Procédures légères
Imagerie et modélisation des circuits sensorimoteurs à l’échelle du cerveau entier de la larve de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 395 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les expériences, elles sont immobilisées vivantes dans un gel d'agarose, soumises à l'ablation de neurones au laser, à l'ablation chirurgicale des deux yeux, au retrait des otolithes d'une oreille ou à la destruction des cellules sensorielles de la ligne latérale par un bain de sulfate de cuivre, pour enregistrer l'activité du cerveau entier. Le porteur justifie le nombre par le fait que seule une petite proportion des larves d'élevage sert au renouvellement de la population, les autres étant utilisées puis tuées. Il affirme que la complexité du système nerveux central "ne peut être reproduite in vitro" et présente ce modèle comme un remplacement partiel de l'expérimentation sur des mammifères.
Objectifs
Comprendre comment le cerveau intègre les multiples informations sensorielles dans son environement afin de produire un comportement approprié est un objectif fondamental des neurosciences. La dynamique cérébrale qui sous-tend ces mécanismes d'intégration est largement distribuée à travers l'ensemble du système nerveux. Son étude requiert donc de pouvoir enregistrer à l'échelle cellulaire l'activité d'une large fraction des neurones. A l'heure actuelle, il n'existe pas de système de réseau de neurones in-vitro comparable à un cerveau entier. La compréhension de sa structure à grande échelle nécessite donc le recours à l'expérimentation animale. Nous utiliserons un organisme modèle vertébré, la larve de poisson zèbre, (Danio Rerio). Cet animal présente à l'état larvaire un ensemble d'atouts - comportements stéréotypés, cerveau de petite taille, transparence des tissus, accessibilité génétique. Cela nous permet d'utiliser des lignées exprimant des rapporteurs optiques de l'activité neuronale pour enregistrer, in vivo et de maniere non invasive, l'activite neuronale de l'ensemble du cerveau, par microscopie optique avec une résolution subcellulaire. Obtenir des données dans plusieurs régions du cerveau simultanément permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre et la durée des manipulations de chaque animal. Au total, 4395 larves de poisson zèbre (Danio Rerio) seront nécessaires pour ce projet de 5 ans. Le stade larvaire du poisson zèbre va d'environ 3 jpf (jours après fécondation) à 21 jpf. Nou utilisons des larves âgées de 6 à 14 jours, un âge où elles sont encore relativement transparentes. Ces larves sont issues de croisements de poissons adultes dans notre animalerie. Nous manipulerons ces larves avec un soin extrême, car nos projets exigent le minimum de perturbations possible pour recueillir des données comportementales et neuronales naturelles et fiables. Notre objectif est d'utiliser ces nouvelles approches expérimentales, couplées à des méthodes de physique statistique et d'apprentissage machine. Notre but est de produire un modèle numérique de la dynamique du cerveau vertébré qui rende compte à la fois de son activité endogène et des processus d'intégration multi-sensorielle et motrice lorsque l'animal évolue dans son environnement.
Bénéfices attendus
L'objectif est de développer un modèle d'interaction d'un vertébré avec son environnement complexe. Les bénéfices attendus sont des avances dans la connaissance scientifique sur l’intégration des stimulus multi-sensoriel et leur hiérarchisation dans la prise de décision motrice. La larve de poisson zèbre dispose par ailleurs d'un riche répertoire de comportements qui ouvrent la possibilité d'étudier les processus d'intégration sensorimotrices dans des contextes éthologiquement pertinents. Ainsi, ce projet devrait également permettre de valider l’utilisation de ce petit modèle dans le cadre du remplacement des modèles mammifères pour l’analyse des réponses sensori-motrices, tout en gardant une très grande pertinence du point de vue neuro-comportemental. Ainsi, nos données fourniront une base de données importante pour tester les modèles basés sur les circuits pour l'intégration sensori-motrice, la prise de décision et l'apprentissage multisensoriel-moteur et pour comparer l'architecture et la fonction des circuits neuronaux biologiques avec les implémentations in silico des réseaux neuronaux.
Procédures
Les expériences de la procédure 2 ont lieu en milieu ouvert: les larves sont libres de nager dans une cuve et leur mouvement est suivi au moyen d'une caméra. Différents dispositifs permettent de soumettre la larve à des stimuli contrôlés (visuels, acoustiques, thermiques, vestibulaires) afin de déterminer sa réponse sensorimotrice. Une larve n'est utilisée qu'une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pour les expériences des procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d'agarose qui les tiennent autour du tronc du corps. Nous observons le comportement (mouvement des yeux et de la queue) spontané et évoqué par des stimuli physiologiques variés (vestibulaires, visuels, thermiques, acoustiques) avec une caméra. Simultanément, nous enregistrons de façon non-invasive via des méthodes optiques l’activité neuronale du cerveau entier. Une larve n'est utilisée qu'une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pendant l'expérience de la procédure 3, certains neurones vont être activés ou désactivés de façon non invasive avec de la lumière. Avant les expériences de la procédure 4, nous injectons un ferrofluide biocompatible de façon uni- ou bilatérale dans les vésicules otiques des larves de poisson zèbre anesthésiées. Après un à deux jours de récupération, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans le gel d'agarose pour les expériences. Ici le ferrofluide sert de point d’accroche pour stimuler la perception vestibulaire et les mouvements corporels compensatoires grâce à un aimant placé sous le poisson. Pendant l'expérience de la procédure 5, des neurones individuels seront sélectionnés et ensuite ciblés pour une suppression rapide par ablation via un laser . Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 6, nous allons enlever via une intervention chirurgicale sous anesthésie les deux yeux des larves. Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 7, nous allons inactiver avec une intervention chirurgicale une oreille. Ceci sera réalisé en enlevant les otolites avec un embout de verre fin hors de la vésicule otique sur des larves anesthésiées entre 2 et 4 jpf. Avant les expériences de la procédure 8, nous allons enlever les cellules sensorielles de la ligne latérale par un bain de 2 heures dans une solution de sulfate de cuivre de faible concentration (10 μM/L).
Impact sur les animaux
Pour la procédure 2 aucun effet indésirable est attendu car les larves peuvent nager librement. Pour les procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d'agarose. Cette méthode permet une oxygénation de l'animal par simple diffusion de l'oxygène à travers la peau. L’immobilisation n’induit pas de douleur mais éventuellement du stress. Toutes les expériences sont effectuées par du personnel formé en expérimentation animale, ce qui permet de garantir de limiter le plus possible le stress. Cela est capital pour le succès des expériences dont le but est de caractériser la réponse comportementale et neuronale sous les conditions les plus naturelles possibles. Toutes les interventions chirurgicales sont exécutées sous anesthésie et la bonne récupération des larves est surveillée au cours du temps pour assurer une bonne cicatrisation et l`absence d’inflammation.
Devenir
Procédure 1 - 8: euthanasie. Pour des raisons de place et de coût, il ne sera pas possible d'amener l'ensemble des individus utilisés jusqu'à l'âge adulte. En milieu naturel, seule une toute petite proportion d’individus atteint l'âge adulte, ce qui signifie que si nous ne limitons pas artificiellement le nombre d'individus la population croît exponentiellement. Ainsi, seule une petite proportion de larves sera utilisée pour renouveler la population d'adultes. Les individus qui ne sont pas utilisés pour ce renouvellement seront utilisés pour les expériences, puis mis à mort à l'issue des procédures expérimentales.
Remplacement
Nos études visent à comprendre comment les capacités computationnelles émergent de l'organisation à toutes les échelles du cerveau chez le vertébré. Compte-tenu de la complexité structurelle et fonctionnelle du système nerveux, une telle recherche ne peut être menée sur des modèle in vitro ou in silico. Le choix du modèle animal (Danio Rerio) permet de répondre aux contraintes physiques (taille et transparence du cerveau) et génétique (disponibilité de méthodes de transgénèse) inhérentes aux méthodes d'enregistrement et de perturbations optiques. L'utilisation de ce modèle permettra de remplacer au moins partiellement l’expérimentation sur des mammifères. La morphogénèse d'un système nerveux central complet et pleinement fonctionnel ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui nécessite de recourir à des organismes modèles animaux pour étudier les réseaux neuronal du cerveau. Nos travaux permettrons à terme de définir des paramètre pour une modélisation in silico pour élaborer des hypothèse avant la phase expérimental ce qui permettra à réduire le nombre des animaux utilisés en expérimentation.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous suivons les méthodes suivantes : - Pour chaque expérience, nous limitons le nombre d’animaux au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous intégrons cependant assez d'animaux pour ne pas risquer d'avoir à refaire l'expérience. En totale, nous utiliserons 4395 larves de poisson zèbre. - Les expérimentations sont faites de façon séquentielle ce qui permet de ne pas intégrer d'autres animaux si les résultats escomptés ne peuvent être obtenus pour des raison techniques. - Nous partageons toutes les lignées de poissons sauvages et certaines lignées transgéniques entre les projets et les équipes utilisatrices. Si possible nous partageons les pontes lorsqu’il y a suffisamment d’œufs fécondés pour une utilisation par plusieurs expérimentateurs. Nous élevons que le nombre minimal d'embryons nécessaires au maintien d’une lignée (35 adultes). La population adulte de poisons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées et optimales pour le maintien de la diversité génétique (éviter la consanguinité).
