Procédures légères

156 animaux, 140 poissons zèbres et 16 xénopes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les poissons zèbres tués à l'issue et les xénopes femelles réutilisées d'une année sur l'autre. Les xénopes reçoivent une injection d'hormone puis un prélèvement d'ovocytes par massage abdominal, les poissons zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire sous anesthésie. Ces gestes servent à des travaux pratiques de formation réglementaire, pour que des stagiaires s'entraînent aux manipulations, anesthésies et mises à mort sur espèces aquatiques. Le porteur indique privilégier des animaux de réforme et affirme que le remplacement par un modèle alternatif est "impossible" pour la partie pratique.

Objectifs

Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.

Bénéfices attendus

A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.

Procédures

Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous utilisons deux modèles expérimentaux, le xénope et le poisson zèbre, qui ne sont pas soumis aux mêmes procédures. Pour les Xénopes, les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée pouvant induire une douleur brève et localisée au point d’injection. De plus, ils peuvent ressentir du stress lors de la contention qui est nécessaire à l’immobilisation de l’animal. Les poissons zèbres sont exposés à une anesthésie par balnéation à faible dose d’anesthésiants qui est maitrisée depuis plusieurs années et n’induit pas d’effet indésirable.

Devenir

Poisson-zèbre : En fin de procédure les animaux seront euthanasiés. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.

Remplacement

Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.

Réduction

le nombre total d’animaux impliqués dans cette demande est de 156 animaux pendant 5 ans(140 poissons-zèbre, 16 xenope). Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal. des plantes en plastqiues sont presents dans les aquariums de Xénopes. Les poissons sont toujours hebergés en groupe. Les poissons et xénopes sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect physique ou comportement anormal et de lui attribuer un score . Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie.

Choix des espèces

Les poissons-zèbres et les xénopes sont couramment utilisés à des fins scientifiques en raison de leur facilité d'élevage, de la disponibilité d'une vaste documentation et de l'existence d'une large communauté scientifique travaillant sur ces espèces. Ils sont considérés comme des modèles de choix en raison de leurs caractéristiques biologiques et des connaissances zootechniques disponibles. Ces deux espèces présentent des caractéristiques spécifiques qui les rendent adaptées aux procédures expérimentales telles que le prélèvement du sperme et d’ovocytes afin de réaliser des fécondations in vitro. Pour obtenir des pontes ou prélever du sperme, il est important d'utiliser des animaux matures sexuellement. Les xénopes nécessitent généralement une période d'environ un à deux ans pour atteindre cette maturité, tandis que les poissons-zèbres peuvent être utilisés à partir de trois mois, car ils ont un développement plus rapide.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris porteuses d'une forme de dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent une injection intramusculaire puis des mesures de contractilité musculaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur décrit des risques d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à l'anesthésie et attend "à court terme" une amélioration du phénotype dystrophique, l'usage chez le patient restant renvoyé au long terme. Il affirme le modèle murin "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive de la maladie.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de tester une nouvelle molécule qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec notre molécule. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra musculaire (10 minutes) (avec analgésie et anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures de contractilité musculaire (40 minutes) (1 fois) (avec analgésie et anesthésie). Euthanasie après les mesures de contractilité musculaire.

Impact sur les animaux

Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des mesures de force, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître mais nous administrerons un analgésique avant la procédure et surveillerons les animaux pour réagir au plus vite. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie mais nous veillerons à que leur température reste constante. Enfin, les animaux pourraient être victimes d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Néanmoins les souris dystrophiques présentent une forte hétérogénéité surtout lorsque nous mesurons des paramètres tels que la force musculaire. En envisageons donc d’utiliser 6 animaux (6 muscles traitées), pour l’analyse des mitochondries et 12 animaux (12 muscles traités) pour les mesures de force. Sachant que l’expérience sera répétée, nous envisageons donc d’utiliser 12 et 24 animaux pour l’analyse des mitochondries et les mesures de force respectivement. Ce nombre d’échantillons permettra d’obtenir une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d'utiliser 60 souris dystrophiques et 60 souris contrôle. La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combine l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 11 semaines en début de procédure et de 21 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux adultes pour ne pas observer de biais dus à la croissance.

