, conduisent à des hospitalisations fréquentes et répétées et les patients concernés souffrent d’une dégradation importante de leur qualité de vie. Notre projet va consister à étudier les vaisseaux intestinaux dans des modelés murins de la MW, ce qui pourra aider à comprendre le mécanisme de formation de ces malformations à l’origine des saignements gastrointestinaux. Le projet se déroule dans deux Etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes de formations des malformations vasculaires gastrointestinales. A plus long terme, ce projet pourra servir de base pour la mise en place d'essais précliniques pour développer et tester des nouvelles options thérapeutiques pour les patients avec maladie de Willebrand (et pas seulement) souffrant de saignement gastrointestinaux.

Procédures

Dans l'établissement EU/1, les souris seront soumises a un geste tres rapide de prélèvement sanguin (30-60 secondes), réalisé sous anesthésie profonde une o deux fois. Dans l'établissement EU/2, l’endoscopie (15-20 minutes) se fait une seule fois sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Douleur légère au réveil après le prélèvement. Stress lors de la préhension des animaux.

Devenir

Les organes d’intérêt sont prélevés après l’endoscopie pour des analyses de microscopie, il est donc impossible ré-utiliser ces souris.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.

Réduction

Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié, nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien- être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et les points limites, susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal, seront strictement appliquée.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (Maladie de Willebrand de différents sous-types). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines. Des souris adultes, entre 3 et 6 mois d’âge et des souris âgées, entre 18 et 24 mois , des deux sexes seront utilisées.

Mettre des chats en restriction calorique pour tester une poudre de biopeptides tirée de l'hydrolyse de protéines sanguines : seize chats en surpoids vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit quatre sédations avec prise de sang et voit sa ration réduite pendant toute l'étude, le porteur reconnaissant que la restriction calorique peut les rendre plus agités. Aucun remplacement n'est envisagé, le chat en surpoids étant la cible commerciale des biopeptides, et le porteur affirmant qu'il est "nécessaire" de tester sur "l'animal entier". Les seize chats sont gardés vivants et doivent être réintégrés dans un autre protocole de test d'aliment une fois leur poids optimal retrouvé.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer l'efficacité de biopeptides, issus de l'hydrolyse de protéines sanguines, chez le chat en surpoids : 1) vitesse de la perte de poids par rapport à l'effet du peptide contrôle, 2) effet sur la triglycéridémie, 3) effet sur des hormones du métabolisme lipidique (leptine, insuline, adiponectine) afin de mieux comprendre leur mode d'action.

Bénéfices attendus

Les biopeptides devraient permettre une perte de poids plus efficace chez le chat en surpoids ainsi qu'une baisse de la triglycéridémie par action sur le métabolisme lipidique.

Procédures

Quatre sédations et prises de sang sur une courte durée, moins d'1h.

Impact sur les animaux

L'ajout de la poudre de biopeptides sur les croquettes pourrait avoir un goût ou une odeur non appréciés par les animaux. Toutefois les quantités étant tellement faibles, cette nuissance sera très limitée. Une prise de poids excessive est une réelle nuisance vis-à-vis de tous les désordres associés (problème de diabète, problème articulaire, problème urinaire), c'est la raison pour laquelle, la prise de poids sera contrôlée et limitée. La restriction calorique pourrait avoir un impact sur le stress des animaux, les rendant moins sereins et plus agités. Cependant, la restriction sera faible, le suivi individualisé et la distribution de la ration en deux fois pourrait être un moyen de limiter ce stress.

Devenir

Les animaux pourront être réintégrés à un projet dont la demande d'autorisation est encore en cours (test d'aliment) ou intégrés dans un nouveau projet car ils auront retrouvé leur poids optimal. Les analyses sanguines classiques de biochimie et d'hématologie confirmeront également la bonne santé des animaux.

Remplacement

Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chat en surpoids est l'animal cible des biopeptides testés et qu’il est nécessaire de tester sur l’animal entier pour nous permettre d’explorer le mode d’action chez cette espèce.

Réduction

Une simulation à l'aide d'un logiciel de statistiques a établi que le nombre minimum d'animaux par groupe permettant d'obtenir des différences significatives était de 8. Un t-test apparié ou un test de Wilcoxon sera utilisé pour analyser les données selon qu'elles suivent une loi normale ou non.

