Procédures légères
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Analyse de la dynamique cellulaire chez l’amphibien Xenopus Laevis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Injectées d'hormone dans les sacs lymphatiques la veille de la ponte, les femelles xénopes sont laissées au repos cinq mois avant d'être stimulées de nouveau. Les mâles, eux, sont tués pour prélever leurs testicules et féconder les œufs hors du corps. Sur 170 xénopes utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère, 70 sont réutilisés et 100 tués, pour étudier des enzymes impliquées dans la migration cellulaire, le porteur décrivant une espèce qui fournit "beaucoup de matériel d'étude" avec peu d'animaux mis à mort. Il ne mentionne comme effet indésirable que des nausées et des vomissements en cas de dose hormonale trop forte, et affirme que la stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles.
Objectifs
La migration cellulaire est essentielle à de nombreux phénomènes physiologiques tels que le fonctionnement normal du système immunitaire, la cicatrisation des plaies ou encore le développement embryonnaire. De plus, la migration cellulaire est impliquée dans des processus pathologique comme la dissémination des cellules cancéreuses (métastases). Le projet vise à mieux comprendre comment les cellules adaptent des capacités migratoires et comment cette migration est ensuite régulée via des interactions entre cellules ou via des informations présentes dans l’environnement des cellules. Le projet porte particulièrement sur le rôle d’enzymes de la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces enzymes sont exprimées et sécrétées par de nombreux types cellulaires au cours du développement et chez l’adulte. Elles sont principalement connues pour permettre aux cellules de modifier la matrice extracellulaire et faciliter ainsi la migration et l’invasion. Toutefois, ces enzymes sont aussi détectées à l’intérieur des cellules. Elles ont de nombreux substrats non-matriciels. Enfin, elles présentent des fonctions indépendantes de leurs capacités enzymatiques. Ces fonctions annexes restent peu ou pas caractérisées. Le projet a pour objectif de mieux définir ces fonctions non-canoniques des MMPs et de valider leurs importances physiologiques de façon expérimentale in vivo dans un modèle amphibien, le Xénope.
Bénéfices attendus
A court termes, le projet permet d’obtenir des informations cruciales sur le mode de fonctionnement des MMPs in vivo et leurs rôles sur l’initiation et le contrôle de la migration cellulaire. Ce projet a déjà donné lieu à plusieurs productions scientifiques dans lesquelles nous avons démontré des rôles précoces des MMPs en amont de l’acquisition du phénotype migratoire notamment via la régulation de la polarité cellulaire et/ou le contrôle de l’expression de gènes régulant la transition épithélium-mésenchyme. A long terme, les informations recueillies sur le rôle des MMPs chez l’embryon permettra d’affiner les analyses d’échantillon pathologique (biopsie de tumeur) et contribuera à la mise au point de protocole permettant de moduler leurs activités dans le cadre des pathologies (cancers, fibroses).
Procédures
Stimulation des femelles : La ponte des femelles d'amphibien doit être stimulée par injection d'hormone. Une injection au niveau des sacs lymphatiques est pratiquée la veille du jour de ponte. Cette procédure est suivie d'une période de repose de 5 mois (20 semaines) à l'issu de laquelle les femelles peuvent être à nouveau stimulées. Stimulation des mâles : Les mâles d'amphibien sont injectés au niveau des sacs lymphatiques. Les mâles ainsi injectés sont fertiles pendant quatre semaines. Les testicules sont prélevés chirurgicalement.
Impact sur les animaux
La stimulation de la ponte par injection hormonale peut entraîner des nausées et vomissements si la dose est trop forte et si les animaux injectés sont nourris le jour de l'injection.
Devenir
Le prélèvement des testicules requiert l’euthanasie préalable. La stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles, elles sont donc gardées en vie le plus longtemps possible.
Remplacement
Le contrôle de la migration cellulaire est impliqué dans de nombreux phénomènes physiologiques (immunité, cicatrisation) et des pathologies comme le cancer et les inflammations chroniques. Nos objectifs scientifiques (analyse de la migration des cellules) et nos stratégies expérimentales nécessitent de travailler sur des cellules animales dans des systèmes qui permettent des manipulations in vivo et in vitro. Le choix est fait d'utiliser un animal modèle (Amphibien/Xénope) qui fournit beaucoup de matériel d'étude (oeufs fécondés) avec un nombre limité d'animaux mis à mort comparativement aux modèles mammifères
Réduction
Les embryons de Xénopes sont obtenus par fécondation in vitro à partir de testicules prélevés sur des mâles mis à mort. Les testicules sont conservés en milieu de culture, au froid, pendant deux semaines ce qui permet de féconder les pontes de 4 à 8 femelles. Afin de réduire le nombre d’animaux mis à mort, nos études sont complétées par l'utilisation de lignées cellulaires de souris et d'embryons précoces de poulet qui ne nécessitent aucuns animaux mis à mort. A activité scientifique constante, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés de 40% par rapport aux projets de recherche précédents.
