Procédures légères

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sélectionnées et croisées pour former deux lignées plus ou moins sociables, elles passent de nombreux tests comportementaux, dont l'interaction sociale, l'enfouissement de billes, la reconnaissance d'odeurs de prédateur et la nage forcée, pour chercher les bases moléculaires de la sociabilité. Le porteur décrit comme seules nuisances une légère inflammation au point de puçage et un léger stress lié aux tests. Les souris sont tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leurs organes.

Objectifs

Les Mammifères, incluant les humains, les animaux de ferme et les rongeurs, ont majoritairement adoptés un mode de vie en groupes sociaux complexes afin de favoriser la survie du groupe et de l’espèce. La vie en groupe est devenue, en retour, essentielle au bien-être de chaque individu. En effet, des chocs psychologiques précoces, comme l’isolement d’individus, entraînent un repliement social et une agressivité exacerbée envers les autres congénères, et sont souvent accompagnés de comportements stéréotypés et répétés. Sans aller jusqu’à ces extrêmes, des variations individuelles des capacités sociales existent au sein d’un même groupe social. Les substrats moléculaires associés à ces variations individuelles sociales n’ont pas été identifiées à ce jour. L’objectif de cette étude est donc 1) de mettre en évidence ces variations individuelles des capacités sociales en créant deux lignées divergentes Sociable+ et Sociable- par croisement respectivement des souris les plus sociables et les moins sociables entre eux , 2) de déterminer les substrats moléculaires associés après plusieurs générations par une approche omique et 3) de les valider.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer l’interaction sociale chez la souris. Ce projet dans son ensemble permettra de valider ces cibles dans différentes espèces établies en groupes sociaux dont l’Homme et les animaux d’élevage. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale dont les acteurs moléculaires mis en jeu reste méconnus, et également à long terme de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.

Procédures

contention (5 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), tests de comportement et habituation (2 fois 30 min, sauf caractérisation entière 10 fois 30min), la perfusion intra-cardiaque (1 fois, 30min). Le comportement social sera évalué en utilisant le test d’interaction sociale directe et le test des trois chambres pour la sociabilité, le test de monte pour le comportement socio-sexuel et le test de déplacement du nid pour le comportement maternel. Enfin, la préférence et la détection olfactives seront mesurées pour la préférence des odeurs sociales. Les comportements stéréotypés, persévérants et répétitifs sont évalués par le scorage en direct des stéréotypies motrices, en mesurant les alternations dans un petit labyrinthe en Y. Les comportements de type anxieux sont mesurés dans le test de l’enfouissement de billes, le test de suppression de prise de nourriture induite par la nouveauté, le test de reconnaissance des odeurs de prédateurs et le test de la nage forcée.

Impact sur les animaux

puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection; Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement social in vitro. Le comportement animal et les substrats moléculaires sous-jacents de l’interaction sociale ne peuvent être étudier que sur des animaux vivants. Il est donc indispensable de recourir à des procédures expérimentales in vivo.

Réduction

Le nombre de mâles et de femelles sont calculés pour voir des effets statistiques et en quantité suffisante pouravoir des couples reproducteurs sociable+ et sociable- pour générer la génération suivante. Il est prévu de faire 6 générations, mais si les animaux sociables+ et sociables- sont obtenus à la quatrième génération, les autres générations ne seront pas nécessaires, réduisant les effectifs de minimum 30%. De plus, les souris issues de ses croisements seront utilisées dans d’autres saisines.

Raffinement

Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements, sont les plus brèves possibles et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, ces expériences ont pour but de déterminer des nouvelles cibles pour améliorer le comportement social, un des marqueurs de bien-être des animaux. En effet, le repliement social est la première dégradation mineure du bien-être des animaux sociaux (incluant les animaux d'élevage et la souris). Les tests de comportement bien que légèrement anxiogènes au début permettent de staisfaire les comportements de curiosité naturelle des souris à explorer en enreichissant leur environnement.

Choix des espèces

Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduise bien et vite et dont les comportements sociaux et stéréotypés sont mesurables par des tests bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-10 semaines) à un stade post-pubère où les neurones sont bien caractérisés et matures. Ces animaux seront mis en reproduction à 3 mois.

6 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une unique instillation nasale d'un fragment d'anticorps sous anesthésie gazeuse, pour localiser où la molécule se disperse dans les bronches, dans le cadre d'un travail préliminaire sur l'asthme sévère. Le porteur n'attend pas d'effet indésirable de la molécule, seulement de légers effets liés à l'anesthésie et à l'instillation. Les souris sont tuées pour prélever leurs bronches et y repérer le fragment d'anticorps.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses, dont l’observance et la technique d’inhalation est bonne, et malgré une gestion optimale des comorbidités. Un des besoins non couverts dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend, entre autre, l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du MLB est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Le MLB de patients asthmatiques se caractérise par l’excès de prolifération cellulaire associée à des modifications du métabolisme énergétique. L’équipe de recherche a déterminé différentes cibles potentielles de régulation du métabolisme énergétique dont l’inhibition permettrait de réduire la taille du MLB et donc de diminuer la pathologie. L’objectif de ce travail est de permettre des expérimentations préliminaires afin de localiser dans la bronche la dispersion d’un fragment d’anticorps (scFv). Le but de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme allergique chronique.

