Procédures légères
Evaluation de l’efficacité d’un candidat médicament, le masitinib dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de son impact sur la réponse inflammatoire à l’aide d’un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 189 étant classées en souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par trois injections pour reproduire une paralysie progressive des muscles proche de la sclérose latérale amyotrophique, avec administration orale de masitinib jusqu'à 42 jours et tests moteurs hebdomadaires de force, coordination et endurance. Le porteur décrit un déficit moteur menant à des paralysies chroniques et une perte de poids, et indique qu'aucun animal ne pourra être réutilisé du fait de ces signes irréversibles. Il présente l'évaluation du masitinib comme "critique et nécessaire" pour renseigner les agences réglementaires et affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire qui conduit généralement au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par un déficit moteur puis une paralysie progressive des muscles (incapacité à marcher, manger, parler, respirer). Cette paralysie est dû à la mort progresse des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière. La SLA est la plus fréquente des maladies du neurone moteur (2.7 cas/an pour 100 000 habitants en France). Il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. Un seul traitement est approuvé en Europe, le Riluzole (Zentiva) qui ralenti modestement l’évolution fatidique de la maladie. Le besoin médical est donc urgent et critique. Le masitinib est une molécule qui un effet protecteur des neurones dans le système nerveux central et périphérique. Il actuellement est en dernière phase de développement clinique pour la SLA et la sclérose en plaque (SEP). Cette molécule a reçu la désignation de médicament orphelin dans la SLA à la fois de l’Agence Européenne du Médicament (EMA) et de la Food and Drug Administration américaine (FDA). En 2023, la FDA a validé une molécule appelée neurofilament comme marquer de l’efficacité d’un candidat médicament pour les maladies du système nerveux. Le but de ce projet est d’étudier l’impact du masitinib sur la libération de ces marqueurs comme le demande la FDA. De plus, la mise en perspective des signes cliniques et des analyses biomoléculaires effectués sur les prélèvements de sang permettra également de comprendre les mécanismes biologiques conduisant à la maladie. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la SLA, SEP, la maladie de Huntington (HD),…. L’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques : déficit moteur lié à la mort progressive des cellules nerveuses - Les mécanismes biologiques impliqués (comme l’inflammation) qui conduisent à la mort des motoneurones - Les marqueurs de la maladie tels que les neurofilaments demandés par les agences règlementaires.
Bénéfices attendus
Le masitinib est actuellement à la fin de sa phase de développement clinique dans plusieurs pathologies neurodégénératives dont la SLA, la SEP et la maladie d’Alzheimer. Il a d’ores et déjà reçu la désignation de médicament orphelin pour la SLA à la fois de l’EMA et de la FDA. En 2023, la FDA a validé l’application d’une molécule appelée neurofilament comme marqueurs des pathologies neuro-dégénératives. Ce marqueur est un point de terminaison nécessaire aux développements d’un candidat médicament. Il est donc aujourd’hui critique et nécessaire d’évaluer l’impact des nouvelles thérapies, dont le masitinib, sur le taux de neurofilament dans des modèles précliniques dédié à la SEP et la SLA. Les résultats de ce projet permettront donc de renseigner les agences réglementaires et ainsi d’accélérer la mise à disposition du masitinib aux patients, avant même l’achèvement des études cliniques en cours. Le masitinib pourrait ainsi devenir la première molécule thérapeutique dans le traitement de la SLA. Par ailleurs, la mise en perspective des modifications des signes cliniques avec les analyses biologiques des échantillons de sang permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule et potentiellement d’étendre son utilisation à d’autres pathologies (Parkinson et Huntington) qui partagent les mêmes marqueurs et certains mécanismes biologiques.
Procédures
Le modèle utilisé consiste à induire les signes cliniques en stimulant le système immunitaire. L’induction de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est effectuée en 3 injections : 1 injection en sous-cutanée et 2 injections en intrapéritonéale. Pour étudier l’action neuro-protectrice du masitinib, la molécule sera administrée par voie orale 1 fois par jour pendant au maximum 42 jours. Tout au long de la période expérimentale, les souris feront l’objet d’un suivi très étroit : - observations quotidiennes. - Enregistrement du poids et les observations cliniques au minimum 3 fois/semaine - Evaluation des capacités motrices (force, coordination, endurance) 1 fois par semaine Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au modèle EAE et les signes cliniques associés: - L’induction se fait par une injection d’un produit qui peut être irritant. En effet, le produit injecté induit une réaction inflammatoire désiré sur le même principe que la vaccination. Cette réaction peut générer une douleur modérée et transitoire (
Devenir
Le modèle d’EAE utilisé reproduit chez l’animal les signes cliniques de la SLA. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé en raison de ces signes sévères, irréversibles et inévitables. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le masitinib est actuellement en phase final de développement clinique et a donc été caractérisé de manière très précise par des études préalables. Pourtant, aucune de ces études vitro ou ex-vivo n’a pu permettre d’étudier les liens entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. En effet, les maladies neurodégénératives comme la SLA sont des maladies multifactorielles et complexes. Ces maladies ne peuvent être réduites à une simple mutation ou à un simple mécanisme dans des cellules isolées. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Analyser les paramètres biologiques tels que la réponse immunitaire, l’accès de la molécule au cerveau, l’évolution des marqueurs au cours du traitement comme le demande les agences règlementaires (FDA). •Valider l’effet du médicament sur les signes cliniques et donc confirmer le mécanisme d’action à l’échelle moléculaire.
Réduction
Le candidat médicament testé est le masitinib qui est actuellement en phase final de développement clinique. La toxicité de la molécule et les schémas de traitement sont donc parfaitement maîtrisés. Le nombre d’animaux utilisé sera donc réduit au strict minimum pour répondre à la problématique du projet. Le nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement sur la base d’une méthode validé et consensuelle de façon à n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les laboratoires de recherche privés.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les souris sont suivies quotidiennement, leur poids sera enregistré et les observations cliniques seront évaluées 3 fois par semaine. L’EAE est un modèle très utilisé et très bien décrit. Dans la majorité des publications, la progression de la maladie est évaluée sur la base des observations cliniques selon un scoring strict, validé et utilisé par l’ensemble de laboratoire utilisant ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes (score + poids + 2 tests de performances musculaires) pour garantir une évaluation précise, quantitative et donc objective de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et permettra conclusion étayée par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle d’EAE, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition des signes cliniques dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté l’EAE présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des pellets mouillés (disposées sur le fond de la cage) et un complément alimentaire gélifié (riche en eau et en ions) seront apportés aux animaux pour faciliter la nutrition et à l’hydratation.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE a été choisi par ce que c’est un modèle éprouvé et largement utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives tel que la SLA, sclérose en plaque (SEP) ou encore la maladie de Huntington (HD). Pour étudier le masitinib, l’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques: déficit moteur progressif menant à la paralysie des muscles - les mécanismes : inflammation du système nerveux central et périphérique qui entraîne la mort des cellules nerveuses - Les marqueurs de la maladie: neurofilament qui est désormais demandé par les agences règlementaires Le modèle d’EAE est développé et utilisé uniquement sur des souris. Ce modèle mime parfaitement la SLA et la SEP qui se développe très majoritairement chez les adultes. De plus, en termes de méthode, l’ensemble des publications indiquent qu’il faut utiliser des souris de 9-13 semaines lors de l’induction. Nous utiliserons par conséquent dans ce projet des souris adultes. Les animaux utilisés seront uniquement des femelles comme préconisé par la littérature scientifique. En effet, il existe une différence significative entre les 2 sexes. Les femelles sont beaucoup plus sensibles à l'induction que les mâles : - Le taux d’immunisation est supérieur chez la femelle que chez le mâle ce qui aura pour conséquence la réduction du nombre d’animaux dans ce projet. - Les signes cliniques sont plus marqués chez la femelle que chez le mâle, les effets seront donc plus marqué ce qui améliore la significativité des résultats.
