Procédures légères

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de phalange pour génotypage, des injections intrapéritonéales et un traitement induisant une inflammation intestinale, avant mise à mort et prélèvements. Le porteur décrit les effets attendus de cette inflammation, diarrhée sanglante, prolapsus rectal, amaigrissement rapide et prostration, et prévoit une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il indique que des organoïdes intestinaux ont déjà servi mais affirme que la complexité d'un "organisme entier" impose le recours à l'animal.

Objectifs

Un dérèglement de la pysiologie de l’épithélium intestinal constituant la muqueuse intestinale, est la base du développement de maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Comprendre comment s’établit cette inflammation chronique de l’intestin représente donc un enjeu majeur de santé publique. Cette inflammation est due à une réaction incontrôlée des lymphocytes qui attaquent la flore microbienne (microbiote) contenue dans l’intestin. Etant en première ligne face au mille milliards de bactéries contenues dans l’intestin, les cellules épithéliales intestinales jouent un rôle pivot dans la régulation de la réponse immunitaire. Grâce aux différents capteurs de motifs microbiens qu’elles possèdent, elles sont capables d’alerter les lymphocytes. Alors que ces lymphocytes ne devraient pas réagir contre le microbiote, ils se mettent à l'attaquer. Ce qui amène à l'inflammation intestinale. En ce sens, les cellules épithéliales représentent une sentinelle régulatrice de premier plan alertant le système immunitaire. Aujourd’hui, nous essayons de comprendre comment les cellules épithéliales intestinales calibrent et transmettent les informations du microbiote aux lymphocytes dans l’intestin en condition physiologique et pathologique. Nous analyserons l’impact de l’absence de molécules potentiellement impliquées dans ce calibrage dirigé par des cellules sentinelles insoupçonnées que sont les cellules épithéliales intestinales. Ainsi, pour y parvenir, nous éliminerons l’expression de molécules que nous supputons être impliquées. Ces molécules « candidates » se basent sur des études précédentes. Ces ablations moléculaires seront spécifiques, conditionnelles et inductibles. Elles cibleront soit les cellules épithéliales intestinales ou les lymphocytes. Nous analyserons l’impact sur les cellules épithéliales, sur les lymphocytes et sur la composition du microbiote. En effet, les réactions des lymphocytes contre le microbiote peuvent altérer la composition du microbiote. Après avoir déterminé l’impact en condition physiologique nous analyserons l’impact en condition pathologique dans des modèles murins établis couramment utilisés. Pour ce projet nous tablons sur l’utilisation de 804 souris réparties en 6 procédures. Chaque procédure sera optimisée pour répondre à différentes questions simultanément limitant significativement le nombre total de souris du projet.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin telle la maladie de Crohn ou la rectocolique hémorragique provoquent un inconfort douloureux chronique pour les patients et peut malheureusement amener à des cancers intestinaux, en particulier le cancer colorectal. Ce cancer est le deuxième cancer le plus fréquent en France. . Cette étude mettra en lumière des nouvelles pistes thérapeutique à envisager. Notamment ce projet précisera le rôle clé joué par des médiateurs moléculaires et microbiens dans la promotion de ces maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

- Récolte des fécés: procédure non invasive et rapide (2 fois) - Biopsie de la phalange distale pour génotypage et identification des différentes lignées (manipulation faite sur souris de 7 à10 jours. Du fait de la faible innervation de ce tissu à cet âge, il est supputé que cette intervention et non douloureuse. - Injections intra-péritonéales (injection à l'aide d'une seringue). Une simple contention sera requise. - Traitement dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 9 semaines (procédé non invasive et aucun problème de prise hydrique n'est observée).

Impact sur les animaux

La majorité des souris utilisées dans ce projet ont été décrites dans d’autres études. Ces animaux ne présentent aucun phénotype macroscopique et physiologique particuliers impactant leur bien-être. Le cas échéant en ce qui concerne, les nouvelles lignées crées dans ce projet ou les souris entrées en procédures invasives (traitement générant une inflammation intestinale) une inspection minitieuse et régulière sera établie. L’inflammation intestinale amène à des problèmes d’hydratation consécutifs à une forte diarrhée. Elle génère des problèmes de transit telle la diarrhée. Cette diarrhée dans certains cas peut s’accompagner de sang. La douleur abdominale peut aussi entraîner des prostrations longues, un isolement anormal de l’animal, et une absence de toilettage. Des rectoprolapses devront être aussi surveillés. Un amaigrissement rapide de l’animal est tout autant un signe de l’inflammation intestinale à scruter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués pour analyses.