Bénéfices attendus

Ce projet préliminaire a pour but d’étudier la dispersion des molécules scFv dans les différentes structures de l’arbre bronchique après leur installation par voie nasale.

Procédures

Les animaux ne seront soumis qu’à une seule instillation nasale de fragments d’anticorps (scFv) sous une anesthésie gazeuse (Isoflurane).

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux, nous nous attendons à pas d’effets indésirables quant à l’effet de la molécule instillée chez les animaux. Par ailleurs, l’anesthésie sous isoflurane et le mode d’instillation nasale, pourrait cependant avoir des légers effets indésirables (dyspnée et mauvaise absorption nasale) qui sont directement corrigés avec une diminution du pourcentage d’isoflurane comme décrit dans la procédure.

Devenir

L’objectif de ce projet préliminaire doit permettre la récupération des bronches des animaux traités afin de localiser dans quelles structures bronchiques les fragments scFv se situent. En fin de protocole, les animaux doivent donc être euthanasiés afin de procéder aux prélèvement de l’organe d’intérêt.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme suite au blocage du gène clé de la biogénèse mitochondriale. L’utilisation du modèle d’asthme chroniques murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 3 souris dans chacun des deux groupes.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, coppeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle au cours de l’anesthésie, induite par les instillations intranasales, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml).

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Souris adultes âgées de 7 semaines

26 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rendus à l'élevage. Ils subissent un sevrage imposé, des prélèvements sanguins mensuels pendant un an et des tests cognitifs et de tempérament, pour mesurer les effets de ce sevrage précoce sur leurs compétences sociales et leur cerveau. Le porteur reconnaît que le sevrage imposé peut être une source de stress pour les poulains. L'étude porte sur une pratique d'élevage courante et se présente comme une contribution à la connaissance du bien-être des chevaux.

Objectifs

Le sevrage est souvent réalisé atour 6 mois dans la pratique (voir encore plus tôt) pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il s’agit d’une pratique qui est répétée par habitude car étant traditionnelle et majoritaire. Elle est donc peu questionnée. Ensuite, elle permettrait de remettre plus rapidement la jument à la reproduction et de limiter la fatigue physique liée à la lactation. De plus, certains considèrent que retirer la mère permet de réorienter l’attention du poulain vers l’humain, et donc de faciliter son entrainement. Enfin, l’hébergement en box individuel est encore très répandu et est donc incompatible avec le maintien d’une vie sociale. Les bienfaits d’un sevrage plus tardif sont encore peu connus alors qu’il existe un fort contraste entre ce sevrage imposé à 6 mois et ce qui est observé en conditions libres. En effet, en conditions naturelles, le sevrage s'initie progressivement vers 9 mois et peur courir jusqu'au 2-3 ans de l'animal (i.e. âge de dispersion). Nos résultats permettront de déterminer si 1/ le sevrage imposé influence le développement social, cognitif et/ou cérébral des poulains, 2/ si de tels effets se maintiennent dans le temps ou si au contraire les poulains compensent cet évènement perturbateur sur le long terme lorsqu’ils sont élevés dans un milieu social par ailleurs riche, et 3/ si le sevrage impact à long-terme le bien-être, la personnalité et la maniabilité des jeunes chevaux. Si nos résultats montrent qu’un sevrage réalisé à cet âge et dans ces conditions a des conséquences néfastes durables, alors ils ouvriront la voie à une nouvelle étude où nous pourrons tester d’autres âges de sevrage (e.g. 7 ou 8 mois) pour trouver le meilleur compromis à recommander pour la pratique. Le suivi longitudinal du groupe « sevrage spontané » nous aidera à cibler la période idéale. S’il s’avère que le sevrage pratiqué dans les conditions de l’étude n’induit pas des déficits sociaux, cognitifs et/ou cérébraux durables, ni n’altère durablement le bien-être ou la relation à l’humain, alors les recommandations pourront se concentrer sur la manière de faciliter ce type de sevrage et ne nécessiteront pas nécessairement de tester d’autres âges. Dans tous les cas, des recommandations concrètes sur la gestion des poulains pourront être faites. De manière plus globale, cette étude ouvrira la voie à cette thématique sur l’optimisation de l’élevage des jeunes afin de garantir un développement idéal et adapté aux conditions domestiques.

Bénéfices attendus

Meilleure caractérisation de l'impact du sevrage équin et apport de connaissances en matière de bien-être animal.

Procédures

Tous les animaux seront utilisés pour des tests comportementaux (tests cognitifs vers 16 mois et tests de tempérament vers 18 mois) et des prélèvements sanguins mensuels au cours d'une année. Les tests de tempérament durent environ 1h par cheval et n’ont lieu qu’une fois. Une familiarisation au box de test a lieu trois fois dans les jours précédents les tests de tempérament. Il s’agit simplement de placer le cheval, libre d’explorer, dans la zone de test durant 15 min. Les tests cognitifs ont une durée variable qui dépendra des performances cognitives des animaux. Ils seront soumis à des sessions de 1h maximum, espacées de 1 à 2 jours. Ces sessions se répéteront durant plusieurs semaines (temps min : 3 semaines temps max : 6 semaines) en fonction de leur vitesse d’acquisition. Ils sont uniquement basés sur la coopération des animaux et leur motivation à obtenir de l’aliment.