Raffinement

Les pièces de vie des chats sont enrichies par des paniers avec des couvertures, des griffoirs muraux, la présence de petits jeux (du type billes à grelots et balle de ping pong), plusieurs étagères et des recoins spécialement aménagés pour que les animaux puissent se cacher. La sédation lors des prises de sang permet de supprimer le stress pouvant être ressenti par l'animal lors du prélèvement. Un suivi quotidien du comportement des animaux (consommation alimentaire et comportement général) ainsi qu'un suivi hebdomadaire du poids des chats sera réalisé afin de mettre en place, si besoin était, des mesures adéquates (modification de la quantité de la ration, augmentation du contact avec les personnels animaliers) pour maintenir un bien-être optimal des animaux durant toute l'étude. Un animal qui consommerait moins de la moitié de sa ration durant 5 jours serait exclu de l'étude, tout comme un animal qui resterait prostré et montrerait des signes de détresse.

Choix des espèces

Le chat est l'espèce cible des biopeptides testés. Lers animaux seront des adultes de 3-4 ans, un âge particulièrement intéressant car la prise en charge du surpoids doit être réalisée le plus tôt possible sans attendre que les répercussions de celle-ci telles que le diabète, les troubles urinaires ou les problèmes articulaires soient déjà en place.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un virus injecté dans la veine de la queue doit leur faire sécréter de la sérotonine par le foie, suivi d'une échographie cardiaque sous anesthésie, de vingt-quatre heures seules en cage métabolique et d'un prélèvement sanguin terminal. Il s'agit de fabriquer chez la souris une cardiopathie carcinoïde, maladie humaine rare pour laquelle aucun modèle animal n'existe et aucun traitement non plus, les essais de molécules restant à venir. Le porteur écrit qu'un modèle animal est "indispensable" pour évaluer l'efficacité de molécules dans cette maladie, tout en indiquant mener en parallèle une approche observationnelle sur échantillons humains et une étude in vitro sur lignées cellulaires de foie de souris.

Objectifs

Dans certaines tumeurs du foie et du pancréas, il y a une sécrétion d'hormones dont la sérotonine. Ces hormones peuvent se jeter dans le coeur ou elles provoquent des remaniements à l'origine d'une maladie appelée la cardiopathie carcinoïde. Dans cette maladie trés rare, des patients ont une tumeur et de l'insuffisance cardiaque. Il n'existe pas de modèle animal de cette maladie qui permettrait de tester des nouveaux médicaments. L'objectif de ce projet sera de développer un modèle de souris, en injectant chez la souris un virus qui provoque une sécretion de sérotonine par le foie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il existe de rares tumeurs qui s’accompagnent d’une atteinte des valves du coeur . La création d’un modèle de souris permettra à l'avenir d’évaluer l’effet de l’administration de divers médicaments chez la souris avant de les introduire chez l’homme. Il n'existe en effet à ce jour aucun traitement pharmacologique de la maladie. Un modèle animal est indispensable pour évaluer l'efficacité de différentes molécules dans cette maladie rare. Cette maladie entraine une mortalité importante chez l'homme.

Procédures

Dans l'EU 1, nous allons réaliser une injection de virus dans la veine de la queue de souris (procédure de 5 minutes). Les virus utilisés sont des outils moléculaires pour du transfert de gènes. Dans l'EU2, nous allons réaliser une échographie cardiaque sous anesthésie (durée 20 minutes) . L'échographie cardiaque est une technique non invasive et indolore. Enfin après 4, 6, 8 ou 10 semaines, le prélevement sanguin sera fait sous anesthésie (5 minutes), avant euthanasie de l'animal, cette fois encore dans l'EU1 .

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés pendant 24h dans des cages dites "métaboliques". Ces cages permettent de recueillir les urines des souris. L'injection du virus n'entraine pas d'effet indésirable selon la littérature. Ces cages peuvent entrainer un stress pour la souris qui est isolée. Anxiété et stress lié au déplacement des cages vers la salle d'intervention. Enfin il existe théoriquement un risque d’insuffisance du coeur associée à des gonflements des membres ( œdèmes en cas d’atteinte cardiaque sévère).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prévenir la souffrance liée à la propagation du cancer, et de pouvoir analyser le coeur des souris. Cette analyse permettra de chercher des signes en faveur de l'apparition de la maladie cardiaque. L'euthanasie aura lieu dans l'EU2.