Remplacement

Les hypothèses avancées dans ce projet se basent sur des études préliminaires issues d’un précédent projet. De plus, beaucoup des assertions avancées ici ont été également étudiées et confirmées in vitro grâce à l’établissement d’organoïdes intestinaux (modèle d’intestin in vitro). Néanmoins, ce système in vitro bien que pratique et informatif ne récapitule pas toutes les complexités d’interactions spatio-temporelles, moléculaires, microbiennes et cellulaires intervenant dans un organisme et demande donc une étude à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Des études statistiques adéquates seront effectuées en nous basant des observations des précédents projets et de nos expertises acquises. Dans toutes les procédures, divers paramètres seront analysés. Ce qui diminue grandement le nombre de souris du projet. Pour réduire encore le nombre d’animaux plusieurs personnes expérimentées de l’équipe seront en charge de récolter, de préparer les tissus et les cellules pour les analyses. Ce travail de collégial est mis en place pour optimiser et permettre d’obtenir des données expérimentales les plus exploitables et fiables possibles. Ce qui évitera d’avoir à répéter des expériences. En effet, la préparation des intestins est délicate et on peut facilement perdre des échantillons (mort cellulaire) en travaillant trop lentement. En outre, pour éviter de faire naître des souris pour rien, les expériences seront réfléchies et construites de telle sorte à pouvoir utiliser à la fois des mâles et des femelles. Les MICI touchent avec la même incidence l’Homme, qu’il soit mâle ou femelle.

Raffinement

Le modèle d’élimination génique conditionnelle et inductible visant des cellules ciblées spécifiques permet de diminuer les effets non voulus d’une délétion précoce, ubiquitaire ou voire constitutive d’un gène. En ce sens les choix du modèle génétique utilisé est un raffinement. Un contrôle 3 fois par semaine sera effectué pendant toute la durée de l’expérimentation. Néanmoins, un suivi tous les jours sera effectué lorsque les souris rentrées en procédure amenant à de l’inflammation intestinale. Lors de ces expériences, nous augmenterons le nombre de bâtonnets de coton dans la cage pour permettre au souris d’établir un environnement plus cocooning et confortable. Ayant en tête que les souris sont des animaux sociaux, pour éviter toute souffrance psychologique, nous tâcherons à organiser nos groupes pour éviter de laisser une souris seule isolée dans une cage. La présence de rectoprolapses (sortie anormal du rectum par l'anus) ou la présence de diarrhée accompagnée de sang ou la perte de poids supérieure à 20% du poids initial et/ou une prostration longue limitant la prise alimentaire des souris impliqueront une mise à mort. Les tissus seront prélevés pour analyses. Si ces points limites ne sont pas atteints mais cependant nous observons, de fécès molles non accompagnées de sang, une prostration courte n’empêchant pas les mouvements et les interactions sociales de l’animal et une perte de poids inférieur à 20%, nous disposerons d’un gel hydratant et nous humidifierons quelques croquettes dans la cage pour favoriser l’hydratation et la prise alimentaire des souris. Nous passerons alors 2 fois par jour visiter les souris pour s’assurer qu’une aggravation dramatique n’est pas lieu dans la journée. Si un des points limites décrits auparavant apparaît l’animal sera mis à mort. Le cas échéant, il est tard et la logistique matériel et humaine nous permettant de tuer les souris pour analyses le jour même n’est pas disponible, nous disposerons d’un gel hydratant et nous humidifierons quelques croquettes dans la cage pour favoriser l’hydratation et la prise alimentaire des souris et les souris seront mises à mort et analysées le lendemain matin. En plus des observations faites par les expérimentateurs, une observation quotidienne des animaux par les zootechniciens informés des signes attendus augmentera la vigilance et une détection précoce des signes de mal-être et permettra une intervention précoce.