Impact sur les animaux

Potentiellement du stress lors du sevrage imposé.

Devenir

Tous les animaux retourneront en élevage après les procédures.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du cheval domestique est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage de cette espèce. De plus, nous avons besoin d’un modèle animal qui présente un développement assez long et pour lequel nous avons déjà les bases quant à l’étude de son comportement et de sa neurobiologie.

Réduction

Pour une étude utilisant l'IRM (APAFIS n°33160), notre effectif est plutôt important (N=2x12 poulains). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les lots expérimentaux, voire entre les individus. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce, le groupe « sevrage imposé » (i.e. traitement le plus « négatif ») correspond en fait à la réalité observée dans la pratique (mais sans isolement social) et les animaux ne seront pas mis à mort à la fin de protocole. La taille de nos effectifs (12 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests de comparaison paramétriques. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non-paramétriques du type tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, mais uniquement si la variabilité inter-individuelle intra-groupe le permet. Puissance des tests : dans le cas où une différence de 15% est observée entre les deux groupes expérimentaux pour un paramètre donné, avec des écart-types de 12% autour de la moyenne et un seuil de 0,05, nous obtiendrions une puissance de test de 87% pour un test t de student et 83% avec un test de Mann Withney (outils AnaStats).

Raffinement

Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. En tant qu’espèce sociale, ils bénéficieront d’un maintien en groupe social. Ils seront hébergés en pâture ou en stabulation (grand box collectif), selon les conditions météorologiques. Des objets d’enrichissement seront présents en stabulation (ex. brosse électrique, bois à ronger…). Leur alimentation sera principalement composée de fourrage et d’herbage afin qu’ils aient la possibilité en continu de s’alimenter avec une alimentation riche en fibres. L’hébergement collectif leur donnera également une liberté de mouvement et un budget d’activité a priori conformes à ce qui attendu en conditions libres. Ainsi, l’ensemble de ces conditions de vie que nous proposons sont au-delà des conditions standards généralement observées dans la pratique, où l’hébergement en box individuel est très répandu (ce qui induit donc un isolement social et une restriction de l’activité locomotrice importante). Concernant l'habituation aux tests, elle consistera à exposer les animaux en amont au lieux et aux dispositifs de tests. Des critères seront définis à chaque étape. Les sessions seront courtes (15 min max) et nous mettrons en place des critères (ex. avoir été en contact avec le dispositif d’apprentissage lorsqu’il a l’occasion de l’explorer librement). Des observations sont réalisées et une attention particulière est portée aux indicateurs de stress aigus (e.g. soufflements et ronflements, posture d’alerte, défécations…)

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux vivants car notre projet explore les liens entre le développement socio-cognitif et neurobiologique. Il nécessite donc l’observation d’animaux vivants, ainsi que l’étude non létale de leur cerveau (par IRM) afin de permettre un suivi longitudinal.

40 rats porteurs de la myopathie de Duchenne vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis cinq fois, entre l'âge de quelques semaines et un an, à des séances de pléthysmographie de 45 minutes dans une chambre hermétique, pour mesurer leur fonction respiratoire. Le porteur reconnaît que le protocole peut conduire à un "manque vital d'oxygène" et que l'isolement dans une chambre sans litière ni enrichissement est une source de stress. À l'issue, ces rats sont réutilisés dans une autre étude déjà autorisée portant sur leur fonction musculaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes respiratoires chez le modèle de rat DMDmdx, modèle animal de la myopathie de Duchenne (DMD). Ces atteintes seront caractérisées et quantifiées de manière longitudinale à différents stades de développement à l’aide de la technique non invasive de pléthysmographie.

Bénéfices attendus

La lignée de rats DMDmdx a été créé en 2014 par un consortium de laboratoire dans le but de pallier aux inconvénients rencontrés avec les autres modèles DMD, la souris mdx et le chien GRMD, pourtant largement utilisés pour étudier l’efficacité de traitement. La souris mdx est facile d’utilisation, peu couteuse mais ne reproduit que partiellement les lésions musculaires retrouvées chez les patients DMD. Le chien GRMD présente un phénotype sévère, mais il reste un modèle de gros animal couteux et lourd à manipuler. Les premières études de caractérisation du rat DMDmdx ont démontré que ces animaux présentent un phénotype sévère, avec une atteinte des muscles squelettiques et cardiaques semblables à celles observées chez les patients DMD. La caractérisation des atteintes respiratoires du rat DMDmdx, encore non explorée, permettra alors de conforter l’utilisation et la validité de ce modèle pour l’évaluation d’approches thérapeutiques avec un intérêt particulier pour la fonction respiratoire, dont les atteintes sont visibles chez les patients dès l’âge de 12 ans

Procédures

Analyse de la fonction respiratoire par pléthysmographie non invasive, sur animaux vigiles Durée d’une séance de pléthysmographie par rat : 45 minutes Nombre de séance de pléthysmographie par rat : 5, de 4-6 semaines à 12 mois d’âge, espacés d’au minimum d’1 mois.