Raffinement
Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Dans toutes les expériences menées, nous suivons systématiquement les signes visibles d’un animal souffrant. Selon les procédures, ces signes peuvent être l’apparence des animaux, leur position dans l'eau, leur cinétique de nage, leur circulation sanguine, leurs battements du cœur, etc. Si des signes d’anomalie apparaissent, nous interrompons immédiatement l’expérience et procédons à une euthanasie. Concernant l’élevage, nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement des points limites). Les poissons trop vieux pour la ponte ou présentant des signes de maladie sont euthanasiés afin d’éviter tout risque de souffrance. L’hébergement est conforme à la réglementation avec un contrôle permanent et quotidien reporté sur un registre. Pour enrichissement les poissons sont maintenus en groupes de 30-40 poissons dans un régime lumière/obscurité de 12/12 heures.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l'imagerie calcique des neurones. Son développement rapide, le grand nombre d'embryons synchronisés par la ponte et la diversité des lignées génétiquement modifiées disponibles en font un système de choix pour les neurosciences. La transparence et les dimensions réduites du cerveau à l'état larvaire en font un modèle pour étudier les réseaux neuronal à l'echelle du cerveau entier. Nous utiliserons des animaux adultes pour l'entretien des lignées. Toutes les expériences sur les animaux seront réalisées entre 6 et 14 jours après la fécondation (jpf). À cet âge, le cerveau est encore petit et peut être entièrement étudié par les méthodes optiques. En revanche, les systèmes nerveux moteur et sensoriel sont déjà en place et peuvent être analysés sans attendre le stade adulte (12 semaines).
Infection expérimentale de carnivores par Echinococcus multilocularis (Taenidae)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
50 renards et chiens viverrins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, dont dix réutilisés ensuite et quarante tués pour prélever les vers adultes dans leur intestin. Ils sont infectés par le ténia Echinococcus multilocularis par gavage œsophagien sous anesthésie, puis suivis par des prises de sang sous contention manuelle, afin de produire du matériel parasitaire de référence pour la mise au point de tests de diagnostic. Le porteur décrit l'infection comme asymptomatique et indique qu'aucun point limite n'est défini, tout en prévoyant une euthanasie en cas de pathologie sévère. Il affirme qu'il est "nécessaire d'utiliser ces espèces", hôtes définitifs du parasite, et qu'aucune méthode alternative ne permet de produire ces vers adultes.
Objectifs
Les échinococcoses telles que l'échinococcose alvéolaire causée par E. multilocularis sont des problématiques de santé publique aux niveaux national et européen. L’incidence annuelle moyenne en France est actuellement de 35 nouveaux cas/an entre 2010 et 2019 et est en constante augmentation en comparaison avec les décennies précédentes. Le nombre de cas hors des zones d’endémie connues augmente aussi, laissant supposer une zone d’endémie plus grande que celle décrite actuellement. Leur surveillance chez l'animal et dans l’environnement (sol, aliments, eau) à la source de la contamination humaine nécessite la disponibilité de méthodes de détection pertinentes requiérant du matériel parasitaire de référence. La maîtrise de l’infection par l'hôte défintif en captivité permettra de : 1/ Produire du matériel biologique de référence (oeufs et vers adultes) qui permettra d'une part de valider de nouvelles techniques de diagnostic d’E. multilocularis, 2/ Valider chez le chien viverrin la technique rapide de grattage pour le diagnostic rapide d'E. multilocularis dans l'intestin , 3/ Réaliser des infestations successives avec des souches différentes pour reproduire les conditions d'infection naturelle afin d'avoir une meilleure compréhension de la répartition des vers par identification génétique des vers tout au long de l'intestin (divisé en 5 segments). Cette distribution qui résulte de la compétition entre les vers impacte grandement les dynamiques de charge parasitaire dans le contexte d'une infection naturelle, ainsi que la détection du parasite lors du diagnostic via l’intestin et les fèces. Les réponses immunitaires périphériques et hématologiques à l’infection parasitaire seront également étudiées pour mieux comprendre l'impact du parasite sur les réponses sanguines de l'hôte.
Bénéfices attendus
L’ensemble des prélèvements collectés permettront de produire du matériel biologique de référence pour le développement d’outils de diagnostics indispensables à la surveillance du parasite chez les hôtes définitifs mais aussi afin de mieux apprehender la contamination intestinale des animaux dans un cadre controlée par une ou plusieurs souches de parasites, et enfin d'apréhender les risques de dispersion environnementale (dans le sol, les aliments, l'eau) des œufs du parasite responsables de la contamination humaine. Les réponses immunitaires périphériques et hématologiques à l’infection parasitaire seront également étudiées pour mieux comprendre l'impact du parasite sur les réponses sanguines de l'hôte. L’expérimentation consistant à inoculer deux souche Echinococcus multilocularis (d'origine différente et différenciée par leur taille et leur profil génétique) à un même renard et 14 jours d’intervalle permettra d’étudier la répartition des vers dans l’intestin pour comprendre les conditions de coinfection et leur impact sur la sensibilité du diagnostic.
Procédures
Les animaux seront manipulés pour recevoir l'injection intramusculaire de cocktail anesthésique, et être infectés expérimentalement, puis euthanasiés. Les prises de sang seront conduites sur animaux contenus mais non anaesthésiés. Les animaux supportent très bien la contention manuelle pour une prise de sang rapide, et cette procédure ne justifie pas les risques associés à une contention chimique. Nous avons tenté, dans des études antérieures, de présenter des formes larvaires directement dans des souris aux renards pour qu’ils les consomment oralement sans anesthésie, mais le succès de l’infection parasitaire était variable, contrairement à l’administration œsophagienne qui était plus standardisée dans ses résultats et son application (dose infectieuse mieux maitrisée). Cette méthode nous semble donc préférable pour augmenter la qualité des études et minimiser le nombre d’animaux requis.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress associée à la contention manuelle pour les prises de sang et l'injection des anaesthésiques. L'infection par le parasite est asymptomatique; aucun point limite n'est donc défini, mais un stress peut être induit par l'infection parasitaire. Cependant une euthanasie compassionnelle sera effectuée en cas de pathologie intercurrente sévère. Les animaux des procédures 2 et 3 seront mis à mort pour récupérer les vers adutes, car cela n'est possible que sur intestin ex vivo.
Devenir
La collecte des oeufs (procédure 1) ne nécessite pas l'euthanasie des renards qui seront vermifugés par 2 administration orale de praziquantel. Les autres procédures impliquant la collecte de vers adultes vivant ne peut se faire que dans l’intestin et nécessite donc l’euthanasie des animau.
Remplacement
Les hôtes définitifs d'Echinococcus multilocularis sont le renard et le chien viverrin. Il n'existe pas de méthode alternative pour produire des vers adultes à partir des protoscolex récoltés chez l'hôte intermédiaire. Il est donc nécessaire d'utiliser ces espèces, hôtes définitifs, pour étudier le développement du parasite, sa répartition spatiale et récolter des parasites adultes de qualité pour le développement des outils diagnostiques.
Réduction
Les animaux seront au maximum réutilisés d'autres protocoles à procédure légère sans impact sur l'infection parasitaire, et les animaux du protocole 1 pourront être réutilisés dans d'autres protocoles. Le nombre précis d'animaux nécessaire sera déterminé en fonction des résultats des premières études et des études antérieures, afin de minimiser au maximum l'utilisation inutile d'animaux et la répétition d'études non nécessaires.
Raffinement
Les renards et chiens viverrins sont hébergés individuellement pour respecter leur mode de vie dans des cages extérieures. Les conditions d’hébergement pour cette procédure tendent à répondre à la limite règlementaire de surface au sol par chien adulte (4m2) prescrit par la directive européenne 2010/63/EU. L’enrichissement de l’intérieur des cages vise de plus à stimuler le comportement naturel exploratoire, fouisseur et mordeur des animaux, et consiste en des plateformes/tunnels associées ou non à des litières (végétale, sable) d’environ 1,5m2 se rajoutant à la base de la cage de 3m2 et apportant aux animaux des aires de repos, de recherche de la nourriture et de marquage de territoire. L’abreuvement est fourni à volonté par des canalisations d’eau (thermostatées) qui courent le long de toutes les cages avec des pipettes accessibles à travers le grillage (2/3 pipettes par cage/animal). La distribution de nourriture est quotidienne. Les prises de sang sur renard sont réalisées avec une contention manuelle (non chimique) des animaux vigiles. Cette contention est rapide et sécurisée pour les animaux et les manipulateurs expérimentés, sur des tables d’examen placées près des cages, et est considérée plus sûre qu’une anesthésie générale induite par l’administration IM d’un cocktail de kétamine/médétomidine qui peut induire une hypothermie, et pour lesquels il faut mettre les animaux à jeun. A l’opposé, l'inoculation reste nécessaire par gavage, et requiert donc une anesthésie. Le gavage apporte des résultats d’infection beaucoup plus standardisés que dans un repas carné, et est donc choisi pour limiter le nombre d’animaux requis.
Choix des espèces
Les hôtes définitifs d'Echinococcus multilocularis sont le renard et le chien viverrin. Il n'existe pas de méthode alternative pour produire des vers adultes à partir des protoscolex récoltés chez l'hôte intermédiaire. Il est donc nécessaire d'utiliser ces espèces, hôtes définitifs, pour étudier le développement du parasite, sa répartition spatiale et récolter des parasites adultes de qualité pour le développement des outils diagnostiques. La technique de référence de recherche du parasite adulte est l'examen du grattage de l'intestin; une technique simplifiée et sans perte de sensibilité a été développée chez le renard. Son adaptation au chien viverrin nécessite l'étude de la répartition du parasite dans l'intestin du chien viverrin. Ce projet visent également à mieux comprendre la répartition de différentes souches parasitaires, y compris dans un contexte de co-infection, afin d'en améliorer le diagnostique et les risques de contamination de l'environnement. Tous les renards et chiens viverrins utilisés dans ce projet auront plus de 8 mois.