Choix des espèces

L’ensemble des outils pour ce genre d’études sont développés chez la souris. Par ailleurs, son système immunitaire intestinal est extrêmement bien caractérisé. Enfin, les processus inflammatoires intestinaux décrits chez la Souris sont souvent conservés et similaires à ceux observés chez l’Homme. Cette ressemblance fait du modèle murin un modèle adéquat. Les animaux seront traités dès le sevrage. Le système immunitaire de l’intestin se mature rapidement à partir du sevrage. Pour s’assurer du rôle de nos molécules candidats sur la maturité de l’intestin, il est donc judicieux de commencer le traitement au moment du sevrage.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Elles sont coïnfectées par un nématode intestinal et par un agent de la malaria murine, avec gavage, injection intrapéritonéale et prélèvements sanguins à la queue trois fois par semaine, puis tuées. Le porteur minimise les effets, décrivant l'infection par le nématode comme asymptomatique et la souche de plasmodium comme non létale, avec une anémie transitoire pour seul symptôme, tout en classant les procédures en modéré. L'objectif est de comprendre la dynamique de cette coïnfection fréquente chez les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’effet de la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine sur la dynamique de l’infection et la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Est-ce que le niveau d’immunosuppression de l’hôte, induit par une infection par des nématodes intestinaux, dépend de la présence d’un autre pathogène ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à obtenir une meilleure compréhension de la dynamique de la coïnfection entre nématodes et plasmodiums. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle de la coïnfection dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois), prélèvements de petits volumes sanguins (10 µl) à l’extrémité de la queue après application d’un anesthésiant local (3 fois par semaine), injections i.p. (100 µl après application d’un anesthésiant local, une seule injection par individu), prélèvement sanguin par ponction maxillaire sur animal anesthésié à l’isoflurane (une seule prise de sang par individu).

Impact sur les animaux

Nous n’attendons que peu (voire aucun) effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Pour la revitalisation de plasmodium 10 souris seront infectées et à J12 post-infection une prise de sang sera effectuée par ponction maxillaire. Cette prise de sang sera effectuée sous anesthésie à l’isoflurane. Dès la prise de sang effectuée, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expérience, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer les effets de la coïnfection sur la dynamique d’un nématode intestinal et un plasmodium, ainsi que sur la réponse immunitaire de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 20 souris par groupe expérimental, avec 5 souris mises à mort pour chaque jour de prélèvement, plus 10 souris initialement utilisées pour revitaliser le plasmodium. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience que 2 fois. Au total donc 420 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 12 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

241 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Ils sont vaccinés par voie intramusculaire, ponctionnés par voie rétro-orbitale, infectés par les variants Beta et Delta du SARS-CoV-2 par voie intranasale, puis subissent un prélèvement de sang total par ponction intracardiaque et une autopsie. Le porteur limite les effets attendus à une perte de poids transitoire entre J+1 et J+6 et affirme que l'infection n'entraîne jamais de mortalité. Il indique que les variants sont produits en culture cellulaire, mais que l'évaluation de l'efficacité vaccinale ne peut être conduite que sur modèle animal.

Objectifs

Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis des protéines situées à la surface du virus. Avec un risque de mutation de ces protéines au cours du temps, l'efficacité des vaccins actuels pourrait s'en trouver diminuée. Par ailleurs la réponse anticorps contre cette protéine de surface, s'estompe dans le temps et pourrait ne plus être suffisante pour une protection à long terme. Le présent projet se propose de poursuivre l'évaluation de l'efficacité d'un nouveau vaccin produit à partir d’une protéine conservée au sein de la famille des coronavirus (protéine N) , qui oriente la réponse immunitaire vers une réponse cellulaire (en plus de la production d'anticorps) en stimulant certaines catégories de cellules (les lymphocytes T) responsables de la destruction des cellules infectées. L'efficacité de ce nouveau vaccin, déjà démontré sur le variant classique du SARS-CoV2 lors des deux dernières études, sera testée ici sur deux variants du SARS-CoV2 largement répandus à travers le monde : le variant Beta (Sud-Africain) et le variant Delta (Indien).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de poursuivre les travaux menés lors des précédents projets sur le variant classique du SARS-CoV2 et d'évaluer l'efficacité des formulations de vaccin (associé ou non à un adjuvant) vis-à-vis des variants du SARS-CoV2. Les bénéfices attendus sont les suivants : - Valider et caractériser l'infection par les variants Beta et Delta du SARS-CoV2 nouvellement acquis au laboratoire et comparer le pouvoir infectieux de ces variants avec celui du variant dit "classique" - Etudier la réponse immunitaire chez le hamster engendrée par les différentes formlulations vaccinales testées - Evaluer l'efficacité des formulations vaccinales testées vis à vis des variants Delta et Beta validant ainsi le spectre d'efficacité du vaccin.