Remplacement

Nous comptons mener en parallèle une approche observationnelle sur échantillons humains. Cependant l’étude animale est indispensable afin dans un premier temps de reproduire la maladie, pour pouvoir dans un second temps réaliser des essais préliminaires médicamenteux (type inhibiteurs de la sérotonine). Nous étudierons in vitro la sécrétion de sérotonine sur des lignées cellulaires de foie de souris. Si la sécrétion est confirmée nous irons vers une utilisation chez la souris. L'utilisation d'un modèle animal est nécessaire, car actuellement aucun modèle in silico ne permet d'étudier les remaniements des valves.

Réduction

Après calcul statistique nous avons démontré qu'il nous faut 20 souris (10 males 10 femelles) par groupe. Dans un premier temps nous souhaitons utiliser 100 souris : Nous souhaitons utiliser 4 groupes euthanasiés à différents temps ainsi qu'un seul groupe controle. Nous avons limité au maximum le nombre de souris nécéssaires. Une fois le modèle validé, nous étudierons par échographie cardiaque sur deux groupes de 20 souris. AU total, utilisation de 140 souris.

Raffinement

Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d'enrichissement comme des batons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu'un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson.Les animaux seront observés trois fois par jour et tout comportement anormal communiqué au responsable. Afin de limiter le stress pendant le transport des animaux, le transport entre les établissements utilisateurs (EU1 et EU2 dure 5 minutes à pied et se fera dans la cage. Leur cage sera placée dans un sac recouvert d'un tissu pour les cacher au regard du public. Les animaux sont hébergés sans isolement, avec enrichissement dans chaque cage. La douleur des animaux sera contrôlée par analgésie. L’enrichissement est adapté au suivi après injection du virus. Une échographie sera envisagé en cas de validation du modele dans les premières manipulations. A la fin de la période d'observation, les souris recevront une analgésie puis une sédation avant prélevement terminal, avant euthanasie. L'enrichissement est majoré lors du passage en cage métabolique (avec des batons et des éléments nouveaux de nidification).

Choix des espèces

L’utilisation de souris est bien connue dans l’utilisation des virus. La souris est donc le modèle expérimental le plus adapté. Les précédentes études avaient mis en évidence des modifications des valves et nous souhaitons raffiner le modèle grace à une injection de virus. Les études menées chez l'Homme indiquent une atteinte fréquente chez le sujet jeune. Nous utiliserons par conséquent des souris âgées de 8 à 12 semaines en début de procédure. L'utilisation du virus devra faire produire de la sérotonine à la souris.

Cinq échographies transrectales, une prise de sang, un écouvillon puis une biopsie de l'utérus sous sédation : dix ponettes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les biopsies servent à produire des organoïdes d'endomètre équin, modèle in vitro destiné à étudier l'endométrite, principale cause de sous-fertilité chez la jument et source de pertes économiques pour l'élevage. Le porteur reconnaît que la biopsie utérine est un acte potentiellement douloureux et qu'elle peut rarement provoquer une rupture de l'utérus ou du rectum, entraînant la mort ou la mise à mort de la jument. Les dix ponettes sont gardées vivantes et réutilisées dans d'autres protocoles après examen vétérinaire, la méthode qui doit à terme réduire le recours aux juments vivantes reposant d'abord sur des prélèvements pratiqués sur elles.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mieux comprendree l'inflammation et de pouvoir reconstituer l'endomètre, qui est la muqueuse qui tapisse l’intérieur de l’utérus des mammifères. L’endométrite est l’inflammation de cette muqueuse, par exemple suite à une infection. L’endométrite est la principale cause de sous-fertilité chez la jument et la troisième maladie la plus fréquente chez les chevaux, causant des pertes économiques importantes pour l'élevage equin. Après un accouplement naturel ou une insémination artificielle, une réponse inflammatoire physiologique transitoire induite par le sperme élimine les rémanents séminaux et les débris de l'utérus .Chez les juments présentant une résistance naturelle à l'endométrite persistante, les composants locaux des mécanismes de défense utérine assurent la guérison du processus inflammatoire. Les juments qui ne parviennent pas à éliminer l'inflammation de l'utérus sont classées comme sensibles à l'endométrite persistante après la reproduction . Une inflammation ou une infection persistante après l'accouplement génère un environnement utérin néfaste pour les spermatozoïdes et inadapté à la vie embryonnaire, à l'origine d'infertilité. Les juments sensibles ont un retard dans l'évacuation des déchets utérins dû à des déficiences dans l'activité du myomètre et ne parviennent pas à évacuer les résidus séminaux après l'accouplement, accumulant du liquide intra-utérin, ce qui est mis en évidence par l'examen échographique . Récemment, des méthodes plus sophistiquées alternatives aux expérimentations animales ont émergé sous la forme de production d'organoides , qui sont des modèles cellulaires en 3D in vitro reproduisant de manière plus précise la structure et la fonction des organes.Ce projet vise à développer des organoïdes à partir des biopsies d’endomètre collectées chez des juments résistantes et sensibles à l'endométrite, puis à les caractériser pour identifier d'éventuelles différences morphologiques et fonctionnelles entre eux dans des conditions normales. De plus, ces organoïdes seront soumis à des challenges inflammatoires pour évaluer leur réponse différentielle. La possibilité de dériver des organoïdes à partir de tissus congelés et de les cryoconserver permettra de disposer de ce modèle tout au long de l'année, indépendamment des contraintes saisonnières qui limitent les expériences sur les juments en vie.