Mecanobiologie: role des mécanorécepteur après myéloablation ou lors de myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, répétées deux fois par semaine pendant quatre semaines pour une partie d'entre elles, et des prélèvements de sang par section de la queue sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leur sang et leur moelle osseuse. Le porteur étudie la formation des plaquettes et le rôle des forces mécaniques, et annonce des retombées à la fois thérapeutiques et technologiques, dont l'augmentation des rendements de production de plaquettes en bioréacteur. Il affirme que les expériences "nécessitent un animal adulte vivant" et que la souris est la seule espèce pour laquelle il dispose du modèle génétique voulu.
Objectifs
Les principaux objectifs de ce projet seront la compréhension des mécanismes de formation des plaquettes sanguines, et notamment le rôle joué par les forces mécaniques de l’environnement. Ces forces mécaniques sont perturbées dans différentes conditions pathologiques qui modifient l’environnement mécanobiologique, telles que les traitements chimiothérapeutiques, ou les cancers de la moelle osseuses aboutissant au développement de myélofibrose. Bénéfices. La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la production des plaquettes chez la patients, ou selon les cas pour prévenir leur chute. Un deuxième bénéfice important est d’ordre technologique. Actuellement on est incapable de produire des plaquettes in vitro à une échelle suffisamment importante pour envisager des transfusions. L’une des raisons en est que la différenciation des mégacaryocytes in vitro est inaboutie en comparaison de la différentiation in vivo. Nous avons montré que la culture des mégacaryocytes en présence de contraintes mécaniques améliore la différenciation de ces cellules et in fine double la quantité de plaquettes produites. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement pour mimer l’impact des forces mécaniques, ce qui augmentera les rendements de production de plaquette en bioréacteur en milieu liquide.
Procédures
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections, soit en i.p., soit en s.c. Les produits injectés ont comme impact soit d’augmenter la quantité de plaquette, soit de la diminuer modérément et transitoirement, de sorte qu’ils n’ont aucun impact négatif sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront majoritairement soumis à une injection unique, soit en i.p., soit s.c. (animal vigile). L’une des procédures fait appel à des injections s.c. répétées (2 injections par semaine, pendant 4 semaines). Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang par section de moins de 1 mm à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les 4 autres prélèvements (toujours sur souris anesthésiée).
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous sacrifiés pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du rôle de l'environnement de la moelle osseuse dans la différenciation hématopoiétique en mégacaryocytes et dans la libération des plaquettes à travers les vaisseaux sinusoides de la moelle. De plus, nous disposons des souris identiques au niveau génétique et modifiées génétiquement afin de nous permettre d'évaluer spécifiquement l'impact de ces mécanorécepteurs et facteurs de transcription.
Réduction
Le nombre d’animal est réduit par le fait qu’un maximum d’analyses seront réalisées pour une même procédure expérimentale avec un même lot d’animaux, selon la question posée (ex. analyse du sang, récupération des os pour culture de cellules, pour récupération de moelle en vue d’analyses histologiques et de microscopie de transmission), récupération éventuelle d’autres organes. Différents manipulateurs seront ainsi réquisitionnés pour permettre d’effectuer simultanément ces différentes analyses afin d’acquérir des données fiables et définitives.
Raffinement
Tout est mis en place pour limiter l’inconfort des souris durant toute la durée de la procédure, incluant une manipulation et contention par des personnes formées et expérimentées, à l’abris du bruit. Le prélèvement caudal de sang est effectué sur souris anesthésiée à l’isoflurane, permettant une bonne anesthésie et un réveil rapide. Les souris restent ensemble dans la même cage, en présence une litière abondante et permettant la formation de nid, dans un environnement enrichi en jouets.
Choix des espèces
La mise en évidence des proplaquettes à partir des MK et cellules souches hématopoiétiques est bien maitrisée chez la souris. En outre, c'est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes qui nous intéressent sont inactivés. Animaux utilisés au stade jeune adulte (8-18 semaines), car à ce stade la moelle osseuse du fémur est encore très hématopoiétique et peu d'adipocytes sont présents.
Etude des capacités pluripotentes d’un nouveau type d’iPs dans le cadre du développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
80 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit une injection de blastocystes par voie vaginale, sans chirurgie ni anesthésie, avant d'être tuée pour prélever les embryons, afin d'évaluer la capacité de nouvelles cellules souches induites à participer au développement embryonnaire. Le porteur souligne avoir choisi une méthode d'implantation "non douloureuse" évitant la chirurgie. Il affirme qu'un "modèle in vivo est indispensable" car le développement embryonnaire complet ne peut être reproduit in vitro.
Objectifs
Tous les organismes vivants proviennent à l’origine d’une seule cellule, dite « cellule souche pluripotente », car celle-ci a la capacité de générer tous les tissus composant un individu. Néanmoins, ces cellules souches pluripotentes disparaissent extrêmement rapidement au cours du développement de l’embryon. Elles sont remplacées par des cellules souches aux capacités beaucoup plus limitées qui ne peuvent produire qu’un nombre limité de types cellulaires. Actuellement, des méthodes de production de cellules souches pluripotentes in vitro existent, mais les cellules ainsi obtenues soit ne permettent pas de générer la totalité des tissus composant un organisme, soit nécessitent des traitements longs et difficiles à mettre en œuvre. Un des défis de la science est de réussir à créer facilement des cellules souches pluripotentes in vitro permettant de reproduire la totalité d’un embryon. Or, à l'aide de nouveaux traitements innovant, notre laboratoire a réussi à produire in vitro de grandes quantités de ces cellules souches. Le but de ce projet est d’évaluer la capacité de cette nouvelle lignée de « cellules souches pluripotentes induites » (iPS) à contribuer au développement embryonnaire, confirmant ainsi leur statut de cellules souches pluripotentes.
Bénéfices attendus
La maîtrise de la production in vitro d’iPS vraiment pluripotente permettrait d'éviter d'avoir recours à des cellules-souches embryonnaire. En effet, ces dernières ont des propriétés qu'on ne peut pas intégralement reproduire chez les iPS. On pourrait ainsi éviter des problèmes éthiques mais également pratiques en simplifiant la production d'une grande quantité de cellules-souches totipotentes tout en se passant d'embryon. Les recherches utilisant des cellules-souches totipotentes sont particulièrement importantes pour la médecine régénérative, car elles pourraient permettre, à terme, de générer des tissus in vitro pour des transplantations ou réparer des dommages corporels après accident ou maladie, mais également de modéliser la progression de maladies, faire de tests toxicologiques et développer la médecine personnalisée (en testant des traitements sur des tissus provenant des iPS du malade).
Procédures
Injection d'une suspension de blastocystes par voie basse (passage par voie vaginale) a l'aide d'une pipette adaptée. L'injection, qui ne dure que quelque seconde, se fera une seul fois, sur animaux vigile, et concernera la totalité des souris.
Impact sur les animaux
La méthode d’implantation choisie est non douloureuse et aussi peu invasive que possible car elle ne requiert ni chirurgie ni anesthésie. En effet, les femelles CD-1 seront simplement implantées par voie basse à l'aide d'une pipette adaptée.
Devenir
Le prélèvement des embryons nécessitera l'euthanasie des souris.
Remplacement
Un modèle in vivo est indispensable car il n’est pas possible de récapituler la totalité du développement embryonnaire in vitro, ce qui est critique dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé en se basant sur les pourcentages de réussite connus et publiés
Raffinement
Nous avons choisi une technique d’implantation ne nécessitant ni chirurgie ni euthanasie, préservant ainsi au mieux le bien-être des souris. 1) les animaux seront observés quotidiennement et leur état de santé évalué à l’aide d’une grille de score standard utilisée par notre équipe et les zootechniciens de l’animalerie (annexe 2). 2) Des points limites ont été définis afin d’anticiper toute souffrance à l’animal. En effet, les souris, comme tout être vivant peuvent développer des pathologies ou se blesser indépendamment des procédures menées. 3) Par soucis de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage, et conservés intacts jusqu'à ce que les animaux soient utilisés pour la reproduction. 4) Les cages sont enrichies à l’aide de matériaux permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, nestlets, lab nest, maison en carton,...).
Choix des espèces
Les modèles murins, et notamment la souche CD-1, sont parmi les modèles les plus répandus pour étudier le développement embryonnaire et pour pratiquer des implantations de blastocystes. De plus, les iPs ont été obtenus originellement à partir de cellules murines transgéniques. Enfin, les souris présentent les avantages d'être des mammifères avec un cycle de vie, et notamment une période gestation, très court, facilitant ainsi le déroulement de l'expérience. Les souris femelles CD-1 devront avoir atteint leur maturité sexuelle et peser au moins 26g. Nous estimons donc que 8 semaines est un âge adéquat.
Fragmentation du sommeil d’un modèle murin: impact sur la barrière hémato-encéphalique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
44 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Une partie subit l'implantation chirurgicale d'électrodes cérébrales, l'ensemble étant soumis à une fragmentation du sommeil sur 28 jours et à des tests de mémoire en labyrinthe en Y, avant une mise à mort par exsanguination intracardiaque pour récupérer un maximum de sang. Le porteur affirme, sur la base d'une étude précédente, que les animaux "ne souffraient pas du protocole de fragmentation". Il justifie le rat en écartant les modèles de "classes phylogénétiques inférieures" comme la drosophile ou le poisson zèbre.