Raffinement
Afin de réduire la manipulation des animaux nous avons modifié le protocole de stimulation des femelles par rapport aux projets de recherche précédents. Elle s’effectue désormais en une seule injection la veille de la ponte au lieu de deux injections à 5 jours d’intervalle. Par ailleurs, avant injection les femelles sont pesées afin d’ajuster au mieux la dose d’hormone nécessaire. Cette pesée permet également un suivant sanitaire. Enfin, pour éviter les risques de nausées et de vomissements les animaux sont mis à jeûn le jour de l'injection.
Choix des espèces
Le choix du Xénope est justifié de par la possibilité d'obtenir un grand nombre d'ovocytes (1000 oeufs pondus par femelle) sans mettre à mort les femelles, par opposition à la souris notamment. Par ailleurs, nous avons choisi comme population cellulaire modèle les cellules de la crête neurale. Ces cellules utilisent un programme de développement qui est ensuite réutilisé de façon opportuniste lors des cancers. Ceci en fait un modèle extrêmement pertinent du point de vue physiologique. Cependant, cette population de cellules n'existe que chez les vertébrés ce qui exclut un remplacement du Xénope par un organisme "inférieur" comme la drosophile. Les femelles et mâles sont achetés et utilisées à maturité sexuelle. Ensuite à partir des oeufs fécondés obtenus, nous travaillons uniquement sur des embryons entre les stades 2 cellules et 3 jours de développement (avant acquisition de l'autonomie).
Traitement thérapeutique de tumeurs hépatiques induites par le virus de l’hépatite B grâce à des vecteurs lentiviraux vaccinaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées sous la peau avec des cellules tumorales sous anesthésie, vaccinées une à deux fois dans le muscle, parfois traitées par lenvatinib administré par la bouche, 8 532 souris voient leur tumeur mesurée au pied à coulisse tous les trois à quatre jours pendant un mois. Les procédures sont déclarées légères à modérées, avec des ulcérations, des tremblements, de la prostration et l'arrêt du toilettage parmi les effets attendus de la croissance tumorale. Les souris dont la tumeur régresse complètement sont suivies quatre mois puis exposées de nouveau à des cellules tumorales. Aucune ne sort vivante, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées, la stimulation immunitaire provoquée par la greffe biaisant toute autre étude.
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules. Le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération notamment grâce aux réponses cellulaires impliquant, entre autres, des lymphocytes T aux propriétés lytiques. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique fondée sur des vecteurs lentiviraux, connus pour induire cette catégorie de lymphocytes T, pourrait être particulièrement efficace dans le contrôle de la prolifération tumorale. En revanche, et en prévision d'une expérimentation clinique, ces vecteurs se doivent d’être non-intégratifs (VLNI). Lors du cancer du foie lié au VHB, les cellules tumorales expriment certaines protéines du VHB comme l’enveloppe, la capside ou la protéine HBx. L’objectif de ce projet est d’utiliser des VL exprimant ces protéines ou fragments de protéine du virus de l’hépatite B comme vaccin thérapeutique chez la souris. Suite à la vaccination, nous espérons obtenir une réponse immunitaire qui conduirait à l’éradication des tumeurs exprimant ces mêmes antigènes. Les vaccins candidats avec une activité anti-tumorale seront ensuite évalués en association avec les traitements actuels des patients avec cancer du foie lié au VHB en prévision d’un essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le virus de l’hépatite B est la cause avérée de 50% des cancers du foie chez l’homme. Les traitements actuels (chirurgie, irradiation, traitements immunomodulateurs) ne permettent au mieux qu’une légère augmentation du temps de survie. Chez l’homme, le développement de ces tumeurs s’accompagne de réponses immunitaires inefficaces. Grâce aux VLNI nous espérons pouvoir potentialiser ces réponses et détruire les cellules tumorales. Si nous parvenons à une élimination totale des tumeurs, un nouveau projet sera déposé afin d’évaluer notre candidat vaccin dans un modèle orthotopique. Cela permettrait d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.
Procédures
Les procédures comprennent une injection en sous cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (5min), une à deux vaccinations intramusculaires (quelques secondes) et éventuellement une injection intrapéritonéale d’anticorps (quelques secondes) et ou une injection per os de Lenvatinib (quelques secondes) (procédure 8). La surveillance de la croissance tumorale sera suivie pendant 3 à 4 semaines. Certains animaux seront soumis à une injection de vecteur lentiviral en intramusculaire (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection intramusculaire du petit volume de vaccin. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).
Devenir
Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce au traitement, elles seront suivies pendant quatre mois, puis seront à nouveau exposées à des cellules tumorales (procédure 6). Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats vaccins dans le but de les transposer chez l’homme. Ces études impliquent nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisés avec les tumeurs chez l’homme. Cette étape constitue également une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’homme, en complément des études réalisées in vitro. C’est pourquoi aucun système cellulaire isolé ne peut être utilisé pour remplacer la recherche sur les animaux.
Réduction
En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe, la littérature et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les vecteurs, nous avons utilisé les moyennes et écart-types d’expériences antérieures. La sélection rapide des meilleurs candidats VLNI dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de LV n’induit aucun signe clinique chez les souris mais l’implantation de tumeurs peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (tous les 3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers mais néanmoins présents (perte de poids inférieur à 10%, poils hérissés, inactivité), plusieurs mesures seront prises : ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages, amélioration de l’enrichissement.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire des petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant la durée de vie d’adulte.
