Procédures légères
Etude de l’interaction des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique avec les lymphocytes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 150 étant classées en gravité sévère. Une pathologie neuro-inflammatoire est induite par injection intra-péritonéale et 100 souris chimères subissent une irradiation, pour étudier le passage des lymphocytes dans le système nerveux central. Le porteur indique que les souris malades présentent perte de poids et troubles moteurs, et mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne fournit de résultats exploitables et décrit son modèle comme "unique".
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'étudier les interactions entre les lymphocytes et les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique afin de cerner les mécanismes et particularités permettant un passage des lymphocytes dans le système nerveux central et le rôle de ce passage en condition physiologiques et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les interactions entre système immunitaire et système nerveux central, en condition physiologique afin de comprendre les conséquences de ces interactions en terme de susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes mais aussi dans le cadre du vieillissement et des pathologies neurodégénratives. En conditions pathologiques, les modèles développés, in vitro et in vivo permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
Une pathologie neurologique inflammatoire sera induite par injection intra péritonéale unique chez certains animaux, pathologie qui pourra être surveillée pour étude entre 2 jours et 90 jours. Certains animaux seront des modèles de souris chimères et subiront une irradiation (100 souris) unique de 6 minutes et 36 secondes.
Impact sur les animaux
Une pathologie neurologique est attendue lors de l'étude de la condition pathologique. Dans ce cas les souris présentent des signes cliniques (perte de poids, troubles moteurs) et immunologiques qui seront alors surveillés.
Devenir
Au total l'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pouvoir quantifier et étudier l'infiltrat lymphocytaire dans le système nerveux central.
Remplacement
L’étude de l’implication des cellules endothéliales dans la migration des lymphocytes dans le système nerveux central via la reconnaissance de l’antigène, nécessite des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées telles que l’activation et la différenciation lymphocytaire in vivo, la migration cellulaire, l’entrée et l’activation dans le tissu cible. Il n’existe pas actuellement des méthodes alternatives à ces études in vivo pour l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents des pathologies humaines. Notre modèle d’étude unique permet d’obtenir des informations nouvelles et importantes concernant les affections neuro-inflammatoires.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé d'après les conditions minimales nécessaires à une puissance statistique permettant d'établir des conclusions statistiques recevables. Les animaux de ces procédures étant utilisés pour des expérimentations in vivo ou in vitro pour générer des cultures primaires, le nombre peu difficilement être réduit. Cependant, la nouvelle version de ce protocole intègre une révision à la baisse des effectifs estimés en raison des premiers résultats d'étude sur les lymphocytes CD4 ayant mis en lumière des difficultés techniques non résolvables à l'heure actuelle. L'ensemble des organes étudiés sont prelevés chez les souris (système nerveux central mais aussi rate, ganglions, et tube digestif) afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures en condition pathologiques ou dans la procédure chimère auront une surveillance accrue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance anormale induisant son exclusion de la procédure et sa mise à mort. Les points limites à surveiller identifiés sont : Activité extrême (grattage ou léchage anormal) - Posture (courbée ou prostrée) - Aspect (perte de poids, déshydratation, poil hérissé, taches) - Absence de toilettage et diminution de l’appétit - Respiration anormale (rythme et mouvement) - Stéréotypies et hyperactivité (démangeaisons, léchage) - Présence d’anomalie (blessure, inflammation). Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie après une anesthésie gazeuse par isoflurane. Les animaux seront au maximum 5 par cage et auront un enrigissement permettant une stimulation de leurs comportements naturels et l'amélioration de leur bien être selon les recommandations en cours dans l'établissement utilisateur. Lors du suivi par test comportemental, les animaux auront une période d'entrainement progressive de 3 jours avant de débuter les tests comportementaux mesurés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines (maladies infectieuses, maladies inflammatoires) comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Notre modèle, floxé, a été développé dans cette espèce et aucune autre espèce d’animaux possédant ce transgène n’est disponible. De plus, l’utilisation de la souris permet une compatibilité cellulaire avec les autres modèles murins développés. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Adultes entre 6 et 16 semaines d’âge car nous avons besoin d'animaux adultes qui ont un développement des systèmes immunitaire et nerveux central complet pour nos expériences. Seule la procédure 1 pour l'induction du modèle est réalisée plus tôt.
Caractérisation du microchimérisme des cellules maternelles vers le fœtus in utero et chez la descendance lors d’une supplémentation en Human Milk Oligosaccharides (HMO) pendant la gestation.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Des femelles sont accouplées de façon répétée jusqu'à gestation, nourries d'un aliment enrichi en sucre du lait humain, puis mises à mort au dix-huitième jour de gestation ou après le sevrage, avec prélèvement des tissus fœto-maternels. La descendance femelle est tuée à trois semaines et les mâles conservés pour des cultures cellulaires avant d'être tués. Le porteur étudie le transfert de cellules immunitaires de la mère au fœtus et affirme qu'il est "impossible" de reproduire ces échanges in vitro.