Mécanismes de l’action anti-tumorale d’exopolysaccharides issus de probiotiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 836 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart. Elles subissent des chirurgies dont une sur anse iléale clampée, des injections de cellules cancéreuses et des gavages, avec des tumeurs sur le flanc pouvant devenir douloureuses au toucher, pour évaluer l'effet anti-tumoral de sucres issus de probiotiques associés à une immunothérapie. Le porteur reconnaît que les bénéfices des probiotiques sont très controversés et vise d'abord à publier et à valoriser un brevet. Il affirme qu'aucun système alternatif ne permet d'étudier la biodistribution de ces composants dans un organisme vivant.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet et de confirmer l’activité anti-tumorale d’une fraction purifiée d’une macromolécule composée essentiellement de sucres, issue de probiotique, chez la souris. A partir des études structurales menées sur les différentes fractions de cette macromolécule, nous avons identifié la sous-unité responsable d’une activité immunogène sur des lignées cellulaires in vitro. Il est désormais essentiel de tester cette fraction sur le modèle souris, en complément d’un traitement ciblé d’immunothérapie. Nous souhaitons ensuite apporter des éléments nouveaux concernant la biodistribution et la métabolisation des unités qui composent la paroi bactérienne, dans un organisme vivant.
Bénéfices attendus
Les effets bénéfiques d’une consommation régulière de probiotiques sur la santé sont très controversés dans la communauté scientifique. Nous souhaitons apporter une réponse claire et factuelle sur les mécanismes exactes des macromolécules composées de sucres, sur le système immunitaire et leur participation à la réponse anti-tumorale d’un traitement ciblé. L’objectif de ce travail en collaboration est, en premier lieu, de publier nos résultats sur la molécule identifiée qui fait l’objet du dépôt de brevet.
Procédures
Ce projet comprend au total cinq procédures expérimentales dont trois procédures chirurgicales. Parmi ces trois procédures, une est classée sans réveil et ne nécessite pas la reprise de conscience de l’animal. La chirurgie de l’anse iléale clampée a une durée de 15-20 min par individu. La sévérité d’une des procédures, tient compte essentiellement du développement tumoral chez le modèle murin et des effets délétères associés. Les actes chirurgicaux pour l’induction des cellules cancéreuses et l’administration du traitement sont, par leur nature, peu invasifs et très rapides ; les injections de cellules cancéreuses et l’administration du traitement sont de courte durée (
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sur les animaux tout au long du projet sont : 1) Le stress, lié à la préhension, contention et au gavage. 2) Une potentielle dégradation de l’état de santé de l’animal sous anesthésie durant la procédure opératoire. Au cours de l’intervention, l’effet des anesthésiques et de l’acte chirurgical, en lui-même, peuvent entraîner une détresse respiratoire, une bradycardie, tachycardie, une déshydratation et une hémorragie. Ces signaux physiologiques sont la traduction d’un stress thermique, d’une manifestation de la douleur, d’une défaillance de l’homéostasie. 3) Inconfort et douleur physique liés à la présence de tumeurs sur le flanc pour les animaux inclus dans l’étude probiotiques et cancer. La douleur peut se caractériser par une extrême sensibilité au toucher lors de la toilette et lors des interactions avec des congénères. Dans un environnement non adapté, c’est-à-dire avec des objets d’enrichissement plastique, l’animal peut se blesser au niveau de la zone tumorale. La douleur physique engendrera du stress, une éventuelle perte d’appétit et une absence d’activité physique (absence de déplacement et d’entretien du « nid » au sein de la cage).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour les procédures sans réveil et de sévérité légère, l’objectif final est de prélever certains organes après traitements pour des études d’histopathologie et pour la détection de nos molécules d’intérêt. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts. A la fin de l’expérience menée sur les différents traitements antitumoraux, nous ne pourrons pas maintenir les animaux en vie car la tumeur induite produira des métastases à long terme et engendrera une très forte dégradation de la qualité de vie.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre aux questions scientifiques suivantes : - Comprendre la biodistribution des composants de la paroi bactérienne des probiotiques dans l’intestin. - Evaluer les effets bénéfiques d’un régime alimentaire basé sur ces composants lors d’une immunothérapie ciblée - Comprendre le devenir de ces composant, leur transformation au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Le nombre optimal d’animaux pour chaque procédure a été longuement débattu en comité. Concernant l’expérience du modèle murin de cancer, nous avons estimé que 1536 souris au total seraient nécessaires pour mener de A à Z cette expérience. En fonction des résultats obtenus lors des premiers essais nous déciderons de la maintenir ou non. Si l’effet bénéfique de notre molécule d’intérêt sur l’immunothérapie n’est pas avéré alors nous mettrons fin à l’expérimentation. Par conséquent, le nombre total d’animaux pourrait être largement inférieur à notre estimation de départ.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est nécessaire pour le bien-être des animaux. Durant cette période et avant chaque procédure, les expérimentatrices rendront régulièrement visite aux souris pour les habituer à leur voix et aux manipulations Des exercices de simple contention de l’animal, pourront être réalisés afin de « routiniser » le geste afin de minimiser tout stress de contact. Dans le cadre du modèle murin de cancer le suivi des animaux sera renforcé car les animaux seront hébergés avec une pathologie contrôlée. L’enrichissement des cages, le nombre d’animaux par cage et les soins médicaux à fournir dépendront des signes cliniques observés. Par exemple, des dômes ou rouleaux en cartons et des pièces en coton (coton dentaire) viendront enrichir l’environnement des cages. Nous pourrons réduire de moitié les animaux par cage pour réduire les interactions intragroupes en cas de comportements agressifs et leur procurer un espace sécurisant Les animaux en attente de chirurgie seront disposés dans un endroit calme et éloigné du champ opératoire pour limiter l’anxiété. Un voilage peut recouvrir les cages en attente pour fournir une obscurité apaisante. Chaque procédure du projet sera réalisée dans un environnement calme, avec un nombre limité de personnel (2 personnes max.) dans la pièce dédiée aux expérimentation afin de ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris est le modèle de prédilection dans l’étude des interactions hôte-pathogènes au sein de la recherche médicale. Ce projet s’inscrit également dans la continuité des études publiées sur cette thématique. Une lignée de souris génétiquement modifiée est actuellement disponible pour servir de population contrôle. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront de préférence âgées de 7 semaines mais le temps d’acclimatation peut être prolongé pour travailler sur animaux âgées de 8-9 semaines. Les animaux sélectionnés seront issus d’une même fratrie afin d’éviter au maximum les comportements agressifs entre individus. La fourchette d’âge définie entre 7 à 8 semaines pour les souris a été choisie afin de travailler sur des jeunes adultes. Les premières expériences menées sur l’effet antitumoral des macromolécules de sucres, ont été réalisées sur de jeunes adultes, afin d’éviter tout biais lié à l’âge, il est essentiel de reproduire cette expérience dans les mêmes conditions afin de confirmer les résultats préliminaires. Si le nombre de semaines peut être flexible à plus ou moins 3 semaines d’écart, l’utilisation de jeunes adultes pour l’ensemble des procédures est requise pour l’ensemble du projet.
Etude des effets d’une d’irradiation sur l’évolution d’une hématopoïèse clonale.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées et greffées de moelle osseuse, elles subissent des irradiations du corps entier et locales, jusqu'à dix-sept prélèvements de sang, des gavages pour induire une mutation et des imageries cardiaques sous anesthésie, pour déterminer si de faibles doses d'irradiation favorisent leucémies et maladies cardiovasculaires. Le porteur relie ces résultats au suivi des populations exposées et à la radiothérapie, bénéfices présentés comme préalables à un essai clinique. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de modéliser ces effets à l'échelle d'un organisme entier et complexe.
