Procédures légères

1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.

Procédures

Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.

Devenir

Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant onze jours, elles reçoivent des gavages quotidiens et une injection d'un agent anticancéreux qui enflamme la muqueuse intestinale, avec pesées et prélèvements répétés, pour tester des bactéries probiotiques contre cette mucosite. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, un pelage hérissé et une apathie comme dommages attendus, et tue les souris en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que l'animal reste "le seul moyen" de reconstituer les interactions entre le microbiote et le système immunitaire.

Objectifs

La mucosite est une inflammation et/ou une ulcération de la muqueuse du tractus digestif, en particulier buccale et intestinale. Elle est un problème majeur rapporté chez 50 à 80 % des patients subissant une chimiothérapie, affectant significativement leur qualité de vie. Cette inflammation peut être provoquée par l´agent anti-cancéreux utilisé. Plusieurs études ont montré qu’elle était associée à une modification du microbiote sain et induisant une aggravation des effets de la chimiothérapie (diarrhée, saignement dans les selles, douleurs abdominales, perte de poids). Dans ce contexte, il est nécessaire de trouver des traitements qui restaurent un microbiote intestinal sain. De nombreuses bactéries probiotiques ont été décrites comme des outils prometteurs pour le traitement et la prévention des inflammations intestinales. Ceci a été démontré dans de nombreux modèles précliniques. Le but de ce travail est d'étudier les effets anti-inflammatoires d’une famille de bactéries probiotiques, sur la mucosite murine expérimentale induite par un agent anticancéreux particulier. L’emploi de ces bactéries comme agent préventif et thérapeutique contre la mucosite constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de l’inflammation intestinale chez les patients sous traitement par l´agent anti-cancéreux. Dans ce modèle, l’agent anticancéreux induit une inflammation des tissus semblable à celle retrouvée chez des patients présentant des effets secondaires. La réponse immunitaire développée suite au traitement peut être étudiée en détail. Le projet sera réalisé en 2 étapes : • Validation du modèle de mucosite dans nos conditions expérimentales • Evaluation des effets préventifs et thérapeuthiques des bactéries ou de composés qui en dérivent sur l’inflammation intestinale ; Analyser l'effet de ces administrations sur la composition du microbiote intestinal avant, pendant et après mucosite ; Evaluer l'action des bactéries ou composés dans l'amélioration des signes cliniques en cas de mucosite due à l´agent anti-cancéreux. Ces bactéries ainsi que leurs composés ont été testées précédemment lors d’essais in vitro et in vivo sur un modèle d’inflammation aigüe reproduisant les symptômes des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Suite à des résultats positifs concernant leur effet anti-inflammatoire sur une inflammation aigüe, nous souhaiterions évaluer leur efficacité sur une inflammation due à l’agent anti-cancéreux.

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des patients cancéreux traités par cet agent anti-cancéreux développe des effets secondaires au niveau intestinal tels qu’une inflammation de la muqueuse appelée mucosite, due principalement à la réponse inflammatoire. Ceci induit des modifications tissulaires et favorise l’altération du microbiote et de l’équilibre intestinal. L’ensemble de ces modifications participe au développement de diarrhée et d’hémorragies intestinales. Ces effets, en plus des contraintes liées au traitement et à la maladie, contribuent très souvent à une baisse de moral des patients combinée à une importante perte de poids. De plus, à l'exception des traitements palliatifs (anesthésiques ou antibiotiques dans les cas graves), il n'existe aucune option thérapeutique connue pour prévenir la mucosite intestinale induite par la chimiothérapie. Il est donc important de développer d’autres approches complémentaires qui préservent les effets thérapeutiques de cette chimiothérapie mais qui protègent contre ses effets secondaires au niveau intestinal. Parmi ces nouveaux traitements se trouvent les probiotiques, qui sont des micro-organismes (bactéries ou levures) vivants ayant des effets bénéfiques sur l’organisme. Beaucoup de bactéries déjà utilisées comme probiotiques, sont des candidates potentielles car leurs effets anti-inflammatoires au niveau intestinal ont déjà été prouvés sur d’autres pathologies, sans effet secondaire. Des bénéfices en termes de connaissances sur l’interaction hôte - microorganisme, plus particulièrement microbiote intestinal - santé intestinale pourront être obtenus au cours de ce projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Nous aimerions savoir si les bactéries testées sont capables d'améliorer les signes cliniques de la mucosite et quels changements induisent-elles au niveau de la réponse immunitaire et histologiques pour y parvenir. Pour les nouveaux microorganismes n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera plus longue mais constitue un objectif d’amélioration du bien-être (réduction des effets secondaires au niveau intestinal du traitement et amélioration de la qualité de vie des patients sous traitement).