Procédures

Procédure 1. Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour prise de sang par voie rétro-orbitale, et vaccinés par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies. 2/vaccinés à J28 par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies. 3/ anesthésiés J56 pour subir une prise de sang par voie rétro-orbitale et une autopsie pour collecte d'organes. Procédure 2. Tous les animaux seront : 1/ anesthésies à J0 pour infection par voie intranasale avec l'un des deux variants 2/ anesthésiés à J+2 (ou J+4 ou J+7 ou J+11 selon les individus) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes. Procédure 3. Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour prise de sang par voie rétro-orbitale, et vaccinés par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies. 2/ vaccinés à J28 par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies. 3/ anesthésies à J56 pour infection par voie intranasale avec l'un des deux variants, et pour prise de sang par voie rétro-orbitale. 4/ anesthésiés à J60 (50%) ou J63 (50%) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir de J+7, les animaux commencent à reprendre du poids. Aucun n'effet indésirable n'est prévu pour les animaux de la procédure 1 qui ne seront que vaccinés.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.

Remplacement

La production des variants Beta et Delta du SARS-CoV2 est réalisée in-vitro sur culture cellulaire au moyen d'une lignée Vero E6. Les évaluations de la pathogénie des variants, de la réponse immunitaire post-vaccination et de l'efficacité vaccinale, ne peuvent, quant à elles, n'être conduites que sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été défini de sorte à avoir 5 ou 6 animaux à chaque temps de mise à mort qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

4 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les modèles, elles subissent des greffes de tumeurs sous-cutanées ou orthotopiques par chirurgie, des injections de cellules cancéreuses dans le ventricule gauche ou le tibia pour induire des métastases, des splénectomies, des prélèvements sanguins répétés et des gavages, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objectif déclaré tient en une ligne, développer de nouvelles nanoparticules théranostiques et des traitements du cancer, et une partie des procédures relève de tests réglementaires de toxicité. Le porteur affirme que la biodistribution ne s'obtient que sur animaux et qu'aucun modèle in vitro ne permet ce travail sans perte d'informations.

Objectifs

Selon l’OMS, on estime à 19 millions le nombre de nouveaux cas de cancer et à 10 millions le nombre de décès liés au cancer survenus en 2019. Les cancers les plus fréquemment diagnostiqués dans le monde sont ceux du poumon (avec 2,2 million de cas), du sein (2,3 million de cas) et le cancer colorectal (1,9 million de cas). Dans ce cadre, nous proposons d’évaluer un panel de nanoparticules à visée diagnostique et/ou thérapeutique. Les particules porteront un marqueur fluorescent qui permettra de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non invasive par imagerie de Fluorescence. Les particules cibleront différentes protéines d’intérêt, généralement surexprimées dans la plupart des cancers. Les lignées de cellules cancéreuses étudiées auront été au préalable transfectées avec le gène de la luciférase. Elles pourront ainsi être suivies dans l’organisme de façon non invasive par imagerie de bioluminescence. Les particules seront tout d’abord testées in vitro sur cellules tumorales en culture. Seules les particules validées in vitro seront évaluées in vivo. Le modèle murin semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles nanoparticules théranostiques et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Dans le cadre du développement de tumeurs sous-cutanée et orthotopiques mammaires, les animaux subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse. Dans le cadre du développement de tumeurs orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations orthotopiques de cellules cancéreuses dans leur environnement, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse. Dans certains cas ils subiront également des procédures chirurgicales de splenectomie et de résection tumorale. Dans le cadre du développement de métastases, les animaux subiront une injection de cellules cancéreuses dans le ventricule gauche ou dans le tibia, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse. Dans le cadre de la détermination de la cinétique sanguine d'un composé, les animaux subiront une injection intraveineuse, sous anesthésie gazeuse, puis des prélèvements répétés dans la veine caudale (animaux vigiles). Dans le cadre des traitements anticancéreux, les animaux subiront soit une injection initraveineuse (sous anesthésie gazeuse), soit une injection intrapéritonéale sur animal vigile, soit un gavage sur animal vigile. Dans le cadre des procédures d’imagerie, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz.