Cibler les mégacaryocytes et les plaquettes hébergeant le virus du SARS-CoV-2 pour une restauration immunologique efficace
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie, 1 704 souris subissent ensuite des prélèvements de sang derrière l'œil, jusqu'à un par semaine, et des prélèvements dans la bouche. Les procédures sont déclarées légères et sévères, aucun animal n'est gardé vivant et la durée de conservation après le début des expériences ne dépasse pas deux mois. L'infection fait perdre environ 12 % de leur poids aux souris Balb/c au quatrième jour et peut en tuer 10 %, l'objet du projet étant de chercher des réservoirs du virus dans les plaquettes et les mégacaryocytes. Le porteur écrit qu'au total 1 224 souris seront "nécessaires", pour un projet qui en déclare 1 704, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit à ce jour les interactions hôte-virus aboutissant au Covid-19.
Objectifs
La pandémie Covid-19 est devenue une urgence sanitaire et médicale dans la plupart des pays dans le monde. Le SARS-CoV-2 cause des symptômes respiratoires qui peuvent être graves, ainsi que des symptômes à l’origine du COVID long par la persistance de réservoirs cellulaires du virus. Notre objectif est d’identifier et de caractériser ces réservoirs viraux dans le contexte de l’infection par le SARS-CoV-2 et les conséquences de ce phénomène sur la réplication virale et la pathologie Covid-19.
Bénéfices attendus
Les plaquettes et les mégacaryocytes sont des cachettes virales largement négligées. Nous étudierons leur participation dans des modèles murins de long COVID et COVID sévère. Nous proposons enfin de les cibler afin de restaurer le statut immunocompétent et la qualité de vie des individus présentant des déficits immunitaires persistants d'origine virale. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire les interactions hôte-virus aboutissant au COVID-19. L'évaluation de la pathogénicité du SARS-CoV-2 pourra aider à développer de nouvelles stratégies de lutte qui nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’est pas possible à ce jour de remplacer par des tests in vitro ou in silico. Il est admis que le modèle murin et l’infection avec une souche du SARS-CoV-2 adaptée à la souris est pertinent pour le suivi de la réplication du virus et pour décrire la physiopathologie associée à l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
(1) Infection de SARS-CoV-2 par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. 1 infection par animal sera réalisée, celle ci dure environ 1 minute, après l'endormissement de l'animal par l'isoflurane. (2) Prélèvement sanguin par voie rétroorbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépot d'une goutte de collyre à base de tétracaine. Une anesthésie générale sera obtenue par l'inhalation d’isoflurane. Les prélèvements intermédiaires (1 fois par semaine au maximum) durent moins d'une minute. Le prélèvement terminal en fin d'expérience durera plus longtemps afin d'obtenir un maximum de volume sanguin, les animaux seront euthanasiés à la suite de ce prélèvement. (3) Prélèvement de swabs buccaux. Ce prélèvement se fera à la suite du prélèvement sanguin intermédiaire pour éviter une autre anesthésie et contention des animaux. Un bref prélèvement à l'aide d'un swab (taille nourisson) sera effectué dans la bouche de chaque animal, ceux ci dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus mouse-adapted SARS-CoV-2 conduit à une perte de poids d’environ 12% au 4ème jour de l’infection chez les souris Balb/c. A cette dose, 10% des souris Balb/c peuvent mourir, les C57Bl/6J ne meurent pas.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans cette procédure sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôle. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de deux mois.
Remplacement
Des modèles d'étude in vitro existent (organoides par exemple) cependant ils ne sont pas pertinents pour notre étude. En effet, nous nous intéressons à comprendre les effets physiopathologiques par l'infection au SARS-CoV-2 et seul l'étude sur l'organisme entier (animal) nous permettra de répondre à la problématique scientifique.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Dans cette étude, nous utiliserons un test de comparaison de moyennes t-test. Les expériences seront répétées 2 fois avec un nombre de 6 animaux par groupe expérimental. Au total, 1224 souris seront nécessaires. Cette utilisation maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, la réalisation de procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Chaque animal sera observé et scoré (évaluation des signes cliniques) toutes les 24h à partir du jour de l’infection. Les souris sont placées dans des cages contenant entre 2 et 4 animaux pour maintenir leur caractère grégaire. Si des conflits sont observés, les animaux agressifs seront écartés du groupe. Pour tout prélèvement et injection, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une analgésie locale sera réalisée pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris, exprimant naturellement le récepteur ACE2 du SARS-CoV-2, représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par ce virus. Chez la souris, il existe de nombreux outils (anticorps, kit ELISA) permettant une analyse des mécanismes immunologiques impliqués dans un effet physiologique. Les souris mâles et femelles seront infectées à l’âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Etude des mécanismes impliqués dans l’altération de la masse et du métabolisme musculaire au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Douze heures de jeûne nocturne avec une perte de poids attendue de 10 à 15 %, 48 heures seules en cage de mesure du métabolisme, six passages en résonance magnétique et une course jusqu'à la vitesse maximale sur tapis roulant, 120 souris subissent ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à la fin pour prélever de nombreux tissus. Elles reçoivent aussi une injection quotidienne pendant cinq jours, un poinçon à l'oreille et des prélèvements de sang à la queue, une partie d'entre elles étant nourries jusqu'à l'obésité. L'objet déclaré est de comprendre la fonte musculaire et la résistance à l'insuline qui accompagnent le vieillissement. Le porteur indique que le tapis roulant retenu remplace la stimulation électrique par un jet d'air sur l'arrière-train, et qu'il n'a jamais observé de blessure.