Procédures

- Pesée quotidienne pendant 11 jours, une pesée dure environ 5-10 secondes, animal vigile, 448 animaux. - Gavage intra gastrique quotidien de 10 secondes maximum pendant 11 jours, animal vigile, 448 animaux. - Isolement des souris pendant 10 minutes maximum dans des pots transparents pour prélever des crottes fraiches. 3 fois pendant les 11 jours , animal vigile, 448 animaux. - Injection intrapéritonéale unique de 10 secondes d’un agent anti-cancéreux (ou de son solvant pour contrôle), animal vigile, 448 animaux. - Isolement quotidien des souris pendant 10 minutes maximum pour réaliser le score clinique. 4 fois pendant les 11 jours (2 de ces isolements seront communs à ceux réalisés pour la collecte de feces). Animal vigile, 448 animaux - injection unique pour l’anesthésie de 10 secondes pendant le 11 jours (avant le prélèvement de sang). Animal vigile, 448 animaux - Prélèvement de sang de 30 secondes après l´administration d’un traceur fluorescent (par gavage) une fois pendant le 11 jours. Animal anesthésié, 448 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole viennent du traitement par l´agent anti-cancéreux qui provoque une inflammation des muqueuses. Les dommages principaux liés au traitement peuvent se manifester par une perte de poids, une diarrhée légère (crotte molle) ou une déshydratation due à la diarrhée. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voutée, yeux clos ou mi-clos, apathie. Lors du prélèvement de crottes et lors de la réalisation du score clinique, les animaux seront isolés pendant 10 minutes maximum, cela peut induire un stress le temps de l’isolement. Les animaux conservent cependant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres animaux. Aussi, les gavages des bactéries et des composés bactériens ainsi que l’injection intrapéritonéale et le prélèvement de sang peuvent entrainer un stress et/ou une douleur le temps de la manipulation.

Devenir

A l’issue de chaque prodédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes pour de futures analyses.

Remplacement

Le présent projet vise à étudier l’effet du microbiote intestinal, plus particulièrement d´une espèce bactérienne en particulier, sur la réponse immunitaire des animaux, principalement son effet anti-inflammatoire lors d’une inflammation due à un agent anti-cancéreux précis (et déjà employé en médecine humaine). A l’heure actuelle, l’utilisation des animaux reste le seul moyen qui permet de reconstituer l’environnement et les interactions complexes que l’on retrouve entre le microbiote et le système immunitaire d’un être vivant.

Réduction

Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données issues de la littérature et acquises les années précédentes sur des modèles similaires comparables ont permis de calculer les tailles de groupes. Le nombre obtenu correspond au maximum d’animaux qui peuvent être utilisés par groupe. Au total, nous utiliserons 448 animaux.

Raffinement

Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où nous injectons l’agent anti-cancéreux aux animaux, un score clinique individuel est établi chaque jour. Les critères observés seront l’aspect des fécès (diarrhée), l’aspect du pelage, la posture, la réponse face au stimulus, la locomotion et la déshydratation de chaque animal. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Des traitements seront mis en place si les animaux présentent des signes de douleur ou stress. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux seront hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton ou en polycarbonate. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. La surveillance, les injections, prélèvements et manipulations seront réalisés par des expérimentateurs formés et maitrisant ces gestes afin de réduire au maximum le temps de manipulation et donc le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est le modèle d’étude dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, car leur développement intestinal est relativement similaire à celui de l'intestin humain et elles possèdent un grand nombre de réponses immunitaires, de microbiomes et de gènes identiques aux l´homme. Il est possible d’induire une mucosite chez la souris avec différents produits chimiques. Les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 semaines. Les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits bactériens sur une mucosite induite. De plus, cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données.

1 522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Nouveau-nés puis adultes, elles reçoivent jusqu'à vingt-deux gavages, des prélèvements de sang et de fèces, et sont soumises à une colite induite chimiquement puis à des infections par des bactéries pathogènes, pour tester des probiotiques contre les effets des antibiotiques pris tôt dans la vie. Le porteur indique une perte de poids, un pelage hérissé et des diarrhées comme signes attendus. Il justifie la mise à mort de toutes les souris par le fait que leur survie est "incompatible" avec les prélèvements effectués.

