Procédures légères

710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des chocs électriques d'intensité modérée dans un test d'évitement de place, subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques du cerveau et un isolement de deux semaines, pour étudier les circuits neuronaux de l'évitement. Le porteur rattache ce travail au syndrome de stress post-traumatique et situe les retombées thérapeutiques pour les patients au conditionnel. Il affirme qu'il est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'étude du comportement d'évitement.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale qui jouent un rôle clef dans le comportement de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique une série d’expériences de validation comportementale durant 1 semaine. Des expériences complementaires impliquent une a deux chirurgies stéréotaxiques d'une heure (espacées de 3 semaines) pour étudier des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement de place durant 1 semaine.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place engendre de l’inconfort pour l’animal puisque des chocs électriques d’intensité modérée sont administrés à l’animal. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses. L’isolement des souris pendant 2 semaines engendre de l’inconfort pour l’animal.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées et ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 646 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.

16 632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de l'oreille, des injections quotidiennes pendant cinq jours et une injection de toxine dans le muscle qui provoque une lésion, avant d'être tuées pour prélever les muscles des pattes. Le porteur revendique injecter les deux pattes pour réduire de moitié le nombre d'animaux et affirme vouloir exploiter au maximum chaque animal. Il indique que l'étude de la régénération musculaire ne peut être conduite que sur un "organisme entier", la souris étant présentée comme le modèle idéal.

Objectifs

Le muscle strié squelettique est composé de fibres musculaires qui doivent s’adapter aux changements physiologiques et environnementaux tout au long de la vie. Il a aussi la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce à des cellules souches musculaires appelées cellules satellites. Ces cellules sont responsables de la régénération des fibres musculaires après une lésion, que celle-ci soit d’origine traumatique ou génétique (maladies musculaires). Des pathologies comme les myopathies, le vieillissement ou un exercice physique trop intense conduisent à un stade chronique d’activation de la régénération avec un épuisement des cellules satellites, aboutissant ainsi à une diminution de la capacité régénérative. Notre projet vise à comprendre comment les cellules satellites répondent aux signaux d’activation lors de la régénération. L'identification de ces mécanismes de régulation pourrait permettre l'établissement de stratégies thérapeutiques afin d'améliorer la régénération musculaire dans des contextes pathologiques affectant le muscle.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à comprendre comment les cellules satellites répondent aux signaux d’activation lors de la régénération. L'identification de ces mécanismes de régulation pourrait permettre l'établissement de stratégies thérapeutiques afin d'améliorer la régénération musculaire dans des contextes pathologiques affectant le muscle.

Procédures

Tous les animaux subiront une biopsie (durée 5 secondes). Une partie des animaux subira une injection quotidienne pendant 5 jours consécutifs (durée 1 min pour chaque injection) puis après 1 semaine de repos ils subiront 3 injections: une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée une minute maximum) et deux sur animal anesthésié pour l’injection musculaire (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

La contention induira un stress. La biopsie à l'oreille induira une douleur légère de courte durée. L’injection intra-péritonéale induira une douleur de courte durée. L’injection musculaire de toxine induira une lésion du groupe musculaire injecté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de collecter les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront soit pour des mises en culture des fibres musculaires ou des cellules souches musculaires afin de réaliser des tests in vitro soit pour des analyses de biologie moléculaire et d’histologie

Remplacement

Des expériences dans les cellules ont déjà été réalisées et pour étudier la physiologie de la régénération musculaire nous devons utiliser l’animal entier. Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro la régénération musculaire qui met à contribution différents types cellulaires. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Lors de l’injection de toxine, nous injecterons les deux pattes de chaque souris afin de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés, car plus le nombre de cellules satellites collectées est important, plus le nombre d’animaux est réduit. Notre expérience a montré qu’en injectant les 2 pattes, nous réduisons de moitié le nombre d’animaux utilisés sans affecter le bien-être de l’animal. Nous exploiterons au maximum chaque animal en prélevant plusieurs groupes de muscles. Nous utiliserons les mâles et les femelles afin d’étudier la régénération chez les deux sexes.

