Procédures légères

406 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent plusieurs anesthésies générales pour des prélèvements sanguins et l'administration d'un vaccin par voie buccale ou stomacale, afin de tester l'hypothèse qu'une vaccination orale contre l'hépatite B protège mieux qu'une injection dans le muscle. Le porteur indique n'attendre qu'un stress de contention et une inflammation modérée après la vaccination. Il affirme qu'aucune méthode in vitro validée ne peut remplacer l'animal et qualifie le développement de nouvelles approches vaccinales d'"indispensable".

Objectifs

L'hépatite B (HBV) est une infection due à un virus qui attaque le foie. Cela peut causer des problèmes de santé sérieux comme des cicatrices au foie ou même un type de cancer du foie. En 2019, plus de 800 000 personnes sont décédées à cause de cela. Le virus se propage généralement de la mère à l'enfant lors de la naissance ou par contact avec le sang ou d'autres liquides du corps pendant les rapports sexuels non protégés, les piqûres d'aiguilles ou le partage d'objets pointus. Il existe un vaccin pour éviter l'hépatite B. Les enfants reçoivent généralement trois doses de ce vaccin par injection dans le muscle avant d'avoir un an. Parfois, même si on a eu plusieurs doses de vaccin, certaines personnes ne sont pas protégées contre l'infection par le virus. La mise au point d’un vaccin optimisé capable de protéger durablement et effacement contre HBV s'avère être un défi qui nécessite de faire appel aux modèles animaux. Notre hypothèse est qu'une vaccination anti-HBV reposant sur une vaccination par voie buccale est supérieure à une vaccination voie musculaire. Notre objectif sera dans un premier temps de trouver des substances qui aident le vaccin à fonctionner quand il est administré par la bouche. Ensuite, nous étudierons comment la muqueuse de la bouche contribue à l'effet protecteur du vaccin. Pour réaliser ces expérimentations nous allons utiliser un total de 401 souris. Notre objectif sera de diminuer la souffrance des animaux au maximum. Il n'est pas attendu de souffrance particulière des animaux si ce n'est le stress lié à la contention et à l'inflammation modérée associée à la vaccination.. Nous utiliserons des méthodes statistiques pour réduire au minimum le nombre de souris nécessaires. De plus, nous améliorerons leur environnement en enrichissant leurs cages et en surveillant leur santé après la vaccination. L’utilisation des souris pour cette étude est nécessaire car les animaux doivent avoir un système immunitaire intègre pour produire une réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les vaccins actuels contre l’hépatite B conduisent parfois à une absence de réponse humorale, malgré un schéma vaccinal intensifié (au moins 6 doses de vaccin). Il peut même arriver qu'il n'y ait pas de protection contre l'infection par le virus, malgré une bonne réponse anticorps de l’individu. Par conséquent, le développement de nouvelles approches vaccinales est indispensable pour optimiser la vaccination contre ce virus.

Procédures

L'ensemble des animaux de cette demande d'autorisation subira deux cycles d'anesthésie générale à 14 jours d’intervalle pour la réalisation d'un prélèvement sanguin et l'administration du mélange vaccinal par voie buccale ou stomacale. Les animaux de la procédure 2 subiront tous des prélèvements sanguins sous anesthésie à J28 post-immunisation. Enfin, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Il n'est pas attendu de souffrance particulière des animaux si ce n'est le stress lié aux injections intrapéritonéales pour l'anesthésie (contention et douleur au point de piqure) et à l'inflammation modérée entre 24 et 48 heures suivant la vaccination.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.

Remplacement

Il n'existe aucune méthode in vitro scientifiquement validée ni test in vitro connu qui fournirait une alternative à l'expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène de la réponse vaccinale ne peut pas être étudié de manière adéquate in vitro, car il s'agit d'un processus complexe qui ne peut être examiné que chez l'animal, en tenant compte de l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Par conséquent, l'utilisation d'un modèle expérimental in vivo est un prérequis pour la phase de développement clinique.

Réduction

Pour toutes les procédures, nous avons déterminé le nombre d'animaux en utilisant une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison des taux d'anticorps sériques entre les différents groupes d'animaux immunisés. Le test de puissance effectué avec un logiciel spécialisé nous a permis de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses formulées.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront logés dans des cages collectives avec un environnement enrichi, comprenant des tubes en carton pour se cacher et des briques de bois à grignoter. Une période d'acclimatation d'au moins 7 jours sera observée, durant laquelle aucune intervention technique liée à la procédure expérimentale ne sera entreprise. L'anesthésie et l'administration de la formulation vaccinale seront effectuées par le personnel qualifié, et les animaux seront sous anesthésie lors des actions susceptibles de provoquer du stress ou de la douleur. Une surveillance attentive sera assurée à 24 et 48 heures après l'immunisation des animaux pour détecter tout effet secondaire inflammatoire douloureux potentiel suite à l'injection d'adjuvant. Des points limites suffisamment prédictifs et précoces seront définis dans le but de minimiser la douleur autant que possible.

Choix des espèces

L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature déjà existantes sur la vaccination des souris conte le virus de l’hépatite B. Nous travaillerons avec des animaux adultes car l’objectif est le développement d’un vaccin utilisable chez l’adulte.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Maintenues seules en cage, elles sont exposées pendant plusieurs semaines à des cycles de lumière allant jusqu'à l'éclairement permanent, un stress qui atténue leur rythme, avant le prélèvement des yeux. L'objectif est de préciser le rôle des cônes de la rétine dans la synchronisation de l'horloge biologique. Le porteur utilise des souris génétiquement modifiées dépourvues de bâtonnets et affirme que cet ensemble œil-cerveau "ne peut pas, pour le moment, être modélisé".

Objectifs

La rétine contient différents types de cellules photoréceptrices capables de répondre à la lumière, parmi lesquelles les cônes et les bâtonnets constituent le support primaire de la fonction visuelle. En plus de ceux-ci, la rétine contient des cellules ganglionnaires photosensibles (dites ipRGC) répondant à la lumière bleue et jouant un rôle majeur dans la synchronisation de l'horloge circadienne centrale localisée dans le cerveau. Cette horloge est synchronisée avec le cycle jour/nuit ambiant grâce à l'information lumineuse transmise par les ipRGC. Il est connu que les ipRGC reçoivent elles-mêmes des projections indirectes des cônes et des bâtonnets. Divers mutants dans lesquels ces différents photorécepteurs ont été invalidés, ont permis d’évaluer la réponse à la lumière de leur horloge mais le rôle particulier des cônes reste peu connu. Le but de notre projet est de tester l'importance des cônes, dans la synchronisation du système circadien. Pour cela, nous utilisons un modèle unique de souris génétiquement modifiée, dans lequel la rétine est dépourvue de bâtonnets, intégralement remplacés par des cônes et un mutant dont les ipRGC sont non photosensibles. Nous proposons d'exposer des animaux combinant ces deux mutations, ou en portant une seule, ainsi que leurs contrôles à différents protocoles d'exposition lumineuse afin d'évaluer la réponse de leur horloge, mesurée grâce aux caractéristiques de leur activité locomotrice.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier le rôle des cônes dans l'entrainement de l'horloge circadienne par la lumière. L'utilisation d'un modèle chez lequel cette population cellulaire est largement augmentée (de 3 % des photorécepteurs chez des souris contrôle à 100% sur notre modèle de souris génétiquement modifié (sans bâtonnet), permettra de plus une sensibilité de mesure de la réponse bien augmentée afin de mettre en évidence des effets qui n'avaient pas pu être mesurés chez les mutants précédemment utilisés.