Objectifs
Le vieillissement se traduit par atrophie musculaire, c'est à dire une perte de la masse musculaire, conduisant à la perte d’autonomie des personnes et à l’augmentation de leur mortalité. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ce phénomène est donc d’un intérêt clinique non négligeable. Cette perte musculaire affecte un type particulier de fibres, les fibres à contraction rapide. De plus, le vieillissement est également associé à une perturbation de la régulation du taux de sucre dans le sang avec une résistance à l’insuline. Notre projet à deux objectifs : 1) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perte de muscles induites par traitement aux glucocorticoïdes (médicaments anti-inflammatoires utilisés fréquemment) et au cours du vieillissement 2) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perturbation de la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang et résistance à l’insuline) qui apparait en en cas d’obésité ou au cours du vieillissement
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la perte de la fonction musculaire au cours du vieillissement pour permettre à plus long terme d’augmenter la qualité de vie (favoriser le bien vieillir). De plus, nous nous intéressons à la vulnérabilité des fibres musculaires à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours de différentes pathologies (cancers, infections, sclérose latérale amyotrophique, insuffisance cardiaque et la broncho-pneumopathie chronique obstructive) ainsi qu’en cas de jeûne ou d’hypoxie (manque d’oxygène). Nos résultats pourraient donc être aussi intéressants pour de nombreuses autres pathologies.
Procédures
Tous les 120 animaux seront identifiés par poinçon à l'oreille (1 fois, 2 secondes) et seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 5 jours. Ils seront également soumis à des tests de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire (équivalent d'un IRM à l'hopital) (6 répartis sur l'ensemble du protocole, soit 6 x1min30 ). Ensuite, 48 animaux recevront aussi 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 7 jours. Le reste des animaux (soit 72) subiront aussi une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (5 secondes par prélèvement) ainsi qu'un test de vitesse maximale aérobie sur tapis (1 fois, 30min). Ils seront également soumis à des tests comportementaux (3 fois 5 min et 3 fois 10 secondes).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront des tests non-invasifs pour caractériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur métabolisme. Ces tests pourront induire du stress. Les tests de capacités fonctionnelles sur les tapis pourraient engendrer du stress chez les animaux. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables du traitement avec les glucocorticoïdes sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement qui sera arrêté si un changement important de comportement est observé. Les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (2 minutes/semaine), de motricité (3 fois 5 min).Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeûne (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Les prélèvements sanguins à la queue et le marquage à l'oreille induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables.
Devenir
Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes d’interaction liant fonte musculaire, vieillissement, inflammation et obésité, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite d’euthanasier les animaux en fin de projet.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu’avec des animaux car il n’y a pas de modèles cellulaires alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibres musculaires. De plus le vieillissement et la résistance à l’insuline sont des problèmes pathologiques impliquant de nombreux facteurs et de nombreux organes ce qui ne permet pas non plus le remplacement par des méthodes in vitro.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de calculs statistiques pour définir le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul groupe contrôle pour l’ensemble des procédures. L’utilisation des deux sexes nous permettra d’inclure tous les animaux à l’étude et d’éviter les mises à mort inutiles lors de la production des lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord 1 minute sans mouvement, puis 1 minute à vitesse réduite. L’habituation sera répétée 2 fois, espacées de 24h, avant le test. Le tapis roulant utilisé sera un nouveau modèle sur lequel l’utilisation de stimulation électrique pour motiver la souris à courir est remplacée par un système qui envoie de l’air sur l’arrière train de l’animal. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque geste permettant d’éviter une trop grande fatigue, le stress ou la blessure. Par expérience nous n'avons jamais vu de blessure, cependant si c’était le cas, l’animal serait soigné et sorti du protocole. Chez les animaux obèses, la nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives. Pour le change et la réalisation des tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (2 min environ). Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des souris obèses, nous utiliserons la grille de score adaptée.
Choix des espèces
Les conditions de perte de muscles chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons un modèle génétiquement modifié qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. D'autre part, des souris âgées seront utilisées pour étudier la perte de muscle qui s’installe à partir de 18 mois.
Evolution de nos protocoles de transfert d’embryons et d’insémination de sperme par voie chirurgicale afin de raffiner la prise en charge de la douleur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 28
Pour valider un protocole antidouleur que le service pourra ensuite appliquer en routine à ses chirurgies de transfert d'embryons, 20 souris et 28 rats vont être utilisés, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 28 un niveau léger. Les rates reçoivent quatre injections, une pour synchroniser leur cycle, une d'analgésique, une d'anesthésique et une dernière pendant leur sommeil. La moitié des femelles subit en plus une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, l'autre moitié seulement l'anesthésie, puis toutes mettent bas et leurs petits sont comptés avant que mères et portées ne soient tuées, faute de pouvoir être réutilisées dans les activités de service de l'établissement. Le porteur écrit aussi que toute femelle chez qui une douleur ou un inconfort serait détecté sera mise à mort, dans un projet dont l'objet déclaré est la prise en charge de la douleur.