Objectifs
Ce projet de recherche est motivé par l’enjeu en santé publique que représente la dégradation des fonctions neurologiques induites par la composante fragmentation du sommeil dans le Syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS). Le SAOS se retrouve en grande majorité chez les personnes âgées et peut être à l’origine de troubles métaboliques tels que l’obésité et les risques cardiovasculaires. Les effets du SAOS peuvent être classés selon deux catégories : l’hypoxie intermittente, qui a été, et est toujours, très largement étudiée, et la fragmentation du sommeil, où le nombre d’études est plus limité. La limitation des troubles cognitifs est un enjeu thérapeutique majeur d'où le multifinancement de ce projet. En effet, participe financièrement l'association SYNAPSE (Système Nerveux Autonome et Physiologie Santé Exercice) et le laboratoire SNA (Système Nerveux Autonome) de l'Université Jean Monnet. Plusieurs appels à projet ont également été déposés.
Bénéfices attendus
Nous faisons l’hypothèse que la fragmentation du sommeil jouerait un rôle majeur dans l’apparition de nombreuses complications neurologiques, en particulier chez les personnes âgées, en favorisant l’apparition de modifications cérébrales propices au développement de pathologies neurologiques. Notre projet actuel est d’étudier les effets isolés de la disruption répétée du sommeil, donc sans hypoxie additionnelle, pour évaluer l’effet propre de la fragmentation du sommeil sur l’étanchéité de la barrière hémato-encéphalique. Améliorer et approfondir les connaissances de l’effet d’une fragmentation du sommeil, sur la dérégulation du système nerveux autonome, passent par la réalisation et la validation d’un modèle de fragmentation du sommeil chronique sur un modèle de rongeurs.
Procédures
Une partie des animaux subira une chirurgie d'implantation d'électrodes EEG. 4 animaux sont prévus à cet effet et 8 autres au cas où il faille recommencer la chirurgie. Tous les animaux seront pesés tous les deux jours et subiront deux tests cognitifs (labyrinthe en Y) sur 28 jours. En cas d'échec de la chirurgie ou de dysfonctionnement du dispositif les rats continueront le protocole si leur état le leur permet (voir points limites). La chirurgie d'implantation des électrodes sur les 4 animaux durera entre 1h et 1h30 par animal.
Impact sur les animaux
Notre première étude a montré que les animaux ne souffraient pas du protocole de fragmentation. Ils ne perdaient pas de poids, ne devenaient pas plus agressifs au fur et à mesure du protocole. Pour ce qui est de l’implantation des électrodes EEG, la prise en charge de la douleur indiquée dans le protocole est adaptée. En effet lors du premier protocole les animaux ont mangé et bu le jour même de leur chirurgie. Pas de signes de douleurs observés par les repsonsables BEA et moi-même.
Devenir
A la fin des chirurgies, les animaux seront tous maintenus en vie. A l'issue des 28 jours de protocole, tous les animaux seront mis à mort par exsanguination intracardiaque sous anesthésie profonde. Cette méthode de mise à mort est nécessaire pour récupérer une maximum de sang, dont sera extrait le sérum, ce dernier servira à effectuer des tests élisa et à isolerde potentiels exosones.
Remplacement
Afin d’étudier la dégradation des fonctions neurologiques ainsi que des voies moléculaires impliquées, il nous faut étudier le phénomène in vivo. Pour étudier les effets neurologiques, il ne serait pas pertinent d’utiliser des animaux de classes phylogénétiques dites « inférieures ».
Réduction
Le nombre de rats nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux pour la mise en place de la procédure (implantation d'électrodes EEG), 12 animaux par groupe (2 groupes) pour l'étude et 8 animaux pour les cas de dérives/problèmes expérimentaux sont prévus soit un total de 44 rats.
Raffinement
Outre l'attention générale portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie pour tous les animaux, la vérification de leur bien-être sera quotidienne. Nous nous appuierons sur l'échelle d'évaluation des expressions faciales du rat afin de détecter tout signe de douleur.
Choix des espèces
Nos travaux sont centrés sur les effets de la fragmentation du sommeil sur le cerveau. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans), utilisés parfois en recherche fondamentale, ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Le rat convient particulièrement à notre étude qui se déroulera chez des rats adultes. L’anatomie du cerveau du rat est parfaitement connue et les outils qui permettront l’analyse immunohistochimique et moléculaire des tissus cérébraux ne nécessiteront qu’une légère adaptation puisqu’ils sont déjà maîtrisés au laboratoire. Les animaux seront matures (1 an) lors de leur utilisation car la fragmentation de sommeil, notamment lors de l'apnée du sommeil, touche une population plutôt âgée chez les hommes. Utiliser des rats trop âgés mettrait à mal le protocole de part le risque de perte.
Revitalisation de lignées de souris à partir de sperme et d’embryons congelés
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Cinquante femelles sont superovulées par injections pour fournir des ovocytes et 295 femelles reçoivent des embryons par chirurgie abdominale, pour régénérer des lignées transgéniques conservées sous forme de sperme ou d'embryons congelés. Le porteur présente le projet comme une application de la "règle des 3R" visant à "réduire le nombre de souris" gardées vivantes à l'animalerie. Les donneuses et les receveuses sont toutes tuées en fin de procédure, les receveuses n'étant pas réutilisées pour éviter une seconde opération jugée plus douloureuse.
Objectifs
Les lignées de souris transgéniques sont maintenues soit sous forme de colonies vivantes au sein de notre animalerie ou dans les animaleries de collaborateurs scientifiques. La préservation de ces lignées est essentielle pour la poursuite des projets de recherche ayant motivé leur création. Les lignées sont conservées par croisement avec de jeunes parents (environ 4 mois) car de nombreuses lignées de souris peuvent présenter des troubles de la fertilité en vieillissant. Pour éviter cela, nous devons générer des nouveaux individus très souvent. Cela représente de nombreuses souris qui sont conservées sans être utilisées dans nos projets scientifiques. Notre objectif est de réduire le nombre de ces animaux et de ne générer que les animaux indispensables à nos travaux de recherche. Pour cela, nous utilisons la cryo-préservation. Aussi, chacune de nos lignées est stockée sous forme d’embryons congelés ou de sperme congelé dans des cryo-préservateurs au sein de notre institut et certaines d’entre elles sont déposées dans un centre de ressource public. Quand nous aurons besoin d’utiliser l’une de ces lignées, nous la raviverons. Selon les mutations étudiées, les lignées seront régénérées par fécondation in vitro à partir de sperme décongelé préalablement en utilisant des ovocytes venant de femelles superovulées. La superovulation permet de réduire le nombre de femelles donneuses d’ovocytes et d’embryons après fécondation. Pour des lignées de génotype complexe des embryons sous forme de morulas (embryons formés de 16 cellules) ont été congelés et ces embryons seront décongelés. Puis les embryons seront transplantés chez des femelles receveuses. Les souriceaux issus de ces transplantations permettront de régénérer les lignées nécessaires à nos projets scientifiques. Notre objectif final est de réduire le nombre de nos souris dans notre animalerie.
Bénéfices attendus
Afin d’éviter une production continuelle de souris, dans le but de mieux répondre à la règle des 3 R et pour des raisons économiques également, nous avons appris à cryo-preserver le sperme de nos lignées que nous n’utilisons pas durant une période pouvant s’étendre de quelques mois à quelques années. Cela nous permet d’avoir uniquement les animaux vivants nécessaires à nos projets scientifiques dans l’animalerie, les autres modèles étant conservés sous forme d’embryons congelés ou sous forme de sperme congelé dans des cryo-préservateurs au sein de notre institut et certaines d’entre elles sont déposées dans un centre de ressource public. Dans le cas où les lignées sont régénérées par fécondation in vitro, la superovulation de femelles donneuses permet de réduire le nombre de souris utilisé car les cycles ovulatoires sont synchronisés. En absence de traitement hormonal, nous obtenons en moyenne 8 oocytes par femelle. En appliquant ce protocole, le nombre d’ovocytes ovulés en moyenne est de 20 ovocytes (2.5 fois plus que normalement). En résumé, notre projet permettra de réduire fortement le nombre de souris utilisées à un temps donné, tout en assurant la préservation de nos lignées.
Procédures
Les lignées seront régénérées par fécondation in vitro à partir de sperme décongelé préalablement et réimplantation des embryons au stade 2 cellules ou par transfert d‘embryons au stade morula. 50 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront fécondés in vitro par le sperme décongelé afin d’obtenir des embryons au stade 2 cellules, qui ont commencé à se développer. La transplantation des embryons ou morulas sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 295 femelles.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Aucun critère d’arrêt anticipé spécifique de la procédure n’est prévu. Les animaux sont néanmoins individuellement manipulés à l’occasion de chaque injection, de la mise en accouplement et de la détection des bouchons vaginaux suivant l’accouplement. Des animaux éventuellement trouvés prostrés, blessés à l’issue d’accident ou bagarre seront sacrifiés immédiatement par dislocation cervicale. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons in utero, un suivi post opératoire individuel des animaux inclus dans la procédure chirurgicale sera matérialisé par le renseignement d’une fiche de suivi. Il n’est pas attendu d’effets dommageables durables du transfert par voie chirurgicale. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de la laparotomie abdominale. Les contrôles prévus prendront place pendant l’intervention chirurgicale, au réveil de l’animal le même jour, le lendemain de l’intervention et le jour suivant. Brièvement, des difficultés opératoires (hémorragies, temps d’intervention trop long) ou post opératoire majeures (réveil retardé, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) conduiront systématiquement à l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
Les femelles donneuses et receveuses seront euthanasiées en fin de procédure, pour donner des ovocytes (donneuses) et assurées une gestation (receveuses). Les femelles receveuses ne seront pas réutilisées pour prévenir une deuxième opération qui pourrait être plus difficile et douloureuse que la première opération.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étiologie de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
L’objectif principal de cette demande est de réduire le nombre de souris. D’une part, la superovulation des femelles donneuses nous permettra de réduire le nombre d’animaux sacrifiés pour obtenir des ovocytes. De plus, le projet vise à réduire de façon importante le nombre de souris dans notre l’animalerie, en congelant le sperme ou les embryons selon les génotypes des lignées et en les ravivant quand les projets le nécessitent. Ainsi les souris présentes à l’animalerie sont nécessaires à un projet scientifique et nous ne gardons pas d’animaux vivants non utilisés.