Impact sur les animaux

Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées. Les signes de souffrance seront observés, quottés et éventuellement additionnés selon les points limites décrits et tout score atteignant 3 ou plus entrainerait l’euthanasie immédiate de l’animal par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux et compte tenu que les expériences ne sont pas de classe sévère, des cohortes d’animaux pourront être utilisées pour répondre à plusieurs objectifs (informations sur la biodistribution de particules, informations sur l’efficacité de traitement anticancéreux, etc). De plus, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% dans certaines procédures si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations).

Raffinement

Nous utiliserons des souris immuno-déprimées, qui représentent un modèle proche de la physiopathologie humaine, et permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La croissance des tumeurs n’entraîne pas de gêne et sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie de bioluminescence. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. Elle sera modérée pour les études sur tumeurs orthotopiques. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

- Les souris immunodéprimées (NOD-SCID,balb nude et NMRI nude) permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. - les souris Balb/c immunocompétentes permettront d'effectuer la cinétique sanguine des particules étudiées. - les souris SKH1 permettent de faire de l'imagerie de fluorescence dans un contexte de souris hairless et immunocompétentes en s’affranchissant du stress causé par le rasage et l’épilation nécessaires dans le cas de souris à poils. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo.

1 326 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour la plupart, modéré pour 60 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'oligosaccharides bactériens comme les LPS, et 60 subissent en plus une chirurgie sous anesthésie pour prélever un organe lymphoïde. L'objectif est d'identifier les signatures immunitaires déclenchées par ces molécules dans l'"organisme entier", pour repérer des cibles de futures stratégies anti-bactériennes et vaccinales, des retombées thérapeutiques lointaines. Le porteur affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" et que l'approche animale est "inévitable", aucun autre modèle comme le poisson-zèbre ou la mouche n'ayant un système immunitaire assez proche de l'humain.

Objectifs

Objectif n°1: Identification in vitro et in vivo des signatures immunologiques, cellulaires et moléculaires associées à la réponse à différents oligosaccharides bactériens (LPSs et CbG) à partir des données obtenues avec la procédure 1 (analyses de cellules primaires in vitro). Procédure expérimentale 2. Objectif n°2: Utilisation des signatures identifiées lors de la procédure expérimentale 2 pour analyser le rôle de certains organes lymphoïdes, comme l'omentum (sans que ce soit limitatif), dans la réponse des souris à nos différents oligosaccharides bactériens (LPSs et CbG). Procédure expérimentale 3. Au total, cette étude devrait identifier les éléments structuraux des oligosaccharides bactériens objets de notre intérêt qui sont responsables d'une signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité et conduire à la découverte de nouvelles molécules/voies de transduction déclenchées dans l'organisme entier par des LPSs ou des motifs particuliers de ces LPSs, ou par le CbG de bactérie intracellulaire, et qui serviront de cibles pour mettre au point de nouvelles stratégies anti-bactériennes et vaccinales.

Bénéfices attendus

Au total, cette étude devrait identifier les éléments structuraux des oligosaccharides bactériens objets de notre intérêt qui sont responsables d'une signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité et conduire à la découverte de nouvelles molécules/voies de transduction déclenchées dans l'organisme entier par des LPSs ou des motifs particuliers de ces LPSs, ou par le CbG de bactérie intracellulaire, et qui serviront de cibles pour mettre au point de nouvelles stratégies anti-bactériennes et vaccinales.