Objectifs
Les cellules souches à l’origine de l’ensemble des cellules du sang sont localisées dans la moelle osseuse. La présence d’une modification de l’ADN (mutation) dans ces cellules souches peut aboutir à la production d’un ensemble de cellules mutées, appelé clone, détectable dans le sang sans pathologie associée. On parle alors d’hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé. Chez l’humain, cette anomalie est détectable dès 30 ans et devient très fréquente avec l’âge. Chez ces individus, une fraction des globules blancs, appelés cellules myéloïdes, est pro-inflammatoire et augmente le risque de développement de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires. Notre projet a pour objectif d’étudier une des mutations les plus fréquentes associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé : la mutation du gène Tet2 (Ten-eleven-translocation 2). Cette mutation, qui conduit à la perte de fonction de la protéine, a pour conséquences une multiplication plus active des cellules souches et une augmentation de la production des cellules myéloïdes. De plus, l’exposition à une inflammation chronique favorise l’expansion de ces clones mutés et leur évolution en cancers du sang ou en maladies cardiovasculaires. L’exposition à de faibles doses d’irradiation pouvant provoquer une inflammation chronique, notre projet vise à déterminer si une irradiation à faible dose peut favoriser l’apparition d’une leucémie et/ou d’anomalies cardiovasculaires dans un organisme présentant une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2. Cette recherche permettra de déterminer si cette mutation augmente les risques sanitaires pour les populations exposées à de faibles doses d’irradiation (travailleurs du nucléaire ou professions médicales) et d’identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin transgénique dans lequel le gène Tet2 est inactivable dans une fraction de cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques de façon contrôlée après traitement médicamenteux et donc de mimer une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2.
Bénéfices attendus
Les objectifs sont ici de déterminer si, et à quelle(s) dose(s), l’irradiation corps entier d’un individu porteur de la mutation du gène TET2, de type hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé, augmente les risques de survenue de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires, et identifier les mécanismes impliqués dans un modèle murin transgénique porteur de la mutation du gène Tet2. Les résultats de cette étude pré-clinique sont nécessaires pour envisager l’initiation d’un essai clinique chez l’humain. La recherche de mutations associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé dans le sang pourrait être un paramètre important à prendre en compte : 1) dans le suivi médical des populations exposées à des doses faibles/modérées d’irradiation, notamment dans un cadre professionnel ; 2) pour la personnalisation des traitements des patients porteurs de cancers et traités par radiothérapie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - identification des animaux de génotype d’intérêt (1fois - 30 secondes) ; - des irradiations locales (2 fois – maximum 10 minutes sur animaux anesthésiés) - des irradiations corps entier (3 fois - maximum 15 minutes sur animaux vigiles) ; - prélèvements de sang (un maximum de 17 prélèvements/animal – 2 minutes par prélevement) ; - injections pour l’anesthésie des animaux avant les irradiations locales (2 fois - 2 minutes/animal) ; injection pour la transplantation des cellules de moelle osseuse nécessaire pour établir le modèle murin transgénique (1 fois -2 minutes) - gavage avec un médicament permettant d’induire la mutation du gène Tet2 (5 fois - 2 minutes) - anesthésie gazeuse (4 fois maximum - 30 minutes/animal), rasage/dépilation (4 fois maximum– 4 minutes/animal) pour les imageries du cœur par écho-doppler
Impact sur les animaux
L’irradiation corps entier sera susceptible de générer un stress, en raison de la contrainte physique de l’animal dans un compartiment de la boîte à irradiation, des transports allers-retours à l’irradiateur et pour les imageries écho-doppler et les anesthésies permettant la répétition de ces analyses au cours du temps. L’injection de cellules de moelle osseuse, la section de l’extrémité de la queue pour le génotypage, les prélèvements de sang pourront induire une douleur brève. Une altération physique et du comportement sont possibles en cas d’apparition de leucémies ou d’anomalies cardiaques.
Devenir
A l’issue des expériences, tous les animaux seront euthanasiés et les organes, notamment le cœur, la moelle osseuse et la rate seront collectés à des fins d’études histologiques, cellulaires et/ou moléculaires. Ces analyses sont nécessaires pour caractériser de manière la plus complète possible les effets différentiels de l’irradiation sur le groupe contrôle et sur le groupe de souris transgéniques.
Remplacement
L’objectif même de notre projet étant d’étudier les effets physiopathologiques d’une irradiation corps entier à faible dose, il n’existe actuellement aucune méthode de substitution à l’utilisation d’animaux vivants permettant de modéliser ce type d’effet à l’échelle d’un organisme entier et complexe. D’autres modèles murins, dans lesquels le gène que nous étudions est inactivé soit dans toutes les cellules de l’animal soit dans toutes les cellules hématopoïétiques, ont montré des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles observées chez l’humain. Ces travaux justifient l’utilisation de souris transgéniques pour répondre aux questions scientifiques décrites dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum mais doit être suffisant pour prendre en compte la possibilité, bien que peu fréquente, d’absence de transplantation efficace des cellules de moelle osseuse (prise de greffe). Les données issues d’expériences précédentes et la bibliographie montrent que 6 animaux par groupe contrôle et 12 animaux par groupe test sont nécessaires pour réaliser les analyses statistiques et s’assurer d’une différence significative entre les différents groupes. De plus, pour une même condition, 2 expériences indépendantes doivent être réalisées pour s’assurer de la robustesse des conclusions scientifiques établies à partir des résultats. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet pourra également être réduit en fonction des résultats obtenus lors des toutes premières expériences. Ainsi, le nombre de dose d’irradiations corps à tester pourra être revu à moins des 5 maximum estimées.
Raffinement
Afin de favoriser le bien-être animal, les animaux seront hébergés en groupe selon la règlementation en vigueur dans un environnement enrichi composé de tunnels en carton et de boules de coton. Les irradiations locales et les analyses par échographie sont réalisées sous anesthésie générale. L'évaluation de la souffrance éventuelle des animaux est basée sur l'observation quotidienne, par le personnel animalier ou l’expérimentateur, des signes cliniques (aspect, comportement spontané, comportement alimentaire, comportement dans le groupe social). En cas de douleur, une analgésie adaptée sera mise en place après concertation avec le vétérinaire. Si à tout moment de l’étude, les animaux présentent des signes d’affaiblissement, une cupule d’aliment riche gélifié sera placée au fond de la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation et réhydrater les animaux. Dans un cas extrême de déshydratation, a priori très peu probable dans le cas de cette étude, les animaux pourront être traités avec des injections sous cutanées de liquide physiologique. Des points limites précoces ont été définis.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier le système de production des cellules du sang. En effet, ce modèle présente des similarités physiologiques et génétiques avec l’humain, et permet l’obtention de lignées transgéniques pour cibler un ou plusieurs gènes d’intérêt, et dont l’activation ou l’invalidation peut être réalisée de façon contrôlée (par traitement médicamenteux des animaux), cette dernière caractéristique étant cruciale pour notre projet. De plus, l’utilisation de lignées de souris exprimant exclusivement certains marqueurs à la surface des cellules hématopoïétiques nous permettra d’étudier parallèlement, après transplantation, les cellules donneuses et receveuses. Pour ce projet, nous utiliserons des animaux âgés de plus de 8 semaines, considérés comme adultes et avec une hématopoïèse stable.
Elevage de chiots sans anticorps contre Bordetella bronchiseptica et Parainfluenza virus canine (CPiV).