48 brebis de race Romane vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées en vie et renvoyées dans le troupeau d'élevage à l'issue. Chaque animal est placé en case individuelle sur caillebotis pendant les huit semaines de fin de gestation, avec des auges peseuses mesurant la quantité de fourrage ingérée. Le porteur indique que les agneaux mâles rejoindront le circuit de commercialisation et les femelles le renouvellement du troupeau. Il présente ce projet comme visant à actualiser des références d'alimentation vieilles de quarante ans, au service de la production ovine.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique mondiale, l'élevage ovins doit être autonome et résilient. Ce projet a pour objectif d'accompagner l'adaptation des systèmes de production face aux aléas et à ces changements climatiques en développant leur autonomie protéique et azotée. Un des enjeux principaux est d'adapter, au plus juste, l'alimentation aux besoins des animaux. Ces besoins sont couverts par les apports énergétiques et protéiques des rations alimentaires mais conditionnés par la capacité d'ingestion de l'animal. L'estimation de la capacité d'ingestion des animaux est donc déterminante pour le calcul des rations, elle varie en fonction de plusieurs facteurs (âge, taille, poids, race, stade physiologique...). Les références actuelles sur le sujet datent de plus de 40 ans et s'avèrent aujourd'hui parfois obsolètes car sous-estimées. Ce projet vise donc à réactualiser ces références sur des races précises en fonction de plusieurs types de fourrages. Dans cette étude, nous nous intéresserons plus particulièrement à la capacité d'ingestion de brebis de race Romane durant le dernier tiers de gestation et la phase d'allaitement, elles seront alimentées avec des fourrages secs aux caractéristiques contrastées (stades de récolte, valeurs d'encombrement et nutritionnelles).

Bénéfices attendus

L'enjeux de ce projet est d'optimiser l'utilisation des fourrages pour l'alimentation des brebis allaitantes, il permettra de : - créer de nouvelles équations de prédiction de l'ingestion - actualiser les références de capacités d'ingestion, durant des phases physiologiques clés (gestation et lactation) et sur différentes races (à l'échelle globale du projet) - tester différents facteurs de variation (poids de l'animal, taille de la portée de la brebis, qualité des fourrages). In fine, ce projet permettra aux éleveurs ovins de disposer de références actualisées quant aux capacités d'ingestion des ovins et d'assurer une couverture optimale des besoins des animaux en fonction de leur stade physiologique et de la qualité des fourrages proposés.

Procédures

Les brebis seront conduites en cases individuelles sur caillebotis pendant la période de fin de gestation (8 semaines) avec accès à deux auges peseuses automatisées. Les cases étant mitoyennes et les barrières ajourées, les interactions entre les animaux seront possibles (contacts visuels, olfactif, auditif et physique).

Impact sur les animaux

La procédure de mesure d'ingestion implique une période de mesures individuelles sur un dispositif de case individuelle sur caillebotis, ces cases sont équipées d'auges peseuses électroniques permettant une pesée automatique du fourrage. Afin de limiter tous risques d'inconfort pour la brebis des tapis en caoutchouc sont installés sur une partie des caillebotis assurant ainsi une zone de couchage confortable. Toutes les stalles individuelles sont installées dans une même pièce pour limiter l’isolement des animaux et réduire le stress éventuel, les animaux sont séparés par des barrières ajourées entre chaque case permettant des interactions sociales avec les congénères placés à proximité (les animaux peuvent se voir, s'entendre et se toucher).