Impact sur les animaux

Le protocole retenu pour étudier la fonction respiratoire par pléthysmographie pourrait conduire à un manque vital d’oxygène. L’observation en continue des animaux pendant le test permettra d’identifier rapidement cet effet indésirable et conduira à l’arrêt de l’étude pour le ou les rats concernés, qui seront par conséquent sortis des chambres de pléthysmographie et remis dans leur cage respective. L’isolement des animaux dans une chambre hermétique de petite taille, sans litière ni enrichissement, peut également être une source de stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie pendant le temps du protocole après la pléthysmographie non invasive puisque celle-ci est utilisée pour suivre au cours du temps l’évolution des atteintes respiratoires. Suite au dernier stade d'exploration (12 mois), les animaux seront réutilisés pour l'analyse de la fonction contractile et intégrés dans une autre demande d'autorisation de projet déjà validée (DAP #10792).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucun modèle animale d’exploration de la fonction respiratoire remplaçant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèle et des approches expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L’évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l’état de santé (difficultés locomotrices, d’alimentation et respiratoires), l’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animal et le responsable du projet pour estimer une éventuelle gène ou douleur liées à l’expression clinique de la maladie. Le protocole, validé, non invasif et effectué sur animal vigile prend également en compte au mieux le bien-être des animaux. Si nécessaire, une mise à mort la plus éthique possible des animaux sera effectuée.

Choix des espèces

La lignée de rats DMDmdx possède une mutation sur le gène dmd codant pour la protéine dystrophine. Deux modèles animaux DMD sont couramment utilisés en pré-clinique : 1) la souris mdx, facile d’utilisation, peu couteuse mais ne reproduisant que partiellement les lésions musculaires retrouvées chez les patients DMD, et 2) le chien GRMD, qui présente un phénotype sévère, mais qui reste un modèle de gros animal couteux et lourd à manipuler. Les premières études de caractérisation du rat DMDmdx ont démontré que ces animaux présentent un phénotype sévère, avec une atteinte des muscles squelettiques et cardiaques semblables à celles observées chez les patients DMD. La caractérisation des atteintes respiratoires du rat DMDmdx, encore non explorée, permettra alors de conforter l’utilisation et la validité de ce modèle pour l’évaluation d’approches thérapeutiques Rats d’âge compris entre 1 et 12 mois afin d’évaluer la progression des atteintes respiratoires chez le modèle de rat DMDmdx. La fonction respiratoire de ces animaux sera ainsi étudiée à 5 stades de développement : 6 semaines, 3 mois, 5 mois, 7 mois et 12 mois. Les premiers signes d’atteintes musculaires et cardiaques sont visibles dès l’âge de 6 semaines, et à 12 mois les rats présentent un phénotype dystrophique sévère.

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau de souffrance léger. Elles reçoivent par voie intraveineuse une greffe de neuroblastome qui provoque des métastases hépatiques, puis des injections d'anticorps censés freiner la tumeur. Le porteur reconnaît que des effets indésirables peuvent apparaître à mesure que les tumeurs progressent, tout en classant l'ensemble en gravité légère. Il affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable" et qu'aucune procédure in vitro ne peut le remplacer, les bénéfices pour les patients restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet a déjà été approuvé récemment, cependant pour des raisons techniques (décrites en 3.3.2.2), l’animalerie dans laquelle une partie des expériences sont décrites dans cette demande doit être modifiée. Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité des combinaisons d’anticorps thérapeutiques anti-OacétylGD2 et d’anticorps bispécifiques dans un modèle de souris greffées avec des cellules de cancers pédiatriques. Cette possibilité de combiner les anticorps ou d’utiliser des anticorps bispécifiques ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Un modèle de souris immunocompétentes sur lequel notre équipe a déjà testé des traitements et dont nous connaissons bien le développement, recevra une greffe d’une lignée de neuroblastome murin par voie intraveineuse ce qui conduit à obtenir des métastases hépatiques puis sera traité avec des anticorps bispécifiques ou des combinaisons d’anticorps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de faire progresser les connaissances scientifiques concernant le mode d’action des anticorps testés. Sur le long terme, ces connaissances offrent la possibilité de proposer aux patients de nouvelles biothérapies plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au totale). Injection intraveineuse sur animal vigile (9 injections, 3 minute maximum chacune, temps de mise en boite de contention + injection, soit 27 minutes au totale).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont ; premièrement le stress et la douleur lié à la manipulation (traitements et pesées) et contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuses). Deuxièmement, l’injection de cellule tumorales conduit la formation de métastases hépatiques. Ainsi, des effets indésirables peuvent apparaitre chez les animaux en fin d’expérimentations (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutiques des anticorps bispécifiques ou combinaison d’anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Les immunothérapies impliquent le système immunitaire de l’hôte. Cette étude nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients. Il n’existe aucune procédure in vitro qui puisse remplacer ces expériences.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques (Two way ANOVA) et les expériences ne seront reproduites que si les résultats ne sont pas significativement différents. De plus, nous conserverons tous les prélèvements d’organes et tissus pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévère (voir annexe) qui conduiront à la mise à mort dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris par cage enrichie (frisotis de cartons). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, le GD2 O-acétylé est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lesquels nous connaissons bien le développement Les animaux âgés de 8 semaines au début des expérimentations conformément aux études réalisées précédemment. Animaux adultes, d’un poids approximatif de 20 g.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par injection de trypanosomes, agents de la maladie du sommeil, puis suivies par imagerie sous anesthésie et prélèvements de sang à la queue, dont l'extrémité est sectionnée au scalpel après application d'un anesthésique local. Le porteur indique que les symptômes n'apparaissent qu'après une à quatre semaines et la mort après six à huit, et qu'aucun dommage évident n'est donc attendu dans la fenêtre d'observation. Il affirme que ce modèle murin est le "seul contexte biologique" permettant d'aborder la complexité de l'infection.