Raffinement
Pendant et après la chirurgie, l’anesthésie au gaz isoflurane et l’administration d’antalgiques permet de limiter au maximum les douleurs engendrées. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Ce protocole inclue la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés permettant de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. De plus, les souris seront hébergées par deux ou par trois dans des cages comportant des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier ces modèles d’ablation/gain-de-fonction conditionnelle inductible dans la souris. De surcroît, toute la collection des systèmes Cre nécessaires à l’inactivation/gain de fonction génétique conditionnelle n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines car c’est la période de fécondité optimum.
Rôle du métabolisme cellulaire dans le maintien de l’homéostasie intestinale.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des composés par voie orale pendant cinq jours et des injections intrapéritonéales pendant deux semaines, avant un prélèvement de sang sous anesthésie terminale, pour étudier le rôle du métabolisme dans le renouvellement des cellules souches intestinales. Le porteur indique disposer d'un modèle d'organoïdes ex vivo mais affirme que le projet "ne peut être mené in vitro" car il porte sur les interactions entre épithélium, cellules immunitaires et microbiote. Les bénéfices médicaux annoncés restent lointains, le porteur précisant que "de nombreuses années de recherche sont encore nécessaires".
Objectifs
Un bon fonctionnement de l'intestin est indispensable afin d'éviter le développement de pathologies dont l'incidence est en constante progression : allergies, diabète, dépression, maladies inflammatoires chroniques ou encore cancer colorectal. Une caractéristique surprenante de l’intestin est sa capacité à se régénérer tous les 4-5 jours chez les Mammifères, et cette capacité de régénération est primordiale en cas de lésions par des pathogènes, des agents chimiques ou encore suite à une radio-thérapie. Cette propriété est assurée par les cellules souches intestinales. Les cellules souches, qui sont des cellules indifférenciées, peuvent soit donner naissance à de nouvelles cellules souches (et ainsi se maintenir au sein de l’organisme, au sein de « niches » créées par des cellules différenciées voisines), soit être à l’origine de cellules spécialisées exerçant des fonctions spécifiques au sein d’un organe. Elles jouent donc un rôle important au cours du développement mais aussi dans le maintien de l’intégrité de certains organes chez l’adulte. Les cellules souches font l’objet de nombreuses recherches et mieux connaître leurs propriétés est un enjeu crucial en médecine. Les objectifs principaux de ce projet sont de mieux comprendre les mécanismes qui régulent le destin des cellules souches intestinales, c’est-à-dire leur capacité à s’auto-renouveler ou se différencier. Cette balance est finement régulée, et nos premiers résultats montrent que le métabolisme cellulaire est un acteur clé dans la régulation de cette balance. Le métabolisme cellulaire, qui est formé par l’ensemble des réactions chimiques se produisant au sein des cellules, permet notamment de fournir l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des cellules, et nos résultats démontrent que des altérations du métabolisme dans les cellules souches intestinales impactent fortement la capacité de régénération de l’intestin. Nous souhaitons maintenant comprendre comment : 1/ le métabolisme influence le fonctionnement des cellules souches intestinales, et 2/ les différentes cellules différenciées qui constituent l’intestin communiquent avec les cellules souches pour contrôler leur fonction.
Bénéfices attendus
La recherche sur la biologie des cellules souches est un domaine qui fait l'objet de nombreuses recherches et est un enjeu primordial en médecine. L’intestin a la particularité de se renouveler très rapidement, et cette propriété est fondamentale pour le maintien de l’intégrité de ce tissu qui est en permanence exposé à des agents délétères (pathogènes, agents chimiques) susceptibles de conduire à des lésions. Les cellules souches intestinales confèrent à ce tissu sa capacité de régénération, et font l’objet de nombreuses études. Les connaissances scientifiques ont progressé ces dernières années mais des questions restent ouvertes. Ce projet de recherche fondamentale permettra d’identifier les mécanismes qui régulent le destin des cellules souches intestinales. Leur capacité à s’auto-renouveler ou se différencier est en effet une balance dont les mécanismes régulateurs ne sont pas bien définis. De plus, le tissu intestinal est formé de différents types cellulaires spécifiques susceptibles de coopérer afin de garantir une fonction optimale des cellules souches intestinales. Ce projet permettra d’élucider les mécanismes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans ce dialogue. Au total, les connaissances acquises au cours de ce projet apporteront des avancées majeures à une meilleure compréhension des modes d'action des cellules souches intestinales. Ces cellules très particulières ouvrent la voie vers la possibilité de réparer, cicatriser et régénérer des parties de l’intestin, mais les connaissances scientifiques afin de comprendre leur fonctionnement nécessitent encore d’être approfondies et de nombreuses années de recherche sont encore nécessaires pour comprendre comment elles pourraient aider au traitement de certaines maladies.
Procédures
- Administration par voie orale : 1 fois par jour pendant 5 jours - Injections intrapéritonéales : 1 fois, et 1 fois par jour pendant 2 semaines. - Prélèvements de sang sous anesthésie générale terminale : 1 fois.
Impact sur les animaux
Les lignées modèles murins transgéniques que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Les procédures 1 et 3 n'induiront pas de douleur ou de stress chez les animaux. Afin de réduire la douleur que la procédure 2 pourrait engendrer, les animaux seront anesthésiés à l’aide d’un mélange kétamine/xylasine et d’un anesthésique local (xylocaïne) avant le sacrifice.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, l'ensemble des animaux sera euthanasié.
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et le microbiote. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Pour certaines expériences, nous disposons du système d’organoïdes intestinaux qui permet de reconstituer ex vivo des minis intestins (sous forme de couche unique, l'épithélium intestinal) en absence de cellules immunitaires et du microbiote. Ce modèle présente l’avantage de pouvoir analyser ex-vivo les propriétés de l’épithélium intestinal en l’absence de contribution du tissu conjonctif, et ainsi de tester l’impact de différents effecteurs d’origine conjonctive sur l'épithélium intestinal. Ce modèle de cultures primaires dérivées des différents modèles murins sera utilisé pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu. Des approches ex vivo et in vitro seront également privilégiées dans la mesure du possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables. La détermination de la puissance et de la taille des échantillons pour différents tests statistiques a été réalisée à l’aide du logiciel G-power. La majorité des animaux produits dans les lignées seront utilisés (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés). De plus, dans la mesure du possible, les mêmes animaux seront utilisés dans différents protocoles.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certains protocoles pourraient engendrer chez les animaux, des points limites ont été définis. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition d’hémorragies rectales ou d’un prolapsus seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés. Afin de réduire la douleur pendant certaines procédures expérimentales les animaux seront anesthésiés à l’aide d’un mélange kétamine/xylasine et d’un anesthésique local (xylocaïne).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les animaux seront utilisés dès l’âge de 8 semaines, lorsque que système digestif est mature.
Evaluation des effets potentiellement émétiques ou anti-émétiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Furets : 800
900 chiens et furets vont être utilisés dans des procédures impliquant une souffrance déclarée de légère à sévère, dont 200 sévères, une partie réutilisée et environ 300 tués à l'issue. Ils reçoivent des substances destinées à provoquer ou à supprimer les vomissements, les furets étant instrumentés d'un implant télémétrique et d'un cathéter abdominal enregistrant la pression pendant plusieurs jours, pour évaluer l'effet émétique ou anti-émétique de candidats médicaments. Le porteur classe en sévère les tests reposant sur le cisplatine, décrit comme provoquant des vomissements comparables à ceux des patients sous chimiothérapie, et présente ces épreuves comme un prérequis réglementaire avant mise sur le marché. Il indique réutiliser les animaux après récupération et reclasser certains chiens après avis vétérinaire, ceux des procédures sévères étant tués.
Objectifs
Les nausées et vomissements sont des effets secondaires courants et très redoutés des patients traités par chimiothérapie. L'intensité des nausées et vomissements observés chez les patients en cure chimiothérapique dépend de facteurs directement liés au sujet et à la nature même de l'agent cytotoxique administré. L'efficacité anti-émétique reconnue des substances antagonistes des récepteurs 5-HT3, n'empêche malheureusement pas l'apparition des crises émétiques chez tous les patients en chimiothérapie oncologique. De plus, la persistance des vomissements retardés constitue toujours un problème clinique majeur. Les études précliniques se poursuivent donc pour découvrir des agents pharmacologiques aux propriétés anti-émétiques plus marquées que celles des substances actuellement utilisées, mais aussi pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables des vomissements chimio-induits. Pour contrer ces problématiques cliniques, chez l’homme ou l’animal, et de disposer de médicaments efficaces et sûrs, il est aujourd’hui encore nécessaire d’effectuer quelques tests sur l’animal. Ces tests consistent à étudier l’efficacité ou la toxicité des futurs médicaments, avant leurs mises sur le marché et pour limiter tout risque sur l’Homme adulte, les enfants ou les nourrissons. Souvent, ces médicaments serviront de base pour en produire de nouveaux utilisables en médecine vétérinaire pour traiter les maladies animales. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets émétiques (effets secondaires) ou anti-émétiques (étude d'efficacité) de substances dans le cadre de développement pré-clinique de produits pharmaceutiques. Contrairement aux rongeurs qui ne vomissent pas, le furet ou le chien sont considérés comme les espèces de choix pour évaluer les effets émétiques ou anti-émétiques de substances. Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter les problématiques de vomissement quels qu'en soient l'origine ou le mécanisme d'action. Ils permettent également de disposer de modèle équilibré, léger lorsque l'indication/mécanisme d'action correspond à un vomissement bénin chez le patient. Ils peuvent être classés comme sévère (e.g. cisplatin), lorsque l'indication/mécanisme d'action est très sévère ou mortel chez les patients (vomissements liés au cancer et traitements chimiothérapeutiques).