Objectifs
La grossesse constitue la première période au cours de laquelle l’alimentation de la mère peut influencer le système immunitaire du fœtus par des transferts mère-enfant de facteurs immuns, nutritionnels et bactériens. De nombreuses études ont déjà démontré que l’alimentation maternelle impacte le développement du fœtus et du nouveau-né et peut provoquer des maladies futures chez la descendance. Dans ce contexte, il a été démontré dans un modèle de souris qu’une supplémentation en sucre du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide ou Oligosaccharide du lait humain) pendant la gestation protège de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Les HMO sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le système immunitaire et le microbiote intestinal. Ces effets sont liés notamment à l’augmentation d’une population de cellules immunes que l’on appelle lymphocytes B régulateurs dans le fœtus mais aussi chez la descendance. Nous savons que des cellules de la mère peuvent être transférées à son fœtus ainsi nous émettons l’hypothèse qu’une supplémentation en HMO pendant la gestation va augmenter les lymphocytes B régulateurs chez la mère qui vont être transférées au fœtus puis perdurer chez la descendance permettant l’établissement d’un environnement protecteur de l’allergie alimentaire. L’objectif de ce projet est d’identifier précisément ces transferts cellulaires in utero et leur durabilité chez la descendance induite par la prise de HMO pendant la gestation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier chez la souris les cellules régulatrices maternelles présentes chez le fœtus et la descendance pouvant expliquer la mise en place de la protection contre l’allergie alimentaire induite par la prise de HMO durant la gestation. Ces cellules régulatrices peuvent être issues d’un transfert de cellules de la mère vers le fœtus afin de protéger les petits de l’allergie alimentaire
Procédures
Lors de la première procédure, les souris sont mises en accouplement une nuit autant de fois que nécessaire jusqu'à qu'elles soient gestantes. Elles sont pesées tous les 2 jours. Le 18ème jour de gestation, les souris femelles reçoivent une injection intraveineuse d’anticorps 1 fois par femelle. Lors de la première procédure, les souris du groupe exposé à l’aliment enrichi en 2’FL sont mis sous aliment 2’FL une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 18ème jour de gestation. Lors de la procédure 2, les souris sont mises en accouplement une semaine. Elles sont pesées tous les 2 jours pour toutes les souris femelles. Lors de la procédure 2, les souris du groupe exposé à l’aliment supplémenté en 2’FL sont mises sous aliment 2’FL une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à la mise bas. Elles repassent ensuite à un régime avec l’aliment contrôle.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont pesées tous les deux jours afin de confirmer la grossesse par la prise de poids. Au 18ème jour de gestation, le jour de leur mise à mort, elles sont déplacées pour les prélèvements de selle, la pesée et l'injection intraveineuse. Le point d'injection peut provoquer une douleur légère et un stress dû à la douleur et la contention.
Devenir
Lors de la procédure 1, les femelles sont mises à mort à 18 jours de gestation afin de récupérer les tissus fœto-maternels ainsi que les mâles pour des mises au point et expériences de culture cellulaire (car nous n'vons pas d'autres protocoles de reproduction en parallèle). Lors de la procédure 2, les mères et des descendantes femelles sont mises à mort afin de récupérer des tissus et mise à mort pour les mâles et descendance mâle pour des mises au point et expériences de culture cellulaire (car nous n'vons pas d'autres protocoles de reproduction en parallèle).
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices des HMO (Human Milk Oligosaccharides) comme le 2’-fucosyllactose.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour être statistiquement pertinent en fonction du modèle utilisé dans notre équipe et du taux de reproduction des souris pour chaque protocole. Nous avons pris en compte le temps de reproduction, la souche des souris mâles et femelles ainsi que la duplication des protocoles.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 2 (femelles) ou 3 à 4 (mâles) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.
Choix des espèces
L’objectif de ce travail est d’évaluer s’il existe un transfert de la mère à son fœtus de lymphocyte B régulateurs connus pour protéger de l’allergie alimentaire et de voir si ces cellules transférées persistent chez la descendance. Le transfert placentaire ainsi que les échanges mère-fœtus sont impossibles à reproduire in vitro, il faut prendre en compte l’organisme dans sa globalité pour évaluer ces paramètres. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément essentiel dans ce projet afin de reproduire la période de vie de la gestation et ainsi visualiser ces échanges. Les souris mâles et femelles seront âgées de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie, car à cet âge elles sont mâtures sexuellement et peuvent ainsi se reproduire. Après une semaine d’acclimatation donc à 7 semaines de vie, elles seront mises en accouplement. Pour le protocole P1, Les souris gestantes seront mises à mort au 18ème jour de gestation soit à 10 semaines de vie. Les fœtus étudiés chez les mères gestantes auront un stade de développement de 18 jours, soit le troisième tiers de gestation. Si la reproduction sous 24h n’a pas été efficace, les souris non-gestantes seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce qu’elles soient gestantes. Les mâles seront mis à mort à la fin du protocole, une fois que toutes les femelles seront gestantes. Pour le protocole P2, Les souris gestantes seront mises à mort à la fin du sevrage de la descendance, soit à 13 semaines de vie. La descendance femelle sera mise à mort à 3 semaines de vie pour rechercher la présence de cellules d’origine maternelle. Les descendants mâles seront conservés dans le cadre d’études in vitro et donc mis à mort à partir de 6 semaines de vie.
Caractérisation phénotypique de souris mutantes dans le cadre du consortium international IMPC (International Mouse Phenotyping Consortium)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
23 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Chaque animal subit une batterie de tests de phénotypage sur 150 lignées mutantes, dont un conditionnement à la peur par choc électrique délivré au plancher, un test de plaque chauffée à 52 °C provoquant une douleur brève, des chocs électriques plantaires et un isolement de vingt-quatre heures. Le porteur cherche à établir la fonction de gènes d'intérêt dans un consortium international et affirme que seul un "organisme complet" permet cette caractérisation. Le volume atteint près de 24 000 souris pour un programme de description systématique du génome.
Objectifs
L’objectif du projet et d’étudier le rôle de 150 lignées, soit délétées pour un gène d'intérêt, soit des lignées consanguines "Collaborative Cross" (CC), potentiellement impliquées dans des maladies humaines. Nous allons réaliser une analyse des effets de la mutation de ces gènes ou des fonds génétiques CC sur les différentes fonctions physiologiques (neurologiques, comportementales, cardiaque, respiratoire, sensorielle et métabolique). Pour procéder à cette étude, des lignées CC ou des souris mutantes pour le gène d’intérêt sont générées et étudiées. Les animaux, seront soumis à une batterie de tests de phénotypage, permettant de déterminer l’impact de la mutation ou du fond génétique sur les fonctions physiologiques majeures et sur l’état de santé de l’animal. Dans le cadre d'un consortium international, le choix des lignées à étudier est fait en coordination avec les autres partenaires afin d’éviter toute redondance quant à l’analyse des souris mutantes pour un gène dans 2 centres différents.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’identifier la fonction de chacun des gènes d’intérêt dans le génome de la souris. Le génome entier de nombreuses espèces a maintenant été publié et le séquençage du génome entier devient relativement rapide et peu coûteux à réaliser. Malgré ces progrès, la fonction de la majorité des gènes reste encore inconnue. Les gènes testés ici sont impliqués dans les fonctions physiologiques suivantes : neurologiques, comportementales, cardiaque, respiratoire, sensorielle et métabolique. Leurs études permettront de mieux comprendre leur rôle dans l’organisme et par conséquent l’impact que pourrait avoir leur dysfonctionnement dans le cadre de pathologies.