Objectifs

La trypanosomose humaine africaine, ou maladie du sommeil, est une maladie tropicale négligée provoquée par le protiste flagellé Trypanosoma brucei. Le Nagana est une maladie similaire des bovins causée par des espèces de trypanosomes très proches. Après leur injection par piqûre de mouche tsétsé, ces parasites extracellulaires transitent apparemment d’abord dans le système lymphatique, avant d'envahir la circulation sanguine où ils prolifèrent et provoquent les symptômes typiques de la maladie. Les trypanosomes sont également capables de quitter la circulation sanguine pour s’installer dans certains tissus comme la peau qui joue alors un rôle de réservoir anatomique de parasites prêts à être transmis à un nouvel hôte. Cependant, très peu de détails sont aujourd’hui connus sur les aspects métaboliques des différentes étapes de l'infection dans le sang et dans la peau, ainsi que la réaction immunitaire de l’hôte mammifère contre les différents stades de développement des parasites dermiques. 1- Le premier objectif de ce projet est de caractériser la signature métabolique de Trypanosoma brucei brucei fluorescents et bioluminescents dans le sang et le derme de la souris, après injection intrapéritonéale, en utilisant des technologies d'imagerie intra-vitales récentes, ceci dans le but de découvrir les mécanismes d’adaptation spécifiques de ces parasites dans des environnements différents (sang vs peau). Nous comparerons le métabolisme de deux souches de parasites . 2- Le second objectif est de comparer les différentes réponses immunitaires mises en place dans les différents compartiments (sang et peau) de l’organisme hôte et dirigées contre les différents stades parasitaires et à différents moments de l’infection. Il est ici en effet question de savoir si : (1) la réponse immunitaire de la peau est différente de celle du sang ? (2) la réponse immunitaire est la même au début et tout au long de l’infection ? (3) la réponse immunitaire varie en fonction du stade de développement « SL » versus « ST » ? Pour parvenir aux différents objectifs, nous utiliserons deux souches de trypanosomes exprimant le triple marqueur RedShiftedLuciferase::TY1::TdTomato mais ayant des profils génétiques différents : - La première monomorphe (n’ayant qu’un seul stade de développement « SL » chez la souris) = Lister 427 - La deuxième pléomorphe (ayant deux stades de développement « SL » et « ST » chez la souris) = AnTat 1.1E

Bénéfices attendus

Au total, ces études déboucheront sur les premières analyses du métabolisme des trypanosomes cutanés et de la réponse immunitaire cutanée de l’hôte mammifère. L’analyse prendra également en compte les deux stades de développements parasitaires ciblés par ces réponses, ce qui sera déterminant pour améliorer le diagnostic et le traitement de cette maladie qui est toujours mortelle en l'absence de traitement.

Procédures

- J-1 : Les souris sont marquées au feutre indélébile au niveau de la queue, avec un code de marquage et de couleur spécifique à chaque groupe. Le poids de chaque souris est mesuré pour noter leur état initial. - J0 : Les souris sont inoculées par injection intra-péritonéale de 100ul de parasites. - Les souris sont alors conditionnées pour imagerie intra-vitale (cf. ci-dessous). - J3, J5 ou J3, J5, J10, J17 et J24 : Le poids de chaque souris est mesuré, leur état de bien-être est contrôlé avec la grille de suivi utilisée pour évaluer leur douleur, leur stress, leur inconfort, mise au point par la SBEA et disponible sur le site internet de l’animalerie centrale. Un prélèvement sanguin de 5ul est effectué à la queue de chaque souris afin d’évaluer leur parasitémie. A J3, un petit bout de l’extrémité de la queue (environ 1mm) est coupé au scalpel fin 20 minutes après application topique d’un anesthésique local (crème EMLA, lidocaïne 5%). Un prélèvement de 5ul est effectué à la micropipette P10 et récupéré en milieu HMI9 pour comptage des parasites. Les prélèvements suivants sont effectués après simple grattage de la croute issue de la plaie résultant du 1er prélèvement. Les souris sont suivies par imagerie intravitale sous anesthésie générale à l’isoflurane. Chaque souris est imagée en faces dorsale et ventrale pendant une durée n’excédant pas 5 minutes. Avant observation à l’IVIS Spectrum, une injection IP de 150 ul de D-luciférine préparée en concentration finale de 33,33 mg/ml dans du PBS 1x stérile est réalisée 15 min avant l’imagerie de la bioluminescence. Il s’agit du substrat de la luciférase qui émettra la bioluminescence après réaction enzymatique. Les souris sont placées sur une plaque chauffante (IVIS Spectrum). La plaque chauffante permet de prévenir l’hypothermie de la souris durant la période d’anesthésie. - J 6-7 ou 27-28 : Les souris sont endormies profondément avec un mélange de 100 mg/kg de Ketamine, 10 mg/kg de Xylazine et 0,1mg/kg de Buprénorphine. La perfusion sera réalisée conformément au geste technique validé N°28. Ce geste technique a pour but de se débarrasser complètement du sang dans les tissus (peaux) de l’animal afin de s’assurer que tous les parasites détectés dans la peau au moment des analyses ultérieures seront des « vrais » trypanosomes cutanés et pas des parasites du sang résiduel des tissus.