Bénéfices attendus

À court terme, le développement d'organoïdes permettra de mieux comprendre la pathophysiologie de l'endométrite et de tester des options de traitement in vitro, avec les avantages susmentionnés de ne pas dépendre d'expériences in vivo. Si des traitements ciblés peuvent être développés pour améliorer la gestion des juments sensibles à l'endométrite, un effet souhaitable à long terme serait une réduction de l'incidence de la pathologie et une meilleure fertilité.

Procédures

Il est prévu que chaque ponette ait 5 échographies, une procédure qui dure de 3 à 4 minutes. Pendant l'étude, il sera également pratiqué un prélèvement sanguin de 5ml, qui durera 5 secondes. Il est prévu de réaliser deux autres prélèvements de 5 minutes chacun, l'un par écouvillon endométrial et l'autre par biopsie endométriale. Pour effectuer le dernier prélèvement, on utilisera une sédation associée à un antalgique.

Impact sur les animaux

Les prises de sang peuvent entrainer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement. Le temps nécessaire pour réaliser une prise de sang est d'environ 1mm. L’examen échographique transrectal de la jument comporte des risques qui sont pris en compte par les techniciens. Les différentes échographies peuvent entrainer une légère douleur, cette technique d’imagerie est rapide 3-4mn par animal. La biopsie utérine est un acte potentiellement douloureux également, cette douleur éventuelle est prise en compte par la médication mise en place. Les biopsies endométriales peuvent rarement entraîner la mort ou l'euthanasie de la jument. Les cas exceptionnels qui pourraient se produire seraient une rupture de l'utérus due à une déchirure profonde ou une coupure du myomètre au moment du prélèvement, entraînant une hémorragie utérine, ou une rupture du rectum au moment de la palpation transrectale au cours de la procédure. La contention pour les différents actes peut engendrer du stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et réutilisés pour d'autres protocoles après examens vétérinaires

Remplacement

L’objectif principal de ce projet étant d’évaluer la fertilité des femelles après insémination, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation des ponettes par un autre modèle. Ainsi dans un premier temps, ce projet vise à développer un modèle in vitro d’endométrite chez la jument afin de réduire à long terme l’utilisation des animaux vivants. Toutefois, au stade actuel de l’étude pour pouvoir développer cette technique, l’utilisation d’échantillons collectés chez des juments vivantes pendant ce projet est nécessaire.

Réduction

Ce projet a pour objectif également de réduire au maximum le nombre des animaux vivants utilisés à des fins scientifiques ainsi que les interventions sur chacun de ces animaux. Le développement des organoïdes permet d'optimiser les prélèvements sur un animal car les organoïdes peuvent être multipliés in vitro. En effet, un seul prélèvement in vivo permet d’obtenir une quantité suffisante d’organoïdes au laboratoire pour mener à terme les expériences nécessaires pour l’étude. De même, une fois le modèle et la variabilité entre les différents phénotypes d’animaux établis, cela permet de connaître le nombre d'animaux nécessaires pour chaque catégorie (sensible et résistante), minimisant ainsi le nombre total d'animaux utilisés dans chaque condition physiologique.