Procédures

Il n’est attendu aucun stress significatif, ni douleur physique des souris à la suite des deux premières procédure. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530 cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou bi-hebdomadaires pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Pour la dernière procédure 60 animaux seulement,lLa petite chirurgie envisagée pratiquée sur souris anesthésiées (100µL kétamine/xylazine/10g de poids corporel, mélange anesthésiant réalisé par le personnel compétent de l’animalerie) est susceptible d'engendrer un stress et douleur physique modérés des souris, qui après récupération seront injectées avec nos oligosaccharides sans stress significatif ni douleur à la suite de ces injections. En cas de tout signe de douleur, souffrance ou d’angoisse suite à l’intervention, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 1-2mg/kg de poids corporel. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nos visites quotidiennes pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris.

Impact sur les animaux

Il n’est attendu aucun stress significatif, ni douleur physique des souris à la suite de cette procédure proprement dite (cf. commentaire ci-dessus). Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum (530 cm²). La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou bi-hebdomadaires pour le suivi des animaux seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort

Remplacement

Le but de ce projet est de définir précisément les voies de signalisation mises en oeuvre par l'exposition du système immunitaire d'un mammifère à divers oligosaccharides (LPSs ou CbG) de façon à déterminer les éléments structuraux de ces molécules responsables du déclenchement d’une signalisation activatrice et/ou inhibitrice dans les différentes cellules de l'immunité. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. Notre connaissance du rôle mécanistique de ces différents oligosaccharides dans la réponse cellulaire et moléculaire d’un hôte proche de l’homme apportera des informations essentielles, qui ouvriront la voie à de nouvelles thérapies anti-bactériennes et vaccinales et rendent l’approche animale inévitable.

Réduction

En ce qui concerne les animaux produits dans l'animalerie du CIML, les femelles seront utilisées dans la mesure du possible pour les expériences in vivo et un mélange mâle-femelle pour les cultures cellulaires de façon à diminuer le nombre de souris à produire. La réduction du nombre d’animaux sera réalisée par la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal.

Raffinement

L’hébergement des animaux se fera en confinement protégé en cages individuellement ventilées, à raison d'un maximum de 5 souris par cage, dans une animalerie de type A1+, avec eau et boisson à volonté. L’environnement est enrichi par ajout de dômes, papier et copeaux compressés utiles à la nidification. Un délai d’une semaine entre la réception des souris et la date d'expérimentation sera respecté. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience ou avant s'ils présentent des signes de souffrance ou détresse.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de caractériser en détail au niveau moléculaire l'impact de l'administration de divers LPSs ou de CbG sur la réponse du système immunitaire dans l'organisme entier et de déterminer les éléments structuraux de ces oligosaccharides responsables de la signalisation activatrice et/ou inhibitrice sur les cellules de l'immunité de façon à proposer de nouvelles thérapies anti-bactériennes et vaccinales. Aucun autre organisme modèle (poisson-zèbre ou mouche) ne permet de répondre à cette question puisque leur système immunitaire est trop éloigné de celui de l'homme, dont le modèle murin est le plus proche tant du point de vue anatomique que physiologique. La caractérisation extensive du système immunitaire murin et les outils techniques, qui en découlent (anticorps pour cytométrie en flux, immunofluorescence et analyse par western ou immunoprécipitation, génome séquencé etc.), constituent des arguments supplémentaires qui font de la souris le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes âgées de 6-8 semaines pour la mise en culture et la différenciation des cultures primaires de moelle osseuse en cellules dendritiques car cette différenciation est impossible plus tardivement. En ce qui concerne les cultures primaires de macrophages issus de moelle osseuse des souris de 8-10 semaines seront utilisées pour les même raisons. Nous utiliserons des souris adultes avec une maturité complète du système immunitaire de 8-14 semaines pour les mises en culture de macrophages péritonéaux et les expériences in vivo.

160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau est irradié aux rayons X en trois séances de 10 Gy, avec prises de sang, IRM cérébrales et musculaires, puis une batterie de tests comportementaux nommés, open-field, test de fatigue, croix surélevée, préférence au sucrose, reconnaissance d'objets et labyrinthe en Y. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids et dégradation de l'état général, avec porphyrine autour des yeux et pelades sur la tête, et cherche à savoir si l'activité physique et la remédiation cognitive atténuent ces effets. Les retombées annoncées se limitent à des arguments supplémentaires pour les cliniciens afin d'améliorer la qualité de vie des patients traités par radiothérapie.