Raffinement

Pendant l’injection intra-musculaire, les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie avec un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront stabulés une nuit en armoire chauffante à 28°C. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau derrière l’intervention, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposées sur le sol de la cage. Toutes les souris de la même cage seront anesthésiées et injectées le même jour afin de maintenir le groupe social. Si des souris doivent être isolées au moment du sevrage, nous regrouperons systématiquement les femelles et nous tenterons de regrouper les mâles de même âge provenant des différentes cages. Grâce à notre précédent projet, nous disposons désormais d’une expérience de 5 ans dans ce type de procédure, nous permettant d’assurer une bonne réalisation des actes et limiter au maximum les dommages.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d’animaux génétiquement modifiés conduisant à l’obtention de modèle dans lequel un ou plusieurs gènes peuvent être rendus non fonctionnels. De plus, le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet donc des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles. Le projet concerne des animaux adultes car le muscle termine sa croissance aux alentours de 8 à 10 semaines. A cet âge, les cellules satellites ont fini de participer à la croissance musculaire et rentrent en quiescence.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale des ovaires pour provoquer une ostéoporose, puis jusqu'à trois séances d'imagerie annuelles sous anesthésie générale, avant d'être tuées pour prélever les tissus osseux. Le porteur reconnaît un risque de mortalité chirurgicale et prévoit d'abandonner la procédure au-delà de certains seuils, mais n'attend "aucun autre effet indésirable". Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour reproduire la perte osseuse post-ménopause liée à la mucoviscidose.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent une forme particulière d’ostéoporose appelée maladie osseuse liée à la mucoviscidose. Cette maladie est due à un problème génétique dont l’effet précis sur l’os n’est pas aujourd’hui connu. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs a pour objectif de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de la problématique génétique sur la qualité osseuse, en étudiant les os de souris où l’ostéoporose sera induite par le retrait chirurgical des ovaires au cours du temps. Ces approches expérimentales permettent de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause chez la Femme, et de façon plus globale dans les deux sexes en lien avec le vieillissement de l’organisme. Ce travail permettra donc, à terme, de mieux comprendre l’impact de la problématique génétique sur les altérations osseuses dans des populations de plus en plus agées et donc de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre la pathologie osseuse liée à la mucoviscidose et plus généralement contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse, ou des substituts des hormones, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques et ne présentent qu’une efficacité limitée chez les patients souffrant de mucoviscidose. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’impact de la problématique génétique dans l’établissement de l’ostéoporose post-ménopause ou liée à l’age et pourront orienter vers de nouvelles pistes thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure de retrait des ovaires au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à trois séances d’imagerie de 30 min, sous anesthésie générale, par an, au sein du second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% pour le groupe d’animaux ne portant pas de problème génétique et supérieure à 50% pour le groupe portant l’anomalie génétique, la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques et biomécaniques.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace qui permet d’étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme, ou en lien avec le vieillissement de l’organisme. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale pour la procédure portant sur l’ostéoporose post-ménopause, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les deux jours suivants la chirurgie et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours ensuite sur la première semaine puis deux fois par semaine ensuite. Les animaux engagés pour la procédure 2 seront visités deux fois par semaine. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

2 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des gavages ou injections quotidiens jusqu'à deux mois, sont isolées quarante-huit heures pour la calorimétrie, subissent des prélèvements sanguins et une série de tests moteurs (rotarod, marche, force de préhension, suspension, tapis roulant) et de tolérance au glucose, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur reconnaît le stress de l'isolement, des mises à jeun et des gavages répétés pouvant irriter l'œsophage. Il affirme que l'action systémique des métabolites ne peut être étudiée que "in vivo" et justifie des groupes de dix animaux par la variabilité liée au vieillissement.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Or, il a récemment été montré que le vieillissement du tissu adipeux blanc (TA) pouvait avoir un impact délétaire sur la fonction musculaire, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, on retrouve les métabolites, de petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence un défaut de production de certains métabolites par le TA âgé qui corrèle avec une diminution de leur concentration circulante et intra-musculaire chez la souris âgée. Compte tenu de leur importance dans le maintien de l'intégrité musculaire, un défaut d’approvisionnement des métabolites du TA vers le muscle au cours du vieillissement pourrait participer au développement du processus sarcopénique ainsi qu’aux désordres métaboliques qui lui sont associés (intolérance au glucose, résistance à l’insuline). Ainsi, l'objectif de ce projet est 1. de tester si une carence en métabolites-cibles identifiés comme sous-produits par le TA avec l’âge participe à la faiblesse musculaire et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. 2. de tester si supplémenter ces métabolites - individuellement ou en combinaison - chez la souris âgée (afin de restaurer leur disponibilité systémique) permet de prévenir/contrecarrer la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2), certains équipements nécessaires au phénotypage de nos animaux n’étant disponibles que dans l’EU1 ou que dans l’EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l’âge en évaluant l’impact d’une carence en métabolites-cibles (précédemment identifiés comme étant déficitaires au cours du vieillissement) sur la mise en place des désordres musculaires et métaboliques associés à l’âge. Le potentiel thérapeutique de leur supplémentation chez la souris adulte/âgée devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir/contrecarrer le développement du processus sarcopénique ainsi que les désordres métaboliques qui lui sont associés.