Devenir

Pas d'abattage expérimental, les animaux seront gardés en vie. Les brebis retourneront dans le troupeau expérimental en conditions d'élevage classiques. Concernant les agneaux, les mâles rentreront dans la chaîne de commercialisation classique et les femelles seront gardées pour le renouvellement du troupeau.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à l'utilisation d'animaux qui nous permettent de répondre aux enjeux de ce projet et c'est pour cela que nous avons recours à des animaux. Le projet porte sur les capacités d'ingestion de la brebis de race Romane et permettra de produire des références qui seront étendues à l'élevage. Le contexte du projet est l'élevage ovin où l'animal est, par conséquent, au centre des préocupations. Centré sur les pratiques alimentaires en lien avec les performances zootechniques, ce projet necessite donc d'utiliser des ovins et plus précisément des brebis avec leurs agneaux.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle des mesures réalisées (ingestions, pesées, note d'état corporel...), le nombre minimum d'animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence au moins égale à 2 fois la valeur de l'écart-type des fidélités intermédiaires des mesures est de 6 avec une probabilité de 0.05. 6 individus sont donc nécessaires par lot, 4 traitements contrastés étant appliqués avec 2 répétitions, 8 lots de 6 brebis seront nécessaires par schéma expérimental, sur deux années. 48 brebis sont concernées par la procédure expérimentale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d'élevage éclairé naturellement. Les parcs d'élevage adjacents seront séparés par des barrières à claire-voie permettant un contact visuel entre animaux de différents parcs et diminuant l’angoisse possible liée au cloisonnement. La taille des cases est adaptée au gabarit de l’animal. Elle lui permet de se lever, se déplacer et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir et de s’entendre. Chaque brebis dispose d'une surface de 2.55 m². Des tapis en caoutchouc de 1m par 2m sont installés sur les caillebotis afin d'améliorer le confort des animaux. Les animaux seront préalablement habitués aux stalles pendant la période pré-expérimentale de 2 jours. Les animaux seront alimentés à volonté, deux fois par jour, et disposeront d’eau à volonté et d’une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les moutons seront suivis tous les jours lors de la distribution de l’alimentation par un animalier habilité, responsable de la mise en oeuvre du protocole.

Choix des espèces

Le projet porte sur les capacités d'ingestion de la brebis de race Romane et permettra de produire des références qui seront étendues à l'élevage. L'expérimentation porte sur l'étude des capacités d'ingestion sur des stades physiologiques précis, dans cette procédure les brebis seront gestantes. Les animaux du reste de l'expérimentation, hors procédures car conduits en lot en condition d'élevage classique seront en gestation puis à l'allaitement.

560 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et 186 maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme. La seule procédure déclarée est le prélèvement de deux millimètres carrés de nageoire caudale sous anesthésie, pour génotyper des lignées mutantes, le travail scientifique portant sur les embryons précoces. Le porteur revendique le poisson zèbre pour éviter, contrairement à la souris, de tuer la mère afin d'accéder aux œufs. Il indique tester des méthodes de génotypage moins invasives, encore trop peu fiables pour être utilisées.

Objectifs

La construction d’un organisme, mais aussi la dissémination de cellules cancéreuses, implique des migrations cellulaires, qui sont souvent des processus collectifs : les interactions entre cellules sont nécessaires à la bonne migration des cellules et à la coordination de leurs mouvements. Nous avons ainsi mis en évidence dans l’embryon précoce de poisson un nouveau type de guidage des cellules par celles qui les suivent, basée sur la transmission d’une information mécanique. Le projet vise d’une part à mieux comprendre ce mécanisme (comment une information mécanique oriente-t-elle l’activité migratoire d’une cellule), et d’autre part à comprendre comment, à partir des interactions cellule-cellule, émergent des mouvements morphogénétiques complexes et coordonnés.

Bénéfices attendus

Nos travaux trouvent des applications en cancérologie, de nombreuses cellules métastatiques migrant collectivement, et en médecine régénérative, où l’un des grands enjeux actuels est de réussir à reproduire et contrôler in vitro les processus de morphogenèse. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales), mais la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo.

Procédures

Sur certains animaux, l'extrémité de la nageoire caudale inférieure est prélevée, afin de séquencer leur ADN. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale. L'intervention prend moins d'une minute. Le tissu prélevé est de 2 mm2, et repousse en 2 semaines environ. Un animal ne subit cette intervention qu'une seule fois au cours de sa vie.