Objectifs
L'objectif du projet est de valider une nouvelle prise en charge de la douleur (administration de médicaments anti-douleur et anti-inflammatoire) lors de nos chirurgies de transfert d'embryons et d'insémination de sperme afin de raffiner nos procédures actuelles. L'utilisation de ces molécules et dans cette chronologie définie autour de la chirurgie doit être validée comme n'ayant aucun effet nocif sur la gestation et la mise bas afin de la passer en routine chez nous.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont d'améliorer la prise en charge de la douleur liée à la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination de sperme sur nos rongeurs (rats et souris) et donc raffiner nos techniques. Le bien-être animal est une préoccupation majeure au sein de nos activités. Un animal qui ne souffre pas à des rendements plus fiables et plus reproductifs, ce qui impacterai également le R de Réduction. Donc sur ce projet on envisage d'impacter favorablement les R de raffiner et réduire.
Procédures
Les rates recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères ou mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, la moitié des animaux prévus vont passer en petite chirugie de transfert d'embryons sous anesthésie, alors que l'autre groupe, sera simplement anesthésié, sans aucune procédure invasive supplémentaire. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total.
Impact sur les animaux
Le geste technique d'injection sous contention est un acte qui peu être un peu stressant pour l'animal, mais il ne dure que quelques secondes (environ 5 secondes) et est peu douloureux. Les animaux restent sous surveillance après leurs diverses injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Les points de surveillance sont les suivants : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au niveau du site d'injection. Les animaux opérés (acte chirurgical) restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante. Les points de surveillance post-opératoire sont : l’apparence de l’animal, son comportement (prostré….), l’aspect du site de chirurgie (rongeur, gonflement, écoulement, automutilation….)
Devenir
Les femelles gestantes doivent mettre bas et nous devons comptabiliser le nombre de petits pour l'analyse de notre projet. Elles seront ensuite mises à mort, puisque nous ne pouvons pas réutiliser ces femelles dans le cadre de nos activités de service. Il en est de même pour les portées.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de l'effet des molécules antalgiques et anti-inflammatoires sur le bon déroulement de la gestation in vivo et la mise bas afin de raffiner nos protocoles chirurgicaux de transfert d'embryons et d'insémination de sperme.
Réduction
Notre activité est connue et il existe bon nombre de données témoins, ainsi, nous avons juste besoin de faire des groupes expérimentaux. Un bonne analyse bibliographique a été faite pour ajuster au mieux le protocole antalgique choisi avec le vétérinaire. Le projet se fera en 2 parties. La première partie (groupe 1) consiste uniquement à valider le fait que les molécules et doses choisies n'altèrent pas le bon déroulement des gestations et mises bas, sur les femelles gestantes mais qui n'ont pas subies de chirurgie. Seulement si cette étape est validée, nous passerons à la phase 2 (groupe 2, avec chirugie de transfert d'embryons). Nous avons choisi un effectif de 10 femelles pour chaque groupe et pour chaque espèce afin d'obtenir des résultats de comparaison fiables.
Raffinement
Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier à toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Les animaux sont hébergés en cages ventilées dans des conditions adéquates pour l'espèce. Des enrichissements (nids et quelques croquettes dans le fond de la cage pour les souris et nids + bois et balles à ronger + croquettes dans le fond de la cage pour les rats) sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation. Comme il s'agit ici d'un test, si une douleur ou un inconfort est détéctée, la femelle sera mise à mort pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons des mère porteuses, il nous faut donc des femelles en âge de procréer donc entre 10 semaines et 6 mois (pour les 2 espèces).