Procédures

Certains animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par gavage (moins de 15 secondes par souris), soit par injection intra-péritonéale ou sous-cutanée (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 2 mois (EU1/2). D'autres animaux seront supplémentées avec les métabolites-cibles de façon non invasive pour une durée de 2 à 6 mois en intégrant ces molécules à leur eau de boisson ou à leur nourriture (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (espacées d'au moins 6 semaines, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système de résonance magnétique nucléaire (RMN) (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre avec le système Rotarod (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche lors d'une marche spontanée à l’aide d’un test de distribution pondérale cinétique (KWB) (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire grâce à un dynamomètre relié à une grille (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) pourront également être réalisés (prélèvements de sang durant les GTT/ITT pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) pour la GTT ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) pour l'ITT (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 4 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 6 semaines entre deux tests.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée); 2. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 3. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 4. Des gavages répétés quotidiennement peuvent induire une irritation de l'oesophage et des injections intra-péritonéales ou sous-cutanées répétées quotidiennement une douleur au niveau du point d'injection (les sites d'injection seront changés chaque jour) 5. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 6. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang (80ul) espacé de 15 jours au minimum)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l'âge et des désordres métaboliques qui lui sont associés, ainsi que leur potentielle amélioration par des stratégies de supplémentation en métabolites-cibles. Ceci nécessite de prendre en compte l'action systémique des métabolites-cibles administrés, ainsi que la contribution relative des différents organes métaboliques au phénotype, ce qui ne peut être réalisé que par une approche intégrée in vivo. Lorsque possible, une partie de l’étude sera réalisée sur des lignées immortalisées de cellules musculaires humaines afin de répondre à des questions plus ciblées ne nécessitant pas une approche intégrée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. De plus, une veille bibliographique sera effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche sur les mêmes molécules. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Lors du transport des animaux, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Lors de leur arrivée à la zootechnie, les animaux seront placés en pièce d'acclimatation. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins une fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. De plus, en ce qui concerne la stratégie de supplémentation en métabolites-cibles, une approche physiologique non invasive via leur eau de boisson/nourriture sera privilégiée afin d'améliorer le bien être animal et réduire le stress lié aux expérimentations. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 10-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de caractériser la contribution d'un déficit en métabolites-cibles dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.

4 166 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des biopsies de la queue, des prélèvements sanguins étalés jusqu'à dix-huit mois, une batterie de tests moteurs (arène, suspension à une grille, mesure de la force musculaire, barre crantée, tapis roulant) et des injections dans le cerveau ou la moelle épinière de trente à soixante-dix minutes, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur décrit une lignée transgénique reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et annonce des symptômes moteurs "très peu probables". Il affirme que l'évaluation de la motricité et le choix de la voie d'administration imposent le recours aux animaux, tout en poursuivant ses modèles in vitro et ex vivo.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive mortelle qui affecte les neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière. La dégénérescence de ces neurones moteurs entraîne une atrophie et une sclérose musculaires qui se traduisent par une perte progressive de la capacité de parler, de manger, de bouger et de respirer. Il s’agit d’une maladie au pronostic sombre, dont l’issue est fatale après trois à cinq ans d’évolution en moyenne. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe aujourd’hui aucun traitement capable de lutter de façon efficace la progression de cette maladie. Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc essentiel pour permettre la prise en charge des patients atteints de cette maladie. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique, dont l’objectif est de délivrer aux cellules un gène à action thérapeutique (transgène) qui exprime une protéine d'intérêt pour la maladie. Ce transgène est transporté dans les cellules grâce à un vecteur médicament, capable de cibler plus ou moins spécifiquement certains types cellulaires. Notre projet a pour but (1) de caractériser le modèle murin utilisé pour l’étude et (2) de déterminer la stratégie thérapeutique optimale pour soigner ces animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de réaliser les études préliminaires au développement d’un traitement curatif pour les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie neurodégénérative mortelle pour laquelle aucun traitement n’existe aujourd’hui. Le projet décrit permettra (1) de déterminer les paramètres qui seront utilisés pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique du traitement et (2) de déterminer la stratégie thérapeutique optimale pour le traitement testé (expression maximale dans les régions et les cellules d’intérêt -sans inflammation associée – avec une efficacité thérapeutique confirmée sur les signes neuropathologiques). Ces études sont donc une étape cruciale et permettront d’obtenir des résultats indispensables pour la poursuite du développement du traitement envisagé pour la SLA.