- Recherche appliquée
- Maladies animales
350 chiens Beagle vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis versés dans d'autres procédures expérimentales. Les chiots, élevés à l'écart de tout contact pour rester dépourvus d'anticorps contre deux agents de la toux de chenil, subissent des prises de sang, des écouvillons nasaux et des traitements antibiotiques, et sont parfois sevrés dès cinq semaines, deux à trois semaines avant les standards du site. Le projet vise à fournir des chiots à un client pour le développement de vaccins. Le porteur affirme que le chien est l'espèce cible du vaccin et qu'il n'existe pas de méthode de remplacement, sans détailler d'alternative.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'élever des chiots Beagle mâles et femelles exempts d’anticorps de Bordetella bronchiseptica, et, en fonction des besoins, de Parainfluenza virus canin (CPiV), de l’âge de 6 semaines à 4 mois environ, reposant sur des mesures d’isolement par rapport à l’environnement et d’antibiothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de chiots qui pourront être utilisés pour le développement de nouveaux vaccins contre la trachéobronchite infectieuse du chien (ou toux de chenil) en ciblant Bordetella bronchiseptica et/ou le virus parainfluenza canin (CPIV) avec un vaccin monovalent ou bivalent. La nouvelle génération de vaccins qui sera développés permettra de proposer une alternative en cas de rupture de stock d’un vaccin actuellement commercialisé ou d’éviter les effets indésirables reconnus sur un autre vaccin également sur le marché. Ainsi les chiens seront mieux protégés contre ces maladies.
Procédures
Les interventions suivantes seront rtéalisées : - prélèvements sur animaux vigils : 1 à 3 prélèvements sanguins pour la réalisation de l’analyse sérologique et 1 à 3 prélèvements par écouvillons nasaux pour l’analyse bactériologique (culture et/ou PCR). - administration de traitement commercialisés par voie orale (antibiotique adapté et de probiotique) pendant 7 à 14 jours, selon les recommendations du fabricant, à 2 ou 3 reprises.
Impact sur les animaux
Il n’y a aucune administration de produit d’essai. Les seules nuisances attendues sont celles liées aux prélèvements des animaux (écouvillon nasal et prélèvement sanguin). Les animaux subissent donc une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l'écouvillon dans la narine, ou de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction. Bien que le fabricant n’ait jamais testé la toxicité des traitements antibiotiques administrés sur les femelles gestantes, le retour d’expérience montre qu’il n’y a pas d’effet materno-fœtal. Pour que les animaux puissent être inclus dans une autre procédure dès l’âge de 6 semaines, il est parfois nécessaire de réaliser le sevrage des chiots de ce projet autour de 5 semaines soit 2 à 3 semaines plus tôt que les standards du site.
Devenir
A l’issue de la seule procédure expérimentale de ce projet, la majorité des chiots seront inclus immédiatement dans une autre procédure expérimentale répondant aux besoins du Donneur d'Ordre initial. Les mères et les chiots surnuméraires retourneront dans le circuit traditionnel de l’élevage et seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour le type de test pour lesquels ils sont élevés.
Réduction
Le nombre d’animaux élevés pour ce projet correspond au minimum nécessaire pour répondre aux besoins du Donneur d’ordre lors de chacune de ces demandes. Les femelles sont sélectionnées en fonction de leur date de chaleurs et ne sont incluses dans ce projet que lorsque la gestation est confirmée par échographie avec une date de mise bas et un nombre de chiots prévus correspondant à la demande du Donneur d’Ordre, selon son cahier des charges. Les chiots surnuméraires (fonction du nombre d’animaux par portée) sont placés dans le circuit d’élevage traditionnel du site. Ces chiots supplémentaires sont inévitables car souvent un sexe ratio 50/50 est demandé par le Donneur d’Ordre pour l’étude suivante et cela permet également d’écarter les chiots avec des taux d’anticorps maternels trop importants ou avec une courbe de croissance trop faible.
Raffinement
Les conditions d'hébergement sont adaptées à l'âge des animaux avec l’enrichissement classique d’une maternité ou post-maternité (plateforme, tunnel, jouet suspendu). Le bâtiment est dédié à ce projet et isolé du milieu extérieur : le personnel effectue un changement complet de tenus et les chiots ne sont pas vaccinés contre les valences ciblées (Bordetella et CPiV). Dans la mesure du possible, les soins à ces animaux sont réalisés par du personnel qui n’est pas affecté à la maternité classique du site, de manière à limiter les risques de transmission, soit d’anticorps vaccinaux, soit d’antigènes « sauvages ». Les chiots sont sevrés entre 5 et 9 semaines selon l’âge de livraison souhaité. Le sevrage « précoce » entre 5 et 7 semaines est suivi de très près par le personnel et n’est envisagé que si les chiots sont capables de s’alimenter avec des aliments solides et que la transition s’est faite par le biais de pâtée spécifique, croquettes humidifiées avec du lait etc…. Le retour sur ces portées avec un nursing intensif est très positif car la majorité des chiots ont une prise pondérale tout à fait satisfaisante. Tout au long de la procédure, les animaux ont accès à volonté à l'eau et à une nourriture adaptée à leur âge. Les prélèvements sanguins sont réalisés par des personnes compétentes avec du matériel adapté pour les jeunes chiots si nécessaire. Les volumes prélevés et les doses administrées respectent les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du vaccin en développement dans les études pour lesquels il est produit. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type de développement. Les femelles reproductrices seront sélectionnées par rapport à leur date de mise bas prévue, par échographie, afin que les chiots naissent tous à 2 semaines d’intervalles maximum. Les chiots issus de ces lots seront fournis à l'âge de 6 semaines à 4 mois.
Etude longitudinale de l’administration chronique d’un activateur d’ANO1 dans Un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 32 d'entre elles. Le modèle repose sur des souris atteintes de mucoviscidose qui naissent en sous-poids et dont environ 30 % meurent au sevrage d'occlusions intestinales, part que le porteur intègre au protocole, les autres recevant jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées sur douze mois. L'objectif est de tester une approche par ARN pour les patients sans traitement, le bénéfice restant à démontrer. Le porteur affirme qu'il faut passer par un organisme vivant entier portant la même mutation et qualifie le modèle murin d'incontournable.
Objectifs
L’objectif de ce projet a pour but de valider une approche thérapeutique basée sur les ARN dans le but de trouver un nouveau médicament pour les patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de cette étude, nous voulons montrer le bénéfice que pourrait apporter notre approche thérapeutique sur la survie des souris qui normalement meurent au moment du sevrage. D’autres paramètres importants seront étudiés comme la prise de poids. Ces données seront importantes pour, à terme, proposer cette nouvelle stratégie à des patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.
Procédures
Les souris homozygotes ont un caractère dommageable et naissent avec un poids plus faible que des souris hétérozygotes ou sauvages avec une mortalité de l’ordre de 30 pour cent qui fait partie intégrante du modèle. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu (12 mois) ou avant en cas de point limite. Les interventions effectuées sur les souris seront : - Prélèvement d'un échantillon caudal de 2mm pour le génotypage sur animal vigile avant J11 (moins de 1 minute par souris), - Prises de poids régulières (moins de 1 minute par souris), - Injections sous-cutanées sur animaux vigiles à J11 et J18 après la naissance puis tous les 15 jours jusqu’à l’euthanasie de l’animal soient 25 injections maximum pour 12 mois (moins de 1 minute par souris).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées ont à la naissance un poids inférieur et la prise de poids peut être réduite par rapport aux souris hétérozygotes ou sauvages ce qui les rend particulièrement fragiles. Les animaux seront susceptibles de ressentir une douleur de courte durée à la suite du prélèvement d’un petit bout de tissus caudal en vue du génotypage nécessaire. Les animaux homozygotes avec un phénotype dommageable ont une mortalité qui apparaît au moment du sevrage provoquée par des occlusions intestinales. Une fois que ces souris ont passé le sevrage, elles demeurent fragiles et la prise de poids est un élément déterminant dans la survie de ce modèle. Les nuisances que l'on peut attendre dans ce projet sont liées à la manipulation des souris lors de l'injection en sous-cutanée. La contention et la piqûre vont induire un stress à l'animal. L'utilisation des oligonucléotides en sous-cutanée de manière répétée peut provoquer une inflammation locale qui peut être palliée en changeant le site de l’injection. Dans d’autres études avec des oligonucléotides, il a été observé une toxicité hépatique que nous n’avons pas retrouvée dans nos études précédentes sur un autre modèle murin en utilisant la même approche.