Impact sur les animaux

D'après la littérature disponible, le prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale inférieure peut causer une douleur à l'animal. Pour l'éviter, une analgésie est mise en place avant l'intervention, et maintenue après intervention en cas de signes de douleur.

Devenir

A l'issue du prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale, les animaux de génotype d'intérêt sont conservés (2/3 des animaux), les autres sont mis à mort. Tout au long du projet, les animaux atteignant l'âge de réforme (2 ans), sont mis à mort. La moitié des animaux seront de ce fait mis à mort au cours du projet. Ainsi, en fin de projet, sur les 560 animaux ayant subi un prélévement de l'extremité de la nageoire caudale, 560 * 2/3 * 1/2 = 186 animaux, qui seront maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme.

Remplacement

Nos travaux visent à mieux comprendre comment les interactions entre cellules modulent leurs déplacements et permettent la mise en place de grands mouvements morphogénétiques coordonnés. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales) et elles le sont par d’autres équipes. Néanmoins, la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo. C’est d’ailleurs l’un des enjeux de ces travaux que de parvenir à comprendre les bases cellulaires des mouvements morphogénétiques pour pouvoir les reproduire in vitro, dans le cadre d’approches en médecine régénérative. L'embryon précoce de poisson permet l’analyse des phénomènes qui nous intéressent sans aucune procédure invasive, tout en assurant une proximité évolutive avec l'humain. Comparé à d’autres modèles, comme la souris, il permet ainsi de ne pas mettre à mort la mère pour accéder aux œufs. Aucune expérimentation n’est effectuée sur les animaux (embryons précoces uniquement). Par contre, le maintien de certaines lignées mutantes implique leur génotypage, qui nécessite le prélévement de tissu.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation de 7 lignées mutantes (phénotype non dommageable), dont le génotypage implique le prélèvement de l’extrémité de la nageoire caudale. Le nombre d’animaux nécessaires au projet est calculé comme suit : nombre de reproducteurs nécessaires à un instant donné (dépendant de la fréquence d’emploi de la lignée, varie de 5 à 10 couples), multiplié par le nombre de générations nécessaires pour couvrir la durée du projet (un couple restant fertile +/- 18 mois, 3 générations sont nécessaires), divisé par 0.8 (pour prendre en compte les animaux infertiles ou d’enventuels biais de sexe ratio, qui font que certains adultes ne sont pas utilisables). Pour les lignées mutantes, s’ajoute à cela le fait qu’un tiers des animaux élevés sont sauvages (les embryons homozygotes ne se développent pas et laissent donc 1/3 de sauvages et 2/3 d’hétérozygotes). Pour 7 lignées mutantes, cela représente 560 animaux environs. Les autres lignées utilisées sont des lignées transgéniques (phénotype non dommageable) porteuses de rapporteur fluorescents, qui peuvent donc être génotypées par simple observation des larves avant élevage. Ceci réduit le nombre d’animaux élevés, et réduit le nombre de prélèvement nécessaires au génotypage. Enfin, nous testons des méthodes alternatives au prélèvement de l’extrimité de la nageoire sur adulte, mais pour l’heure, elles ne sont pas suffisemment fiables pour être utilisées.

Raffinement

L’unique procédure de ce projet est le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire caudale, afin de génotyper les lignées mutantes. Pour réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux : - la surface de nageoire prélevée est limitée à 2 mm2. - une analgésie est mise en place avant le prélévement, par traitement à la Lidocaïne, prolongée si nécessaire après prélévement. - après prélèvement, les animaux doivent être maintenus isolés, le temps que le génotypage soit réalisé. Celui-ci sera effectué le plus rapidement possible, pour limiter la durée de l’isolement. Les animaux isolés sont maintenus à proximité d’autres animaux, assurant un contact visuel. Si le génotypage n'a pas été effectué sous 15 jours, les animaux sont hébergés avec au moins 2 autres animaux d'un fond génétique différent, permettant une identification visuelle simple.