Procédures

Une biopsie de l’extrémité de la queue sera réalisée sur les animaux produits autour de 10 jours, afin de déterminer la présence de la maladie (durée : 1 s). Pour une première partie des animaux, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie et analgésie à 2, 5, 9 et 18 mois d’âge (durée : 3 s). Une deuxième partie des animaux sera soumise à 4 sessions maximum de tests comportementaux, chacune de ces sessions se répartira sur 13 jours. Avant ces tests comportementaux, les animaux seront habitués à être manipulé entre 3 et 5 min par jour pendant 16 jours maximum (4 jours x 4 sessions). Pour analyser leur locomotion spontanée ils seront placés dans une arène pendant 10 min, 4 fois maximum, ils seront ensuite maintenus par la base de la queue pendant 10 s, 4 fois maximum pour l’évaluation d’un réflexe, indicateur de l’état neurologique. Les animaux seront aussi soumis à des tests pour évaluer leur force musculaire. Les 2 premiers seront des tests de suspension (à une grille ou à un fil), (durée : 3 min maximum par test, 4 répétitions maximum). Le troisième test permet de mesurer la force musculaire, (durée : 2 s par essai avec 4 essais pour les pattes avant et 4 pour les 4 pattes, 4 répétitions maximum). La coordination motrice sera évaluée grâce à un premier test dans lequel les souris devront réaliser 5 traversées d’une barre crantée (durée : 6 min, 4 répétitions maximum). Le deuxième test de coordination motrice comprend 4 essais de 5 minutes maximum par jour et est réalisé 12 jours maximum (3 jours x 4 sessions maximum). Enfin, les souris sont placées sur un tapis roulant pour évaluer leur locomotion forcée, pendant 1 min et 30 s, 4 fois maximum. Ces animaux seront ensuite soumis à un prélèvement sanguin unique réalisée sous anesthésie et analgésie à 13 mois d’âge (durée : 3 s). Pour la dernière partie des animaux, une injection sera réalisée entre 1 et 2,5 mois d’âge (injection dans le cerveau, dans une cavité située à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre, dans les ventricules du cerveau, ou au niveau de la moelle épinière entre les vertèbres). Ces injections ont des durées comprises entre 30 et 70 min et sont réalisées sur animal anesthésié et analgésié. Afin d’éviter la douleur en post-chirurgie, les animaux reçoivent une prise en charge analgésique au cours des 48 heures suivant la chirurgie. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisances peuvent subvenir lors de notre étude : 1) des nuisances directement liées au développement de la maladie chez la souche utilisée (très peu probables) et 2) des nuisances induites par nos procédures. Les nuisances inhérentes au modèle utilisé sont très peu probables (non observées par le fournisseur de la lignée). Il pourrait s’agir d’une faiblesse musculaire voire de l’apparition progressive d’une paralysie. Les nuisances induites par nos procédures sont les suivantes : une légère et brève douleur de l’extrémité distale de la queue au moment du prélèvement pour le génotypage, une angoisse ou appréhension ainsi qu’une fatigue musculaire lors de la réalisation des tests comportementaux (les tests envisagés sont non douloureux mais sortent l’animal de son environnement habituel), une sensibilité au niveau des oreilles suite à l’utilisation des barres d’oreilles (appareil chirurgical), des démangeaisons au niveau des sutures, une angoisse ou appréhension après les procédures chirurgicales, des douleurs post-opératoires ainsi que des risques anesthésiques (stress thermique, risque cardio-respiratoire, etc.).

Devenir

Les souris inclues dans les différentes études seront euthanasiées entre 2 et 18 mois d’âge, pour les différentes études histologiques et biomoléculaires. Les animaux produits qui ne seront pas inclus dans les études seront euthanasiés, de même que les reproducteurs à l'issue de la période de reproduction.