Procédures
-Une biopsie d'oreille sera réalisée sur les animaux devant être génotypés. (contention 5-10 secondes)- Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70- 75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min. - Les mécanismes d’action de la peur et de la mémoire seront étudiés grâce à un test de conditionnement à la peur d’une durée cumulée de 10+20 min - Un test de calorimétrie qui nécessite d'isoler les souris durant 24h maximum - Une évaluation cardiaque sera effectuée et implique une anesthésie gazeuse de 10 minutes environ - Un test de tolérance au glucose, après une administration de glucose par injection intrapéritonéale, 5 prélèvements d'une goutte de sang (chaque acte durant environ 30 secondes) sont réalisés – Les animaux recevront trois doses d’anesthésiques (durée = moins d’une minute) - Insertion d'électrodes en sous-cutanée à la base du crâne pour enregistrer les réponses évoquées (durée = 15 minutes)-Etude de la structure de l'œil par histologie in vivo (durée = 10 minutes)-Mesure de la composition corporelle et anlayse du squelette par rayons X (durée = 18 minutes). -La conductivité sensorielle sera mesurée à l’aide d’un test sur la sensibilité plantaire d’une durée de 10 min -La sensibilité thermique intégrée sera mesurée à l’aide d’un test de plaque chaude d’une durée de 30 secondes - 1 prélèvement sanguin qui dure 2-3 minutes
Impact sur les animaux
Une biopsie d'oreille sera réalisée sur les animaux devant être génotypés. Le test d'altérations des capacités de filtrage de l'information présente un inconfort léger en raison des stimuli auditifs qui sont de 110 dB et durent quelques ms. Lors du test de conditionnement à la peur un choc électrique d’intensité modérée sera délivré à la souris par le plancher (grille) pouvant provoquer un léger inconfort. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés durant la durée du protocole (maximum 24h) occasionnant un stress modéré dû à l'isolement. Lorsque nous étudierons la fonction cardiaque, les animaux seront anesthésiés par méthode gazeuse. Durant les 4 dernières minutes de l'anesthésie, dans le protocole d'électrocardiographie, 4 électrodes seront piquées en surface de la peau pour obtenir les signaux électriques. Pour étudier les mécanismes de régulation du glucose, les animaux subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers : 20, 40, 60 et 90 minutes après l’injection de glucose, afin de suivre leur glycémie. Les animaux recevront une dose d’anesthésiques lors de l’étude de l’imagerie du squelette, du test des réponses évoquées et de l'étude de la morphologie de l'oeil. Lors de l’étude de la sensibilité plantaire aux chocs électriques, plusieurs chocs électriques plantaires sont réalisés et lors du test de la plaque chaude l'animal est placé sur une plaque à 52 degrés, provoquant une douleur de très courte durée. Enfin, afin de suivre les paramètres biochimiques, 1 prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser les fonctions de gènes d'intérêt, ce qui ne peut être modélisable que dans un organisme complet capable d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude. Ces données pourront ensuite permettre de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, nous utiliserons la souris car nous pouvons retirer les gènes d’intérêt dans ce modèle.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé à la suite d'autres projets présentant les mêmes tests. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 8 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques paramétriques ou non paramétriques en fonction de la normalité des données.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement des modèles d'intérêt porteurs des modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. Les animaux seront de jeunes souris adultes (8-16 semaines), afin d’avoir un développement suffisant.
Suivi de la dissémination tumorale dans un modèle murin de tunorigénèse intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Une partie reçoit des cellules tumorales sous la peau, avec des tumeurs laissées croître jusqu'à 1 000 mm³ pendant environ deux mois, d'autres une injection de cellules dans la rate par une chirurgie que le porteur reconnaît pouvoir entraîner la mort sous anesthésie. Toutes finissent mises à mort, une partie par ponction cardiaque. Le porteur étudie la précocité de la dissémination du cancer du côlon et affirme qu'aucun modèle de substitution ne peut aborder la question, tout en développant des organoïdes pour réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Alors que les métastases sont la cause de la majorité des morts attribués au cancer, nos connaissances demeurent limitées concernant les mécanismes mis en jeu lors de l'invasion des cellules tumorales dans d'autres organes. Alors que ces mécanismes étaient décrits pour intervenir tardivement des études récentes suggèrent dans le mélanome et le cancer du sein fortement que cela arrive très précocément. Le but de cette étude est de démontrer chez la souris que cette précocité d'invasion existe également dans le cas du cancer du côlon.
Bénéfices attendus
La réalisation du projet permettra dans un premier temps d'augmenter nos connaissances concernant la dissémination tumorale qui mène à la formation des métastases repsponsables de la très grande majorité des morts attribuées au cancer. Par ailleurs, à plus long terme les données acquises pourront bénéficier aux patients afin de prévenir l'apparition de métastases.
Procédures
190 animaux recevront un agent chimique qui permet l'induction (tamoxifène) quotidiennement pendant 5 jours, pour cette procédure, les animaux seront tous gardés en vie sauf si un des points limite définis au préalable est atteint. À la fin de cette procédure, des ponctions cardiaques seront faites au moment de l'euthanasie, sous anesthésie et par un expérimentateur qualifié, sur l'ensemble des animaux (190). La procédure 3 qui consiste à injecter de cellules tumorales en sous cutané sera réalisée dans 60 souris et la taille des tumeurs sera ensuite mesurée deux fois par semaine, les animaux seront conservés pour une durée d'environ deux mois. Après cette durée, les souris seront euthanasiées. La procédure 4 qui consiste à injecter de cellules tumorales dans la rate sera réalisée sur 180 souris (divisé en 5 groupes) et les animaux seront euthanasiés à deux temps différents (15 jours et à 30 jours) après l'injection.