Objectifs

Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée par différents types de microorganismes (dont des bactéries, champignons et virus), et influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). L’administration d’antibiotiques dans la périnatalité induit des perturbations majeures au niveau de la primocolonisation de l’intestin du nouveau-né. Au cours du développement précoce du nouveau-né, des perturbations dans les interactions entre le microbiote et l'hôte pourraient nuire de manière irréversible et durable à la maturation du système immunitaire, prédisposant l'hôte à développer des maladies inflammatoires et une altération de la fonction de la barrière intestinale. Cette fonction correspond à la capacité de la muqueuse intestinale à confiner des éléments indésirables (typiquement des bactéries pathogènes) dans la lumière intestinale, tout en conservant sa capacité d’absorption des nutriments. Par ailleurs, la prise d’antibiotiques est l’un des nombreux facteurs intervenant dans l’apparition de certaines maladies inflammatoires comme la maladie de Crohn, de l’obésité, et à une plus importante sensibilité aux infections Dans ce contexte, des interventions ciblées au tout début de la vie pourraient constituer des stratégies faciles à mettre en œuvre et à contrôler pour compenser les perturbations du microbiote dues à la prise des antibiotiques tôt dans la vie. Dans ce projet, nous nous proposons d´utiliser un modèle souri de prise d´antibiotiques précoce et d’étudier la capacité d’une supplémentation avec différents probiotiques candidats, c’est-à-dire des microorganismes ayant des effets bénéfiques sur la santé, à restaurer le microbiote intestinal. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons utiliser un modèle de colite induite chimiquement et un modèle d’infection par des agents pathogènes bactériens intestinaux ou non-intestinaux (2 pathogènes différents).

Bénéfices attendus

Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de 5 souches potentiellement probiotiques à améliorer la résilience du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liés à la prise périnatale d’antibiotiques. Il s’agit donc d’améliorer les connaissances fondamentales et les perspectives potentielles d’utilisation de bactéries probiotiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par des traitements antibiotiques survenus précocement.

Procédures

Contentions et gavage sur animal vigile: 21 contentions et gavages pour 1522 souris + 1 contention avec gavage pour 918 souris (les animaux subiront donc ce geste 21 ou 22 fois, selon les cas) ; chaque contention/gavage dure environ 15 secondes. Prélèvement de fèces : 1 fois pour 1522 animaux + 2 fois pour 432 souris + 7 fois pour 486 souris (les animaux subiront donc ce type de prélèvement 1 fois, 3 fois ou 8 fois selon les cas) ; chaque prélèvement dure quelques minutes. Anesthésies : 1 fois pour 915 animaux ; Une anesthésie = une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. Administration intra-rectale sur animal anesthésié : 1 fois pour 432 animaux. Une administration = 20 secondes, par un manipulateur expérimenté. Administration intra-veineuse sur animal anesthésié : 1 fois pour 486 animaux. Une administration = 20 secondes, par un manipulateur expérimenté. Prélèvement de sang submandibulaire : sur animal vigile, 1401 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement de l’inflammation induite ou des infections. Les principaux symptômes visibles attendus sont : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée. Les traitements par antibiotiques pourraient générer des altérations du transit intestinal, de type diarrhée légère.

Devenir

La survie des animaux est incompatible avec les différents prélèvements et procédures effectués.

Remplacement

Les rongeurs sont utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes.

Réduction

Les bactéries testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver , pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques seront aussi utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée (12 souriceaux en moyenne). Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte.

1 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un changement de régime alimentaire pendant quatre semaines et des prélèvements de sang par incision de la queue, pour étudier le rôle de l'inflammation dans une maladie du foie liée au diabète et à l'obésité. Le porteur indique que 880 souris de bon génotype sont gardées vivantes pour la reproduction et que les 840 autres sont tuées en fin de procédure pour prélever le foie. Il décrit les modèles in vivo comme "indispensables" et affirme qu'ils "ne peuvent pas être substitués".

Objectifs

Les maladies comme le diabète et l'obésité sont généralement associées à une accumulation excessive de lipides dans le foie. Cette accumulation anormale de lipides va induire le développement de la maladie du foie, qui pourrait évoluer vers complications ou même cancer du foie. Il est bien établi aujourd'hui que les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la mise en place de cette pathologie. Cependant, les mécanismes sont moins bien connus. Ce projet de recherche fondamentale vise à déchiffrer les mécanismes de ces cellules dans le foie en utilisant un modèle de souris afin de déterminer le spectre des conséquences associées au diabète et à l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de déchiffrer les rôles des cellules immunitaires dans les altérations du foie associées au diabète et à l'obésité. Il permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait définir une nouvelle approche thérapeutique dans l’obésité et ses complications.