Impact sur les animaux

D’après la littérature et nos expériences préliminaires : (1) aucune réaction inflammatoire localisée n’est observée au site d’injection, (2) les symptômes de la maladie que sont la fièvre, la léthargie, l’anémie causant une perte de poids et une faiblesse ne s’installent chez la souris qu’après au moins 1 semaine avec la souche monomorphe et 4 semaines avec la pléomorphe, (3) la mort ne survient qu’à partir de 6 à 8 semaines. Dans nos conditions d’observation, aucun dommage évident n’est donc attendu.

Devenir

A la fin de cette procédure, toutes les souris seront mises à mort par surdosage d’anesthésique préalable à la perfusion (geste technique validé N°28).

Remplacement

Le modèle murin est le seul contexte biologique permettant d’appréhender les questions posées dans leur complexité physiologique.

Réduction

L’approche d’imagerie intravitale envisagée permet une réduction significative du nombre d’animaux.

Raffinement

De façon générale, afin de remplacer, réduire et raffiner l’utilisation des animaux de laboratoire dans nos protocoles, nous avons mis en place depuis 10 ans des méthodes alternatives standardisées et désormais utilisées en routine dans notre laboratoire. L’approche d’imagerie intravitale envisagée minimise grandement le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur ces animaux. Pour les souris infectées par la souche pléomorphe, le suivi de la dissémination des parasites bioluminescents sera réalisé une seule fois par semaine, réduisant encore l’inconfort dû à l’anesthésie générale à l’isoflurane (Geste technique validé N°6A) pré- imagerie. Les prélèvements sanguins à la queue seront précédés (20 minutes avant) d’un traitement à la lidocaïne 5% (crème apaisante). Les étapes d’imagerie intravitale seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane (Geste technique validé N°6A). L’étape finale d’anesthésie profonde et analgésie avant perfusion sera réalisée après inoculation intrapéritonéale d’un mélange de 100 mg/kg de Ketamine, 10 mg/kg de Xylazine et 0,1mg/kg de Buprénorphine, la Buprénorphine étant injectée 30 minutes avant l’injection du mélange Kétamine/Xylazine.

Choix des espèces

La souris est le plus petit modèle Mammifère validé disponible et suffisamment proche de l’homme pour permettre un accès à toutes les informations recherchées et une interprétation / extrapolation par analogie. Adultes de 8 semaines. Il s’agit du modèle le plus fréquemment utilisé dans la littérature, ce qui nous permettra des comparaisons.

18 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés dans d'autres projets. Ils reçoivent quotidiennement un extrait de raisin dans leur alimentation et subissent deux prises de sang sur animaux vigiles, pour vérifier l'innocuité de cet extrait chez le chien. Le porteur indique que la contention lors des prélèvements peut être une source de stress, mais que les animaux y sont habitués. Il affirme qu'aucun remplacement n'est envisageable, le chien étant "l'espèce cible" de cet extrait déjà commercialisé pour d'autres espèces.

Objectifs

L'objectif du projet est de vérifier l'innocuité d'un extrait de raisin chez le chien adulte sain, c'est à dire s'assurer qu'il ne provoque aucun désagrément sur l'animal (aucun effet sur le poids, aucune modification du comportement, aucune modification des paramètres de santé rénale et hépatique). Cet extrait possède déjà une autorisation de commercialisation pour d'autres espèces mais pas encore pour le chien.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la démonstration de l'innocuité de l'extrait de raisin testé chez le chien adulte sain car de rares cas d'intoxication avec du raisin ont été rapportés chez le chien sans qu'une explication de cause à effet ait réellement pu être démontrée.

Procédures

Les chiens recevront l'extrait de raisin dans leur alimentation quotidiennement durant la durée de l'étude et deux prises de sang seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Une baisse de l'acceptation de l'aliment peut être envisagée mais la quantité d'extrait est tellement faible et homogène dans l'aliment que cela ne doit pas avoir d'impact sur la consommation de la ration. Les prises de sang constituent une nuisance attendue à cause du stress éventuel de la contention mais les animaux sont habitués à cette procédure ce qui permet la réalisation de celles-ci dans les meilleures conditions de rapidité et de bien-être de l'animal. Le prélèvement sanguin est, lui, considèré comme une procédure légère constituée d’acte (piqûre) non algogène ne justifiant pas l’administration d'analgésiques. Cependant, afin de préserver le bien-être des animaux, tout prélèvement sera interrompu si l’animal montre un quelconque signe de détresse.