Procédures
Si l'évaluation de la phase précoce d'emesis est relativement facile par observation directe de l'animal, cela s'avère plus compliqué quand les effets émétiques sont attendus sur plusieurs jours, comme cela est le cas avec le cisplatin par exemple (phase précoce suivie d'une phase retardée). Dans ce cas, les furets sont instrumentés avec un implant télémétrique. Un cathéter est placé dans la cavité abdominale et la pression abdominale est enregistrée en continu pendant plusieurs jours. Lors d'un événement émétique, les muscles abdominaux se contractent entrainant une augmentation de la pression abdominale. Les animaux restent hébergés en groupe pendant les périodes d'enregistrement. En fin d’expérience, tous les prélèvements nécessaires (histologie, prélèvement sang etc…) sont réalisés de façon à pouvoir effectuer l’ensemble des analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de réduire significativement le nombre d’études, d’éviter d’avoir à dupliquer des expériences ou d’inclure des animaux satellites pour la vérification de l’exposition plasmatique par exemple. Un prélèvement de sang chez l’animal vigile (par exemple, à la veine cave crâniale chez le furet ou veine jugulaire chez le chien) est classiquement réalisé dans ce type d’expérience. Pour les besoins des études, les animaux peuvent être enthanasiés pour le prélèvement des organes cibles d'intérêt (cerveau, rein, …).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédures, il est attendu de voir la potentielle apparition d'événements émétiques (vomissement et haut le coeur). L’anticipation de ces effets sert à écarter des molécules inacceptables ou à établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner des effets secondaires ou de l’efficacité des substances testées, des doses ayant induit ces effets et de la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’homme. Selon la durée et la fréquence de ces événements, ces procédures engendrent une souffrance plus ou moins intense et sont donc classées de légère à sévère. Pour le développement d'un nouveau médicament, 3 doses sont classiquement testées dans la même expérience (soit 24 furets ou 15 chiens) en comparaison d'un groupe contrôle. Selon les espèces, un effectif minimum de 8 (furet) ou 5 (chien) est inclus dans les expériences pour mettre en évidence un effet suffisamment robuste. Il est donc difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure.
Devenir
Pour les procédures légères ou modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sévères, les animaux sont euthanasiés à la fin du test. Lorsque possible et après avis vétérinaire, un programme de reclassement des chiens est mis en place.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur l’apparition d’événements émétiques (haut-le-cœur et vomissement, principalement).
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisé dans le projet est garantie par la réutilisation des animaux entre différentes sessions. Une période de récupération d’une semaine est généralement observée. D’autre part, la stratégie expérimentale, dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement émétiques, est de démontrer que le produit testé n’induit pas fréquemment d’effet émétique. Afin de limiter la consommation d’animaux dans les études ultérieures, les effets potentiellement émétiques ne sont testés que sur quelques animaux par dose croissante. Dans ce contexte, aucune analyse statistique n’est réalisée. Cinq chiens ou 6 furets sont classiquement inclus dans ces expériences. Les analyses de puissance ne sont pas réalisées car il serait nécessaire de générer de nombreuses études avec systématiquement le même agent émétique. Dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement anti-émétiques, la stratégie expérimentale consiste à comparer, à l’aide de tests de Mann-Whitney U, les groupes recevant les substances d'essai à un groupe contrôle recevant un agent émétique, l'objectif étant de réduire le nombre d'évènements émétiques induits par l'agent émétique. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle positif et négatif. Cherchant à réverser/diminuer l’effet émétique d’une substance réactive, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent émétique utilisé et à la substance d’essai évaluée. Afin d’avoir une réponse suffisamment reproductible, le nombre d’animaux par groupe est augmenté. Huit furets ou 5 chiens sont classiquement inclus dans ces expériences.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données
Choix des espèces
Les tests seront réalisés chez le furet ou le chien. Le furet est considéré comme l'espèce de choix pour évaluer les effets émétiques ou anti-émétiques de substances. Le chien est également utilisé pour évaluer les effets émétiques ou anti-émétiques de certaines substances ne pouvant pas être administrées en première intention chez le furet. Ces 2 espèces ont un réflexe de vomissement comparable à l'homme (Les rongeurs et herbivores ne vomissent généralement pas). Furets et chiens adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique
Dosages hormonaux dans la salive de juments comme alternative aux prises de sang et injections
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
20 juments vont être utilisées, réutilisées à l'issue et rendues à leur troupeau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent sept à huit ponctions veineuses à la jugulaire à différents stades du cycle, pour comparer les dosages hormonaux sanguins à des dosages salivaires en cours de développement. Le porteur présente le projet comme un "gain éthique", ces tests salivaires devant à terme éviter les prises de sang et les injections d'hormones en élevage. Il indique que les juments sont entraînées aux prélèvements et que le volume prélevé ne dépasse pas 5 ml par ponction.
Objectifs
Actuellement, le suivi et la maîtrise de la reproduction des juments nécessitent des interventions douloureuses. En effet, pour vérifier si une jument a repris les cycles de reproduction après le repos sexuel hivernal (test de cyclicité), ou pour vérifier si elle est gestante après une insémination (test de gestation), les éleveurs demandent au vétérinaire de réaliser une prise de sang pour un dosage hormonal. Par ailleurs, pour inséminer une jument au plus près de l’ovulation afin de maximiser le taux de réussite, les éleveurs demandent au vétérinaire de réaliser des échographies transrectales quotidiennes pour suivre la croissance des follicules ovariens puis d’induire l’ovulation par injection d’hormones. Ces interventions sont invasives (prises de sang et injections), couteuses (intervention d’un vétérinaire) et les hormones rejetées via les urines ont un impact négatif sur l’environnement. L’objectif de notre laboratoire est de proposer des alternatives aux prises de sang et aux injections d’hormones en développant des dosages hormonaux dans la salive équine. L’objectif de ce projet est de collecter de la salive et du sang sur des juments à différents stades du cycle afin de comparer les dosages sanguins actuellement utilisés et les dosages salivaires que nous développerons.
Bénéfices attendus
Les prélèvements de sang et de salive aux différents stades permettront 1) de comparer des juments en repos sexuel et des juments cycliques pour développer un test salivaire de cyclicité, 2) de comparer des juments gestantes et non gestantes pour développer un test salivaire de gestation, 3) de suivre l’évolution des hormones salivaires dans les jours précédents l’ovulation pour identifier un biomarqueur prédictif de l’ovulation qui permettra d’inséminer au plus près de l’ovulation, 4) de suivre l’évolution des hormones salivaires dans les jours précédents la mise-bas pour identifier un biomarqueur prédictif de la mise-bas afin de placer la jument dans de bonnes conditions et de faciliter sa surveillance. L’éleveur pourra ainsi éviter les prises de sang pour le test de cyclicité ou de gestation et réaliser lui-même les prélèvements de salive, ce qui permettra un gain éthique : diminution des actes douloureux en élevage, contacts moins anxiogènes avec l’humain (l’éleveur plutôt que le vétérinaire souvent associé à des actes désagréables). L’éleveur pourra de plus identifier le moment opportun pour inséminer ses juments à l’aide d’un biomarqueur salivaire prédictif de l’ovulation, sans avoir recours aux injections d’hormones pour l’induction d’ovulation, ce qui permettra de diminuer les rejets hormonaux dans l’environnement. L’éleveur pourra enfin prévoir le moment du poulinage à l’aide d’un biomarqueur prédictif de la mise-bas, ce qui permettra un gain éthique en plaçant la jument dans de bonnes conditions.
Procédures
Entre le mois de janvier et le mois de juillet, nous réaliserons : - 8 prélèvements de 5ml de sang par ponction veineuse à la jugulaire sur un lot de 10 juments : 1 prélèvement au stade 1 (repos sexuel hivernal), 5 prélèvements au stade 2 (dans les 5 jours avant ovulation), 1 prélèvement au stade 3 (phase lutéale), 1 prélèvement au stade 4 (début de gestation), - 7 prélèvements de 5ml de sang par ponction veineuse à la jugulaire sur un lot de 10 autres juments au stade 5 (dans les 7 jours avant la mise-bas).
Impact sur les animaux
Entre le mois de janvier et le mois de juillet, nous réaliserons : - 8 prélèvements sur 10 juments : 1 prélèvement au stade 1 (repos sexuel hivernal), 5 prélèvements au stade 2 (avant ovulation), 1 prélèvement au stade 3 (phase lutéale), 1 prélèvement au stade 4 (début de gestation), - 7 prélèvements sur 10 autres juments au stade 5 (avant la mise-bas). Lors des prises de sang par ponction veineuse à la jugulaire, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général. Les animaux ne ressentent pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Afin de limiter la douleur, les prélèvements sanguins seront réalisés par des opérateurs expérimentés selon un mode opératoire réfléchi et clairement décrit (1291-MO-0079).