Remplacement

Le développement de thérapies pour la Slérose Latérale Amyotrophique est essentielle car actuellement, aucun traitement ne permet de lutter efficacement contre la progression de cette maladie au pronostique sombre. Les premières étapes du projet (validation et raffinement de la thérapie développée) ont été réalisées sur des modèles in vitro (lignées cellulaires) et ex-vivo (cellules de patients). Cependant, ce type de modèle ne permet pas de réaliser l’ensemble des étapes nécessaires au développement du traitement. L’analyse de l’effet du traitement sur la motricité est un paramètre essentiel à l’évaluation du bénéfice thérapeutique, qui nécessite l’utilisation d’animaux. De même, la sélection de la voie d’administration optimale pour la thérapie requiert également l’utilisation d’animaux. Toutefois, nous continuons d’utiliser nos modèles in vitro et ex-vivo pour tous les aspects du projet auxquels ces modèles peuvent répondre.

Réduction

Le nombre total d’animaux pour l’ensemble de l’étude est 4166. Les effectifs des différentes procédures correspondent aux effectifs minimaux d’animaux nécessaires pour une comparaison de moyennes entre les différents groupes. Ces effectifs ont été calculés grâce à une analyse a priori réalisée à l’aide d’un logiciel statistique adapté. Les analyses seront réalisées au fur et à mesures, et les résultats obtenus conditionneront la poursuite des différentes sous-études, afin de ne pas utiliser des animaux si les premiers résultats ne sont pas concluants. Cette stratégie permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour l’étude.

Raffinement

Nos souris suivent les protocoles d’hébergement établis par la responsable et le personnel de l'animalerie. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 maximum et jamais isolés (sauf cas exceptionnel, traitement particulier suite à une blessure ou agression). Ils bénéficient d’un enrichissement dans la cage (maisonnette et matériaux pour confection du nid). La pièce d’hébergement a un accès restreint afin de limiter le bruit et les perturbations dues à la présence humaine. Un examen des animaux sera effectué quotidiennement par le personnel de l’animalerie, permettant de s’assurer du bien-être des animaux. Toute anomalie (aspect ou comportement anormal, blessure ou apparition inattendue des symptômes de la maladie (i.e.début de paralysie)) sera signalée au responsable du projet. En cas de signalement, de l’alimentation sera ajoutée directement dans la cage ainsi que de l’hydrogel pour permettre à l’animal de continuer à s’alimenter et s’hydrater correctement et un contrôle approfondi et une pesée seront réalisés quotidiennement par la personne en charge du projet jusqu’à résolution de l’anomalie. Les animaux seront également pesés toutes les semaines. Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie, définis et validés par une équipe vétérinaire, seront mis en place pour les différentes procédures. Un suivi renforcé des animaux sera réalisé en post-chirurgie : l’état de la cicatrisation, l’aspect du poil, l’expression faciale, la structure du nid, l’activité locomotrice, les vocalisations ainsi que la perte de poids seront scorées de manière à guider la prise en charge d’une douleur potentielle, grâce à un arbre décisionnel validé par notre vétérinaire. Un traitement analgésique sera administré en cas de signe de douleur. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les animaux seront immédiatement euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone si un point limite est atteint.

Choix des espèces

Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la Sclérose Latérale Amyotrophique permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité thérapeutiques. Une biopsie de la queue sera prélevée autour de dix jours d'âge pour réaliser un test permettant de vérifier la présence de la maladie. Pour caractériser la progression des signes neuropathologiques et investiguer la présence de marqueurs de dégénérescence neuronale dans le sang, nous utiliserons des animaux de différents âges : 2, 5, 9 et 18 mois. D’autres animaux seront étudiés à 2, 5, 9 et 12 mois d’âge pour tenter de déterminer des signes fonctionnels de la maladies (symptômes moteurs). Ces différents signes ou marqueurs serviront ensuite à évaluer l’efficacité de notre approche thérapeutique. Enfin, des animaux seront injectés entre 4 et 10 semaines d’âge (début de l’apparition des signes neuropathologiques), et euthanasiés entre 2 semaines et 5 mois après injection (soit, 7.5 mois d’âge maximum) pour les analyses, afin de déterminer la stratégie thérapeutique optimale pour soigner ces animaux, et in fine les patients.