Devenir

Les animaux pourront soit être réintégrés à un projet dont la demande d'autorisation est encore en cours soit intégrés dans un nouveau projet.

Remplacement

Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chien est l'espèce cible de cet extrait.

Réduction

Cette étude est un projet préliminaire qui permettra une fois l'innocuité établie sur un petit nombre d'animaux sains, d'envisager de montrer des effets positifs de l'extrait sur des animaux souffrant de désordres métaboliques liés au surpoids. La taille des groupes proposée est celle minimale basée sur notre expérience, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et d’assurer la robustesse des analyses statistiques (tests statistiques non paramétriques Mann-Whitney).

Raffinement

Cette étude ne limite pas les sorties des animaux et leur sociabilisation. Ils peuvent de plus continuer à vivre en groupe (3 à 4 chiens dans un box de 18 m2 avec présence de niches et de jeux type kong ou ballon). Ils ont accès à l’eau à volonté. Lors de la prise des repas, les animaux sont attachés dans leur box et ne peuvent ainsi consommer que la ration qui leur est présentée. Ils sont amenés, en laisse, de leur box jusqu’à la salle de prélèvement se trouvant dans le même bâtiment. Un suivi quotidien du comportement des chiens est réalisé afin de mettre en place, si besoin était, des mesures adéquates (changement de place dans le chenil, apport de nouveaux jeux dans les boxes) pour maintenir un bien-être optimal à nos animaux.

Choix des espèces

Le chien est l'espèce cible de l'extrait testé. Les animaux utilisés seront adultes, car ils sont les cibles de l'utilisation de cet extrait (stade de développement le plus susceptible d'être sujet à l'embonpoint).

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous-cutanée d'une puce de détection sous anesthésie, dans le seul but de mettre au point un dispositif de suivi comportemental. Le porteur indique qu'aucune puce classique ne convient et que l'insertion impose une intervention chirurgicale. Il précise que ces souris ne pourront ni servir de reproductrices ni rejoindre d'autres études comportementales, et seront donc euthanasiées, quelques tissus étant conservés pour des mises au point ultérieures.

Objectifs

Le comportement social est la disposition naturelle d’un individu à interagir avec autrui au sein de son propre groupe social ou de groupes sociaux différents. Les membres d’un groupe partagent des informations, des enseignements, expriment des émotions, font preuve d'empathie et maintiennent un lien entre membres par divers moyens de communication. Les comportements sociaux sont importants pour la santé psychologique de l’individu et l’harmonie du groupe social. Des comportements sociaux inadaptés sont caractéristiques de plusieurs pathologies humaines, telles que les troubles du spectre autistique, les troubles anxiodépressifs, la maladie d’Alzheimer et la schizophrénie. Les altérations des interactions sociales peuvent être de nature diverse, entre autres, le retrait social, l’absence de motivation à interagir avec autrui ou une altération de la mémorisation sociale.

Bénéfices attendus

Des nombreuses initiatives ont vu le jour ces dernières années afin d’optimiser l’exploration comportementale du rongeur de laboratoire. Différents dispositifs ont été créés par des chercheurs de laboratoires académiques ou compagnies spécialisées visant à explorer les interactions sociales de proximité ou les activités sensori-motrices de l’animal en limitant l’intervention de l’expérimentateur. Pourtant, des dispositifs permettant l’évaluation concomitante des interactions sociales, des activités motrices et du comportement alimentaire d’un groupe conséquent d’individus (12) ne sont pas disponibles à l’heure actuelle vraisemblablement en raison des nombreux verrous techniques à dépasser.

Procédures

Intervention chirurgicale unique pour implantation d'une puce de détection, la durée de l'intervention ne devrait pas excéder 30 à 40 minutes.

Impact sur les animaux

La création d’un tel dispositif nécessite le puçage de souris. Pour différentes raisons techniques, les puces traditionnellement utilisées ne peuvent l’être ici . Les puces adéquates, (disque plat plastifié de 0,4 cm de diametre pesant moins d'1 g) devront être insérées sous la peau de l’animal nécessitant une intervention chirurgicale sous anesthésie.

Devenir

Les souris ne pourront être utilisées comme " reproducteurs" car la reproduction est interdite dans l'animalerie dédiée à l'exploration fonctionnelle des souris où se dérouleront nos expériences.Les souris ne pourront pas être transférées en zone de reproduction dont le statut sanitaire est plus contraignant que celui de la plateforme d'exploration comportementale. D'autre part, ces souris ne pourront pas non plus être intégrées dans des explorations comportementales lesquelles ne recrutent que des animaux naïfs, sans manipulations préalables qui pourraient modifier les caractéristiques comportementales et donc biaiser les résultats obtenus. Pour ces raisons, les souris seront euthanasiées. Différents tissus seront collectés et conservés et serviront à des mises au point d'analyses biologiques ultérieures.