Impact sur les animaux
Les injections des cellules tumorales en sous cutané est un geste maitrisé dans l'équipe et ne présentent pas de risques pour les animaux. Les tumeurs pourraient nécroser. L'injection des cellules tumorales dans la rate nécessite un geste chirurgical incluant une anesthésie et cela engendre des risques de non réveil des animaux. Les animaux sont traité avec des anti-douleurs pré et post-chirurgie et 1 jour apres la chirurgie. Enfin les ponctions cardiaques seront pratiqués par des personnes très bien formées et habituées à pratiquer ces gestes et seront realisés sous anesthesie.
Devenir
A l'issue du traitement des souris avec l'agent chimique qui permet l'induction (tamoxifène), les animaux seront tous gardés en vie sauf si un des points limites définis au préalable est atteint. A la fin de cette procédure, des ponctions cardiaques seront faites au moment de l'euthanasie, sous anesthesie et par un experimentateur qualifié, sur l'ensemble des animaux (190). Pour la procédure des injections tumorales en sous cutanée les aniamux seront conservés jusqu'à ce que leur tumeur atteigne la taille de 1000 mm3 (environ deux mois). Pour les injections de cellules tumorales dans la rate, les animaux (5 groupes) seront mis à mort à deux différents temps 15 jours et à 30 jours après l'injection.
Remplacement
Les questions posées dans le cadre de ce projet (suivi de la dissémination tumorale depuis le colon vers des organes distants dès un stade précoce du cancer ) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être globalement abordée par un autre modèle de substitution.
Réduction
Un nombre minimum de souris est planifié dans les expériences. Compte tenu de nos expériences précédentes, comme les souris ne présentent pas toutes des tumeurs intestinales (1/3 des souris), le nombre total doit être augmenté de 33 %. En parallèle, une nouvelle approche a été désigné où les tumeurs des souris sont dissociées puis cultivées sous forme d'organoïdes afin de réaliser des expériences in-vitro ultérieures et de diminuer le nombre des souris.
Raffinement
Étant donné que les souris après l'induction à un agent chimique (tamoxifène) seront gardées en vie pour une période bien définie, des bonnes conditions d'hébergement seront respectées. Les souris seront hébergées en groupes de 4 - 5 souris par cage dans un environnement enrichi contenant des maisons en carton, des copeaux et des morceaux de coton afin qu'elles se fabriquent des nids. Des points limites spécifiques et une grille de score a été définie et les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et analgésies.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Grâce à une mutation particulière dans ce modèle de souris le cancer du côlon est initié et les cellules intestinales colorées peuvent être suivies dans les organes de l'animal. Les souris sont à des stades très précoces de la maladie et ne subissent pas par conséquent de soufrance.
Étude du rôle physiopathologique de la sumoylation – étude d’une inhibition transitoire de la sumoylation pendant le développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Des femelles gestantes reçoivent une à trois injections abdominales d'une molécule inhibant la sumoylation, subissent une échographie, puis sont mises à mort pour prélever leurs embryons. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable sur les femelles gestantes en s'appuyant sur un projet précédent, et signale que les femelles ne peuvent être réutilisées après trois injections. Il étudie le rôle de la sumoylation dans le développement embryonnaire et juge l'étude sur "organisme entier" indispensable.
Objectifs
Les modifications post-traductionnelles jouent un rôle majeur dans le contrôle de l’activité des protéines et régulent, de ce fait, les processus cellulaires fondamentaux. Parmi celles-ci, la modification par SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) a été reconnue comme un processus majeur de l’activité de la cellule eucaryote. Notre laboratoire dispose de plusieurs souris génétiquement modifiées permettant l’inactivation de la sumoylation via l’invalidation du gène. Comme l’invalidation complète du gène induit une forte létalité embryonnaire, jusqu’à ce jour, nous avons utilisé 2 modèles principaux : - Des souris qui permettent une inhibition de 50% du gène - Des souris permettant d’induire un KO inductible du gène Malgré ces modèles, il est difficile d’étudier l’impact de la sumoylation sur un organisme entier et dans le développement embryonnaire. Il a été montré que la sumoylation jouait un rôle majeur dans le développement embryonnaire : une souris génétiquement déficiente pour SUMO meurt in utero à 5,5 jours du stade embryonnaire. De plus, il a également également été montré in vitro que la sumoylation était très importante pour l’identité cellulaire des cellules souches embryonnaires Nous souhaitons aujourd’hui regarder in vivo les effets d’une hyposumoylation transitoire au cours du développement embryonnaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de cette étude est de mieux comprendre le rôle majeur de la sumoylation dans le développement embryonnaire. ce qui permetrait à terme d’envisager des traitements pour les nombreuses maladies lié au develleppement embryonnaire et/ou permettre de trouver des traitements anti cancéreux car on sait que les changements d’indetités cellulaires sont extremement important dans de nombreux cancers.
Procédures
Les animaux de ce projet seront injectés en IP 1 à 3 fois ; (20sec par injection). Une échographie sera réalisée sur les femelles (30secondes)
Impact sur les animaux
Les Nuisance et effets indésirables sont : Le stress ou la douleur lié à linjection en Intrapéritonèale. La fiche Sécurité de la molécule utilsée, nous donne la dose maximum tolérée chez le rat et nous avons l’expérience de cette molécule grâce à notre précédent projet. En théorie, nous n’attendons pas d’effet sur les femelles gestantes en injectant à 6.5 jours du stade embryonnaire..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer les embryons ou car elles ne peuvent pas être réutilisés car elles ont reçu 3 injections de molécule.
Remplacement
Ces travaux mettant en jeu plusieurs types cellulaires et phénomènes différents nécessitent une étude sur l'organisme entier, ce qui impose le recours à des animaux. Le but de cette procédure est de mettre au point un modèle d’hyposumoylation transitoire dans le modèle murin.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris -Les souris seront de même fond génétique (C57BL6/J) afin de limiter les variations liées. - Nous réaliserons un maximum d’analyses sur une même souris quand cela est possible. - Des analyses statistiques seront faites à l'aide de modèles à effet mixte, afin de prendre en compte les effets techniques indésirables. Les effets de l’hyposumoylation causés au cours du développement embryonnaire seront comparés entre le groupe de souris traité avec la molécule utilisée et le groupe de souris contrôle. Pour une puissance statistique fixée à 80% et un risque alpha de faux positif fixé à 5% nous utiliserons des groupes de 10 souris femelles afin d'assurer l'obtention d'un nombre suffisant de souriceaux (au moins une cinquantaine). -Ces expériences seront à chaque fois effectuées 3 fois à l’identique pour s'assurer de la reproductibilité des observations. Cependant si les deux premières expériences donnent des résultats similaires, la 3ème série ne sera pas effectuée. - Les deuxième procédure n’aura lieu que si la première nous permet d’induire une perte de la sumoylation transitoire sans que cela ne provoque une létalité embryonnaire.
Raffinement
Afin de limiter la douleur et le stress -Les animaux sont élevés à un nombre maximum de 7 animaux par cage. Les cages contiennent des copeaux et sont enrichies avec du coton permettant aux souris de recréer des « espaces /niches » comme dans les conditions de leur habitat ancestral. -L’injection sera pratiquée par une personne expérimentée, puis les animaux seront suivis 2 fois par jour pendant les 16 h d’action de la molécule utilisée , puis 3 fois par semaine après. Ce suivi permettra d’éviter ou minimiser l’apparition des points limites et d’adapter des soins préventifs plus spécifiques pour les groupes suivants si apparition de points limites. D’après notre projet précédent, nous savons qu’une injection n’induit pas d’effet délétere sur les souris non gestantes. Nous n’attendons donc pas d’effet délétère sur les femelles gestantes en injectant à 6.5 jours du stade embryonnaire. Cependant, nous nous baserons sur l’apparition de signes cliniques généraux décrits dans la grille d’évaluation de la douleur recommandée par le comité d’éthique et la SBEA (Structure bien être animale). Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes avérés de souffrance, des soins adaptés (réhydratation, enrichissement…) seront alors mis en place.
Choix des espèces
La souris de laboratoire (Mammifère) est largement utilisée à travers le monde, pour sa proximité évolutive avec l’homme : cette large utilisation témoigne de (a) la maîtrise de son élevage sous forme de lignées consanguines, (b) sa reproduction facile et rapide à laquelle sont couplées des portées d’effectif élevé (c) de la relative facilité de modification génétique transmissible/héritable. Des souris adultes seront utilisées, agée entre 6 à 15 semaines, âge idéal pour le reproduction.
Analyse de l’innervation cornéenne en imagerie in vivo chez des souris agées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Une lésion est provoquée sur la cornée de chaque animal, qui subit ensuite jusqu'à cinquante-deux séances d'imagerie sous anesthésie, à raison d'une par semaine pendant un an. Le porteur reconnaît que la répétition des anesthésies peut entraîner une détresse respiratoire et une opacification de la cornée. Il étudie le vieillissement de l'innervation cornéenne et juge l'animal "indispensable", sans alternative in vitro.
Objectifs
Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier comment l’innervation cornéenne est affectée par le vieillissement. Grâce à des techniques d’imagerie en temps réel combinés à l’utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l’innervation de la cornée des souris au cours du temps.
Bénéfices attendus
La bonne compréhension des mécanismes de dégénérescence de l’innervation de la cornée ainsi que les interactions se produisant entre les nerfs et les cellules immunitaires pourront servir de base pour développer et tester des traitements contre la dégénérescence de l’innervation cornéenne
Procédures
Un partie des animaux recevra une injection unique par voie intrapéritonéale (réalisé sur animal vigil, l'acte dure moins de 1 min par animal). L'induction de la lésion de l'épithélium cornéen concerne tous les animaux du projet, l'acte est réalisé sous anesthésie, par une personne expérimentée et dure moins de 5 min par animal. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant jusqu'à 1an (soit 52 sessions d'imagerie réalisées sous anesthésie d'une durée de 40-45min chacune). Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l'épithélium cornéen chez les animaux pour étudier la réinnervation de la cornée. Cette lésion induit une perte de sensation au niveau de la cornée. L'imagerie en temps réelle est non invasive et n'engendre pas de douleur à l'animal. Cependant, la répétition des anesthésies peuvent augmenter le risque de détresse respiratoire lors de celles-ci. Toute difficulté respiratoire (gasp) entraînera l’interruption de la procédure en cours. Egalement, les sessions d'imageries répétées peuvent provoquées dans de rares cas une opacification de la cornée des animaux étudiés. L'anesthésie peut dans de rare cas amené un stress thermique ou une potentielle détresse restpiratoire chez les animaux.
Devenir
A l'issus de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).
Remplacement
Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec les cellules immunitaires et le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 150 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un test de puissance a été réalisé pour determiner le nombre minimal d'animaux requis. Des tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour l'étape d'induction de la lésion et pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une anesthésie gazeuse complémenté par une anesthésie locale de la cornée.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris, et en particulier avec le fond génétique C57Bl6J, est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Le modèle animal est requis pour ce projet car seule l'utilisation d'animaux transgéniques permet de visualiser les interactions entre les neurones et les cellules immunitaires. Il a été observé une dégénérescence de l'innervation cornéenne à partir de 6ème mois, due au vieillissement des animaux. Ainsi, nous induirons les lésions de l'innervation de la cornée au 6ème mois de vie des animaux pour étudier le potentiel de régénération de l'innervation dans un contexte de vieillissement. Comme il n'est pas attendu d'effet lié au sexe des animaux, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles.
Production d’antigènes de parasite permettant de fabriquer des tests de diagnostic
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Tests réglementaires
6 000 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal est infesté par des larves de schistosome qui pénètrent sa peau lors d'un pataugeage, laissé porter le parasite pendant 49 jours au maximum, puis saigné à mort sous anesthésie pour récolter les vers adultes. Le porteur revendique une infestation indolore et arrête la maturation avant l'apparition des symptômes, mais l'objet du projet reste la production en série d'antigènes pour des tests de diagnostic commercialisés. Il affirme le recours à l'animal comme obligatoire, aucune culture in vitro ne maintenant le cycle du parasite.
Objectifs
La Bilharziose ou schistosomose est une maladie parasitaire humaine, classée seconde après le paludisme. Environ 600 Millions de personnes vivent en zone d’endémie et 200 millions de personnes sont infectés. Le cycle biologique comprend deux hôtes obligatoires : un hôte vertébré et un hôte mollusque vecteur. Les passages entre les hôtes se font grâce à des larves nageantes qui pénètrent par la peau de l’hôte cible. Comme toutes les maladies infectieuses le diagnostic est un élément clef dans le contrôle de l’infection. Dans les pays du Nord les diagnostics directs qui identifient la présence active du parasite prennent peu à peu la place des diagnostics indirects qu’ils soient sérologiques ou parasitologiques. Dans les pays du sud, le développement d’outils de diagnostics direct ne sont pas encore développés et les diagnostics indirects sérologiques sont largement majoritaires. Les diagnostics sérologiques détectent les anticorps présents dans le sang du patient lorsqu’il a été contaminé. Pour ce faire, ces tests incluent des protéines appelés antigènes provenant du parasite, qui vont réagir en présence des anticorps contenus dans le sérum des personnes infectées. Aujourd’hui, il n’existe aucune méthode permettant de maintenir le cycle du parasite in vitro. De plus, les schistosomes sont des organismes trop complexes en termes de diversité antigénique pour être « simplifiés » par un seul antigène synthétique ou même par un cocktail d’antigène synthétique. Dans ce contexte, il est nécessaire de produire des antigènes provenant des deux espèces majeures qui infectent l’être humain, Schistosoma mansoni et Schistosoma haematobium. Les vers adultes ou les œufs du parasite sont extraits à partir de hamsters infectés par des larves de ces pathogènes. Par la suite, des extractions sont effectuées pour isoler les antigènes et les intégrer dans les tests sérologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de récupérer des vers adultes et des œufs des parasites du genre Schistosoma sp. qui permettront de produire des antigènes natifs du parasite. Ces antigènes sont indispensables dans la fabrication de kit de diagnostics médicaux humains.
Procédures
Les rongeurs sont soumis à la phase d'infestation qui se fait de manière naturelle, par pataugeage dans un petit volume d'eau contenant les larves du parasite. Cette étape se fait en une fois et dure une heure. Une fois sous anesthésie les animaux sont soumis à un prélévement sanguin qui conduira à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
L’infestation par les schistosomes provoque une nuisance chronique chez le rongeur par accumulation des œufs notamment dans le foie et les intestins. Les symptômes visuels attendus sur les rongeurs peuvent survenir à partir de deux mois. C’est pourquoi le délai de maturation au cours de ce projet est de 49 jours maximum, afin que les animaux ne subissent pas les symptômes de la parasitose.
Devenir
Le but du projet est de produire des parasites du genre Schistosoma. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites adultes.
Remplacement
Le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire car on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes. De plus, dans les tests sérologiques il n’est pas possible de remplacer la complexité/diversité des protéines natives par une ou plusieurs protéines recombinantes.
Réduction
Expérimentalement les schistosomes infestent : la souris, le hamster et le cobaye. Le hamster est le meilleur hôte, c’est-à-dire celui qui permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les schistosomes sont de petits organismes et la quantité nécessaire de vers pour fabriquer les tests de diagnostic justifie l’utilisation de 1200 hamsters par an.
Raffinement
Nous avons fixé le nombre optimal de parasites proposés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de vers sans engendrer de mortalité prématurée de l’animal. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Le protocole a été établi pour éviter tout signe de souffrance ou de stress. L’infestation par pataugeage est la forme d’infestation naturelle chez les rongeurs dans le milieu naturel, elle est indolore. Pendant le développement du parasite dans l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu permettant qu’ils aient des activités ludiques et sociales. Les animaux ne sont jamais seuls dans leurs cages. La mortalité ne survient quasiment jamais à l’issue de l’infestation. Cependant, durant cette période, tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint les points limites pourra-t-être euthanasié par un personnel habilité.
Choix des espèces
Le hamster a été choisi car cette espèce permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les animaux utilisé sont de jeunes adultes de 6-semaines d’âge pour éviter les mortalité lors de l’infestation
Création de lignées de poissons zèbre génétiquement modifiées pour la recherche en neuroscience
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
44 200 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à terme, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de créer des lignées génétiquement modifiées, huit par an sur cinq ans, vendues comme prestation à des laboratoires publics ou privés, chaque poisson étant identifié à trois mois par une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les modifications génétiques peuvent provoquer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou des troubles de la reproduction. Les individus non modifiés sont tués, dix par lignée étant gardés pour l'entretien puis tués à dix-huit mois, et le recours au poisson est justifié par la part de gènes partagés avec l'humain et l'usage d'un "organisme entier".
Objectifs
Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous l’avons choisi pour créer des lignées génétiquement modifiées afin de fournir ces dernières à des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Ces lignées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. L’objectif est de créer 8 lignées par an durant les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Notre plateforme a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant le modèle poisson zèbre pour comprendre certaines maladies humaines et progresser dans leur traitement.
Procédures
Les poissons doivent être identifiés génétiquement à l’âge de 3 mois. Pour cela ils sont isolés et anesthésiés successivement afin de minimiser la souffrance de l’animal lors du prélèvement de tissu de la nageoire caudale qui est réalisé par la suite. Un seul prélèvement est réalisé par individu, ne durant qu’une minute. Une fois la biopsie terminée, le poisson est remis à l’eau dans un bac de réveil. Il ne sera réhabilité dans un aquarium d’élevage qu’après rétablissement complet de l’anesthésie. Cette biopsie ne doit entrainer aucune séquelle sur la nage ou l’alimentation du poisson. Il est nécessaire de maintenir l’animal isolé jusqu’à l’obtention des résultats d’analyse (maximum 2 semaines). Il est possible qu’un phénotype dommageable apparaissent sur l’ensemble des animaux suite aux modifications génétiques.