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux ont un examen vétérinaire afin de vérifier qu’ils ont pleinement recouvré leur état de santé et de bien-être, puis ils retournent dans le troupeau.
Remplacement
Ce projet concerne des dosages salivaires pour le suivi et la maîtrise de la reproduction des juments, il implique des prélèvements de salive et des suivis de cycle de reproduction, l’utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée.
Réduction
Au cours d’une étude prospective en 2019, nous avons réalisé des prélèvements de sang et de salive sur des juments afin d’étudier le stéroïdome et le métabolome de la salive équine. Nous avons ainsi une connaissance préliminaire des concentrations des hormones stéroïdiennes et des métabolites dans la salive équine et de la variabilité individuelle. Dans ces conditions, l’effectif de 10 juments par groupe est nécessaire et suffisant pour observer des différences significatives entre stades du cycle avec une analyse de type ANOVA sur mesures répétées suivie d’un test de Tukey. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons les mêmes juments pour les prélèvements des stades 1 à 4 (du repos sexuel hivernal jusqu’au début de gestation), ce qui permettra de plus que chaque animal soit son propre témoin. Les prélèvements au stade 5 seront réalisés sur 10 autres juments afin qu’ils soient réalisés au cours de la même année (durée de gestation des juments : 11 mois).
Raffinement
Les juments que nous utiliserons ont bénéficié d’un entrainement pour la réalisation de prises de sang par ponction veineuse à la jugulaire sans stress, elles restent calmes et détendues lors des prélèvements sanguins. De plus, le personnel de l’unité expérimentale a suivi une formation pour comprendre la perception du cheval et apprendre les méthodes pour l’approcher et le manipuler sans induire de stress ou de peur. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des opérateurs expérimentés selon un mode opératoire réfléchi et clairement décrit. La fréquence des prélèvements sera faible et le volume prélevé ne dépassera pas 5ml par animal. Après les prélèvements sanguins, une surveillance de la zone de prélèvement sera réalisée quotidiennement, en cas de phlébite sur une veine, les prélèvements suivants seront réalisés de l’autre coté et un baume apaisant et anti-inflammatoire sera appliqué. En cas de signes de maladie ou d’impact sur l’état général des animaux (fièvre, problèmes respiratoires, perte de poids, prostration, …) une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté sera mis en place. L’animal sortira du protocole si nécessaire
Choix des espèces
Ce projet concerne des dosages salivaires pour le suivi et la maîtrise de la reproduction des juments, il est donc nécessaire de choisir l’espèce équine. Nous utiliserons des animaux adultes pubères qui présentent des cycles de reproduction réguliers.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Hamsters dorés : 10000
60 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de légère à sévère, dont 5 900 en gravité sévère. Ils reçoivent un vaccin vétérinaire puis se voient inoculer la souche pathogène correspondante, parfois par injection intracérébrale sous anesthésie, pour contrôler l'activité et l'identité de lots commerciaux de vaccins destinés aux chiens, chats, furets et animaux d'élevage. Le porteur décrit chez les témoins non vaccinés une prostration, des tremblements, une parésie, une paralysie, des convulsions et un "état proche de la mort", et attribue le nombre d'animaux et le recours à ces épreuves à la réglementation de la Pharmacopée européenne. Il affirme qu'aucun test in vitro n'existe pour remplacer ces contrôles, dont les rongeurs servent d'espèces de substitution aux espèces cibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de déterminer l’activité de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques, ainsi que l’identité de souches vaccinales. Ces objectifs doivent être respectés afin d’être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution d’un dossier de mise sur le marché et pour la fabrication d’un lot commercial. Les contrôles d’activité et d’identité d’un vaccin se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche d’épreuve (les animaux vaccinés sont protégés). Ils sont effectués in vivo sur espèce alternative. L’utilisation d’espèces alternatives est possible si les espèces utilisées (dans le cas présent des souris ou des hamsters) sont sensibles aux souches testées. Ceci permet d’éviter le recours aux espèces cibles, et de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs qui protègent l’animal de la maladie. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats concrets, certains obtenus sur l’animal.
Bénéfices attendus
L’avantage est que ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la santé et le confort des animaux de compagnie ainsi que des propriétaires.
Procédures
Après au moins deux jours d’acclimatation, les rongeurs peuvent entrer dans la phase de test avec l’administration d’un vaccin. Pour les trois contrôles une même démarche est appliquée : Il y a en premier lieu l’administration du vaccin aux animaux. Après un certain temps pour que l’immunité s’installe, la souche d’épreuve est inoculée aux animaux. Tous les animaux sont ensuite suivis deux fois par jour jusqu’à la fin du test. Une anesthésie est réalisée avant l’injection des souches d’épreuve en intra cérébral.
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les animaux peuvent présenter une légère augmentation du stress due aux injections des vaccins et aux manipulations. Les témoins montrent les symptômes liés aux maladies infectieuses testées: la prostration, le dos voussé, les reins creusés, des tremblements et l’absence de réactions aux stimuli. Pour les maladies virales avec un tropisme pour le système nerveux : les poils hérissés, la réduction des déplacements, des tremblements, des mouvements saccadés, la parésie, la paralysie, des flancs creusés, les yeux enfoncés, des convulsions et/ou un état proche de la mort. Des points limites spécifiques aux pathologies sont appliqués.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation des pays destinataires. Elle permet de démontrer l’activité et l’identité des lots de vaccins à commercialiser. Les tests in vitro sont actuellement inexistants pour remplacer le modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est imposé par la réglementation. Une réduction du nombre d’animaux est possible grâce à la mutualisation de lots témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont déterminés pour les témoins non vaccinés. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Pour les hamsters, un igloo ou hutte et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, des copeaux compressés sont disposés dans la cage. Et pour les souris, un igloo et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, l’enrichissement est limité à la litière et aliment afin d’éviter tout risque EHS de manipulation de l’enrichissement par l’opérateur lors des observations quotidiennes. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ces espèces de rongeurs sont utilisées comme espèces alternatives aux espèces d’animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques. Ces espèces sont sensibles aux souches testées et permettent de réaliser les tests. Pour l’épreuve rage sur souris : Il faut des souris de 4 à 6 semaines pour la technique d'identité ou de 4 à 5 semaines pour la technique d'activité par épreuve. Pour l’activité par épreuve leptospirose sur hamster : Il faut des hamsters de 35 à 55g, c’est-à-dire de 3 à 6 semaines. Pour l’activité par épreuve rhinopneumonie équine sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 50g. Ces stades de développement sont ceux requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et aux dossiers déposés aux autorités.
Utilisation digestive et métabolique des aliments d’allaitement et des aliments solides chez les veaux
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
80 veaux vont être utilisés, renvoyés en élevage à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus dans des cages individuelles qui les empêchent de se retourner et équipés d'un harnais de collecte des fèces pendant neuf jours, placés dans des enceintes fermées pendant sept jours et soumis à un jeûne de moins de 24 heures, pour mesurer l'utilisation digestive et métabolique de différents aliments. Le porteur décrit l'isolement et la restriction de mouvement comme les principales contraintes, et indique les atténuer par des dispositifs audio et la proximité des cages. L'objet réel du projet est de mieux calibrer l'alimentation des veaux d'élevage, notamment pour réduire les rejets azotés dans l'environnement.
Objectifs
Les veaux issus des troupeaux de vaches laitières peuvent être alimentés avec des proportions variables d'aliments liquides (aussi appelés aliment d'allaitement) et d'aliments solides selon leur devenir. Ainsi, les veaux destinés à la production de viande de veau sont généralement élevés avec une forte quantité d'aliments liquides et une faible quantité d'aliments solides. A l'inverse, les autres veaux (destinés au renouvellement du troupeau de vaches laitières, ou à la production de viande sous forme de taurillons) sont élevés avec une faible quantité d'aliments liquides, mais une forte quantité d'aliments solides. Chez les ruminants, les aliments solides sont orientés vers le rumen, où se déroulent les fermentations associées à la rumination, avant de rejoindre l'estomac, puis les intestins. A l'inverse, les aliments liquides sont directement orientés vers l'estomac via le mécanisme de fermeture de la gouttière oesophagienne, sans étape de rumination. Il résulte de cette particularité des modifications dans les utilisations digestives et métaboliques des aliments selon leur nature. Les objectifs du projet sont de déterminer les utilisations digestives et métaboliques de 10 rations expérimentales (figure 1) : 1/les rations 1 à 4 sont constituées de proportions variables d'aliments d'allaitement et d'aliments solides (de 90 à 0% d'aliment d'allaitement) de façon à évaluer l'effet de la substitution entre ces deux types d'aliments. Pour ces 4 rations, les aliments solides sont constitués de fourrages (mélanges de paille et de foin) et de concentrés de céréales et de protéagineux. 2/les rations 5 à 8 contiennent 57% d'aliment d'allaitement et 43% d'aliments solides. La composition des aliments solides varie afin de contenir des proportions variables de paille et de foin en association avec un concentré de céréales et de protéagineux de façon à évaluer les conséquences induites par le type de fourrage utilisé. 3/les rations 9 et 10 contiennent sont constituées de 85% d'aliment d'allaitement et de 15% d'aliment solide. Les rations 9 et 10 se distinguent par la composition de l'aliment d'allaitement (utilisation de deux poudres de lait écrémé issues de deux procédés industriels différents). La composition de l'aliment solide est la même pour les deux rations: concentré de céréales et de protéagineux en association avec de la paille. Toutes les rations seront calculées de façon à satisfaire les besoins nutritionnels des animaux.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre de disposer de mesure originales pour connaître les utilisations digestives et métaboliques de différents aliments chez les veaux. Aujourd'hui, la complémentarité entre les aliments d'allaitement et les aliments solides est mal maitrisée dans les élevages, ce qui aboutit à des déséquilibres nutritionnels caractérisés par un excès de certains nutriments. Par exemple, un excès de protéines dans l'alimentation est à l'origine de rejets excédentaires qui sont néfastes pour l'environnement. Le projet permettra de proposer des règles pour mieux alimenter les veaux.
Procédures
Les fèces sont collectés lors de la défécation naturelle, mais ceci néssite de placer les animaux dans des cages individuelles les empechant de se retourner et de les équiper d'un harnais de collecte des fèces. Les veaux seront équipés du harnais pendant la durée la plus courte possible (9 jours au cours des procédures 2, 4, 5 et 6). La mesure de la production de chaleur nécessite de placer les animaux dans des enceintes pendant 7 jours (procédures 4 et 5). La mesure de la production de chaleur basale nécessite de placer les animaux dans une situatuin de jeûne pendant moins de 24 h (procédure 5).
Impact sur les animaux
Les objectifs du projet nécessitent de placer les animaux dans des conditions d'hébergement particulières. D'une part, les procédures 2, 3, 4, 5 et 6 nécessitent d'héberger les animaux individuellement. Dans les procédures 2 et 6, la liberté de mouvement est également restreinte de façon à pouvoir collecter les fèces des animaux en les séparant des urines. Les procédures 4 et 5 renforcent l'isolement des animaux puisque ceux-ci sont alors hébergés individuellement dans des enceintes fermées. La procédure 5 met enfin en oeuvre un jeûne alimentaire de moins de 24 heures.
Devenir
A l'issue des procédures 3, 5 et 6, les animaux réintègrent une structure d'élevage car toutes les rations sont élaborées de façon à satisfaire les besoins nutritionnels des animaux et en n'utilisant que des matières premières autorisées en alimentation animale pour les veaux.
Remplacement
Nous souhaitons mesurer les réponses digestives et métaboliques aux apports d'aliments liquides et d'aliments solides. Pour cela, nous avons besoin de mettre en place des expérimentations sur animaux dont l'objectif est d'obtenir des valeurs de digestibilité et de productions de chaleur, qui est l'un des éléments descriptifs de la réponse animale.
Réduction
Le nombre d'animaux a été estimé sur la base d'essais antérieurs qui utilisaient entre 4 et 5 animaux par lot afin d'obtenir des valeurs nutritionnelles mesurées avec un coefficient de variation inférieur à 1 %. Le projet se déroule en 2 étapes. Au cours de la première étape, nous allons évaluer 8 rations, ce qui représente un total de 40 animaux. Cet effectif sera doublé pour certaines procédures d'adaptation alimentaire, afin de disposer de l'effectif de 40 animaux au moment des mesures. La deuxième étape mobilise 10 animaux supplémentaires, ce qui correspond à l'effectif nécessaire d'après les essais précédemment menés.
Raffinement
La première étape du projet nécessite de placer les animaux dans des enceintes qui isole fortement les animaux. Les enceintes sont équipées de dispositifs audio permettant aux animaux de s'entendre. Lors de la deuxième étape, les cages dans lesquelles sont hébergées les animaux seront placées à proximité les unes des autres, de façon à limiter l'isolement des animaux. Tous les animaux réintègrent une structure d'élevage en fin de projet.
Choix des espèces
il s'agir de l'espèce-cible de l'étude. Les animaux seront d'un poids vif d'environ 150 kg (première étape) à 250 kg (deuxième étape) et correspondant à des animaux en croissance. Il s'agit du poids vif moyen d'élevage des veaux.
Propriétés thérapeutiques d’agonistes du récepteur Sigma1: impact sur la neuroprotection et la réparation neuronale et oligodendrocytaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 742 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une alimentation additionnée de cuprizone pour provoquer une démyélinisation du cerveau, puis passent des batteries de tests comportementaux évaluant 61 critères neurologiques, des séances d'IRM et des électrocardiogrammes, pour tester deux agonistes du récepteur Sigma1 comme candidats médicaments contre la sclérose en plaques. Le porteur affirme que ce modèle ne provoque pas de signe clinique évident et n'altère pas la prise alimentaire, et conclut qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour reproduire ces mécanismes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de mesurer la neuroprotection avant mise à mort par injection létale et perfusion intracardiaque.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neuroinflammatoire évoluant sur différents modes cliniques. De récentes études montrent le caractère hétérogène et complexe de cette maladie auto-immune. Son étiologie est à l’heure actuelle encore inconnue. L’interaction de facteurs environnementaux et génétiques mènerait à la génération d’une réponse immunitaire anormale. L’immunité cellulaire et le système humoral sont impliqués dans la pathogénie de la maladie, provoquant des lésions démyélinisantes inflammatoires du système nerveux central (SNC) qui peuvent être classifiées en quatre catégories. Les lésions de type I et II ont de nombreuses caractéristiques communes (localisation péri-veineuse, démyélinisation active associée à la présence de lymphocytes T et de macrophages). Les lésions de type III présentent des infiltrats leucocytaires beaucoup moins importants et une oligodendropathie intense. Elles seraient la conséquence d’une exposition à des facteurs environnementaux produisant un stress métabolique. Les traitements de la SEP disponibles ne présentent qu’une efficacité restreinte sur la progression du handicap à long terme, c’est pourquoi il reste nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cibler les processus de démyélinisation paraît être une voie prometteuse pour moduler la phase progressive de la maladie. La proteine Sigma1 (S1R) est exprimée dans le cerveau et la moelle épinière, plus particulièrement par les neurones, les oligodendrocytes et la microglie. S1R est également exprimé par le système immunitaire (notamment par les lymphocytes B et T). Des ligands de S1R ont été synthétisés. La pharmacomodulation a permis d’augmenter leur affinité et leur sélectivité. L’impact de deux de ces composés a été testé in vivo dans un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, EAE. Ce modèle animal de SEP reproduit les lésions de type I et II. Des résultats prometteurs ont été obtenus.
Bénéfices attendus
Le modèle de démyélinisation toxique et les diverses analyses associées permettront d’analyser l’impact de nos candidats médicaments sur les processus de neuroprotection et de réparation.
Procédures
Tests comportementaux permettant l'évaluation de 61 critères neurologiques larges (30 minutes). Acquisitions IRM afin d'assurer un suivi longitudinal des animaux sans sacrifice (45 minutes). Electrocardiogrammes (ECG) afin de mesurer l'espace QT et de valiser une abscence de perturbation du rythme cardiaque (10 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle expérimental d'induction de la démyélinisation par la cuprizone est usuellement réalisé chez la souris. Les atteintes oligodendrocytaires et neuronales de la substance blanche sont majoritairement localisées dans le corps calleux et le pédoncule cérébelleux supérieur, cependant les animaux ne présentent pas de signe clinique évident. Leur prise alimentaire et hydrique n'est pas altérée.
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort au point d'analyse final. Les animaux recevront une dose létale de Dolethal afin de réaliser d'une perfusion intracardiaque qui permettra de fixer les tissus avant les études en microscopie.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées avec des agonistes S1R préalablement à cette expérimentation. Il est décrit que des ligands synthétiques moins selectifs et moins affins que nos composés montrent des capacités à inhiber la démyélinisation ou à activer la remyélinisation. Nos molécules pharmacologiques ont donné des résultats prometteurs lors de leurs injections dans des souris développant une EAE. Nous avons construit une collaboration scientifique avec un partenaire industriel dans le but d’étudier plus précisément l’implication de nos composés sur les processus de démyélinisation/remyelinisation qui constituent une voie prometteuse pour moduler la phase progressive de la SEP. Les mécanismes impliqués dans ces processus sont complexes. Ils impliquent la destruction tissulaire, le système immunitaire et la neuropathologie chronique. Ces événements sont uniquement reproduit dans des modèles animaux, aucune alternative in vitro, ni in silico n'existe actuellement.
Réduction
La recherche d’une grille de lecture clinique permettra de parfaire le suivi de l’évolution de chaque individu. L’utilisation de techniques IRM nous permettra de suivre les modifications présentes au sein du SNC durant 12 semaines, sans sacrifice. Notre plan d’expériences imbriquées permettra de limiter le nombre d’individus. Un grand nombre d'animaux sera sacrifié durant la seconde procédure expérimentale afin de valider un seul protocole d'administration et deux fenêtres thérapeutiques. Les données des animaux témoins seront réutilisés.
Raffinement
Le modèle de démyélinisation est maitrisé par notre équipe et répandu dans les laboratoires étudiants la physiopathologie des phénomènes de démyélinisants/remyélinisants. Les points d’analyses nécessitant une euthanasie ont été clairement définis grâce à la bibliographie. Leur pertinence pour chaque animal sera attestée par l’utilisation d’une grille de lecture clinique affinées et d’un suivi IRM longitudinal.
Choix des espèces
Le modèle expérimental d’induction de la démyélinisation par la Cuprizone est usuellement réalisé chez la souris. La souris C57BL/6 male est classiquement utilisée. Cependant, aucune différence notable des profils de démyélinisation n’est observée en fonction du sexe. Les souris sont âgées d’environ 8 semaines lors de la mise sous une alimentation additionnée de cuprizone (0,2%). Nous veillerons à effectuer une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’engager tout protocole. Les animaux seront donc livrés à l’âge de 7 semaines.