Procédures

Changement de régime alimentaire pour l'induction de la maladie du foie, 4 semaines par animal. Microcoupure de l'extrémité de la queue, 10 secondes, 1 fois par animal. Prélèvement sanguin par incision de l'extrémité de la queue, 10 secondes, 3 fois par animal.

Impact sur les animaux

Régime alimentaire induisant une perte de poids. Coupure au bout de la queue qui peut entraîner une douleur légère.

Devenir

Les animaux non utilisés (femelles et/ou de mauvais génotype) sont mis a mort. Des animaux femelles et males avec le bon génotype sont gardés en vie pour la reproduction. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt, notamment le foie pour analyse ultérieures.

Remplacement

Pour étudier le métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables et ne peuvent pas être substitués.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris générera donc de nombreuses informations. Nous avons calculé le nombre minimal de souris à utiliser dans cette étude pour obtenir le nombre de cellules suffisantes pour réaliser les différentes analyses à la fin de l’étude.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. La grille de score a donc été adaptée de façon à veiller au bien-être des animaux sans mettre en péril les résultats et sa fréquence sera portée à 2 fois par semaine. C'est le poids des animaux qui déterminera la durée de la procédure du groupe et n'excédera jamais 4 semaines. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès à l'eau et à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le milieu est enrichi avec une maison et du coton compacté de façon à faire leur nid.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l’étude de l’obésité et du diabète. Les gènes impliqués dans ces conditions jusqu’à présent identifiés chez l’Homme sont conservés chez la souris. La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont adaptées à ce projet. Les souris seront génotypées à 10 jours. Les souris utilisées auront 16 - 18 semaines au début de la procédure, ce qui correspond à la maturité sexuelle des souris soit la stabilisation hormonale. A la fin de la procédure, les souris seront âgées de 20 à 22 semaines. Il s’agit de souris adultes.

109 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines, génétiquement modifiées, développent spontanément un cancer anorectal accompagné d'une inflammation intestinale, avec perte de poids, prostration et diarrhée à partir de six ou sept mois. D'autres subissent des microlésions de la jonction anorectale qui provoquent des saignements de l'anus, ainsi que des injections rétro-orbitaires et une phalangectomie. Le porteur évoque les organoïdes comme alternative mais affirme qu'aucun ne reproduit aujourd'hui cette région, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Avec plus de 40 000 cas par an en France, le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Les services de santé publique s’accordent tous sur le fait que ce nombre de cas sera plus que doublé d’ici 2035. Faute de connaissance des mécanismes précoces conduisant à ce cancer, son diagnostic est très souvent tardif expliquant une prise en charge à un stade trop avancé de la maladie et donc le fort taux de mortalité. Il y a donc urgence de comprendre les étapes précoces de la maladie pour la soigner à son début. Ce cancer se localise préférentiellement dans la partie basse du rectum dans la région entre le rectum et l’anus, appelé la jonction anorectale. Chez l’Homme plusieurs arguments suggèrent que des micro-cassures spontanées de la région anorectale notamment lors du passage de selles, provoqueraient une entrée des bactéries qui vivent dans le rectum et donc créeraient une inflammation à l‘origine du cancer. Ce projet de recherche vise à comprendre comment la région anorectale se répare pour prévenir l‘entrée des bactéries et de l’inflammation. L’hypothèse basée sur des études antérieures suggère que le système immunitaire et plus particulièrement certains globules blancs contribuent à la réparation de la jonction anorectale.

Bénéfices attendus

Ainsi, en validant que certains globules blancs sont capables réparer les micro-cassures de la jonction anorectale, ce projet devrait permettre de considérer les patients présentant un défaut de ces globules blancs comme des sujets à risque de développer un cancer colorectal et ainsi de mettre en place une prise charge à un stade très précoce la maladie afin d’augmenter leur survie.

Procédures

Certains animaux servent à l’élevage et ne subissent pas de gestes techniques autres qu'une phalangectomie, d’autres subissent au maximum une unique procédure avant la mise à mort, consistant à réaliser des microlésions de la jonction anorectale, cette intervention sera réalisée une unique fois par animal.