Objectifs

Le projet analysera les effets de l’irradiation encéphalique par rayons X sur le cerveau et sur les muscles squelettiques, déterminera les mécanismes sous-jacents à ces atteintes tissulaires et évaluera l’intérêt de stratégies thérapeutiques comme l’activité physique spontanée et la remédiation cognitive pour atténuer ces altérations cérébrales, musculaires ainsi que la fatigue et les déficits cognitifs. Ce projet fera suite aux travaux de thèse réalisés au sein de l’équipe, visant à évaluer l’impact de l’activité physique forcée sur les atteintes cérébrales et musculaires radio-induites chez le rat adulte. Notre projet permettra donc de comparer les effets de l’activité physique forcée et spontanée ainsi que d’évaluer l’intérêt de la remédiation cognitive associée ou non à l’activité physique spontanée pour réduire les altérations musculaires, la fatigue et les déficits cognitifs radio-induits.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'évaluer les effets négatifs de l'irradiation cérébrale sur le tissu sain et de déterminer l'intérêt de l'activité physique spontanée ou forcée, associée ou non à une remédiation cognitive chez le rat. Il permettra donc l'apport d'arguments supplémentaires aux cliniciens pour améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancers qui nécessitent l'utilisation de traitement et d'optimiser leurs soins de support.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures comme des prélèvements sanguins (2 fois pendant 5min maximum) et une irradiation cérébrale globale (irradiation fractionnée en 3 fois 10Gy pendant 3min). Ils seront également soumis à des acquisitions IRM cérébrales (2 fois pendant 45min) et musculaires (2 fois pendant 15min). L'ensemble des animaux réaliseront également des tests de comportement : test de l'openfield (activité locomotrice), test de fatigue (fatigue) , test de la croix surélevée (anxiété), test de préférence au sucrose (dépression) , test de reconnaissance d'objets (mémoire à court terme), le labyrinthe en Y (mémoire spatiale). L'ensemble des tests est réalisé 2 fois (à 2sem et 1mois après irradiation). La durée de chaque test est comprise entre 10 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids (graisseuse et musculaire) et pourront présenter des signes de leur dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête). L'intérêt de ce projet est d'évaluer l'intérêt de l'activité physique et de la remédiation cognitive pour atténuer et réduire ces effets indésirables. De plus, des soins seront apportés aux animaux irradiés comme du sérum physiologie pour nettoyer la présence de porphyrine ou l'ajout d'une crème cicatrisante pour la pelade sur la tête.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures #1, 2, 3, 4. Ils seront mis à mort lors de la procédure #5.

Remplacement

L’évaluation des effets de l’activité physique et de la remédiation cognitive après une irradiation encéphalique nécessite l’utilisation d'animaux. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et permettant d’évaluer l’intérêt thérapeutique de l’activité physique en association ou non avec la remédiation cognitive.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM, tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 160 rats répartis en 8 groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés aux normes requises, avec un ou plusieurs enrichissements dans les cages (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets, stimulation sociale avec un hébergement avec plusieurs animaux par cage) ; le personnel participant au projet est formé et les inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Enfin, les points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée (Irradiateur X-Rad 225CX) ainsi qu’une imagerie de haute résolution (IRM 7T Pharmascan). D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, nous avons développé au sein du laboratoire un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat, pour lequel nous avons déjà très bien caractérisé les dommages cérébraux ainsi que les modifications comportementales (fatigue, mémoire, comportements de type anxiété et de type dépression) jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi nous maitrisons très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie et aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés auront un poids d'environ 400g, âgés de 6 mois au début du protocole expérimental. Cet âge correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie. De plus, à l’âge de 6 mois, le rat présente le maximum de sa croissance squelettique et a atteint sa masse musculaire et sa force musculaire optimales (pic atteint entre 6 et 8 mois chez le rat Wistar).