Choix des espèces

Nous utilisons le poisson zèbre pour ses qualités en terme d’accessibilité à l’embryon (développement externe), d’imagerie (embryon translucide autorisant l’imagerie de processus internes sans acte invasif), de génétique (génome séquencé, nombreuses lignées disponibles), et de proximité à l'humain. L’accessibilité et la transparence de l’embryon permettent d’effectuer nos travaux sans les gestes invasifs qui seraient nécessaires sur un modèle mammifère, et de limiter le nombre d’embryons utilisés (embryons suivis sur plusieurs heures au lieu de sacrifier de nombreux embryons). Enfin, il existe une large littérature scientifique utilisant le poisson pour aborder des questions proches des nôtres sur lesquelles nous nous appuyons pour concevoir nos expériences. Le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire pour génotypage sera réalisée entre 1 et 6 mois.

6 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, entretenues pour maintenir des lignées transgéniques liées à l'obésité. Chaque animal subit une pose de bague sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, les reproducteurs étant réformés puis tués ou réutilisés, les autres orientés vers d'autres procédures ou tués selon leur génotype. Le porteur signale des cas de cannibalisme des parents sur les petits et des dystocies conduisant à euthanasier les femelles. Il affirme que l'élevage de ces lignées est le "seul moyen" de les étudier et que les expériences doivent être menées dans un "organisme intégré".

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie du tissu adipeux (TA). Ainsi, au laboratoire nous nous intéressons à trois grandes voies et à leur rôle dans l’homéostasie adipocytaire : ->la seipine est une protéine dont l’absence entraine une perte massive de tissus adipeux, nous avons généré des souris constitutivement déficientes en seipine dans tout l’organisme et des souris avec une déficience induite dans le tissus adipeux -> Nos travaux récent suggèrent que les point de contact entre le réticulum et la mitochondrie ont un rôle important dans le tissu adipeux, nous avons généré une souris déficiente pour une des protéines clés de ces points de contact ->L’accumulation du cholestérol semble avoir un effet délétère sur l’homéostasie de l’adipocyte. Nous avons généré une lignée de souris doublement déficiente pour les enzymes qui assurent l’estérification du cholestérol. Afin de réaliser les projets apafis déjà autorisés, et nos futurs travaux, nous avons besoin d’entretenir l’élevage de ces animaux.

Bénéfices attendus

L’élevage de ces lignées est le seul moyen de les étudier car elles ne sont disponibles commercialement. Les résultats des études réalisées avec ces lignées pourraient permettre de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les conséquences néfastes de l'obésité avec notamment une focalisation sur les facteurs de risques cardiométaboliques.

Procédures

Anesthésie à l’isoflurane pour identification de l’animal avec pose de bague Biopsie de queue 1 fois dans la vie de l’animal pour génotypage et/ou phénotypage

Impact sur les animaux

En règle générale, il n’y a pas de nuisance prévue. Néanmoins, il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur leur petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux sont isolés avec un enrichissement adapté et peuvent être exclus de l’aspect reproduction. De plus, des cas de dystocies peuvent être observées chez les femelles qui doivent alors être euthanasiées.

Devenir

Après 6 à 8 mois après l’accouplement, les reproducteurs sont réformés et soit euthanasiés ou réutilisés dans d’autres procédures. Pour les autres animaux, en fonction de leur génotype les animaux seront utilisés dans des procédures expérimentales dans le cadre d’une utilisation continue, ou sinon ils seront euthanasiés

Remplacement

Nos trois principales hypothèses de travail sont étudiées en parallèle dans des lignées d’adipocyte, les 3T3-L1 ainsi que des biopsies de tissu adipeux de patients bénéficiant de chirurgies bariatrique. Ces modèles ont permis de remplacer les modèles animaux dans la détermination du rôle de différents gènes dans la dysfonction adipocytaire et ils permettent également de déterminer quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires associés dans l'adipocyte. Les expériences proposées chez l’animal correspondent à des questions qui doivent impérativement être adressée dans des organisme intégrée permettant de faire le lien entre dysfonction adipocytaire et maladies métabolique.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 6250 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistique adaptés