Impact sur les animaux

Les souris ayant une réponse incomplète à la molécule d'intérêt développe un cancer anorectal, associé à une inflammation intestinale qui se manifeste par la perte de poids de la souris, sa prostration et la présence de diarrhée, à partir de 6-7 mois de vie. La procédure de microlésions de la jonction anorectale peut provoquer des micro saignements de l’anus, observables par tapotement avec un mouchoir en papier blanc (petites traces rouges). Ces micro saignements ne durent pas plus de 30 minutes. L’injection intra- veineuse par voie retro-orbitaire est une procédure courante, mais qui peut toutefois causer une douleur courte. Dans l’ensemble des procédures, les contentions des souris sont également une source de stress à ne pas négliger.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort soit suite à la fin des procédures, soit lorsqu’un point limite est atteint.

Remplacement

Une alternative à l’utilisation d’animaux pour des pathologies intestinales serait la génération d’organes in vitro, appelé organoïdes qui, en théorie, impliquerait un seul animal. Si ces organoïdes de côlon sont facilement mis en place dans les laboratoires, il n’existe pas aujourd’hui de méthode permettant la génération d’organoïdes comprenant l’anus, le rectum et la jonction anorectale. La génération de tels organoïdes reste encore un challenge technologique qui impliquerait plusieurs dizaines d’animaux du fait que cette région est unique. Par ailleurs, des bactéries commensales devraient être placées dans la lumière. Une telle approche alternative demanderait dans ses mises au point plus de 30 souris. Par ailleurs, les facteurs physiologiques tels que les tensions physiques dues au passage des selles ne seraient pas prises en compte, excluant toutes conclusions physiologiques des observations qui pourraient être faites in vitro.

Réduction

Le développement de la pathologie dans les souris développant un cancer anorectal est standardisé. 100% des animaux développent spontanément un cancer. Par ailleurs, le site de transformation est très précis et spécifiquement localisé à la jonction entre l’anus et le rectum. Ces conditions font que nous obtenons une puissance statistique forte avec 6 animaux par groupe par rapport aux modèles d’injection de cellules tumorales ou d’agents oncogéniques communément utilisés en cancérologie (le nombre de souris a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistique). Le genre n’ayant pas d’effet sur la pathologie observée, les animaux des deux sexes seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux générés Par ailleurs, les moelles osseuses des animaux mis à mort seront systématiquement congelées. Elles permettront de recréer un système immunitaire génétiquement modifié dans des souris receveuses. Une moelle pouvant générer un système immunitaire dans plus de 20 souris, ces moelles seront partagées avec des chercheurs du monde entier, évitant la génération d’animaux.

Raffinement

Les procédures de microlésions impliqueront en plus d’une anesthésie gazeuse, une injection d’analgésique et une pommade anesthésiante, appliquée en région anale 5 min avant les microlésions. Ces 2 produits sont efficaces dès les premières minutes et durent entre 1h30 et 4h, délai au-delà duquel la fonction de défécation doit être revenue. Par ailleurs, le geste de microlésion est maitrisé par les expérimentateurs qui ont été formés par l’équipe ayant décrit la méthode des microlésions. Les animaux ne seront jamais isolés directement afin d’éviter tout stress et si un isolement est obligatoire il se fera via un système de plexiglass assurant un maintien olfactif et visuel. En plus des observations faites par les responsables de protocoles et le personnel technique, une observation quotidienne des animaux par les responsables bien être sera réalisée. Les expérimentateurs surveilleront le moindre signe de souffrance de l'animal selon un système de score, ce qui permettra une réponse adaptée à la douleur en question.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire impose que cette étude ne se fasse que dans un système proche de celui de l’Homme. La souris, apparaît comme un modèle d’expérimentation animale de choix. De plus la physiologie de la jonction anorectale est identique à celle de l’Homme et correspond à une région à fort potentiel de transformation. Enfin, les outils d’analyse indispensables à ce projet de recherche, sont développés chez cette espèce animale. Pour les souris dont le phénotype est potentiellement dommageable, les premiers signes cliniques sont observés après l’âge de 6-7 mois de vie. Dans ce contexte, y compris pour les accouplements, aucun animal au-delà de 6-7 mois de vie ne sera utilisé. La maturité du système immunitaire au niveau de l’intestin est établie après 2 mois. Tous les animaux utilisés en procédure auront entre 2 et 6 mois de vie.