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Des souriceaux nouveau-nés et juvéniles sont anesthésiés quelques minutes puis tués pour en extraire une partie du système nerveux, tandis que d'autres souris reçoivent deux solutions, par le nez sous anesthésie gazeuse ou par injection dans le ventre, avant des mesures de leur respiration en enceinte fermée. 1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, que le porteur décrit comme "une source de douleur et de stress". Une partie porte la mutation du syndrome d'Ondine, où la respiration ne réagit plus à l'excès de CO2, et ces souris mutantes risquent des troubles respiratoires mortels lors des administrations par le nez sous anesthésie. L'équipe veut savoir si des agents qui empêchent la formation d'agrégats de protéines améliorent leur respiration. Le résumé ne nomme ni les deux solutions ni ces agents, et ne dit pas si la biopsie des nouveau-nés se fait sous anesthésie.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles puis adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) puis recevront une administration par voie nasale de deux solutions (faible volume par narine ; en 10 minutes par souris). 48 heures séparent les 2 administrations. D’autres souris juvéniles puis adultes recevront par administration intrapéritonéale les deux solutions. 48h sépareront les deux administrations. La mesure des variables ventilatoires chez les souris juvéniles et adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 60 min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Une biopsie caudale (au niveau de la queue, inférieure à 2 mm) est réalisée chez les souris nouveau-nées, juvéniles et adultes pour génotypage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés pour des contraintes zootechniques (agression entre congénères, etc...). Dans ce cas, la structure chargée du bien-être animal sera toujours sollicitée pour trouver la solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors de ces administrations sous anesthésie, une surveillance accrue en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène, présent sur des neurones impliqués dans la sensibilité au dioxyde de carbone (hypercapnie). Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et leur contrôle, des souris sauvages ; étude de l’influence des agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude de la ventilation chez l’animal juvénile et adulte vigil et de l’effet sur la respiration des agents anti-agrégats appliqués par administration intranasale et par injection intrapéritonéale.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et chacune peut subir un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue jusqu'à une fois par jour pendant 20 jours consécutifs. Toutes sont infectées par des parasites du paludisme, injectés dans la patte, une veine ou l'oreille, ou transmis par des piqûres de moustiques, et une partie reçoit des candidats vaccins par injections répétées. Certaines sont opérées : ouverture de l'abdomen pour filmer le foie sous une anesthésie maintenue jusqu'à la mise à mort, ou, avec réveil, pose d'un anneau en titane dans l'abdomen, ablation de la rate ou greffe de peau humaine. L'équipe espère en tirer, à terme, un vaccin contre la première phase de l'infection. Les souris infectées sont tuées avant l'apparition de la prostration, du poil altéré ou de la perte de poids, signes que le parasite se multiplie sans contrôle dans leur sang.
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de cette phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou de nouvelles approches vaccinales et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de Plasmodium falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements de sang au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera le maximum par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental. Le rongeur anesthésié pourra être exposé à des injections intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, ou intraveineuse, ainsi que à de micro-injection dans la peau et à de piqûre des moustiques. Toutes ces procédures sont classifiées comme étant de sévérité légère. Pour l’imagerie intravitale du foie à court terme sans réveil, la souris anesthésiée sera soumise à une laparotomie avant la séance d’imagerie. Pendant la séance d'imagerie la souris sera maintenue constamment anesthésiée jusqu'à sa mise à mort à la fin de l'expérience. Pour l’imagerie intravitale à long terme du foie, de la rate, ou de la peau humaine greffée, l'intervention chirurgicale pour l'implantation d'un anneau d'imagerie ou de la greffe sera réalisée sur des souris anesthésiées. Des analgésiques seront utilisés pendant l’opération et les soins post-opératoires. Pendant la séance d'imagerie les souris seront maintenues constamment anesthésiées. Les procédures impliquant un acte chirurgical avec réveil sont classifiées comme étant de sévérité modérée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les reutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité etique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide du logiciel SHADE qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont gérées par l'utilisation d’anesthésiques et antalgiques.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Etude du rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation des cellules germinales chez le foetus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.
Procédures
Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits sous forme de dialyse péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vocalises spontanées, difficultés respiratoires, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement : ces signes déclenchent la mise à mort anticipée des rats en phase de décompensation. 3 374 rats vont être utilisés au total, 1 368 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 356 un niveau modéré et 650 un niveau léger, tous tués pour l'analyse histologique du foie, des reins et du cerveau. Chacun reçoit jusqu'à 32 administrations de tétrachlorure de carbone, deux par semaine pendant seize semaines, ou subit une laparotomie avec ligature des voies biliaires, avant que des injections de lipopolysaccharide bactérien ou douze administrations d'éthanol ne déclenchent la défaillance hépatique. Le porteur écrit que la décompensation peut inéluctablement conduire l'animal à la mort, et n'appuie l'effectif de 3 374 rats sur aucun calcul.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. La principale cause de cette pathologie est la cirrhose hépatique qui est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 32 administrations de CCl4 (tétrachlorure de carbone, agent fortement hépatotoxique) à raison de 2 par semaines pendant 16 semaines (15 secondes) ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) Pour les études pilotes : un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Pour les études avec produits : un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Décompensation provoquée selon les procédures : Entre 18 et 20 administrations de CCl4 à raison de 2 par semaines pendant 9 ou 10 semaines (15 secondes) Ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Déclenchement de la décompensation : Soi 4 administrations de LPS (Lipopolysaccharide: fragment de la paroi bactérienne entrainant une réaction inflammatoire à l'identique de celle rencontrée lors d'une infection) (15 secondes) à raison d’une administration journalière pendant 4 jours avec ou sans anesthésie selon la voie retenue soi 12 administrations d’éthanol à raison de 3 administrations par jour pendant 4 jours (15 secondes) un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Si procédure avec produit à étudier ajouter: 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation qu’elle soit « spontanée » en prolongeant l’induction soit dans l’épisode aigu associé à l’administration de l’agent précipitant à un stade plus précoce de la cirrhose compensée peut inéluctablement le conduire à la mort, c'est par définition la caractéristique du modèle étudié dans ce projet. Nous reproduisons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent qui dans le cadre d’une ACLF (décompensation ou aggravation d’une décompensation rapide et brutale par un agent précipitant - infection, absorption massive d’alcool, intoxication médicamenteuse, …- chez des patients souffrants d’une maladie chronique du foie) peuvent avoir une survie estimée à 28 jours dans 70% des cas. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner (sauf dans le cadre du binge drinking où les pertes d’équilibres peuvent aller jusqu’à l’incapacité à se retourner), une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés chez les animaux en phase de décompensation. Ils constitueront un point d’arrêt et une mise à mort des animaux par anticipation.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue ou chronique. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.)
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. L’estimation du nombre d’animaux des groupes finaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés sur la pathologie. Les procédures de caractérisation des modèles permettront d’ajuster au mieux ce nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet thérapeutique de composés.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (prolongation de l’agent inducteur ou administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. L’insuffisance hépatique qui conduit à l’encéphalopathie étant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans: "Phenobarbitone induced enlargement of the liver : its relationship to carbon tetrachloride induced cirrhossis -Br. J.Exp.Pathol. 1981 Jun;62(3):283-8 », c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gfr environ que le ratio du poids du foie et le plus favorable, de même que l’expression du cytochrome P450 qui est plus stable.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris_Amendement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Caractérisation d’un nouveau modèle de neuropathie de type Charcot-Marie-Tooth du à des mutations du gène KCTD11
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
108 souris, dont un tiers privées du gène kctd11 et un tiers porteuses d'une seule copie, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à 18 mois pour le prélèvement de leurs nerfs et de leur moelle épinière. À 6, 12 et 18 mois, chacune passe quatre tests, locomotion et équilibre, démarche, force musculaire mesurée en la tenant par la queue et en tirant, sensibilité de la plante des pattes à un filament appliqué jusqu'à cinq fois. À 12 et 18 mois s'ajoute la mesure des vitesses de conduction nerveuse, par aiguilles plantées à travers la peau des pattes sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique disposer de modèles cellulaires dérivés de cellules de patients et les utiliser, puis conclut que le remplacement reste impossible parce que ces modèles ne reconstituent pas le système nerveux périphérique complet.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer si le modèle murin dit « knock-out » (KO), dans lequel nous avons supprimé le gène kctd11, est un bon modèle pour la maladie humaine, causée par des mutations dans ce même gène KCTD11. Il s'agit de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, une maladie caractérisée par une dégénérescence progressive des nerfs du Système Nerveux Périphérique. Nous étudierons l'état des nerfs des souris KO en comparaison à des souris normales, grâce à des analyses de la structure des nerfs, à la mesure des vitesses de conduction nerveuse, ainsi qu’à l’évaluation des capacités locomotrices des souris, à différents âges (6-12-18 mois). Disposer de ce modèle va nous permettre de mieux comprendre comment la perte du gène KCT11 aboutit à une neuropathie et à définir des traitements pour la maladie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce modèle de souris présente des caractéristiques de la maladie CMT et a le potentiel d’être un nouveau modèle de la pathologie afin de développer des traitements futurs pour les patients atteints de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.
Procédures
Les animaux subiront quatre tests comportementaux, peu ou pas invasifs, à trois âges différents (6, 12 et 18 mois). Ces tests visent à tester les fonctions locomotrices des souris et à repérer des troubles de la sensibilité (ex: toucher, douleur). Les 4 tests sont listés ci-dessous: 1) un test pour mesurer la locomotion et l’équilibre des souris. Ce test se déroule sur 2 jours : 1er jour pour habituation, 2ème jour pour mesure. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). 2) un test pour évaluer la démarche de l'animal. Durée : 15 minutes. 3) un test pour évaluer la force musculaire des souris. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). Il est réalisé pour les pattes avant seulement puis répété pour les pattes arrière seulement. 4) un test pour analyser la sensibilité des souris à un stimulus mécanique au niveau des dessous des pattes. Durée : 10 minutes (temps de repos inclus). A 12 et 18 mois, on ajoute un cinquième test, qui sert à mesurer les vitesses de conduction des nerfs, par pose d’électrodes (aiguilles), sans chirurgie, au travers de la peau, au niveau des pattes inférieures. Nous réaliserons 3 mesures pour chaque patte, soit 6 mesures au total par animal. L’intervention dure environ 10-15 minutes par animal. A chaque âge, l’ensemble des tests, pour l’ensemble des souris, s’effectuera sur 3 semaines : La 1ère semaine : test 1 (2 jours) et test 3 (2 jours). La 2ème semaine : test 2 (4 jours) La 3ème semaine : test 4 (2 jours) et mesure des vitesses de conduction nerveuse (2 jours) (à 12 et 18 mois uniquement).
Impact sur les animaux
Les tests qui sont prévus dans ce projet ne sont pas ou peu invasifs. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus invasif est la mesure des vitesses de conduction nerveuse. On pose des électrodes au niveau des pattes inférieures. La pose des électrodes est non invasive (sans chirurgie) :les électrodes sont posées à travers la peau. Ce test n’est réalisé qu’à deux âges (12 et 18 mois). Pour éviter toute douleur ou inconfort, ce test est réalisé sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont maintenus au chaud grâce à un coussin chauffant et une couverture de survie. Enfin, afin d'identifier et de génotyper les animaux en procédure, ces derniers subiront la pose d’une puce RFID (puce électronique que l'on peut ensuite scanner à l'aide d'une scannette pour identifier facilement les animaux) et un petit poinçon à l'oreille à l'âge de 4 semaines. Ceci nécessite une contention des animaux de quelques secondes.
Devenir
A l'issue de l'expérimentation, les animaux seront âgés (18 mois) et nous avons besoin de récupérer leurs nerfs et la moelle épinière pour étudier quels sont les effets de la maladie sur la structure de ces tissus à long terme. Ainsi, les animaux seront mis à mort pour prélever ces tissus.
Remplacement
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique du Système Nerveux Périphérique, composé par l'ensemble des nerfs craniens et les nerfs "spinaux"qui servent à innerver tous les muscles du corps pour les faire bouger ou à transmettre au cerveau, à partir des extremités, une information de type douleur par exemple. Chez l’homme, le Système Nerveux Périphérique est inaccessible et impossible à étudier. L’utilisation de modèles cellulaires, à base de cellules souches adultes, dérivées de cellules (peau ou sang) prélevées chez un patient, peut dans certaines circonstances, constituer une bonne alternative, et nous les utilisons. En effet, nous savons, à partir de ces cellules souches, fabriquer les neurones du Système Nerveux Périphérique, mais pour l'instant nous ne parvenons pas à reconstituer, en tube, le Système Nerveux Périphérique complet. Ils sont un modèle extrêmement simplifié, qui ne permet pas notamment de reproduire la complexité du Système Nerveux Périphérique et de ses interactions avec les muscles. Il existe un autre modèle in vitro de la maladie, mais qui est obtenu à partir d’embryons de rongeurs (rat ou souris, génétiquement modifiés ou non) et qui donc nécessite l’utilisation des animaux. Pour finir, nous travaillons sur des anomalies du système neuromusculaire et devons donc pouvoir étudier la locomotion et la sensibilité à la douleur chez des animaux vivants. C’est pourquoi, malgré l’existence de modèles cellulaires alternatifs, que nous utilisons pour réduire et raffiner, le remplacement n’est pas possible et cette étude nécessite l’utilisation de modèles souris. Le passage au modèle animal est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Nous aurons trois groupes d'animaux (mutés (KO), hétérozygotes pour la mutation (HET) et sauvages (WT)). Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation du projet est de 36 animaux par groupe. Ce nombre a été calculé, par un test statistique, au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur les paramètres que nous allons évaluer.
Raffinement
Le phénotype des souris est très léger et leur survie est identique à celle des animaux contrôles.Il n'y a aucune chirurgie dans ce projet. Les tests sont décrits au paragraphe 5.6.1. Lors de chaque test, la salle est réservée et seule la personne expérimentatrice est présente dans la salle. Pour tous les tests, les animaux sont habitués au minimum 30 min dans la pièce expérimentale, avant le début de l’expérience. Après l’expérience, (et un temps de repos selon les tests), les souris sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Afin de limiter le stress des animaux durant l’expérimentation, on procède toujours à une habituation, en particulier pour les tests 1 et 2. Lors de la manipulation, nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. L’habituation permet aux souris de limiter le stress qu’elles pourraient ressentir.Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, 30 minutes avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus stressant est le test de mesure des vitesses de conduction nerveuse. Il sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’anesthésie sera suffisamment profonde, les animaux seront placés sur un coussin chauffante pour éviter l’hypothermie. Une petite couverture de survie pourra être placée sur l’animal pour bien maintenir sa température corporelle. Après les mesures, les souris sont maintenues sur le coussin chauffant, recouvertes d’une couverture de survie, jusqu’au réveil, puis placées dans une cage une dizaine de minutes sous surveillance. Lorsqu’elles sont bien réveillées, elles sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Tout le long de la procédure, des points limites sont définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption définis.
Choix des espèces
Le laboratoire a identifié un nouveau gène muté dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), une maladie génétique des nerfs périphériques (nerfs qui servent à faire bouger les muscles), qui entraine des troubles de la locomotion et de la sensation (toucher, douleur). C'est une maladie neurologique progressive aujourd'hui incurable. A l’heure actuelle, le rôle de ce gène dans le déclenchement de la maladie n'est pas bien compris, mais cette compréhension est nécessaire pour pouvoir mettre au point des traitements. Malgré le développement de modèles cellulaires alternatifs, nous avons besoin d'étudier un modèle animal, dans lequel le gène incriminé est invalidé, pour regarder quelles sont les anomalies des nerfs de ces souris, comprendre les mécanismes par lesquels l'invalidation du gène mène à ces anomalies, et tester des traitements qui permettent de supprimer les anomalies. le choix d'un animal dans lequel le gène est invalidé est justifié par le fait que chez les patients, les mutation qui causent la maladie aboutissent à une perte de fonction de la protéine représentée par le gène muté. Les expériences proposées dans ce projet sont réalisées à partir de mois et jusqu'à 18 mois, car la neuropathie, dont sont atteints les patients mutés pour le gène, est une maladie neurologique lentement progressive. Il faut donc pouvoir étudier des animaux agés. De plus à plus long terme, avant d'envisager un essai thérapeutique chez l'homme, il sera nécessaire de tester les traitements sur un modèle murin.