Raffinement

Lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du Nestlet (coton) est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum J+3 après la mise bas ; une étiquette est apposée pour signaler ce report. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Les gestes invasifs tel que le baguage et biopsie sont réalisés sous anesthésie générale, excepté pour une des lignées, qui est intolérante à l'anesthésie avant l’âge adulte (détresse respiratoire) chez laquelle ces gestes sont réalisés à l’état vigile.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiométaboliques associées à l’obésité. De plus, l’ajout de séquences Lox sur les différents gènes d’intérêt, nécessaires à leur délétion, n’a été réalisé que dans le modèle murin. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils d'analyse biochimique. Nous utilisons les animaux de 8 à 10 semaines qui sont matures sexuellement pour l’élevage. Nous utilisons des animaux de 8 à 10 semaines pour nos procédure, car c’est à ce stade que les dysfonctions adipocytaires sont les plus marquées.

324 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et 50 animaux réutilisés pour l'élevage ou d'autres projets. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et la pose d'une bague à l'oreille à quinze jours, puis un test de force musculaire sous anesthésie, tout en développant une perte de coordination et une intolérance à l'effort. L'objet est de caractériser la composante musculaire d'une maladie neuromusculaire génétique. Le porteur affirme que la coordination des processus en jeu ne peut être étudiée qu'in vivo, sur un animal vivant.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une maladie neuromusculaire d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une perte de coordination des mouvements avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré et des crises d’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre la composante musculaire de cette maladie en étudiant la fonction musculaire de façon non invasive dans un modèle qui possède une perte totale du gène responsable de la maladie et qui développe une forme modérée de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront, à moyen terme, une meilleure compréhension des anomalies de la fonction musculaire et des anomalies moléculaires et biochimiques dans cette maladie, ce qui permettra de mettre en place des essais pré-cliniques afin de tester l’efficacité d’agents pharmacologiques. A long terme, l’identification de solutions thérapeutiques efficaces permettra le transfert de ces données vers la clinique pour une meilleure prise en charge et prévention de la maladie

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute. Le projet comprend aussi un test de force musculaire non invasif sous anesthésie générale (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les souris modèles développent une maladie neuromusculaire progressive avec la perte de la coordination des mouvements et une intolérance à l’effort uniquement décelable grâce aux tests de comportement, ce qui peut induire un léger stress. Ces souris ont une alimentation et une durée de vie normales. Pour l’identification et le génotypage des animaux, le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. A l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort dus au poids de la bague.

Devenir

Les animaux reproducteurs seront utilisés pour générer le nombre d’animaux nécessaires pour la procédure expérimentale. Les animaux de génotypes non-utiles seront recyclés pour les croisements ou d’autres utilisateurs, ou mis à mort. Les animaux des cohortes expérimentales sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et biochimiques

Remplacement

Bien que l'analyse de la fonction musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, la coordination des processus biologiques qui la régule et leurs répercussions fonctionnelles ne peuvent être étudiées qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les souris étant génétiquement modifiées, un élevage spécifique est mis en place. Les souris surnuméraires et de génotypes utiles sont recyclées pour les croisements ou pour d’autres utilisateurs. L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses expérimentales. L’utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l’établissement des données expérimentales, à l’aide des analyses statistiques effectuées précédemment. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des mesures de force musculaire rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors du protocole de la mesure de la force musculaire.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines puisque 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos premières données de l’étude du modèle montrent que ce modèle reproduit la maladie étudiée dans ce projet. Pour l’élevage de la lignée, des souris âgées entre 8-20 semaines seront utilisés pour s’affranchir d’éventuelle baisse de production après 6 mois. L’identification et la biopsie pour le génotypage se font à 15 jours. Pour la procédure expérimentale, deux stades seront étudiés pour les test de force musculaire: 20 et 40 semaines. A 40 semaines, une intolérance à l’effort a déjà été identifiée dans une expérience pilote menée dans une précédente animalerie sur un nombre limité d’animaux en utilisant un protocole de tapis roulant, démontrant des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire. Ensuite, les analyses biochimiques montrent des anomalies dès 20 semaines pouvant potentiellement entraîner des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire.