Procédures légères
Compréhension et Traitement du Cancer de la Prostate
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 572 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles porteurs de la mutation développent un cancer de la prostate, avec des difficultés à uriner, et reçoivent jusqu'à huit injections espacées de 48 heures avant d'être tuées pour prélever prostate et sang. Les nouveau-nés qui n'ont pas le bon génotype ou le bon sexe sont tués, seuls des reproducteurs restant en élevage. Le porteur affirme que le micro-environnement de la prostate est impossible à mimer in vitro et juge le modèle murin "indispensable" pour tester des immunothérapies dont l'application humaine reste énoncée au conditionnel.
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la deuxième cause de décès par cancer chez les hommes des sociétés occidentales. Le gène PTEN est un suppresseur de tumeur dont la mutation est observée dans la majorité des cancers de la prostate chez l’Homme. Dans notre étude, nous utilisons un modèle murin transgénique dont les mâles développent un CaP du fait de la perte du gène PTEN dans les cellules de la prostate. Ce modèle préclinique de CaP récapitule les phases de progression du CaP humain. La morbidité et la mortalité élevées du CaP avancé nécessitent le développement de nouvelles stratégies de traitement. Les progrès spectaculaires dans le traitement de certains cancers sont liés à l’utilisation de l’immunothérapie mais malheureusement, ce traitement seul est peu efficace pour le cancer de la prostate chez l’homme. Aussi, il a été suggéré qu’il fallait prendre en compte le rôle des différentes cellules immunitaires dans le développement du CaP. Nous avons étudié l’évolution de l’infiltrat immunitaire dans notre modèle pré-clinique de CaP et, nous avons montré une augmentation de certaines populations de cellules immunitaires associées à la progression tumorale et nous suspectons une altération de leurs fonctions biologiques. Le but du projet actuel est d’étudier plus en détail ces cellules immunitaires de la prostate d’un point de vue fonctionnel et de se baser sur nos résultats pour développer des immunothérapies innovantes et évaluer leur efficacité pour ralentir ou stopper le développement du CaP.
Bénéfices attendus
L’ensemble de nos résultats sur le modèle pré-clinique murin nous permettra des avancées dans la compréhension des cancers de la prostate humains et pourrait conduire à de nouvelles combinaisons d’immunothérapies applicables à l’homme et agissant en particulier sur les cellules immunitaires que nous soupçonnons d’être impliquées dans la progression tumorale dans le cancer de la prostate.
Procédures
Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuses, des contentions de quelques secondes, des biopsies pour le génotypage, des injections intrapéritonéales (IP) sur animaux vigiles, des injections intraveineuses (iv) sous anesthésie gazeuse et un prélèvement sanguin d’un volume n’excédant pas 0.1ml/souris au niveau de la veine sous-mandibulaire sur animaux vigiles avant la mise à mort, l’ensemble de ces gestes techniques n’excédant pas quelques secondes car étant réalisés par du personnel formé et expérimenté. Les animaux en élevage seront soumis à 1 tatouage au niveau des phalanges (quelques minutes) et 1 biopsie au niveau de la queue (quelques secondes) - Certains animaux recevront 2 injections IP à 24h d’intervalle et après 2, 7, 15, 30 ou 60 jours, ils recevront 1 injection iv et 3 min après celle-ci, ils seront soumis à 1 prélèvement sanguin. - Certains animaux recevront 2 injections iv à 1h d’intervalle et 3 min après la 2nde injection iv, ils seront soumis à 1 prélèvement sanguin. - Pour l’induction du cancer de la prostate, certains animaux recevront 5 injections IP à 24h d’intervalle. A) Après 3 mois ou 5 mois, certains animaux en expérimentation seront soumis à des traitements exploratoires et recevront 1 injection IP puis après 5 jours, ils recevront 1 injection iv et 3 min après celle-ci, ils seront soumis à 1 prélèvement sanguin; ou B) Après 3 mois, certains animaux en expérimentation seront soumis à des traitements thérapeutiques et recevront jusqu’à 8 injections IP à 48h d’intervalle chacune ou à 8 injections iv à 48h d’intervalle puis 24h après le dernier traitement, ils recevront 1 injection iv et 3 min après celle-ci, ils seront soumis à 1 prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
- Stress dû à la contention - Douleur au point de piqure et suite à la biopsie - Difficulté à uriner et un besoin d’uriner plus fréquent
Devenir
Dans la procédure relative à l’élevage des animaux transgéniques utilisés dans notre étude, certains animaux (mâles et femelles) seront gardés pour le renouvellement des accouplements, tous les mâles qui auront le bon génotype seront gardés en vie et affectés dans des cohortes pour l’étude des macrophages de la prostate, des neutrophiles dans le cancer de la prostate et des tests thérapeutiques dans le cancer de la prostate. Tous les nouveaux-nés qui n’auront pas le bon génotype/sexe seront mis à mort. Tous les animaux transgéniques et non transgéniques affectés dans des cohortes pour l’étude des macrophages de la prostate, des neutrophiles dans le cancer de la prostate et des tests thérapeutiques dans le cancer de la prostate, seront mis à mort à l’issue des différentes procédures et leur prostate et leur sang seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Afin de tester les thérapies de demain pour le traitement du cancer de la prostate, le modèle murin est indispensable. En effet notre projet permet d’étudier le développement tumoral de la prostate in vivo en mimant le plus fidèlement la pathologie cancéreuse humaine. La prostate est un organe complexe, c’est une glande exocrine qui répond à des stimuli hormonaux, qui est constituée de nombreux types cellulaires dont les cellules immunitaires, et qui est connectée aux systèmes sanguin, lymphatique et nerveux. L’ensemble de l’organe dans son environnement naturel et avec ses connections sanguines et lymphatiques est nécessaire pour mieux comprendre l’interaction entre le système immunitaire et l’initiation et la progression du cancer de la prostate et pour tester l’efficacité des immunothérapies. En effet, les processus d’oncogénèse et leur interaction avec le système immunitaire de la prostate sont complexes et nécessitent un micro-environnement spécifique et dynamique qu’il est impossible de mimer in vitro ou sur des modèles ex vivo disponibles à l’heure actuelle. Ce n’est que par l’utilisation de lignées de souris transgéniques que nous pourrons clairement apprécier le rôle des cellules immunitaires dans la progression du cancer de la prostate et l’efficacité des immunothérapies ciblées.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de statistiques pour déterminer le nombre minimal mais pertinent d’animaux utilisés dans notre projet et permettant de déterminer avec un risuqe acceptable si la moyenne des valeurs observées dans les groupes contrôle est égale ou différentes des groupes test. Le résultat est de 12 souris par groupe.
Raffinement
Les souris seront élevées et hébergées dans des cages enrichies avec du coton pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures expérimentales décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Le bien- être et la douleur des animaux seront évalués par une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. La mise en place d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance permettra de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Des traitements anti-inflammatoires et/ou analgésiques adéquats, locaux par application topicale ou systémique dans le biberon seront mises en place et les animaux ayant atteint un point limite seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin, dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la petite taille, la rapidité du cycle de reproduction et les techniques de mutagénèses conditionnelles font de la souris le modèle le mieux approprié pour les études envisagées. Seul le modèle murin transgénique nous permet d’induire une mutation spécifique dans la prostate après la puberté et ainsi reproduire le développement du cancer de la prostate de l’homme. Nous utiliserons des animaux adultes pour l'ensemble des expériences. Les souris seront utilisées à 8 semaines puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte afin que leur système reproducteur dont la prostate et leur système immunitaire soient matures et que les stades de développement du cancer de la prostate miment ceux de l’homme.
Caractérisation de la relation entre l’efficience alimentaire à différents stades de la vie en race bovine Holstein
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Bloquées au cornadis pour deux prises de sang à la queue et pesées à répétition, 240 génisses et 60 vaches taries sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, gardées en vie à l'issue. Le porteur précise ce que ce devenir signifie : les génisses poursuivent leur carrière laitière et entrent dans un nouveau protocole de mesure, les vaches taries terminent leur engraissement avant l'abattoir. L'objet déclaré est de mesurer l'efficience alimentaire, soit la quantité d'aliments consommée par unité de lait ou de viande, pour décider lesquelles des génisses de renouvellement garder. Il fixe l'effectif à la capacité maximale de phénotypage du site, et annonce des campagnes supplémentaires pour atteindre les nombres requis par les analyses génétiques.
Objectifs
L'efficience alimentaire consiste à évaluer la quantité d'aliments nécessaire pour obtenir une unité de produit animal (lait et/ou viande en bovin). L’amélioration de celle des bovins laitiers est une thématique qui a été mise en avant ces dernières années pour ses atouts économique (diminution des quantités ingérées) et écologique (diminution des émissions directes et indirectes liées aux cultures). Toutefois, l’efficience alimentaire est le plus souvent mesurée uniquement pendant la période productive de la vache, généralement pendant tout ou partie de la première lactation, comme dans une expérimentation d’efficience alimentaire actuellement en cours dans le même établissement utilisateur. Des premières études ont pu montrer qu’il existait une certaine répétabilité (autour de 0,4) de l’efficience d’une lactation sur l’autre. Toutefois, les différents stades physiologiques que l’animal traverse au cours de sa vie mettent en jeu des processus biologiques variés et très différents entre une période de croissance, une période de lactation ou encore une période d’entretien ou d’engraissement. Cette expérimentation vise à étudier les liens entre des efficiences alimentaires évaluées à des moments de la vie distants et faisant intervenir des processus biologiques différents. L’objectif de ce projet est donc de mesurer l’efficience alimentaire des animaux à des stades de la vie autres que la lactation. Enfin, ce projet permettra de tester si des biomarqueurs de l’efficience alimentaire déterminés sur le bovin allaitant en croissance dans le cadre d’un projet de recherche en cours sont également pertinents pour prédire l’efficience alimentaire de la génisse laitière en croissance. Dans le cas où ces biomarqueurs, circulant dans le sang, seraient prometteurs pour les bovins laitiers, cela simplifierait la mesure de l'efficence. En effet, une simple prise de sang suffirait alors.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal est d’obtenir une meilleur compréhension de la répétabilité de l’efficience alimentaire entre les différents stades de la vie en bovin laitier. Il pourra ainsi être évalué, au regard de la vie entière de l’animal, la pertinence de sélectionner pour l’efficience alimentaire mesurée en première lactation, ou encore la pertinence de choisir au sein des génisses de renouvellement lesquelles conserver sur la base de leur efficience alimentaire pendant la croissance. Si les biomarqueurs de l’efficience alimentaire déterminés sur le bovin allaitant en croissance dans le cadre d’un projet de recherche en cours étaient également pertinents pour prédire l’efficience alimentaire de la génisse laitière en croissance, alors ces biomarqueurs pourraient éventuellement ouvrir la voie à un nouveau projet de recherche d’envergure.
Procédures
Pour le suivi du métabolisme des prélèvements sanguins (2 x 9 ml) seront effectués 2 fois au cours de l’expérimentation sur les femelles vigiles, maintenues au cornadis. Les mesures de poids et d’état corporel se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux.
Impact sur les animaux
Les prélèvements prévus (sang) et les mesures prévues (poids, note d'état) seront réalisés dans le cadre d'une contention adaptée (cornadis pour le sang et la note d'état, cage de pesée pour le poids).Cette contention, ainsi que la simple présence humaine et la manipulation associée peuvent générer un stress ponctuel chez l'animal. Le prélèvement en lui-même (en particulier le prélèvement sanguin) peut générer sur le moment une douleur limitée et fugace. De part les interventions d'élevage, ces animaux sont habitués à la présence de l'homme. Cela réduit grandement le stress généré par les prélèvements, d'autant que ce sont les mêmes personnes qui interviennent. Il n'est attendu aucun dommage ni effet indésirable à moyen ou long terme. Il n'y a pas de mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue de ce protocole, les génisses poursuivent leur croissance et sont mises à la reproduction afin d'effectuer à nouveau des mesures d'efficacité alimentaire pendant leur vie productive (lactation). Les vaches adultes sont elles destinées à la réforme (engraissement puis abattage). Les 300 animaux du projet sont répartis comme suit : 5*48 génisses soit 240 génisses et 5*12 vaches taries soit 60 vaches taries
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico
Réduction
La variabilité du caractère étudié doit être suffisante pour des analyses phénotypiques. Ce projet porte sur environ 300 femelles sur 5 campagnes. Il participera à la constitution d’une base de données internationale sur l’efficience alimentaire. Le nombre de femelles correspond à la capacité maximum de phénotypage du site dans les conditions requises pour l’expérimentation. Il sera complété de campagnes supplémentaires dans le cadre d’une nouvelle demande afin d’atteindre les effectifs nécessaires à des analyses génétiques.
Raffinement
Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Afin de minimiser la douleur, les prises de sang nécessaires au protocole seront réalisées au niveau de la queue des animaux, peu fréquentes, pour des volumes ne dépassant pas 2*9ml et espacées d'au moins un mois. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée (7 m2/animal), une aire d'exercice (3 m2/animal) et une ration d’ensilage d’herbe distribuée dans des auges en accès libre. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage définies par le vétérinaire sanitaire lors de sa visite annuelle. Au besoin le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation. Les génisses poursuivent leur carrière de vache laitière et les vaches taries terminent leur engraissement à la fin du projet avant d'être envoyées à l'abattoir.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Prim’Holstein, principale race laitière française et internationale. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique Les animaux seront des génisses en croissance ou des vaches adultes taries. Ces deux stades de vie correspondent aux stades pré et post lactation, elle-même étudiée dans le protocole de mesure de l'efficience alimentaire.
Effets sublétaux des produits phytosanitaires sur les passereaux au sein d’un agrosystème
- Protection de l’environnement
Tous relâchés sur leur site de capture, 2 400 passereaux sauvages de onze espèces sont pris au filet et maintenus jusqu'à cinq minutes en main, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Sur cinq ans, 1 320 adultes et 660 jeunes à l'envol subissent un prélèvement sanguin, 200 oiseaux un lavement cloacal et 220 mâles un massage cloacal pour récupérer leur sperme, tous ces gestes étant pratiqués sur animaux vigiles. Le porteur nomme les espèces concernées, du rouge-gorge familier à la mésange charbonnière, et retient les plus grosses pour pouvoir prélever du sang sans dommage. Il présente lui-même l'effectif de 2 400 comme un maximum qui ne sera pas atteint, et admet que la comparaison entre espèces resterait valable "avec seulement quelques individus".
Objectifs
Depuis plusieurs décennies, l’utilisation massive et croissante de pesticides de synthèse dans l’agriculture conventionnelle a permis une augmentation considérable des rendements agricoles mais elle a également eu des effets sur la biodiversité et notamment sur les populations d’oiseaux, même si la magnitude de ceux-ci reste l’objet de controverses. La conversion à l’Agriculture Biologique, dans le cadre de la politique agricole commune et soutenue par l’État français, permet de proposer un ensemble de mesures permettant la restauration des écosystèmes agricoles et ainsi de promouvoir la biodiversité. A ce jour, beaucoup d’études se sont intéressées à la comparaison entre l’agriculture conventionnelle et agriculture biologique avec pour résultats principaux que les densités et abondances des espèces et des individus sont plus importantes dans les paysages en agriculture biologique. En revanche, un effet positif sur la dynamique des populations évoluant en agriculture biologique, reste encore à démontrer, d’autant qu’identifier les processus et mécanismes impliqués reste aussi à l’ordre du jour. Une des hypothèses principales serait le relâchement de la pression en produits phytosanitaires en agriculture biologique, dont les impacts négatifs sur la dynamique des populations concerneraient avant tout les effets sublétaux. L’objectif de ce projet est d’apporter des connaissances cruciales au regard des effets sublétaux (c'est à dire des effets n'entrainant pas directement la mort de l'individu mais une dégradation de son état de santé général) de l’agriculture conventionnelle par rapport à l'agriculture biologique, sur différentes espèces de passereaux nichant dans les haies au sein de ces agrosystèmes, en comparant en conditions naturelles et à l’échelle d’un vaste territoire agricole, plusieurs marqueurs de la « santé » des oiseaux.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu de ce projet sera de comprendre comment l’agriculture biologique peut être un levier pour préserver la biodiversité aviaire en diminuant l’exposition aux pesticides des individus et si l’état de santé des oiseaux et de leurs populations s’améliorent par rapport à des paysages dominés par l’agriculture conventionnelle.
Procédures
Les animaux seront capturés dans la nature et différentes mesures seront réalisées. Ces mesures sont des mesures classiquement réalisées sur les oiseaux dans les programmes de recherche in natura. Tous les animaux subiront 1 capture et 1 contention d'une durée maximale de 5 minutes. Durant la contention et pour les 5 années du programme, 1320 oiseaux adultes et 660 jeunes à l'envol subiront un prélèvement de sang sans effraction (durée de moins de 1 minutes), 200 oiseaux subiront un lavement cloacal (durée de 1 minute) et 220 mâles subiront un massage cloacal (durée de 1 minute) pour récupération du sperme. Tous ces gestes (prélèvement de sang, lavement et massage) seront réalisés sur les animaux vigiles. Chaque animal ne subira qu'un seul acte par an. Si un individu est recapturé pendant deux années consécutives, il pourra alors rentrer dans deux procédures différentes (une procédure par an). S’il est recapturé une troisième année, il ne subira pas de nouvelle procédure.
Impact sur les animaux
1) Tout d’abord, il y aura un stress léger lié à la capture. En effet, la capture par des filets maillants est la procédure habituelle pour capturer des passereaux et n’engendre pas de traumatisme ni de mortalité quand elle est réalisée dans des conditions météorologiques favorables. 2) Il y aura ensuite un stress léger lié à la contention des oiseaux pendant les mesures (mesures de comportement, mesures morphométriques, mesure du parasitisme) qui durera moins de 5 minutes. 3) En fonction des procédures, il pourra y avoir une gêne légère et passagère lors du lavement cloacal, du prélèvement de sperme et lors de la prise de quelques microlitres de sang sans effraction. Chacun de ces gestes (lavement, sperme et sang) durera moins d'une minute (compris dans les 5 minutes).
Devenir
Tous les individus seront relachés sur le site de capture après les manipulations et chaque individu ne subira qu'une seule procédure par an. Si un individu est recapturé une seconde année, il rentrera dans une nouvelle procédure. Si il est recapturé une troisième année, il ne rentrera pas dans une nouvelle procédure. Chaque individu subira alors deux gestes aux maximum.
Remplacement
S’agissant de suivi populationnel pour comprendre des mécanismes complexes en milieu naturel, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de remplacer les animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'individus pour chaque procédure est réduit à son maximum et est celui qui permettra de réaliser des analyses statistiques avec une puissance suffisante pour détecter des effets sublétaux qui sont par définition subtils à mettre en évidence. Comme notre projet se focalisera sur 11 espèces différentes afin de pouvoir relier l'écologie de l'espèce à l'exposition aux pesticides, il faut un nombre suffisant d'individus capturés dans les 2 modes d'agriculture (biologique et conventionnelle). Nous voulons également déterminer si le sexe des individus adultes peut jouer un rôle sur les conséquences de l’exposition aux pesticides. 10 individus par sexe, espèce et paramètre seront nécessaires pour obtenir des résultats robustes. Un individu ne rentrera que dans une seule procédure dans la même année mais pourra rentrer dans deux procédures différentes sur deux années différentes. Au total, des prélèvements et des mesures seront réalisés sur 2400 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre doit être considéré comme un maximum car (i) il est certain que nous ne pourrons pas atteindre 20 individus pour chaque espèce pour chaque procédure et (ii) que certains individus seront recapturés plusieurs années et donc rentreront dans deux procédures différentes, même si ce nombre de recapture devrait être relativement faible. Des modèles statistiques adaptés (modèle linéaire généralisé avec effets mixtes) seront utilisés afin de pouvoir détecter les effets des produits phytosanitaires sur l'état de santé des oiseaux. Même si nous n’atteignons pas ce nombre, les résultats ne seront absolument pas remis en cause car une analyse interspécifique (comparaison des effets entre espèces en lien avec leur écologie) pourra être réaliser avec seulement quelques individus et elle restera parfaitement valable. En revanche, les analyses intraspécifiques seront réalisées que pour les espèces où nous aurons un nombre suffisant d’individus.
Raffinement
L’ensemble des manipulations est réalisé dans le respect de l’animal aussi bien pour les adultes que les jeunes à l'envol. Les manipulations sont faites de façon à minimiser le stress, dans un temps limité et toujours à proximité du site de capture. Les oiseaux seront relâchés sur le site précis de capture. Les expérimentations sont réalisées avec des conditions météorologiques optimales (température supérieure à 10°C, absence de pluie et de vent) afin de minimiser le stress et l'impact de la manipulation. Les manipulations seront réalisées par des personnes expérimentées uniquement et des points limites stricts ont été déterminés afin de préserver le bien-être de l'animal pendant la durée de la capture. Les manipulations seront réalisées dans le respect du protocole sanitaire. Le matériel de prélèvement sera stérile et à usage unique. En cas de stress marqué, l'expérience sera immédiatement arrêtée et l'animal sera isolé dans son sac jusqu'à retour au calme avant d’être relâché. Les individus recapturés sur deux années différentes rentreront dans deux procédures différentes. Les sacs seront nettoyés entre chaque session.
Choix des espèces
Les passereaux sont un modèle parfaitement adapté à notre questionnement puisque pendant la période de reproduction, ils restent à proximité de la haie où ils nidifient (dans un rayon de 150 mètres pour la plupart des espèces) nous permettant ainsi d'être certains que les individus seront confrontés à une exposition aux pesticides en agriculture conventionnelle. Les différentes espèces de notre projet seront les plus abondantes dans notre d’étude afin de disposer d'un échantillon statistique suffisant et ce seront les espèces les plus grosses nous permettant de pouvoir prendre un échantillon de sang sans dommage. Nous travaillerons sur 11 espèces : l'accenteur mouchet, le bruant zizi, la fauvette à tête noire, la fauvette grisette, l'hypolaïs polyglotte, le merle noir, la mésange charbonnière, le moineau domestique, le pinson des arbres, le rossignol philomèle et le rouge-gorge familier. Les études seront faites sur les adultes et sur les jeunes volants (c'est à dire les individus ayant quitté les nids et qui seront donc déjà autonomes au même titre que les adultes)
Effets du Contact Répété Avec le Sperme sur la Réceptivité Endométriale chez la Génisse (ECRASREG)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
60 génisses Prim'Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées en vie et intégrées ensuite à d'autres protocoles autorisés. Chacune peut être inséminée artificiellement jusqu'à cinq fois si la reproduction échoue, avec une prise de sang à la queue au même moment, puis subir jusqu'à deux échographies dans les mêmes conditions de contention au cornadis ou en cage. Le porteur ne retient comme effets indésirables que le stress de la contention et une éventuelle douleur au point de piqûre, sans rien dire des inséminations répétées elles-mêmes. L'objet du projet est d'écarter en amont les femelles ayant peu de chances de mener une gestation à terme, pour relever les taux de gestation des entreprises de sélection bovine.
Objectifs
Les biotechnologies de la reproduction et de l’embryon sont largement utilisées par les entreprises de sélection bovine mais, même lorsque la qualité de l’embryon transféré est optimale, les taux de gestation ne dépassent pas 60 à 65%. Afin d’augmenter ces taux de gestation, de multiples programmes de recherche s’intéressent à l’amélioration de la qualité des embryons produits mais n’abordent que très rarement l’évaluation de la qualité de la femelle receveuse. Or, il a été démontré que la gestation résulte d’interactions étroites et réciproques entre l’embryon et l’endomètre justifiant pleinement l’étude de la réceptivité utérine aux stades péri implantatoires. Un projet terminé a permis l’identification de biomarqueurs circulants protéiques dans les vésicules extracellulaires (EVs), permettant de prédire les femelles étant capables de mener une gestation à terme. Un autre projet de recherche, qui a débuté en 2023, a pour objectifs la validation de ces biomarqueurs prédictifs circulants sur deux nouvelles cohortes d’échantillons biologiques plus conséquentes : une cohorte de 60 génisses en ferme expérimentale et une cohorte de plus de 200 génisses dans plusieurs fermes commerciales. Les acquis de ce projet permettront de développer une méthode de phénotypage objective de la femelle receveuse d’embryons pour écarter les femelles qui ont très peu de chance de mener une gestation à terme. Le projet vise à déterminer si la semence mâle a un effet positifr sur la réceptivité endométriale chez la femelle. Nous allons mesurer dans le sang circulant l’effet du contact répété avec la semence du même mâle sur la réceptivité endométriale chez la génisse. Nous allons pour cela analyser le protéome (l'ensemble des protéines) des vésicules extracellulaires circulant dans le plasma des animaux. Deux cohortes de génisses seront inséminées avec 2 types de semences (conventionnelle ou sexée) provenant de trois taureaux différents. Nous souhaitons répondre à deux questions : 1- une signature dans le protéome des vésicules circulantes dans le plasma, montrant une réceptivité accrue de l’endomètre, peut-elle être retrouvée suite au contact, répété ou non, avec du sperme ? 2- si cet effet est mesuré, est-il lié à la présence de composants présents dans le sperme. Pour cela, seront utilisées soit de la semence conventionnelle contenant du liquide séminal dilué, soit de la semence sexée qui ne contient plus de liquide séminal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice scientifique principal est de déterminer si la semence mâle a un effet potentialisateur sur la réceptivité endométriale chez la femelle et dans un deuxième temps si un tel effet est lié à la présence de liquide séminal (présent, quoique dilué, dans la semence conventionnelle, mais absent dans la semence sexée).
Procédures
Quand ils sont en stabulation, les génisses sont bloquées au cornadis pour l'IA (insémination artificielle). La prise de sang sera réalisée au même moment pour limiter les manipulations des animaux. Au pâturage, les génisses sont isolées dans une cage de contention, dans un corral à proximité immédiate des parcelles pâturées, pour l'IA et la prise de sang. Sur la période de l'essai, chaque génisse peut être inséminée jusqu'à 5 fois si la reproduction échoue. Ensuite les échographies (2 maximum) se font dans les mêmes conditions que l'IA, donc la prise de sang aussi. Toutes ces opérations sont rapides, de l'ordre de la minute et l'animal est ensuite relâché avec ses congénères
Impact sur les animaux
Les mesures prévues dans ce projet correspondent à une prise de sang (PS) par génisse à deux moments clefs de la reproduction chez des bovins, à savoir l’insémination et l’échographie. Les effets indésirables causés par ces prises de sang sont le stress dû à la contention de l'animal pour l'immobiliser et une éventuelle douleur au point de piqure.
Devenir
à l'issue de la procédure, les génisses poursuivront leur carrière en intégrant des protocoles faisant l'objet de DAP validées.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes, suite à l’insémination artificielle, au sein de l’animal entier qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico
Réduction
Cette étude pilote portera sur 60 génisses sur lesquelles seront testées les inséminations artificielles répétées avec uniquement de la semence conventionnelle ou uniquement de la semence sexée. Les effectifs ont été calculés en fonction d'une étude précédente sur un effectif de 20 animaux, qui a permis de mettre en évidence des biomarqueurs prédictifs de la réceptivité endométriale. Cet effectif est le minimum nécessaire pour que les résultats statistiques soient significatifs. Comme trois taureaux seront utilisés, cela fait donc un effectif de 3 fois 20 animaux pour ce projet.
Raffinement
Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Afin de minimiser la douleur, les prises de sang nécessaires au protocole seront réalisées au niveau de la queue des animaux, de manière concomitante aux actes d’élevage classiques (IA ou échographie) qui nécessitent déjà une contention de l’animal pour des volumes ne dépassant pas 1*9ml et espacées d'au moins 21 jours. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée de 7 m2/animal, une aire d'exercice de 3m2/animal et une ration d’ensilage d’herbe distribuée dans des auges en accès libre. Au printemps, les animaux seront dehors dans les pâturages avec une surveillance bi quotidienne. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage validées par le vétérinaire, au besoin celui-ci sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Prim’Holstein, principale race laitière française et internationale. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux utilisés sont des femelles d'environ 15 mois, cyclées naturellement, et donc mises à la reproduction pour la première fois dans un objectif de vêlage à deux ans, ce qui correspond aux pratiques usuelles en élevage. Les animaux utilisés dans l'étude correspondent donc à ceux élevés en élevage et les résultats s'appliqueront donc dans les fermes commerciales.
Effet de la supplémentation d’une levure vivante seule, d’une protéine de levure (prébiotique) et de leur combinaison sur les performances laitières, les fermentations ruminales et la synthèse des protéines microbiennes dans le rumen chez la vache laitière
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Pour tester l'effet d'une levure sur le rendement fromager, 4 vaches laitières sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, gardées en vie et destinées à d'autres essais du même établissement. Chaque vache subit par période quatre prélèvements d'urine par palpation entre la mamelle et la vulve, six prélèvements de lait et un prélèvement de jus de rumen par sonde oesophagienne pouvant durer quinze minutes. Le porteur reconnaît un risque de lésions de l'oesophage et des voies respiratoires supérieures lors de l'introduction de la sonde, qu'il qualifie d'extrêmement faible, et admet un possible inconfort lors de la contention. Il indique remplacer plusieurs méthodes de référence par des mesures in vitro ou par le tamisage de bouse, et fixe l'effectif à une vache par lot dans un carré latin où chaque animal sert de témoin à lui-même.
Objectifs
Le projet est une preuve de concept qui vise à tester l'effet d'une supplémentation avec une levure vivante seule, une levure riche en acides aminés (protéine de levure) seule et leur combinaison sur les performances laitières, les fermentations ruminales et la synthèse de protéines microbiennes dans le rumen chez la vache laitière.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples: 1/ Comprendre comment une levure vivante seule, une levure riche en acides aminés seule, et leurs combinaison fonctionnent dans un rumen. 2/ Evaluer l'effet de levure probiotique, levure riche en acides aminés et leur combinaison sur les performances, les fermentations ruminales et les protéines microbiennes dans le rumen. 2/ Comprendre, si en fournissant une levure vivante qui optimise l'environnement du rumen et une levure riche en acides aminés pour alimenter le microbiote, on augmente la synthèse des protéines microbiennes dans le rumen qui effectent directement les performances et le rendement fromager.
Procédures
Prélèvement d'urine (4 prélèvements/vache/période) - Prélèvement de fecès: au sol - Prélèvement de lait : 6 échantillons/vache/période. Prélèvement de jus de rumen: 1 prélèvement/vache/période. Durée de prélèvement des urines: 5 mn/vache. Si pendant ces 5 mn, on n'arrive pas à collecter les urines, on passe à la vache suivante et on reviendra à la chache précédente par la suite pour une palpation de 5 mn. Prélèvement des échantillons du lait: ces prélèvements s'effectueront penant la traite pour une durée maximale d'une minute/vache. Fecès: prélèvement au sol (1kg/vache): durée 2-3 mn. Prélèvement du jus de rumen: durée maximale 10-15 mn/vache
Impact sur les animaux
Risques pour l'animal pendant le prélèvement de jus du rumen: lésions dans l'oesophage et les voies respiratoires supérieures durant l'introduction de la sonde. Les risques de lésions de l'oesophage sont extrêmement faibles car nous utilisons du matériel médical suffisamment souple pour ne pas léser un organe élastique comme l'oesophage. La cavité buccale, le pharynx et l'oesophage possèdent un épithélium malpighien soit un épithélium pavimenteux pluristratifié résistant l'abrasion. Néanmoins, même si le risque est très faible, il faudra vérifier que les animaux mangent bien après les prélèvements. Même si toutes les précautions seront prises pour atténuer les effets indésirables sur les vaches, il se peut que les animaux soient dans un état d'inconfort lors de leurs contentions pour le prélèvement de liquide ruminal. les prélèvements des urines se feront par palpation entre la mamelle et la vulve par un personnel qui maîtrise bien cette technique. Ce prélèvement ne présente pas de risque pour les vaches.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie après chaque procédure. Après chaque procédure, le vetérinaire responsable du suivi de cheptel fera le diagnositic de l'état de santé des vaches et prendra la décision avec le personnel de l'unité expérimentale. Les animaux serviront à d'autres essais expérimentaux au sein de notre unité.
Remplacement
La mesure de dégradabilité nécessite l'utilisation des vaches canulées. Durant notre étude, cette méthode sera remplacée par la méthode in Vitro "daisy incibator system" bien maîtriseé par notre équipe. La digestibilité est l'indicateur le plus utilisé pour éstimer la valorisation des rations. La méthode de référence consiste à utiliser les vaches et les placer dans des cages de digestibilité pendant une semaine. Pendant notre essai, cette méthode sera remplacée par la méthode de tamisage de bouse. Aussi, au lieu de collecter les fecès directement sur les vaches par le rectum, le prélèvement sera effectué au sol (1 kg), puis tamisé avec 2 tamis superposés de 5 et 2 mm.
Réduction
Pendant l'essai, 4 vaches seront utilsées dans un design de carré latin où chaque vache sera son propre témoin. L'avantage de ce type de design est, d'être à effectif identique plus puissant qu'un design en parallèle. La prise de l'animal comme son propre témoin réduit la variabilité de la mesure de l'effet de traitement. Pour le calcul de l'effectif, a utilisé des études antérieures qui ont évalué l'effet de la levure chez la vache laitière en comparant un lot contrôle et un lot expérimental (moyenne et écart type). Ainsi, nous avons préconisé d'utiliser une vache/lot.
Raffinement
Pendant les prélèvements expérimentaux, le confort de l'animal est toujours priviligié à savoir que les prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié et habitué aux gestes. Pendant les prélèvements de jus du rumen, un système de lêve tête sera utilisé pour limiter le mouvement des animaux et faciliter l'entrée de la sonde par l'oesophage. Les vaches seront maintenues à l'aide d'un cornadis adapté à la contention de bovins adultes et auquel les vaches sont habituées. Les prélèvements des urines se feront pendant la traite pour limiter les déplacements des animaux. Après chaque prélèvement, les vaches seront surveillées pendant 20 mn. Une surveillance sur 48 h sera automatiquement réalisée surtout sur les animaux ayant eu un problème pendant le prélèvement (toux et saignement). Tous problème sera signalé à la structure de bien être animal qui prendra les dispositions nécéssaires pour faire soigner les animaux.
Choix des espèces
Une partie de l'étude consiste à utiliser le système in vitro qui nécessite l'utilisation d'inoculum (jus de rumen) provenant de l'animal. Pour cela, l'utilisation de bovins adultes est obligatoire. Aussi, vue les objectifs et les hypothèses de l'étude qui visent à améliorer les performances et notament le rendement fromager (via l'augmentation de synthèse de protéines microbiennes dans le rumen), les résultats qui seront obtenus nous permettrons d'envisager et de développer des solutions chez la vache laitière. Néanmoins, ça n'empêche pas de les appliquer sur d'autres espèces (ovins et caprins).
Adaptations des populations d’ombles en lacs d’altitudes.
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tous remis à l'eau après manipulation, 900 ombles sont capturés au filet, anesthésiés, photographiés et amputés d'un fragment de nageoire pelvienne de 0,5 cm, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'opération dure moins de deux minutes par poisson et n'est pratiquée qu'une fois, sur trente populations de lacs d'altitude à raison de trente individus chacune. Le porteur affirme que ces procédures sont sans séquelles importantes et que les poissons peuvent être remis à l'eau "sans conséquences", tout en retenant des adultes au motif qu'ils sont les moins affectés par le prélèvement de nageoire. L'objet déclaré est de comprendre le déclin des salmonidés face au réchauffement, sur des poissons dont les populations ont été introduites dans ces lacs pour la pêche de loisir.
Objectifs
Les salmonidés sont des espèces emblématiques en raison de leur importance économique (pêche professionnelle et amateur), patrimoniale et écologique. Néanmoins, malgré des politiques de conservations, les populations connaissent de nombreuses fluctuations. Le réchauffement climatique est l’une des causes pouvant expliquer ce déclin, la température influençant la physiologie, le développement et la performance des individus. Certaines populations présentent une sensibilité plus faible à une hausse de la température, laissant apparaitre une possible adaptation. Aussi, au cours des siècles derniers des salmonidés ont été introduits dans plusieurs lacs différents à des fins de pêches de loisirs. Ces milieux présentant des régimes thermiques distincts, le fait que les populations d’ombles se maintiennent suggère qu’ils ont pu s’adapter à des températures contrastées. Ce projet a pour but de comprendre la diminution des effectifs dans les populations de salmonidés. Les animaux sont relachés dans leur milieu à la fin du projet.
Bénéfices attendus
Globalement, ce projet permettra d’approfondir nos connaissances sur l’écologie d’une espèce sensible aux variations de température menacée du fait du changement climatique. Alors connaitre leur évolution trophique et morphologique dans ces milieux nous permettra de mieux appréhender leurs places et leurs effets dans ces écosystèmes patrimoniaux.
Procédures
Les poissons seront pêchés au filet, anésthésiés, pris en photo, puis le prélèvement d’un morceau de nageoire (0.5cm,
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet n’impliquent qu'un léger stress dû à la manipulation des animaux, à leur maintien dans des bacs de reveil et à l'anésthésie. Le prélèvement de petites sections de nageoire sera effectué.
Devenir
Les procédures de ce projet étant légère et sans séquelles importantes pour les poissons, ils pourront être remis à l’eau sans conséquences.
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre la diminution des effectifs dans les populations de salmonidés. L'objectif est d'évaluer les effets d’une augmentation de la température en milieu sauvage dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température. Le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il répond a une problématique spécifique. De plus, chaque espèce répond différemment aux variations environnementales, ainsi il n’est pas remplaçable ni substituable.
Réduction
Cette expérimentation prévoit de mesurer les différences morphologiques, génétiques et de régime alimentaire entre 30 populations de salmonidés. Trente individus par populations sont nécessaires afin de pouvoir calculer des différences fiables entre les populations. Les 30 populations sont un minimum afin de conduire des analyses corrélatives avec les facteurs environnementaux (Règle des 3 R : Réduction).
Raffinement
Les poissons seront anesthésiés avant de les manipuler afin de réduire leur stress. L’anesthésie sera légère car les manipulations n’induisent qu’une faible nuisance, ce qui permettra d’obtenir un réveil plus rapide et donc une remise à l’eau plus rapide. Pendant les manipulations, la tête des poissons sera recouverte d’un linge humide pour réduire le stress. Les poissons resteront en observation après leur reveil avant leur remise à l'eau afin de s'assurer de leur bien-être. Les pêches et toutes les manipulations seront effectuées par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
Les populations de certains salmonidés sont en déclin, notamment dans les lacs depuis plusieurs décennies, sans que les raisons de cet effondrement ne soient complètement comprises, ayant des conséquences pour la préservations des espèces concernés et les pêcheurs amateurs et professionnel. Certains lacs étant sensibles du changement climatique, ce projet apportera des connaissances essentielles au potentiel d’adaptation rapide des ombles face au réchauffement climatique. Nous utiliserons des poissons au stade adulte. Cela correspond aux poissons les plus capturables et moins impactés par le prélèvement d’une section de nageoire (plus grande nageoire et elle repousse).
Caractérisation d’un nouveau modèle de souris hémophile A modérée transgénique pour le FVIII humain
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue, dont 150 sans jamais reprendre conscience, 837 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au modéré. Une partie d'entre elles est hémophile sévère, donc exposée à des hémorragies au moindre traumatisme, et le protocole prévoit jusqu'à deux injections intrapéritonéales par semaine cumulées à une injection intraveineuse hebdomadaire pendant six semaines, des prélèvements sanguins répétés, et une section de l'extrémité de la queue pour mesurer pendant trente minutes le temps de saignement et le volume de sang perdu. Le porteur justifie la mise à mort par la collecte des organes lymphoïdes, destinés à évaluer la réponse anticorps contre le facteur VIII. Il mentionne un modèle canin hémophile comme seule alternative connue, et retient la souris pour la taille des effectifs, l'homogénéité des génotypes et la disponibilité des outils immunologiques.
Objectifs
Ce projet de recherche fait écho à un projet Apafis en cours pour lequel nous avons fait générer une lignée murine invalidée pour le FVIII murin et qui exprime à la place le FVIII humain. A ce jour, les seuls modèles murins disponibles sont soit des modèles invalidés pour le FVIII murin ou transgénique pour un FVIII humain non fonctionnel ou non sécrété. Or notre modèle exprime du FVIII qui est présent dans la circulation à hauteur de 10-20 pour cent comparé à un plasma humain standard. Il pourrait donc être le premier modèle d’hémophilie A mineure disponible. Le but de ce projet ici est de décrire et caractériser plus en détail ce modèle d’un point de vue physiologique (expression tissulaire du FVIII humain), hémostatique et immunologique (tolérance au FVIII humain, mécanismes de tolérance et de rupture de tolérance).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser le premier modèle d’hémophilie A mineure qui pourrait permettre de comprendre les mécanismes de tolérance et de rupture de tolérance dans la pathologie de l’hémophilie A congénitale (30 pour cent des patients hémophiles A sévères développent une réponse anti-FVIII) mais également dans la pathologie de l’hémophilie A acquise. L'incidence de l'hémophilie A congénitale est d'environ 1 naissance sur 5000 chez les garçons. Actuellement, l'apparition d'une réponse anti-FVIII chez les patients hémophiles A multiplie par 3 le coût de la prise en charge de ces patients et n'est donc pas sans conséquence pour la société. Une meilleure compréhension des mécanismes menant à l’apparition des anticorps anti-FVIII est donc indispensable pour améliorer la qualité de vie des patients hémophiles A mais également pour réduire les coûts de prise en charge de ces patients.
Procédures
Un des modèles utilisés est hémophile sévère (risque des saignements lors de traumatismes ou blessures). Les animaux subiront des injections intraveineuse et/ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. La fréquence la plus élevée sera de 2 injections intrapéritonéales par semaine, cumulées avec une injection intraveineuse une fois par semaine durant 6 semaines. Toutes ces injections ne durent que 10 à 20 secondes et seront réalisées sur les animaux anesthésiés afin de limiter le stress et la contention. Des prélèvements sanguins sont également prévus. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. La fréquence maximale de prélèvement sera d'un prélèvement par semaine pendant 3 semaines. Afin d'évaluer le profil hémorragique des souris, une mesure du temps de saignement et du volume de sang perdu sera réalisée après section de la partie distale de la queue (souris sous anesthésie gazeuse tout au long de la procédure) durant 30 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Un des modèles utilisés est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. L'induction d'une douleur ou d'une lésion lors des injections et des prélèvements sont possibles. L'induction d'une détresse respiratoire ou d'une hypothermie est possible lors de l'anesthésie, de même qu'un stress lors du réveil.
Devenir
L'euthanasie des animaux est requise à l'issue de chaque procédure. Les organes lymphoïdes seront collectés pour l'évaluation de la réponse immunitaire anti FVIII ou pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment les mécanismes de tolérance et rupture de tolérance au Facteur VIII de la coagulation qui est une molécule essentielle à la correction du saignement chez l'hémophile A). Aucun système in vitro actuel ne permet d'explorer les mécanismes d'induction de tolérance immunitaire à un antigène.
Réduction
Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle. Si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 837 animaux est prévu pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de nids végétaux et de tunnels en carton. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris par cage. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La seule alternative connue est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Cependant, la souris est la seule espèce qui permettent d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. La souris déficiente en FVIII est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. En revanche, les souris transgéniques exprimant 10 à 20 pour cent de FVIII plasmatique humain présentent des risques très limités de saignements comparé au souris déficiente en FVIII. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.
Impact de l’exposition aux nanoparticules de plastiques et adjuvants phtalates sur les troubles du comportement alimentaire et la perception sensorielle et nociception chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
Exposées de façon prolongée à des nanoparticules de polystyrène et à des phtalates, 3 336 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole prévoit 72 heures en cage métabolique individuelle, 48 heures en cage d'observation, des tests d'anxiété en espace ouvert éclairé et sur surface surélevée, des mesures de seuils de sensibilité par stimulations thermiques chaudes ou froides et par stimulations mécaniques, une injection de carragénine dans la patte pour provoquer une inflammation cutanée, et pour certaines une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur attend chez les groupes exposés des troubles du comportement alimentaire, de l'anxiété et des hyperalgies de type fibromyalgie, et ouvre la même rubrique par la phrase "ce projet obéit à la règle des 3R". Il précise retenir des polluants "dont les effets sont avérés" sur la santé humaine et animale, ce qui situe l'apport attendu du côté des mécanismes plutôt que de la démonstration du danger.
Objectifs
Les matières plastiques sont omniprésentes dans notre environnement. Quand ils ne sont pas éliminés ou recyclés correctement, les plastiques perdurent dans l’environnement pendant des années car ils ne sont pas biodégradables. Ils se décomposent alors en particules de micro et nanoplastiques (respectivement inférieures à 5 et 0,1 µm) qui sont des sources de pollution environnementale. Cette forme de pollution a atteint un niveau record en Méditerranée où la concentration de plastique y est quatre fois plus élevée que dans "l'île de plastique" du Pacifique Nord. La Méditerranée représente 1% des eaux marines du globe mais abrite 7% de tous les microplastiques. Par ailleurs, les plastiques libèrent des additifs plastifiants (bisphénol A, phtalates, etc.) dans l'environnement dont les effets nocifs pour les animaux et les humains sont bien documentés. Les mesures récentes réalisées pour Santé Public France montrent que ces polluants sont présents dans l’organisme de l’ensemble des adultes et des enfants, avec des niveaux d’imprégnation plus élevés chez les enfants. Les phtalates sont des perturbateurs endocriniens et métaboliques, et des reprotoxiques, pour lesquels des effets néfastes sur l'asthme chez l'enfant, l'obésité juvénile et le diabète de type 2, les TDAH, et chez l'adulte sur l'endométriose, l'infertilité, ainsi que sur le développement neurologique ont été documentés. Les enquêtes épidémiologiques montrent une forte incidence de neuropathologies centrales, périphériques ou autonomes, chez les professionnels exposées. Si le diagnostique est clair, les mécanismes neurobiologiques impliqués sont inconnus. Il a été montré que les nanoplastiques traversent la barrière hématoencéphalique et provoquent un stress oxydatif dans le système nerveux. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence que l’exposition prolongée aux nano et microplastiques et adjuvants phtalates affecte les profils inflammatoires systémiques et induit une neuroinflammation dans les régions du système nerveux central impliquées dans la réponse au stress, l’anxiété et la prise alimentaire (hypothalamus, amygdale et hippocampe), et le système nerveux périphérique impliqué dans la nociception et la réponse autonome (ganglion sensoriels de la corne dorsale de la moelle épinière et ganglions autonomes), et que cette réponse neuroinflammatoire impacte le comportement animal en comparaison à des animaux sains non exposés.
Bénéfices attendus
Cette étude présente un intérêt translationnelle car il est clairement démontré que l’exposition aux particules de plastiques et aux adjuvants de phtalates, polluants environnementaux d'origine anthropique, affectent la santé humaine. L'étude apportera des connaissances sur l'impact de ces polluants sur la santé mentale et les comorbidités neuronales. Elle permettra de comprendre les mécanismes neurobiologiques fondamentaux responsables des effets toxiques de ces polluants. A ce titre, les connaissances acquises sur les animaux seront applicables pour les études sur la santé humaine et éclaireront les agences responsables de la définition des normes environnementales et industrielles pour la santé humaine.
Procédures
Le métabolisme des souris est mesuré dans des cages métaboliques individuelles pendant 72heures. L’activité spontanée des souris est mesurée dans des cages d'observation individuelles pendant 48heures. La mesure est répétée pour 3 stades de développement après la naissance. La répartition des masses grasses et maigres tissulaires est mesurée sous anesthésie générale gazeuse, pendant 5 minutes. Pour les souris engagées dans l’étude de l’anxiété, 3 tests sont réalisées d’une durée respective de 20, 20 et 30 minutes. Chaque souris subie ces 3 tests à 3 périodes de développement après la naissance. Pour l’étude de la sensibilité au toucher des souris, le seuil de sensibilité mécanique cutanée est mesuré par 2 tests réalisés dans des boxes individuels en plexiglas transparent d’une durée totale approximative d’1h. Le seuil de la sensibilité cutanée à la température est mesuré par des tests d’exposition à des stimulations thermiques chaudes ou froides. Les stimuli sont calibrés pour un délai moyen de réponse de l’animal de 10 secondes. Le temps maximum d’exposition au stimulus de température est de 30 secondes. Pour certains tests, les souris subissent une période d'habituation de 4 jours. Les souris qui subissent la perfusion intracardiaque sont sous anesthésie générale avec un anesthésique et un antalgique injectable. Elles sont perfusées par la circulation générale avec le tampon de rinçage et le fixateur pendant environs 30 min.
Impact sur les animaux
Ce projet obéit à la rège des 3R. Toutefois, il est attendu que lors de l'exposition prolongée aux nanoparticules de plastiques de polystyrène et phtalates, les animaux des groupes tests pourraient développer des troubles métaboliques et du comportement (troubles du comportement alimentaire, perturbation du métabolisme glucidique, stress et anxiété, hyperalgie nociceptives et inflammatoires, hyperalgies généralisées de type fibromyalgie), en comparaison aux groupes témoins. Les effets indésirables sont évalués par des tests de comportements qui visent à en observer l’apparition et en mesurer l’intensité : Stress-anxiété : exposition à des situations anxiogènes, à savoir, déplacement dans un espace ouvert éclairé ou sur une surface surélevée. Hyperalgie nociceptives : mesure des seuils de sensibilité thermique et mécanique par l’exposition à des stimuli thermiques chauds ou froids ou mécaniques jusqu’au seuil de réponse des animaux. Hyperalgie inflammatoire : la nuisance est une réaction inflammatoire cutanée (œdème et chaleur) au niveau de la patte après injection de carragénine. Métabolisme glucidique : hypo- ou hyperglycémie transitoire provoquée par l’injection d’insuline ou de glucose.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques.
Remplacement
L'étude et la veille bibliographiques permanente de la littérature scientifique abondante sur le sujet nous permettent de choisir les polluants dont les effets sont avérés sur les organismes pour la santé humaine et animale. En parallèle, les études préliminaires sur des cultures cellulaires in vitro, menées dans un laboratoire du consortium européen Horizon Europe-MSCA-Staff Exchange-2022 Psycomed (cité précédemment) et en collaboration avec les équipes du projet PLASTICHEAL financé par l’union européen, sont réalisées pour définir le choix et les quantités des matériaux plastiques et phtalates qui seront utilisées sur les animaux. L’étude de l’impact des polluants micro-nanoplastiques et adjuvant phtalate sur la santé et le comportement (prise alimentaire, proprioception et nociception), impliquant possiblement des effets pro-inflammatoires et de perturbateurs endocriniens, affecte simultanément plusieurs organes (les organes périphériques : foie, tissus adipeux, tube digestif, pancréas, tissus lymphoïdes, les glandes endocrines, la peau) et les systèmes nerveux centraux et périphériques responsables des comportements de prise alimentaire, proprioception, nociception et réponses autonomes. De plus, l'effet des polluants dépend de leurs voies de pénétration dans l'organisme (per os ou volatil). Il est par conséquent impossible aujourd'hui de pouvoir réaliser notre étude d'impact des polluants autrement que dans un contexte in vivo global. Le développement des effets sur la santé psychique et neurologique (stress-anxiété, prise alimentaire, proprioception, nociception et autonome) fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car il n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables (basé sur nos expériences et un calcul statistique pour trouver un effet significatif). Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu’elle soit normale ou non. En cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques. En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques, même si ceux-ci sont moins sensibles. Un nombre minimum d'animaux sera utilisé dans nos procédures expérimentales en respectant strictement ces différents points: (i) Utilisation d’un groupe de souris contrôles commun pour plusieurs séries d'études chaque fois que cela est possible. (ii) multi-prélèvements et création d’une base d’échantillons (cerveau et sang après sacrifice).
Raffinement
Les animaux, en provenance d’élevages accrédités, seront hébergés dans une animalerie certifiée, dans des cages sur portoirs, avec nourriture et boisson ad libitum, dans le respect des règles d’hébergement en vigueurs (respect du nombre d’animaux par cage, condition de vie dans les cages…). Avant expérimentation, les souris seront acclimatées pendant plus d’une semaine durant lesquelles les expérimentateurs les habitueront à être manipulées, pour réduire toutes formes de stress au cours des expérimentations. Les souris sont suivies quotidiennement. A partir du début de l’expérience, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs évalueront aussi l’état général des souris quotidiennement afin de déterminer la présence ou non de signes de souffrances excessives (comportement d’isolement, attitude soumise, dos voûté, respiration difficile, extrémités pâles, démarche anormale, diarrhée, vocalises, agressivité…). En cas de souffrance, les animaux seront traités selon la sévérité du comportement observé et en cas où les signes de souffrance persisteraient, les animaux seront euthanasiés. Une fiche d'observation longitudinale et une grille d'évaluation de l'état de nos souris ont été établies. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Notre étude présente un intérêt translationnelle, étant donné que l’exposition aux plastiques polluants environnementaux affecte les humains, il est donc nécessaire de mesurer les effets des molécules étudiées sur les deux sexes. Par ailleurs, il est bien documenté que mâles et femelles peuvent avoir des différences notables dans la réponse inflammatoire et leur sensibilité aux polluants environnementaux
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études précliniques et en recherche fondamentale pour analyser la relation entre l'exposition à des substances potentiellement toxiques et les effets sur le métabolisme, les états inflammatoires et le comportement des animaux. La proche similitude du patrimoine génétique de la souris avec l'homme nous permet dans la mesure du possible de tirer des conclusions extrapolables pour la santé humaine, dans une étude au potentiel translationnel important.
Rôle de PAR2 dans la régulation du métabolisme du fer lors d’un stress érythroïde
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales sur animal vigile en contention, une prise de sang sous anesthésie, une irradiation, et pour certaines l'ablation de la rate, afin d'explorer le rôle d'un récepteur nommé PAR2 dans la régulation du fer lors d'une anémie. Le porteur affirme qu'aucune méthode informatique ni aucune expérience en laboratoire ne peut imiter l'équilibre du fer dans l'organisme, et conclut qu'il est "nécessaire" de recourir à l'expérimentation animale. Il énumère par ailleurs les "cinq libertés fondamentales" de l'Organisation mondiale de la santé animale, dont celle d'exprimer les comportements naturels, dans un protocole qui prévoit irradiation et ablation de la rate.
Objectifs
Le fer est un élément essentiel pour notre santé, présent notamment dans nos globules rouges sous forme d'hémoglobine. Lorsque nous avons besoin de produire plus de globules rouges, comme en cas d'anémie, il est crucial d'apporter rapidement du fer supplémentaire à notre corps. Un mécanisme de régulation, contrôlé par une hormone appelée hepcidine, joue un rôle important dans cette gestion du fer dans notre organisme. Toutefois, certains aspects de cette régulation ne sont pas encore bien compris, notamment lorsque l'anémie persiste au-delà des premières 24 heures ou en cas d'anémie chronique. C'est là que notre projet de recherche intervient. Nous avons remarqué, chez des souris, que l'absence d'un récepteur nommé PAR2 (Protease-Activated Receptor-2) semble empêcher la diminution de l'hepcidine en cas d'anémie. Le récepteur PAR2 est un acteur clé dans la communication entre les cellules en réponse à différents stimuli, et il joue un rôle dans la régulation de divers processus physiologiques, dont l'inflammation, la douleur et la coagulation. Notre objectif est donc d'explorer un nouveau rôle potentiel de ce récepteur dans la régulation du fer pendant une anémie. Pour atteindre notre but, nous cherchons à identifier les types de cellules spécifiques responsables de cette régulation et à comprendre les mécanismes de signalisation impliqués. En résumé, notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment le fer est régulé pendant une anémie en étudiant le rôle potentiel du récepteur PAR2. En identifiant les cellules et les voies de signalisation impliquées, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation du fer, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les troubles liés à son métabolisme.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait représenter une avancée majeure en démontrant, pour la première fois, un rôle de PAR2 dans la régulation de l'hepcidine et du métabolisme du fer. En clair, il aiderait à comprendre comment le corps contrôle la production d'une protéine appelée hepcidine quand la production de globules rouges est altérée par des facteurs génétiques ou environnementaux. Si le projet réussit, il ouvrirait la voie à de nouvelles stratégies de traitement pour des maladies chroniques et ceci répondrait à un besoin crucial en santé publique, car de nouvelles options thérapeutiques sont nécessaires pour ces maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les procédures : - injection intra-péritonéale de molécules ou véhicules sur des animaux vigiles en contention manuelle (durée du geste 30 secondes/souris). - prélèvement sanguin unique sous anesthésie gazeuse (durée du geste 1 min/souris). - irradiation (durée du geste 3 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). - ablation de la rate sous anesthésie (durée maximale du geste 20 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées pour ce projet sont connues comme étant viables et fertiles, et elles ne présentent généralement pas d'effets indésirables en conditions normales. Toutefois, il est important de noter que toute manipulation expérimentale, les prélèvements sanguins, l'administration de substances ainsi que l'anesthésie, peut entraîner des effets temporaires ou transitoires sur les animaux. Ces procédures peuvent causer du stress et une légère douleur, ce qui peut altérer le comportement des souris. Lors des chirurgies, une attention particulière sera accordée à la réduction de la douleur post-chirurgicale chez les souris. L'utilisation d'analgésiques dont l'efficacité et la toxicité ont été évaluées grâce à des données expérimentales sera privilégiée. Tout au long de l'étude, des précautions seront prises pour minimiser tout inconfort ou détresse pouvant être associé à ces procédures. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.
Devenir
À la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever divers organes. Ceci vise à approfondir notre compréhension sur la régulation du fer et de l'hepcidine lorsqu'il y a une altération dans la production de globules rouges due à des facteurs génétiques ou environnementaux. L'étude se concentrera particulièrement sur le rôle potentiel du récepteur PAR2.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode informatique, aucune expérience en laboratoire, ni aucune simulation qui puisse vraiment imiter tous les détails de maintien de l’équilibre du fer dans notre corps. Ces méthodes ne peuvent pas représenter de manière correcte ce qui se passe quand les cellules rouges du sang subissent des contraintes, en tenant compte de la façon dont différents organes interagissent et des nombreuses substances chimiques impliquées. À cause de ces limites, il est nécessaire de recourir à l'expérimentation animale pour évaluer l'efficacité de nouveaux médicaments.
Réduction
Nous avons optimisé nos procédures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires dans nos expériences, tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle des animaux. Pour garantir une validité statistique, nous employons un outil de calcul de la taille d'échantillon pour dimensionner nos groupes de manière à obtenir des résultats significatifs. De plus, dans le but de minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous prévoyons de prélever un maximum de tissus qui seront stockés de deux manières différentes. Tout d'abord, certains échantillons seront conservés à une température de -80°C, ce qui permettra de préserver leur intégrité pour des analyses ultérieures de biologie moléculaire. D'autres échantillons seront préparés spécialement pour des analyses microscopiques. Cette approche nous permettra d'effectuer des analyses supplémentaires sans avoir besoin de répéter les expériences in vivo, contribuant ainsi à réduire le nombre d'animaux nécessaires pour la recherche. Ces stratégies sont mises en place pour optimiser l'utilisation des animaux, tout en respectant les exigences expérimentales et éthiques, afin de progresser dans la recherche tout en veillant au bien-être des animaux utilisés.
Raffinement
Dans le souci de respecter la directive européenne 2010/63/UE, nous avons mis en œuvre des mesures d'enrichissement destinées à améliorer le bien-être des animaux. Ces mesures comprennent la fourniture de matériaux tels que des bûchettes de bois, du coton et des igloos, favorisant ainsi leur comportement naturel de rongeur et de nidification. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective sera réalisée pour évaluer les possibilités de réduire le nombre d'animaux utilisés et/ou d'améliorer les procédures afin de minimiser la souffrance animale. Pendant toute la durée de l'expérimentation, l'état général des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être. Des indicateurs physiques et comportementaux prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal, comportements stéréotypés) seront évalués et renseignés dans une grille d'évaluation des points limites. Si un animal atteint l'un des points limites, la procédure sera arrêtée afin de prévenir toute détresse supplémentaire et l’animal sera mis à mort. Les personnes responsables du projet ont reçu une formation spécifique à l'utilisation des animaux à des fins scientifiques. Elles assurent la formation et l'encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L'apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées, garantissant ainsi une utilisation responsable et éthique des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal couramment utilisé dans la recherche, car elle permet de reproduire différentes pathologies humaines, y compris les problèmes liés au métabolisme du fer. Elle présente de nombreux avantages pratiques, tels que des coûts relativement faibles, un cycle de reproduction court et une facilité de manipulation, de transport et de logement dans des installations dédiées à la recherche. Dans notre projet, nous utilisons des souris génétiquement modifiées qui sont essentielles pour atteindre nos objectifs spécifiques. Aucune autre espèce animale ne présente les caractéristiques génétiques nécessaires pour mener à bien nos expériences. L'utilisation de la souris nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de régulation du fer et d'évaluer de nouvelles approches thérapeutiques dans ce domaine. Dans notre projet de recherche, nous avons choisi d'utiliser des souris âgées de 8 à 16 semaines. Nous nous assurons ainsi d'avoir des animaux dans leur "âge adulte" avec un développement physique et des niveaux hormonaux équilibrés. Cela nous permet de minimiser les variations individuelles et les influences liées à l'âge, et d'obtenir des résultats plus fiables, cohérents et significatifs pour nos études.
Elevage de lignées murines transgéniques avec prélèvement de tissus par une méthode invasive pour le génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
149 440 souris vont être utilisées pour une seule procédure, la coupe de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, classée en souffrance légère. Le prélèvement sert à lire leur génotype et à trier celles qui entreront dans d'autres projets, celles qui resteront reproductrices et celles dont l'établissement n'a pas l'usage. Le porteur indique que ces dernières sont mises à mort dès le sevrage, sans en chiffrer le nombre, et que d'autres sont tuées pour prélever des tissus. Il affirme qu'il n'existe "pas d'autres méthodes aussi performantes" que le tatouage et la biopsie de queue, les prélèvements de salive ou de poils étant jugés trop peu fiables.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Il s’agit d’un prélèvement du bout de la queue à un stade précoce. Cette DAP (Demande d'Autorisation de Projet) de caractérisation génétique se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres DAP) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour une autre utilisation (la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de DAP)).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage est de permettre une sélection des animaux d’intérêt. Le génotypage par prélèvement de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une biopsie de queue : 1 fois – durée : quelques secondes. Cette procédure est réalisée sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ce geste provoque une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant l'acte et donc peut etre une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats de leur caractérisation génétique: a/ ils sont sélectionnés pour un projet, pour la formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont mis à mort pour prélèvements de tissus; d/ ils sont mis à mort dès sevrage si leurs caractéristiques génétiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible, e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite selon les règles en vigueur par une méthode non douloureuse.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que les études neurologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. La responsable de la gestion des lignées établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
L'acte de génotypage est réalisé par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Cette caractérisations génétique des animaux est réalisée avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Les animaux sont hébergés dans des cages collectives avec pour enrichissement des carrés de coton pour leur permettre de faire des nids.
Choix des espèces
De très nombreux modèles servant à la recherche sur les systèmes nerveux ont été développés chez la souris. C'est pourquoi notre établissement travaille sur des modèles de souris. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont caractérisés génétiquement entre 6 et 12 jours selon la règlementation européenne car à cet âge : -les animaux sont aisément manipulables ; -le cartilage est souple ; -les groupes sociaux constitués sont stables.
Etude des pathologies liées à l’âge associées à une dérégulation de SHP2 (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
1 664 souris vont être utilisées pour étudier un vieillissement accéléré lié au syndrome de Noonan, toutes tuées à l'issue, dont 1 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun, injectées à l'insuline, gavées cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, piquées huit fois pour mesurer leur glycémie, irradiées puis greffées en moelle osseuse. Leur force est mesurée en les étirant par traction de la queue, leur équilibre par des tests hors de leur cage. Le porteur indique que certaines lignées créées pour le projet développeront des tumeurs, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.
Procédures
-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée
Impact sur les animaux
-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.
Développement de traitement dans un modèle rongeur de la maladie de Lesch-Nyhan
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectés au cerveau avec une neurotoxine à l'âge de trois jours, 1 127 rats seront tous tués par surdose médicamenteuse, 650 d'entre eux dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Devenus adultes, ils reçoivent cinq jours par semaine pendant cinq semaines un composé antiparkinsonien qui provoque des mouvements involontaires et, chez les animaux lésés, les automutilations caractéristiques de la maladie de Lesch-Nyhan. Leur activité locomotrice et leurs stéréotypies sont enregistrées trois heures d'affilée en cage d'actimétrie. Le porteur signale aussi que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère, et rattache le projet à son "activité préclinique de service".
Objectifs
La maladie de Lesch-Nyhan (LN) est une maladie génétique rare qui se manifeste par des troubles neurologiques et comportementaux. Actuellement la prise en charge est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients de cette maladie. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation d’un modèle rongeur de cette maladie afin d’en reproduire les symptômes et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Ce modèle est généré par l’administration chez des ratons nouveau-nés d'une toxine dans le cerveau. A l’âge adulte, un traitement est administré au sein du système nerveux central et ses effets seront observés au niveau comportemental et cellulaire. Le but de ce projet est de permettre l’émergence de nouveau médicament pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. Actuellement la prise en charge de cette maladie est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Ce projet préclinique a pour but de permettre l’émergence de traitement pour la maladie de Lesch-Nyhan.
Procédures
Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée d’une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 4 semaines. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, injecté (durée injection : 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. A 3, 4 et 5 semaines après l’injection intracérébrale, nous observerons au cours d’une session test l’activité locomotrice, les stéréotypies et les automutilations induites par une injection unique du composé. L'activité locomotrice est mesurée dans des cages d'actimétrie et enregistrée pendant 3 heures.
Impact sur les animaux
La maladie de Lesh-Nyhan (LN) est une maladie rare et invalidante. Les nuisances attendues sont celles associées à l’administration de neurotoxine chez les nouveau-nés et d'un traitement à l’âge adulte. L’injection de neurotoxine peut entrainer une perte de poids et la manipulation des animaux nouveau-nés peut entrainer un rejet de la mère. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. Ce composé, chez les animaux lésés en néonatal, peut également entrainer des automutilations caractéristiques de la maladie de LN.
Devenir
A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par surdose médicamenteuse et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rat pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénératives, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une étude de puissance a été effectuée, permettant d’établir le nombre à 14 animaux par groupe pour des résultats statistiques exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse préliminaire est menée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à la mise en place du modèle de LN. L’utilisation de tous les animaux issus de la portée (mâles et femelles) nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. Lorsque cela sera possible, après le sevrage, les animaux utilisés uniquement pour le training maternel seront réutilisés pour d’autres études.
Raffinement
Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée quotidiennement par les techniciens qui signalent tout problème aux expérimentateurs (weekend et jours fériés inclus). Des critères de bien-être seront évalués. Si un ou plusieurs signes sont observés les animaux sont pesés quotidiennement. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi des soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution de ces signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animaux à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, un réchauffement, une nourriture adaptée et des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des conditions d’hébergements : les animaux seront hébergés en groupes sociaux (en fratrie avec la mère jusqu’au sevrage puis 2 rats par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (nid de papier, maison en carton, bâton de bois à ronger). Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie par le froid (nouveau-né) et à l’isoflurane (adulte) avec administration d’analgésique et d’anesthésie local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un gel ophtalmique est appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 7 jours est mis en place. Des mesures spécifiques peuvent être prises comme : si l’animal manque de tonus, une injection de sérum physiologique sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort par surdose médicamenteuse est prise par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine ou de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. Dans notre étude nous utiliserons des rats nouveau-nés de 3 jours. Le modèle de la maladie de Lesch-Nyhan nécessite que la lésion par neurotoxine soit réalisée pendant la période critique pour le développement de neurones dopaminergiques.