Raffinement

Notre procédure sera raffinée, minimisant les interventions, un ou deux prélèvements par animal au maximum pendant la réalisation de tout le projet. Les juments seront logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et en contact avec des congénères pour rendre le plus agréable possible leur environnement expérimental pendant toute la durée du projet. Les ponettes voient plusieurs fois par jour les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent attentivement leur comportement. L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts des bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux : les animaux sont habitués aux différentes procédures et les vivent sans stress.

Choix des espèces

Le but de cette expérience est le développement d'organoïdes d'endomètre équin qui permettront un modèle in vitro et qui pourra contribuer à la compréhension fondamentale de la pathophysiologie de l'endométrite, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation des ponettes par un autre modèle. il est donc nécessaire d’avoir des ponettes donneuses pour réaliser des biopsie d'utérus pour ce projet Les animaux utilisés seront tous pubères, puisqu'il faut qu'ils soient capables de se reproduire. La collecte des biopsies sera realisée chez des ponettes en œstrus et avec un follicule dominant pré-ovulatoire et un œdème utérin de grade II ou IV.

Aucun des 31 rats de ce projet n'est tué à son terme. Ils sont mis à jeun huit heures, gavés une fois, équipés d'un cathéter posé sur une veine de la queue sous crème anesthésiante, puis soumis à neuf prélèvements sanguins étalés sur huit heures, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger. Le porteur indique que ni les gestes ni la substance administrée ne provoquent d'effets irréversibles, et prévoit quatre semaines de récupération avant de les réutiliser dans une autre procédure. L'objet est de mesurer si l'encapsulation de l'acétate d'abiratérone dans des nanoparticules lipidiques améliore son passage intestinal, pour un effectif de quatre animaux en étude pilote et vingt-sept en cinétique, dont trois de réserve mobilisés seulement si un point limite est atteint.

Objectifs

Le projet vise à développer une nouvelle forme d’administration orale de substances actives pharmaceutiques (SA) à base de nanoparticules lipidiques (NPL) afin d’améliorer l’efficacité de SA présentant une très faible biodisponibilité orale. En effet, du fait de leur faible solubilité et faible perméabilité intestinale, elles sont généralement soit administrées par voie parentérale soit par voie orale en dose très importante. L’encapsulation de ces SA faiblement biodisponibles dans des NPL pourront pallier ce problème et permettre de diminuer les doses administrées aux patients et la toxicité qui pourrait en découler. L’acétate d’abiratérone a été retenu comme molécule modèle de notre étude, puisqu’il constitue le meilleur candidat en termes d’intérêts thérapeutique, pharmacologique et galénique. Du fait de sa faible solubilité et perméabilité à travers la barrière intestinale, cette dernière présente une très faible biodisponibilité orale (

Bénéfices attendus

De façon générale, ce projet permettra d’étudier les effets de l’encapsulation de la substance active dans des nanoparticules lipidiques sur ses paramètres de pharmacocinétique, en comparaison à la substance active seule en suspension. Plus précisément, les paramètres de pharmacocinétique étudiés seront la concentration plasmatique totale de la SA ainsi que sa concentration maximale atteinte. Dans le cadre de l’objectif (1a), il permettra de mettre en évidence l’impact des nanoparticules lipidiques sur l’absorption intestinale de l’actif mais aussi d’identifier laquelle des deux formules de NPL développées offre les meilleurs paramètres de pharmacocinétique (de l’absorption jusqu’à l’élimination). Plus précisément, une augmentation significative de la concentration plasmatique totale est attendue lorsque la substance active est encapsulée dans les NPL. Dans le cadre de l’objectif (1b), le projet permettra de démontrer l’innocuité des étapes de séchage et compression sur l’amélioration de la biodisponibilité orale de la substance active encapsulée. Ceci permettrait de valider l’administration des NPL sous forme de comprimés pour le traitement chez l’homme.