Impact sur les animaux
Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Un traumatisme peut faire suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale, qui est une petite plaie de quelques millimètres. Il s’en suit ensuite un processus cicatriciel qui prend 2 semaines durant lequel le poisson est isolé. Il est possible que les modifications génétiques entraînent des phénotypes dommageables, par exemple une scoliose ou un problème lors de la reproduction.
Devenir
Au cours du projet, les animaux produits qui ne sont pas génétiquement modifiés seront euthanasiés. Nous conserverons 10 individus par lignée produite qui permettront d’obtenir et de garantir le maintien de la lignée nouvelle lignée. Enfin, ces animaux seront également euthanasiés à l’âge de 18 mois après confirmation de l’implantation de la lignée dans le laboratoire demandeur. Les animaux ne seront pas conservés au-delà afin d’éviter qu’ils ne développent des anomalies qui s’intensifient avec le vieillissement des animaux ou qu’ils ne deviennent le réservoir d'infection.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement larvaire et l’imagerie. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
Aux vues de la physiologie du poisson-zèbre et de notre expérience sur la création de lignées génétiquement modifiées au cours des dernières années, nous estimons que le minimum requis de lignée à créer est de 8 par an sur les 5 ans à venir. Nous allons générer 850 individus fondateurs (F0) et 255 individus de la génération suivante (F1) soit 8 lignées x (850 F0 + 255 F1) x 5 ans = 44200 poissons zèbres. Afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaire à la création de ces lignées, nous essayerons d’insérer un rapporteur fluorescent lorsque cela sera possible. Ce qui nous permettra de sélectionner et de garder que les poissons génétiquement modifiés diminuer le nombre de poissons à élever par 4 d’après nos précédentes études soit élever 11 050 poissons zèbre.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Ainsi les paramètres environnementaux comme la qualité de l’eau, la température et le cycle lumineux seront à surveiller. La température de l’air devra être comprise entre 25 degrés Celsius et 27 degrés Celsius et le cycle lumineux de 14-10 avec aube et crépuscule. Le poisson zèbre est une espèce grégaire, ils seront donc placés en groupe de 5 à 20 congénères adultes maximum dans les aquariums d'élevage. Seul les poissons à génotyper seront isolés et maintenus dans le système afin de garantir un environnement contrôlé. Cela leur permettra de maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils seront surveillés quotidiennement et un affichage assurera la traçabilité et le respect de la durée de l’isolement. Pour préserver l'ensemble des poissons hébergés, une limite d'âge de 18 mois sera appliquée pour éviter que les animaux vieillissants puissent être le réservoir d'infection. En effet, la durée de vie moyenne d’un poisson zèbre est de 24 mois. De la nourriture vivante sera fournie 2 fois par jour afin que les animaux puissent exercer un comportement de chasseur pour se nourrir. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour cela nous utiliserons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels. Cela permettra d’évaluer quels poissons doivent être euthanasiés ou non. Si nous observons des problèmes physiques nous ferons une évaluation pour en définir la gravité et mettre en place des solutions adaptées pour garantir le bien-être des animaux. Si cela s’avère une demande d’autorisation sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser ce modèle pour créer des lignées génétiquement modifiées. De plus, il atteint l’âge de la maturité sexuelle à 3 mois et les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus attrayante. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. Ils seront donc utilisés pour générer une lignée afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses recherches sur le modèle. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à partir de 3 mois et nous ne les utiliserons pas au-delà de 18 mois. Le prélèvement pour génotypage se fait aux alentours de 3 mois, lorsqu’ils ont atteint une taille suffisante. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Evaluation des effets secondaires de composés pharmacologiques de différentes classes à l’aide d’un service de screening basé sur une batterie de tests chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre eux et modéré pour 1 200, 800 étant tués pour prélèvement de tissus et 1 040 pouvant être récupérés. Ils reçoivent des candidats médicaments par de multiples voies puis subissent une batterie de tests, dont le Rotarod pour la coordination, un prélèvement d'estomac pour évaluer les ulcères et un test au charbon avec prélèvement d'intestin pour la motilité digestive. Le porteur présente l'ensemble comme une "offre de services" commerciale destinée à profiler les effets secondaires des molécules de ses clients. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage chez l'homme.
Objectifs
La dimension sensori-discriminative de douleur a été largement étudiée sur une variété importante de modèles animaux et quasiment la totalité des antalgiques disponibles actuellement sur le marché ont été testés dans des modèles précliniques classiques chez le rongeur. Cependant, l’utilisation de ces antalgiques est souvent associée à de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d’évaluer ces effets secondaires indésirables sur l’organisme. De plus, une utilisation abusive des opiacés s’est développée ces dernières années mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». D’autres classes de molécules comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens présentent également des effets secondaires notamment, la formation d’ulcère qui est le principal effet indésirable. De plus, les Gabapentinoides (Gabapentine, prégabaline) qui sont indiqués dans le traitement des crises partielles d’épilepsie et dans les douleurs neuropathiques, provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. Un autre effet secondaire pouvant apparaitre après une prise d’un composé est la catalepsie. Celle-ci se caractérise par est un état comportemental de rigidité musculaire associé aux médicaments antipsychotiques et à plusieurs autres classes de médicaments. L’objectif de ce projet est de pouvoir caractériser les effets secondaires d’un candidat médicament. Cet outil permettra l’évaluation des effets secondaires cités :la formation d’ulcère, la sédation, la catalepsie, la locomotion, la constipation.