Remplacement

Les interactions sociales, motivationnelles et alimentaires ne peuvent être étudiées que sur des animaux. Développer et tester une nouvelle approche d’exploration comportementale est la base de notre projet; de fait, le projet est impossible à réaliser in cellulo ou in vitro.

Réduction

Le dispositif est prévu pour accueillir un groupe 12 souris afin de constituer un groupe social hiérarchisé. Le même groupe de souris sera utilisé pendant toute la durée de mise au point du dispositif soit une année environ.

Raffinement

Dans ce projet, les animaux sont hébergés et libres de circuler dans un environnement spacieux, offrant la possibilité de choix d’activité diverses (roues d’exercices, nids, jouets, etc). Les souris seront hébergées en groupe de 12 individus permettant la constitution d’un groupe social hiérarchisé proche des conditions éthologiques. Le suivi de activités des animaux sera réalisé sans intervention de l’expérimentateur dans le respect de leur rythme circadien. Enfin, des analyses corrélatives seront faites entre les données comportementales et biologiques pour chaque animal indépendamment. Entre deux essais de mise au point, quand les animaux ne sont pas hébergés dans le dispositif, ils seront placés ensemble, pour ne pas perturbé le groupe social, dans une grande cage en présence de l'enrichissement cité ci-dessus.

Choix des espèces

La souris est l’animal pour lequel les paradigmes d’apprentissage, de mémorisation, d’interactions sociales et de capacités motrices et exploratoires sont bien documentés du point de vue comportemental et neurobiologique. L’utilisation de souris isogéniques limite les variations inter-individuelles observées dans les tests biologiques et comportementaux permettant de limiter les effectifs d’animaux utilisés en préservant la validité statistique. Une fois, le dispositif créé et validé, il sera mis à disposition des autres équipes de l'Institut pour répondre à des questions biologiques diverses. Toutes les équipes de l'Institut utilisent la souris comme modèle pré-clinique, justifiant le choix de cette espèce pour la présente demande d'autorisation. Les 12 souris C57BL6 âgées de 6 semaines, obtenues auprès d’un fournisseur agréé, seront hébergées toutes ensemble dans une seule grande cage (40cm X 60 cm) contenant divers enrichissements ( bâtonnets à ronger, roues d’exercices, nids, matériel de nidification, jouets, etc). A l’âge de 8 semaines, les souris seront pucées puis suivies une année durant pour des tests de validation du dispositif de mesure des comportements sociaux chez l'adulte; tests pouvant durer de quelques heures à quelques jours. En fin de test, les souris seront replacées ensemble dans leur cage de stabulation.

1 150 animaux non-humains, 600 souris, 150 rats, 200 cobayes et 200 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Chacun reçoit l'injection d'un agent infectieux puis subit des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à un prélèvement terminal, pour produire des sérums servant de réactifs aux contrôles de lots pharmaceutiques. Le porteur présente cette production comme un moyen de limiter le nombre d'animaux utilisés dans les contrôles qualité. Il affirme la production de sérums "irréalisable" in vitro, sans détailler les alternatives explorées.

Objectifs

Ce projet a pour objectifs : - la production de réactifs sériques (anticorps polyclonaux) nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider les tests in vitro, et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot pharmaceutique. Ces tests sont effectués sur espèces rongeurs, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif. - être en adéquation avec les exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM).

Bénéfices attendus

Ces tests permettent la réalisation des contrôles in vitro réalisés dans les laboratoires. Ceci permet la libération de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal en favorisant les méthodes alternatives.

Procédures

Une période d’acclimatation de 2 jours minimum est requise pour les rongeurs. Les modes opératoires débutent par l’administration du produit à J0. Il y a ensuite une phase d’observation quotidienne avec éventuellement jusqu’à 8 rappels en fonction des techniques qui sont appliquées. Des prélèvements sanguins intermédiaires sont réalisés pour vérifier le taux d’anticorps et un prélèvement sanguin final est effectué. La principale substance injectée pour ces tests est : la souche de l’agent infectieux Le volume injecté dépend de l’espèce et de l’âge des animaux.

Impact sur les animaux

Aucun dommage n’est attendu, un léger stress lié aux manipulations et injection des souches peut apparaître. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Ces tests garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés

Remplacement

La production de sérums est actuellement irréalisable sur un modèle In vitro. Il faut passer par le modèle in vivo. Les sérums produits entrent ensuite comme réactifs dans les contrôles in vitro réalisés permettant la libération d’un lot.

Réduction

le nombre d’animaux est fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins et du type de réactifs nécessaire. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.

Raffinement

Dans ce projet, aucune souffrance ou stress significatif est attendu. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Les conditions d’hébergement varient en fonction de l’espèce et de l’âge des animaux pour maximiser leur confort. Des copeaux pressés sont disposés dans la cage, et un igloo ou hutte transparente colorée pour les souris, hamsters et les rats sont ajoutés, ainsi qu’une hutte transparente colorée pour les cobayes. Du foin irradié est fourni aux cobayes et des briquettes végétales et bonny bloc à ronger sont ajoutées aux rats.La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Rongeurs : 4 à 10 semaines