Procédures

Une mise à jeun des animaux aura lieu (sans restriction hydrique), pour une durée totale de 8h. Elle débutera 4h avant administration de la dose et durera jusqu’à 4h post-administration. Un gavage oral d’une durée inférieure à 30 secondes sera réalisé par un personnel compétent et qualifié, une seule fois pour l’administration de la dose. Un cathéter périphérique sera installé sur la veine caudale latérale des animaux, chez l’animal vigil ou sous anesthésie gazeuse si nécessaire. La durée de la pose sera de maximum 10min, en incluant la pose du tube de protection. Au total, 9 prélèvements sanguins seront réalisés, pendant une durée inférieure à 1min, sur une plage horaire de 8h, par le biais du cathéter et sans nécessité d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances liées à la procédure de pharmacocinétique, l’administration unique est réalisée par gavage oral car il est indispensable que tous les animaux reçoivent la même dose précise et au même moment. De plus, l’absorption de la substance active étant fortement influencée par l’administration concomitante de nourriture, une période totale de mise à jeun (sans restriction hydrique) de 8h est indispensable. Enfin, pour réaliser les prélèvements sanguins, un cathéter sera installé sur la veine caudale de l’animal. Bien que le cathéter ne nécessite pas d’anesthésie de l’animal à chaque prélèvement, il peut présenter un risque d’inconfort et dans de rares cas une réaction au site de prélèvement.

Devenir

L’étude de la pharmacocinétique ne nécessite pas, in fine, une mise à mort des animaux dans la mesure où, théoriquement, ni les gestes techniques ni la substance active administrée n’engendrent d’effets indésirables importants et/ou irréversibles. Une période de 4 semaines de récupération sera nécessaire aux animaux avant de pouvoir être réutilisés pour une autre procédure.

Remplacement

La pharmacocinétique d’une substance active consiste à étudier son devenir dans l’organisme après son administration, en incluant les étapes d’absorption, distribution (dans le sang puis dans les organes cibles), métabolisme et d’élimination par les voies d’excrétion. Des expériences in vitro ont été réalisées afin de prédire certains paramètres d’absorption tels que la cytotoxicité et le passage des nanoparticules lipidiques à travers la couche de cellules intestinales. Malheureusement, aucune étude in vitro n’est, à l’heure actuelle, suffisamment robuste et complète pour prédire toute la complexité de l’organisme, et en particulier de son système digestif. C’est la raison pour laquelle le recours au rongeur apparait comme la seule issue possible pour évaluer de façon globale le profil pharmacocinétique de la substance active.

Réduction

Le nombre d’animaux est optimisé pour être le plus restreint et permettant d’obtenir rapidement des résultats scientifiquement robustes. La cohorte totale est composée de 3 groupes de 8 animaux, dont un seul groupe contrôle commun (administration de la substance active seule, en suspension dans de l’eau) et de deux groupes recevant chacun une formule différente de nanoparticules lipidiques en suspension dans de l’eau. Afin de minimiser les biais de sélection, la répartition des animaux dans chaque groupe sera faite par méthode de randomisation par paire à l’aide du logiciel Excel. Ces deux formules étudiées (une formule par groupe expérimental) ont été retenues en raison de leur innocuité et intérêt pharmacologique après un screening préliminaire in vitro. Le calcul du nombre de rats a été réalisée par une approche statistique et en s'appuyant sur des études similaires publiées dans la littérature. Un animal par groupe sera rajouté dans le cas où un point limite serait atteint durant la cinétique avec une mise à mort requise. Ainsi, chaque groupe sera composé de 8 animaux étudiés + 1 animal supplémentaire (inclus dans l’étude uniquement si besoin), soit au total 9 animaux par groupe, donc 27 animaux prévus au total pour la pharmacocinétique des 3 groupes. A chaque temps de prélèvement, il sera considéré une amélioration significative de la concentration plasmatique totale des groupes expérimentaux si cette dernière est au moins deux fois supérieure à celle du groupe contrôle. Cette différence sera appréciée à l’aide d’un test statistique de comparaison des moyennes pour échantillons indépendants. Ainsi, 4 animaux seront nécessaires pour l’étude pilote préalable et 27 animaux pour la pharmacocinétique, soit un total de 31 animaux.

Raffinement

La pharmacocinétique implique des prélèvements sanguins répétés. Après anesthésie locale à la queue par crème EMLA, un cathéter sera implanté sur la veine caudale latérale de l’animal vigile ou si besoin anesthésié par isoflurane, par un personnel qualifié. Cela évite les anesthésies répétées et permet une cinétique complète pour chaque animal, limitant les variations inter-individuelles et donc le nombre d’animaux nécessaire. Cette technique, recommandée par notre vétérinaire, s'appuie sur un protocole similaire de prélèvements répétés chez le rat dans un autre établissement. L'absorption de la SA est influencée par la prise alimentaire. Une mise à jeun de 4h avant et après l'administration de la dose, avec accès illimité à l'eau, permet de garantir que l’absorption n’est pas biaisée par un bol alimentaire présent dans l’estomac ou le petit intestin et donc assure des résultats plus robustes. Pour limiter les effets du jeun, du sucre pourra être rajouté dans l’eau de boisson 2h après administration de la dose jusqu’à la fin du jeun. Pour réduire au maximum le stress, la procédure se déroule en période diurne, période de moins activité chez les rats. Les animaux sont hébergés par groupes de 2, dans des cages aux dimensions, litière et matériel d’enrichissement adaptés. Pendant l’acclimatation, ils seront habitués à la manipulation, au tube de contention et récompensés après les gestes par une céréale ou du lait concentré sucré. Le cathéter est posé sous anesthésie locale (EMLA) et retiré avec de l'EKYFLOGYL gel anesthésique anti-inflammatoire. En cas de problème avec un cathéter bouché, un autre abord veineux (sur la veine saphène) est utilisé pour éviter l'euthanasie en cours de procédure. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis afin de soustraire l'animal à toute souffrance.

Choix des espèces

Le choix du modèle « rat » a été établi selon plusieurs critères. Du point de vue scientifique, le rongeur, et en particulier le rat, présente des similitudes non négligeables avec l’homme, étant un mammifère avec des organes digestifs équivalents, ce qui permet une transposition des résultats à l’homme. Du point de vue technique, une pharmacocinétique requière des prélèvements sanguins répétés ce qui implique que l’espèce animale choisie doit posséder un volume sanguin suffisant. C’est pourquoi, par exemple, la souris n’était pas un modèle adapté aux besoins de l’étude, en raison de son volume sanguin trop faible. Afin de pouvoir transposer les résultats à l’homme adulte, l’ensemble des tissus et organes des animaux doivent être arrivés à maturité. C’est la raison pour laquelle les rats doivent être adultes, de préférence jeunes adultes, pour limiter les variations inter-individuelles liées au vieillissement. Ils présenteront un poids de 300-325g à leur arrivée sur la plateforme pour permettre d’être en adéquation avec la réglementation sur la fréquence et volumes de sang prélevés.

Pour obtenir une atteinte des valves du cœur qui n'a pas encore de modèle animal, des souris reçoivent un virus qui leur fait sécréter de la sérotonine par le foie. 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger. Chacune reçoit l'injection dans la veine de la queue, passe vingt-quatre heures seule en cage métabolique, subit une échocardiographie de vingt minutes sous anesthésie dans un second établissement, puis un prélèvement de sang avant d'être tuée pour l'analyse de son cœur. Le porteur qualifie l'échographie de "non invasive et indolore" et affirme que l'injection du virus n'entraîne pas d'effet indésirable, tout en mentionnant un risque d'insuffisance cardiaque accompagnée d'œdèmes des membres.

Objectifs

Dans certaines tumeurs du foie et du pancréas, il y a une sécrétion d'hormones dont la sérotonine. Ces hormones peuvent se jeter dans le coeur ou elles provoquent des remaniements à l'origine d'une maladie appelée la cardiopathie carcinoïde. Dans cette maladie trés rare, des patients ont une tumeur et de l'insuffisance cardiaque. Il n'existe pas de modèle animal de cette maladie qui permettrait de tester des nouveaux médicaments. L'objectif de ce projet sera de développer un modèle de souris, en injectant chez la souris un virus qui provoque une sécretion de sérotonine par le foie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il existe de rares tumeurs qui s’accompagnent d’une atteinte des valves du coeur . La création d’un modèle de souris permettra à l'avenir d’évaluer l’effet de l’administration de divers médicaments chez la souris avant de les introduire chez l’homme. Il n'existe en effet à ce jour aucun traitement pharmacologique de la maladie. Un modèle animal est indispensable pour évaluer l'efficacité de différentes molécules dans cette maladie rare. Cette maladie entraine une mortalité importante chez l'homme.

Procédures

Dans l'EU 1, nous allons réaliser une injection de virus dans la veine de la queue de souris (procédure de 5 minutes). Les virus utilisés sont des outils moléculaires pour du transfert de gènes. Dans l'EU2, nous allons réaliser une échographie cardiaque sous anesthésie (durée 20 minutes) . L'échographie cardiaque est une technique non invasive et indolore. Enfin après 4, 6, 8 ou 10 semaines, le prélevement sanguin sera fait sous anesthésie (5 minutes), avant euthanasie de l'animal, cette fois encore dans l'EU1 .

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés pendant 24h dans des cages dites "métaboliques". Ces cages permettent de recueillir les urines des souris. L'injection du virus n'entraine pas d'effet indésirable selon la littérature. Ces cages peuvent entrainer un stress pour la souris qui est isolée. Anxiété et stress lié au déplacement des cages vers la salle d'intervention. Enfin il existe théoriquement un risque d’insuffisance du coeur associée à des gonflements des membres ( œdèmes en cas d’atteinte cardiaque sévère).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prévenir la souffrance liée à la propagation du cancer, et de pouvoir analyser le coeur des souris. Cette analyse permettra de chercher des signes en faveur de l'apparition de la maladie cardiaque. L'euthanasie aura lieu dans l'EU2.

Remplacement

Nous comptons mener en parallèle une approche observationnelle sur échantillons humains. Cependant l’étude animale est indispensable afin dans un premier temps de reproduire la maladie, pour pouvoir dans un second temps réaliser des essais préliminaires médicamenteux (type inhibiteurs de la sérotonine). Nous étudierons in vitro la sécrétion de sérotonine sur des lignées cellulaires de foie de souris. Si la sécrétion est confirmée nous irons vers une utilisation chez la souris. L'utilisation d'un modèle animal est nécessaire, car actuellement aucun modèle in silico ne permet d'étudier les remaniements des valves.

Réduction

Après calcul statistique nous avons démontré qu'il nous faut 20 souris (10 males 10 femelles) par groupe. Dans un premier temps nous souhaitons utiliser 100 souris : Nous souhaitons utiliser 4 groupes euthanasiés à différents temps ainsi qu'un seul groupe controle. Nous avons limité au maximum le nombre de souris nécéssaires. Une fois le modèle validé, nous étudierons par échographie cardiaque sur deux groupes de 20 souris. AU total, utilisation de 140 souris.

Raffinement

Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d'enrichissement comme des batons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu'un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson.Les animaux seront observés trois fois par jour et tout comportement anormal communiqué au responsable. Afin de limiter le stress pendant le transport des animaux, le transport entre les établissements utilisateurs (EU1 et EU2 dure 5 minutes à pied et se fera dans la cage. Leur cage sera placée dans un sac recouvert d'un tissu pour les cacher au regard du public. Les animaux sont hébergés sans isolement, avec enrichissement dans chaque cage. La douleur des animaux sera contrôlée par analgésie. L’enrichissement est adapté au suivi après injection du virus. Une échographie sera envisagé en cas de validation du modele dans les premières manipulations. A la fin de la période d'observation, les souris recevront une analgésie puis une sédation avant prélevement terminal, avant euthanasie. L'enrichissement est majoré lors du passage en cage métabolique (avec des batons et des éléments nouveaux de nidification).

Choix des espèces

L’utilisation de souris est bien connue dans l’utilisation des virus. La souris est donc le modèle expérimental le plus adapté. Les précédentes études avaient mis en évidence des modifications des valves et nous souhaitons raffiner le modèle grace à une injection de virus. Les études menées chez l'Homme indiquent une atteinte fréquente chez le sujet jeune. Nous utiliserons par conséquent des souris âgées de 8 à 12 semaines en début de procédure. L'utilisation du virus devra faire produire de la sérotonine à la souris.