Bénéfices attendus
Cet outil d’évaluation sera proposé à l’offre de services de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité d’établir des profils de nouveaux candidats médicament en discriminant les effets secondaires potentiels. Ainsi, les molécules testées pourront être orientées vers un profil antlagique d'une certaine classe pharmacologique.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m), intrathécale (i.t), Intranasal (i.n). Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés. Le test du Rotarod a pour objectif l'évaluation de la coordination motrice lors d'un test de vitesse de rotation constante. Ce test dure 3minutes, les animaux réalisent 3 passages sur la roue et cela est répété 2 fois. Le test pour évaluer l'apparition d'ulcères consiste à admnistrer un composé qui dure environ 1 minute puis à prélever l'estomac. Le prélèvement dure environ 5minutes. Le test pour évaluer les effets indésirables d'un composé sur la motilité gastro-intestinale consiste à administrer un composé (durée : 1minute) puis une solution de charbon (durée 2minutes) et enfin de prélever l'intestin grêle. Le prélèvement dure environ 2 minutes. Pour ces deux tests décrits (ulcer et test au charbon),une mise à jeun est nécessaire la veille des tests et dure maximum 24h. Enfin le test de l'irwin couplé aux tests de l'openfield et de la catalepsie permettent d'évaluer d'une part les effets d'une nouvelle substance sur le système nerveux et les fonctions physiologiques de l'animal, et d'autre part d'évaluer la rigidité musculaire et la locomotion de l'animal. Pour ces 3 tests, les animaux recoivent une adminsitration d'un composé d'une durée d'environ 1 minute et l'enchainement des 3 tests dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dépendent des procédures, mais pour l'ensemble des animaux, les nuisances pourront être liées à l'administration unique ou répétée de composés (risque d'irritation des zones d'injection, lésion superficielle, nuisance légère). Une injection de produit dure environ 1minute. Lles animaux peuvent également subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance modérée); selon la voie de prélèvement le temps est peut être estimé de 30secondes à quelques minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang unique (intracardiaque,) ou en répété peuvent être réalisés sous anesthésie (jugulaire, retro-orbital, veine caudale, nuisance modérée). Pour certains tests, les animaux sont mis à jeun (nuisance modérée). Pour un test, les animaux peuvent chuter du dispositif d'une hauteur de 30cm (nuisance légère).
Devenir
Pour certains tests, les animaux sont soumis à des prélèvements de tissus, ils sont donc mis à mort. De plus, pour tous les tests décrits, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société. Pour d'autres procédures, les animaux pourront être récupérés sous réserve d'absence d'effets secondaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » . L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=5 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux dispositifs des tests). Les tests possèdent des valeurs de Cut off afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie générale est utilisée pour la réalisation de prélèvements par exemple. Des points limites, pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des rats plus âgés pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Etude d’efficacité d’un extrait de raisin chez le chien adulte sain
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
18 chiens adultes en bonne santé vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réaffectés à d'autres projets. Ils reçoivent quotidiennement dans leur alimentation un extrait de raisin, produit commercial déjà autorisé pour les animaux d'élevage, et subissent deux prises de sang, l'objet étant de démontrer que ce complément améliore leurs paramètres anti-oxydants. Le porteur relie l'étude au concept "One Health" et à une future option nutritionnelle pour les chiens en surpoids. Il indique qu'aucun remplacement n'est envisageable puisque le chien est "l'espèce cible" du produit.
Objectifs
L’extrait de raisin, objet de cette étude, est un produit commercial qui possède déjà une autorisation de vente et dont les cibles actuelles sont les animaux d’élevage et d’aquaculture. Ce produit est un mélange d’extraits de pépins de raisin riches en proanthocyanidines et d’extraits de peau de raisins riches en anthocyanes. Les bénéfices anti-oxydants de cet extrait ont déjà été validés chez les animaux d’élevage. Cette étude a pour but de montrer que cet extrait peut également protéger efficacement les chiens contre le stress oxydatif. L'objectif du projet est donc de valider l'efficacité de l’extrait de raisin chez le chien adulte sain, c’est à dire s'assurer que celui-ci permet d'améliorer les paramètres anti-oxydants sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter une nouvelle option nutritionnelle pour la gestion du stress-oxydant chez le chien qu'il soit un animal de propriétaire, un animal de chenil ou un animal d'élevage et ainsi contribuer au concept One Health.
Procédures
Les chiens recevront l'extrait de raisin dans leur alimentation quotidiennement durant la durée de l'étude et deux prises de sang seront réalisées sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Une baisse de l'acceptation de l'aliment peut être envisagée mais la quantité d'extrait est tellement faible et homogène dans l'aliment que cela ne doit pas avoir d'impact sur la consommation de la ration. Les prises de sang constituent une nuisance attendue à cause du stress de la contention et mais les animaux sont habitués à la procédure de contention permettant la réalisation de celles-ci dans les meilleurs conditions de rapidité et de bien-être de l'animal.
Devenir
Les animaux pourront soit être réintégrés à un projet dont la demande d'autorisation est encore en cours soit intégrés dans un nouveau projet.
Remplacement
Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chien est l'espèce cible.
Réduction
Cette étude est un projet préliminaire qui permettra une fois l'efficacité établie sur un petit nombre d'animaux sains, d'envisager de montrer des effets positifs de l'extrait sur des animaux souffrant de désordres métaboliques liés au surpoids. La taille des groupes proposée est celle minimale basée sur notre expérience, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et d’assurer la robustesse des analyses statistiques (tests statistiques non paramétriques Mann-Whitney).
Raffinement
Cette étude ne limite pas les sorties des animaux en laisse et leur sociabilisation. Ils peuvent de plus continuer à vivre en groupe (2 chiens dans un box de 4 m2 avec présence d'une niche chauffée et de jeux type kong ou ballon). Ils ont accès à l’eau à volonté. Lors de la prise des repas, les animaux sont attachés dans leur box et ne peuvent ainsi consommer que la ration qui leur est présentée. Ils sont amenés, en laisse, de leur box jusqu’à la salle de prélèvement se trouvant dans le même bâtiment.
Choix des espèces
Le chien est l'espèce cible de l'extrait testé. Les animaux utilisés seront adultes, car ils sont les cibles de l'utilisation de cet extrait (stade de développement le plus susceptible d'être sujet à l'embonpoint).