Devenir
A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer une analyse des principaux organes (poumon, foie, reins, intestins, cœur, pancréas, testicules, ovaires).
Remplacement
Dans la pathologie de la mucoviscidose, les modèles les plus utilisés sont des cellules issues de patients. Ces cellules peuvent être cultivées de différentes façons mais ne permettent pas de rendre compte des effets des molécules sur la toxicité et l’efficacité des molécules testées. De plus ces modèles ne miment pas les effets dans un organe ou dans un animal vivant. Les souris atteintes de mucoviscidose possèdent des caractéristiques physiologiques similaires à celles des humains, en particulier en ce qui concerne les atteintes respiratoires et intestinales. Avant de commencer ce projet, nous avons montré que notre molécule était active et n’était pas toxique sur des lignées cellulaires, mais également sur des cellules issues de patients. Afin de valider une approche thérapeutique potentielle pour les patients atteints de mucoviscidose, nous devons passer par un organisme vivant entier et qui possède la même mutation que les patients. Le modèle murin est le modèle le plus souvent utilisé dans les recherches sur la maladie de la mucoviscidose. En utilisant le modèle murin, nous pouvons étudier la mucoviscidose à différents niveaux, allant de la biologie moléculaire à la physiologie des organes. Cela permet aux chercheurs de mieux comprendre la maladie et de développer de nouveaux traitements. Ce modèle se révèle incontournable pour étudier les effets d’une molécule pouvant traiter la maladie.
Réduction
Nous utiliserons le minimum de souris qui nous permettra d’obtenir des données statistiques fiables et de valider ou non nos résultats obtenus sur des cellules isolées. Pour la détermination du nombre minimal de souris requis, nous nous appuierons sur les standards utilisés pour ce genre d'études. En tenant compte de la mortalité lié au modèle, nous avons prévu de produire 32 souris homozygotes (24 seront traitées et nous estimons à 8 souris qui décéderont avant le traitement) et nous arrêterons le projet dès ce nombre atteint. Pour produire ces 32 souris homozygotes nous devrons produire 96 souris hétérozygotes et sauvages à l'aide de 8 fondateurs. Une étude de fertilité sera également effectuée, ce qui implique la production supplémentaire de 40 animaux. Au total ce projet implique donc 176 souris.
Raffinement
Les animaux sont élevés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès permanent à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Une prise de poids régulière, mesurée 3 fois par semaine les deux premières semaines puis toutes les deux semaines et une grille d’évaluation comportementale seront effectuées avant le début de la procédure expérimentale. Des croquettes humides ou l’utilisation d’un gel enrichi seront ajoutées dans les premières semaines, car les souris atteintes de mucoviscidose présentent une taille et un poids inférieur aux souris normales ce qui peut limiter l’accès à la nourriture et à l’eau. Une perte de 15 pour cent du poids des souris atteintes de mucoviscidoses entraînant l’euthanasie de l’animal. Une absence ou une perte de prise de poids des souriceaux entrainera l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle murin proposé pour cette étude est le modèle de référence dans le cadre de la pathologie de la mucoviscidose pour mimer au mieux ce qui est observé chez l’homme. Ce modèle murin est intéressant pour cette pathologie, car il reproduit les atteintes que l’on retrouve chez les patients qui ne sont pas traités. Nous retrouvons une atteinte qui va toucher de nombreux organes comme le système gastro-intestinal, les os, les organes reproducteurs ainsi que les dents. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une molécule sur le modèle murin sur ces différentes atteintes et de voir l’amélioration de la survie induite. Les souris seront traitées précocement à J11 et J18 avant le sevrage qui est une étape critique des souris atteintes de mucoviscidose. Ensuite les souris seront traitées tous les 15 jours.
Etude préliminaire des effets systémiques d’une administration de Denosumab chez une femelle babouin olive
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
1 femelle babouin va être utilisée dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis maintenue en vie. Elle reçoit une injection sous-cutanée de Denosumab et trois prélèvements de sang sous anesthésie, à un mois d'intervalle, pour une étude pilote des effets de ce médicament de l'ostéoporose sur la fonction reproductrice femelle. Le porteur justifie le recours au primate par le fait que le modèle souris ne refléterait pas la signalisation en cause chez l'humain, et retient le babouin parce que son cycle est visible extérieurement. Il présente ce seul animal comme suffisant pour orienter des recherches ultérieures, sans test statistique.
Objectifs
Dans le squelette, certaine cellules osseuses expriment une protéine RANKL qui se lie et active un récepteur spécifique RANK. L’intéraction RANKL-RANK est contrôlée par un récepteur qui inhibe l’activation de RANK. Le système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur de l'apoptose et de la prolifération des cellules germinales, de la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que ce système est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Chez les femmes suivant un traitement de fertilité, le RANKL était présent dans le liquide folliculaire et les niveaux de RANKL étaient liés au nombre de follicules matures et à la concentration des niveaux d’hormone anti-müllerienne (AMH). Les effets possibles du RANKL sur la fonction de reproduction peuvent avoir une importance clinique immédiate, étant donné que le Denosumab, un inhibiteur du RANKL, est un médicament existant et actuellement utilisé pour le traitement de l'ostéoporose. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'homme et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'homme. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. L'analyse de la séquence protéique du site cible du denosumab indique qu’il devrait être actif chez les babouins. En outre, en raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la fonction de reproduction chez la femme. Ainsi, les babouins peuvent constituer un modèle pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction de reproduction afin d'essayer d'extrapoler ces effets à l'homme. Ce projet est une étude pilote permettant de valider l’espèce babouin (papio anubis) en tant que modèe pour étudier les effets du traitement Denosumab sur la reproduction féminine.
Bénéfices attendus
L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de reproduction assistée (TRA). Ce traitement est couronné de succès dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de ptoentiels effets secondaires chez la mère. De nouveaux traitements sont donc nécessaires pour lutter contre l'infertilité. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le denosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose, et la régulation du RANKL peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les modèles murins ne sont que peu transposables à la condition humaine en ce qui concerne le rôle de RANKL dans la fonction de reproduction, d'où la nécessité d'un nouveau modèle. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur l'applicabilité des babouins en tant qu'organismes modèles pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction reproductrice féminine. Cela guidera par la suite le cadre et la structure des recherches à venir.
Procédures
La femelle babouin olive sera soumise à une injection sous-cutanée et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie. Il y aura donc 3 anesthésies à 1 mois d'intervalle environ. Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 30 minutes maximum, le prélèvement devrait durer moins de 5 minutes (volume collecté de 12 mL).
Impact sur les animaux
Stress lors de la capture. Anesthésie. Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 5 fois la dose administrée).
Devenir
L'animal sera maintenu en vie car les prélèvements ne sont pas invasifs ni douloureux.
Remplacement
Le denosumab est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques, une étude in vivo est donc nécessaire pour étudier ses effets sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.
Réduction
Le médicament utilisé dans l'étude, le Denosumab, est un anticorps monoclonal humain qui se lie à la protéine humaine RANKL, et son efficacité n'a pas encore été testée chez les babouins. Tout d'abord, afin d'examiner la probabilité de la liaison Denosumab-RANKL, l'homologie de la séquence RANKL entre humains et babouins a été évaluée par une analyse d'alignement de la séquence protéique. Le site cible du Denosumab est homologue entre les deux espèces, ce qui suggère que le Denosumab peut inhiber l'activité du RANKL chez les babouins. La présente étude est une étude pilote, dans laquelle un seul babouin sera injecté. L'étude pilote fournira des connaissances précieuses sur l'effet du Denosumab chez les babouins et guidera la mise en place et la conception d'études futures, minimisant ainsi l'utilisation d'animaux. En outre, pour réduire le nombre d'animaux, le babouin injecté servira de contrôle. L'effet du Denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection. On s'attend à ce que les marqueurs osseux soient fortement affectés par le traitement au Denosumab. Par conséquent, l'analyse d'un seul animal devrait être suffisante pour confirmer un effet clinique du denosumab chez les babouins. Aucun test statistique ne sera effectué. En outre, les échantillons de sang pourront être utilisés pour mesurer d'autres hormones d'intérêt telles que l'hormone anti-mullerienne et l'inhibine B, et donner ainsi une indication du nombre d'animaux nécessaires pour les études futures.
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie (fléchage). Les prélèvements de lait seront réalisés sous anesthésie chimique : les animaux seront sédatés par injection intramusculaire. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, la femelle sera réveillée dans sa loge d’origine et réintroduite dans son groupe dès qu’elle est suffisament réveillée, selon la procédure validée par la structure du bien-être animal.
Choix des espèces
Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'homme et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'homme. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. On sait que les marqueurs osseux sont affectés chez le macaque cynomolgus après injection de denosumab. Cependant cette espèce ne constitue pas forcément le modèle de choix dans le cadre de ce projet. En effet, ce protocole nécessite l'identification précise des stades du cycle reproductif afin d'effectuer l'injection et les prélèvements à des temps précis. Le suivi des cycles n'est possible chez le cynomolgus que par suivi hormonal (dosage sanguin) ou par frottis, ce qui nécessiterait des manipulations invasives et fréquentes. En revanche, le stade du cycle œstral peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale. En outre, en raison de leur taille et leur similarité anatomique et physiologique avec l'Homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la fonction de reproduction chez la femme. L'analyse de la séquence protéique du site cible du denosumab indique que le denosumab devrait être actif chez les babouins. . Ainsi, les babouins peuvent constituer un modèle pour étudier les effets du traitement au Denosumab sur la fonction de reproduction afin d'essayer d'extrapoler ces effets à l'homme. Le but de ce projet est d’étudier le rôle du RANKL dans la fonction reproductive féminine. L’animal sélectionné doit donc être une femelle mâture sexuellement et dans l’âge fertile/reproductif soit approximativement entre 6 ans et 25 ans.
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation du thorax entier chez la souris avec déplétion des cellules club par le naphtalène (NA)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
820 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 500 d'entre elles. Elles reçoivent une irradiation du thorax entier à 20 Gy sous anesthésie et des injections répétées de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, et sont gardées jusqu'à six mois, pour étudier la réponse de l'épithélium bronchiolique à la radiothérapie. Le porteur indique que cette irradiation entraîne à elle seule la mort de 35 % des animaux sur six mois et des difficultés respiratoires, l'absence des cellules ciblées pouvant aggraver les lésions. Il conclut que la réponse du tissu pulmonaire ne peut être appréhendée qu'in vivo, dans un système biologique intégré.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral mais également la qualité de vie des patients. La radiothérapie est très efficace mais génère néanmoins des séquelles. La réponse pulmonaire à la radiothérapie fait l’objet de publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages de type inflammatoire ou fibreux post-irradiation. En revanche, très peu de données existent sur la réponse de l’épithélium bronchiolique. Lors d’un projet précédent, nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans le développement de la fibrose au niveau du poumon. Les cellules club sont situées sur l’épithélium bronchiolique et sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Elles sont également des cellules capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. Cette protection passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une substance particulière, l’utéroglobine. Une diminution de cette sécrétion ou une modification génétique impactant les gènes codant pour celle-ci ont été associés au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique. L’objectif du présent projet est donc d’utiliser un modèle dans lequel les cellules club sont éliminées afin de déterminer l’impact de ces cellules sur le développement des lésions pulmonaires après irradiation du thorax entier chez la souris. Cela est possible, de façon transitoire, par injection de naphtalène qui toxique pour les cellules club. Ce modèle, très utilisé, ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux. L’élimination des cellules club maintenue dans le temps peut être obtenue en répétant les injections tous les 3 à 4 jours. Une expérimentation préalable sera effectuée afin d’évaluer la toxicité éventuelle de ces injections répétées. Deux lignées de souris seront utilisées car elles ont des spécificités en lien avec le développement de lésions pulmonaires. Comparer ces deux lignées de souris pourrait nous permettre de comprendre quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution des dommages pulmonaire depuis l’inflammation vers la fibrose, une notion importante dans la gestion clinique des séquelles des radiothérapies thoraciques.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Selon les procédures et lots : • Irradiation 20 Gy, sous anesthésie (durée 10 min) • Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée) jusqu’à 1 injection tous les 3 ou 4 jours pendant 4 semaines (soit 16 injections maximum) • Injections répétées de naphtalène/véhicule, 1 injection/semaine/4 semaines, sur animal vigile • Scanner sous anesthésie (8 min, max 3 fois) • Les animaux sont gardés au maximum 6 mois.
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation du thorax entier sur un irradiateur de type médical à une dose unique de 20 Gy entraine une mortalité de 35% des animaux sur une période de 6 mois. On peut s’attendre à une mortalité comparable suite à une irradiation sur un irradiateur guidé par l’image. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Les effets cliniques de l’irradiation thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une injection unique de naphtalène n’a pas d’effet clinique notable. Les injections répétées de naphtalène peuvent générer de la fibrose péribronchique en 14 semaines, nous prévoyons d’injecter pendant 4 semaines seulement. Une expérimentation dédiée sera réalisée. La procédure complète ne sera mise en place que si cette expérimentation préalable ne démontre pas d’effet toxique notable.
Devenir
La collecte d’organes pour les analyses ultérieures (histologie, analyse génétique) nécessite l’euthanasie des animaux. Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 10 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement). Les souris sont suivies régulièrement et tout signe d’atteinte importante du bien-être animal (amaigrissement, immobilité, déshydratation importante, signes de détresse ou douleur, incapacité à se redresser lors du test de redressement) entrainera l’euthanasie anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Effet d’un probiotique et d’un postbiotique sur la santé, le microbiote, l’immunocompétence, le métabolisme et la croissance chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
320 poulets de chair vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 88 tués pour prélèvements d'organes et 232 relâchés avec leurs congénères. Les poulets subissent des prises de sang à la veine de l'aile à vingt et un puis trente-cinq jours, pour évaluer l'effet d'un probiotique et d'un postbiotique sur leur croissance et leur microbiote en élevage conventionnel. Le porteur relie ces travaux à une réduction des intrants pharmaceutiques et à une amélioration du bien-être des animaux non-humains, bénéfices renvoyés au court et au long terme. Il affirme que l'espèce aviaire ne peut être remplacée par un modèle in vitro ou in silico pour rester représentatif des conditions d'élevage.
Objectifs
En élevage de poulet de chair, la santé intestinale est un élément clé du bien-être et des performances des animaux, et notamment de leur capacité à valoriser au mieux les nutriments. Les produits issus de fermentation comme les probiotiques (bactéries bénéfiques vivantes) et les postbiotiques (bactéries bénéfiques non viables et/ou leurs métabolites) ont montré des potentiels intéressants afin d’améliorer la santé intestinale et la valorisation alimentaire. Leurs modes d’action reposent beaucoup en théorie sur leurs interactions avec le microbiote et l’épithélium intestinal, mais ils restent en réalité mal documentés. Par ailleurs, l’évaluation en condition terrain est très peu documentée, or il a été montré une forte différence entre les microbiotes intestinaux de volailles élevées en fermes de celles élevées en station expérimentales. L’objectif du projet est d’évaluer les effets et d’investiguer les modes d’actions de probiotiques et de postbiotiques issus de lactobacilles chez le poulet de chair en condition d’élevage conventionnel. L’utilisation de ces derniers ayant montré la capacité à promouvoir la croissance de poulets de chair.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour enjeu l’amélioration de la santé des poulets en élevage par l’utilisations de solutions naturelles (probiotiques, postbiotiques), avec à la clé une réduction des intrants pharmaceutiques et une amélioration du bien-être des animaux. A l’issue du projet et à relativement court terme, l’identification des modes d’action des pro- et postbiotiques permettra de les utiliser de façon optimisée. D’un point de vue théorique, nous comprendrons mieux comment interagissent les probiotiques et postbiotiques avec le microbiote et le métabolisme de l’hôte dans l’élaboration des phénotypes exprimés par l’hôte (santé intestinale, croissance, immunocompétence). Après le projet, à plus long terme, l’identification de liens entre utilisation de probiotiques/postbiotiques, nutrition, santé, microbiote et immunocompétence permettra d’élaborer des stratégies d’études visant à promouvoir la santé, le bien-être et la croissance des poulets de chair.
Procédures
Une prise de sang à la veine alaire sera effectuée sur animaux vigiles, à raison de 32 animaux par groupe à 2 stades de croissance (J21 et j35). Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Un total de 320 poulets subira la procédure au cours de l’essai. Chaque prise de sang dure 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les prises de sang alaires pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes.
Devenir
A j35, 3 des 4 poulets par case des groupes T1, T2 et T3 échantillonnés pour les prises de sang seront euthanasiés afin de prélever des échantillons divers, les animaux non prélevés au cours de l’essai seront relâchés avec leurs congénères.
Remplacement
Compte-tenu de l’objectif du projet qui doit être représentatif des conditions d’élevage de poulets de chair standard, l’espèce aviaire ne peut être substituée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Concernant les mesures sanguines, l’unité statistique sera l’animal. Un nombre de 32 animaux par traitement doit permettre de mettre en évidence des différences. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives et biologiquement pertinentes en tenant compte d’expériences précédentes dans un contexte similaire (essais terrain induisant une plus grande variabilité) et de la variabilité inter-individuelle attendue pour ces observations.
Raffinement
Les poussins sont élevés en groupe suivant les caractéristiques réglementaires d’un élevage conventionnel. En-sus, le bâtiment est équipé de fenêtres transparentes permettant l’entrée d’une luminosité naturelle. Les animaux auront la possibilité d’explorer et de gratter la litière (sol en terre battue). Ils auront également à disposition des perchoirs en carton qui seront disposés dans les parquets (1 module par parquet). Ils permettront aux animaux de se percher et de picorer le carton du module. De plus, les animaux soumis à la procédure prise de sang seront surveillés le jour même et le lendemain. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite (animal prostré pendant plus de 24h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal. Les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées, notamment pour les prises de sang et euthanasies.
Choix des espèces
Notre étude vise, à terme, à promouvoir l’utilisation de solutions naturelles préventives non chimiques telles que pro- et postbiotiques chez le poulet d’élevage pour prévenir des désordres digestifs causés par les constituants des matières premières utilisées pour leur alimentation. Il est donc nécessaire d’effectuer nos expérimentations chez le poulet domestique , qui a des réponses spécifiques que nous devons prendre en compte. Les animaux seront élevés de 1 à 37j, âge classique d’abattage des poulets standards.
Travaux Pratiques de pharmacologie : étude des effets de molécules anti-hypertensives chez le rat mâle et femelle
- Enseignement supérieur
392 rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 180 réutilisés dans d'autres protocoles. Les rats reçoivent des molécules antihypertensives par voie orale, subissent des mesures répétées de pression artérielle par contention en tube et des piqûres à la queue pour la glycémie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants se destinant aux métiers de l'expérimentation animale. Les rats témoins sont tués en cours de séance pour une étude sur organe isolé, les autres à la fin. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune méthode de remplacement permettant une formation technique équivalente sur l'animal vigile.
Objectifs
Cette séance de travaux pratiques (TP) chez le rat est destinée à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. Cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : mettre en évidence les effets de différents médicaments sur le système cardiovasculaire (Pression artérielle et fréquence cardiaque chez le rat vigile - D’un point de vue éthique (raffinement) : montrer l’intérêt du renforcement positif aux étudiants en mettant en place un système de récompence chez les animaux ; mettre en pratique un système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque non invasif chez le rat - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former à la réalisation d’une administration par voie orale chez le rat ; apprendre à utiliser le système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque au niveau de l’artère caudale chez le rat ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre à nos étudiants à réaliser des expérimentations in vivo de pharmacologie. En effet, les enseignements de ce diplôme sont définis selon un programme pédagogique national. Les étudiants doivent acquérir 5 compétences durant leur formation, et notamment la compétence « mener des études à l’échelle du vivant ». En troisième année, la validation de cette compétence implique de savoir « Participer à l’évaluation de l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ». Il est également précisé que la mise en pratique de l’étude des médicaments des grandes fonctions, dont les médicaments du système cardiovasculaire, se fait in vivo et/ou in vitro. Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants seront les suivants : - consolidation de l’apprentissage de la manipulation des rats vigiles : contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque - mise en oeuvre d’une étude en pharmacologie in vivo : constitution des lots d’animaux après randomisation, identification des animaux, utilisation d’un logiciel dédié, recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence du respect du bien-être des animaux au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect des regles de bien-être animal dans ce TP.
Procédures
Les animaux pour l'entrainement à la voie orale suivront cette administration par voie orale 2 fois au maximum par animal (2 fois, car 2 séances d'entrainement par session). Les animaux du protocole expérimental seront soumis à trois interventions: 1. Injection par voie orale du véhicule ou molécules antihypertensives. L'administration par voie orale sera réalisée 2 fois maximum par animal (2 traitements car 2 séances d'étude par session). Chaque administration dure quelques secondes. 2. Mesure non invasive de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque au niveau de la veine caudale. Cette mesure sera réalisée 4 à 8 fois par animal (réparties sur 2 jours consécutifs puis 2 jours après sur 2 jours consécutifs, 1 à 2 mesures par jours). En effet il arrive que les résultast obtenus ne soient pas exploitables, si l'animal bouge par exemple lors de la prise de mesure, dans ce cas une nouvelle prise de pression artéreille est réalisée à distance de la précédente dans la même demi-journée. Chaque mesure de pression artérielle/fréquence cardiaque dure environ 2 minutes et nécessite 7 minutes d'habituation pour sytabiliser la température de mesure. 3. Mesure de la glycémie après piqure au niveau de la veine caudale. Cette intervention sera réalisée 4 fois en 4 jours par animal et durera quelques secondes à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les manipulations (contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque) génèrent du stress chez les animaux. Le prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale entraîne une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux ayant servi pour l'entraînement à la voie orale seront gardés en vie jusqu'à leur utilisation dans des protocoles hors champ, car cette procédure est légère. Pour la procédure expérimentale, les animaux du lot témoin seront mis à mort au cours des sessions de TP afin de réaliser une étude sur organe isolé. Les autres animaux seront mis à morts à la fin de chaque session. En effet, nous considérons que, bien que les gestes techniques effectués soient faiblement invasifs, le fait qu'ils soient effectués par des étudiants peut augmenter le stress des animaux. C'est pourquoi nous proposons que cette procédure soit considérée de gravité modérée. Dans ces conditions la mise à mort des animaux à la fin des séances est adaptée à la procédure. Les animaux surnumraires n'ayant pas été inclus dans l'étude pourront être utilisés pour des procédures hors champ.
Remplacement
Dans la formation de nos étudiants le programme pédagogique national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets de molécules de référence par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux. Ce TP doit permettre d’illustrer les effets de traitements des pathologies cardiovasculaires et notamment la classe des médicaments ciblant le système adrénergique . Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile, mesure de l'activité cardiovasculaire…). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et de limiter le nombre d'animaux d'entraînement ainsi que la durée de manipulation de ceux-ci, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, administration VO) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/sondes dédiées sur un support inerte.
Réduction
Ce TP aura lieu sur 2 sessions comportant chacune deux séances d'étude sur 3 jours de protocole, pour 12-15 étudiants par séance (annexes 2 et 3). Deux groupes de 15 étudiants maximum participeront à chaque session d'étude, pour un total de 52 étudiants par an. Pour chaque séance, chaque étudiant sera en charge du traitement et du suivi d’un animal. Pour chaque session, les 4 animaux témoins seront utilisés pour une séance d'étude d'organe isolé et ne seront donc pas réutilisés à la seconde séance d'étude. Les 8 à 11 animaux restant seront utilisés pour la séance d'étude suivante, avec 4 nouveaux animaux témoins (annexe 3). Le même nombre d'animaux sera utilisé pour la session suivante. Soit un total de 34 animaux + 3 animaux surnuméraires par session soit 34+3+3=40 animaux par an pour 52 étudiants et 200 animaux pour 5 ans pour 260 étudiants. A ces animaux s’ajoutent la première année les 12 animaux nécessaires à l’étude préliminaire soit 212 animaux au total. Une semaine avant la séance d'étude, les étudiants s'entraineront à la réalisation de la VO sur des rats issus du surplus d'élevage, à raison d’1 rat par étudiant. Ces rats serviront aussi pour l'apprentissage des étudiants de la seconde séance d'étude d'une même session. Ainsi pour une session de 26 étudiants en moyenne, il sera prévu 13 animaux+ 5 animaux surnuméraires, c'est-à-dire pour un an et deux sessions, un total de 26+10=36 rats par an et pour 52 étudiants. Ainsi au total sur 5 ans, 212 + (36 x 5)= 392 rats pour 260 étudiants.Ce chiffre sera bien évidemment indexé chaque année sur le nombre réel d’étudiants inscrits à notre formation. Afin de garantir une formation de qualité aux étudiants, il n’est pas possible de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois et noix à ronger). Afin de limiter le stress des animaux lors de la manipulation, mais également lors de la mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque, qui s’effectue à l’aide de tubes à contention, les animaux seront habitués à la préhension/contention et à ces mesures quotidiennement pendant la semaine précédant le début des travaux pratiques. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché, billes de céréales…). Tout animal présentant des signes de stress ou de maladie tels que: poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids tel qu'attendu à l'âge de ces animaux ne sera pas inclus dans le TP. Enfin, le site de piqure pour le prélèvement de la goutte de sang (nécessaire à l'analyse de la glycémie) sera noté pour chaque rat et modifié à chaque mesure pour limiter la sensibililté.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très souvent utilisée pour les études de pharmacologie. C'est notamment une espèce de choix pour l’étude de la fonction cardiaque, notamment en pharmacologie de sécurité. C'est donc un modèle de choix pour l'étude des effets de médicaments agissant sur la fonction cardiovasculaire. Pour voir l'effet des médicaments utilisés des animaux jeunes adultes sont couramment utilisés dans les essais de pharmacologie. Les animaux seront utilisés à deux stades différents en fonction du sexe: - 8 à 12 semaines pour les mâles - 14 à 18 semaines pour les femelles Ces stades sont choisis d'une part pour que les animaux aient un poids permettant l'utilisation des tubes de contention fournis dans le système de mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque et d'autre part afin que les mâles et femelles utilisés puissent provenir des mêmes portées de notre élevage. Quant aux animaux utilisés pour l'apprentissage de la voie orale, ils seront de tout âge (> 7 semaines) selon les disponibilités du surplus d'élevage.
Mise au point d’un dispositif expérimental externe et non-invasif pour la mesure de paramètres physiologiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes réutilisées à l'issue. Rasées et anesthésiées à plusieurs reprises, elles sont équipées d'un textile connecté porté jusqu'à vingt-quatre heures, parfois isolées, pour mettre au point un dispositif de mesure cardiorespiratoire présenté comme une alternative aux capteurs implantés par chirurgie. Le porteur reconnaît que les souris peuvent chercher à retirer le dispositif et se blesser en se grattant, que l'isolement les stresse et que le rasage provoque hypothermie et inflammation. Il affirme que des modèles 3D précèdent la phase animale mais que le recours à la souris reste un "passage obligé" pour évaluer le comportement et la tolérance.
Objectifs
Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.
Bénéfices attendus
L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.
Procédures
Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.
Impact sur les animaux
Une fois équipé du dispositif, il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène qui a été décrit avec d’autres dispositifs externes et pour d'autres espèces, peut conduire à une irritation et des lésions dues à des grattages excessifs. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.
Devenir
À l’issue de ces procédures légères, à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis, tous les animaux pourront être réutilisés dans d’autres projets, contribuant à réduire le nombre d’animaux requis à des fins scientifiques.
Remplacement
Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.
Réduction
Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.
Choix des espèces
La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.
Détermination de la toxicocinétique d’un candidat médicament en vue de son utilisation clinique dans la lutte contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 36 en gravité sévère. Elles reçoivent chaque matin pendant onze jours, par voie orale, un candidat médicament contre la maladie de Huntington à doses croissantes, avec des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour examiner leurs organes et l'atteinte du cerveau, pour mesurer la toxicité du composé. Le porteur reconnaît qu'aux fortes doses la molécule peut provoquer une toxicité et des signes d'inconfort. Il affirme que les études de toxicité sont "obligatoirement" réalisées chez l'animal et constituent une "étape indispensable" avant tout médicament.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Un candidat médicament capable de réparer l’activité des neurones humains et de souris a été identifié. Il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie de Huntington. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de la maladie de Huntington à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet : 1/ identifier les éventuels effets toxiques d’une prise répétée à différentes doses de la molécule et 2/ évaluer les effets de plusieurs doses d’administration. Cette molécule est un traitement potentiel pour la maladie de Huntington qui n’a jamais été utilisée auparavant et qui mérite d’être étudiée.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que l'administration d’une seule dose de cette molécule avait un effet thérapeutique chez les souris atteintes de maladie de Huntington sans induire de toxicité. Afin de développer un traitement pour les malades, nous allons ici étudier l’effet de cette molécule administrée en dose répétée et voir quelles sont les meilleures doses répétées pour avoir un effet thérapeutique sans toxicité.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie orale tous les matins pendant 11 jours. Ce geste, d’une durée inférieure à 10 secondes, est bien toléré par l’animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après gavage, le premier et le dernier jour du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin et n’engendrera qu’un léger stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Le traitement sera administré oralement, voie d’administration obligatoire car c’est celle qui sera utilisée chez l’homme. La contention et l’administration orale peuvent engendrer un léger stress chez l’animal. Une toxicité induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de mesurer l’atteinte du cerveau par cette molécule.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont une étape indispensable à la validation d’une molécule avant d’en envisager son utilisation comme médicament chez le patient. Notre étude permettra de documenter les éventuels effets toxiques de cette molécule et aidera à définir les doses répétées à utiliser.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons le nombre d’animaux au minimum afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 13 groupes de 4 animaux. Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations de la molécule dans le sang et pour doser les différents paramètres de toxicité. Également, cet effectif sera suffisant pour nous permettre d’écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard par des analyses statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement par gavage sera réalisé par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à préparer les études de toxicité réglementaires qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie musculaire rare, elles subissent des tests de force et de coordination, une course forcée jusqu'à l'abandon entretenue par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures et des prélèvements allant jusqu'à 15 % de leur volume sanguin, avant un test terminal sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur signale une faiblesse musculaire dès quatre mois, une angoisse modérée et des douleurs musculaires liées à la course forcée. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne suffit pas à évaluer une thérapie et qu'il faut mesurer les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.