Procédures

Les animaux seront en cages individuelles et leur activité locomotrice sera enregistrée en permanence grâce à des détecteurs infra-rouge placés au dessus de la cage. Ils seront exposés à des cycles de lumière obscurité spécifiques dans lesquels la durée journalière de la période lumineuse ira de 0 à 100%.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront différentes nuisances: -les mesures d'activité locomotrice ne peuvent se faire que sur des animaux en cage individuelles. -l'exposition à la lumière constante pendant plusieurs semaines constitue un stress pour l'animal, chez qui la rythmicité de l'horloge va s'atténuer.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et les yeux seront prélevés pour analyses post mortem.

Remplacement

La synchronisation de l'horloge circadienne par la lumière environnementale est un processus très intégré mettant en jeu les yeux et l'hypothalamus; cet ensemble ne peut pas, pour le moment, être modélisé.

Réduction

Le nombre d'animaux pour cette étude a été défini sur la base de nos expériences préliminaires avec des animaux de la plupart des génotypes envisagés, et à l'aide des tests statistiques approrpiés.

Raffinement

Pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement (bâtonnet de bois à ronger, tube transparent incolore) sera fourni. L'état général des animaux exposés sera évalué de façon hebdomadaire (attitude globale, état du pelage, poids). Si un animal présente des symptomes anormaux (diminution du comportement exploratoire, prostration, aspect du pelage, perte de poids) son état sera discuté avec la vétérinaire responsable de la structure et le traitement adéquat sera mis en place.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles de choix pour les études de chronobiologie et les paramètres de son comportement rythmique sont bien définis et serviront de référence dans cette étude. Seule la souris nous permet de faire cette étude à l'aide de mutations ciblées : les lignées portant ces mutations existent déjà et sont bien caractérisées. Nous utiliserons les animaux au stade de jeunes adultes (6 semaines à 4 mois) car la rétine est à ce stade entièrement différenciée et c'est celui auquel nous avons réalisé les expérimentations préliminaires qui ont permis de définir les conditions de l'étude.

1388 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Des souris nouveau-nées reçoivent des injections répétées entre le troisième et le dixième jour de vie, avec une biopsie de la queue, et leurs mères gestantes sont gavées, avant l'analyse des cerveaux post-mortem. L'objectif est de caractériser la production d'oligodendrocytes dans des modèles d'autisme et de maladie de Charcot. Le porteur affirme qu'aucune culture ne reflète cette genèse dans un "organisme entier" et que les modèles de ces maladies "n'existent que chez la souris".

Objectifs

Le projet est destiné à caractériser, au moment de la naissance, la production des oligodendrocytes c'est à dire les cellules qui synthétisent dans le système nerveux central, la myéline, une enveloppe qui s'enroule autour des prolongements des neurones et qui est indispensable au bon fonctionnement de ces derniers. Il y a quatre objectifs majeurs : 1) Caractériser le rôle des signaux transmis par une protéine - appelée Smo et connue pour être essentielle à la mise en place du système nerveux central - dans la production des oligodendrocytes; 2) Visualiser les oligodendrocytes produits par des animaux génétiquement modifiés qui vont permettre de déterminer le lieu de naissance et le lieu de migration de différentes populations d’oligodendrocytes; 3) Déterminer quand débute la production anormale des oligodendrocytes dans deux modèles animaux de maladies humaines où la myéline est altérée : l'autisme et la maladie de Charcot; 4) Déterminer l’influence des hormones sexuelles mâles sur la production des différentes populations d’oligodendrocytes, ce qui est important à évaluer puisque l’autisme atteint préférentiellement les garçons.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer à quel âge les souriceaux utilisés comme modèles de ces maladies humaines commencent à présenter une production anormale d’oligodendrocytes et si les anomalies mises en évidence portent sur la quantité de cellules produites et/ou sur leur capacité à devenir des cellules synthétisant de la myéline. L'information sera importante pour déterminer à quel moment il conviendrait de mettre en place un traitement. Par ailleurs, nous identifierons les molécules possiblement responsables des anomalies observées. Ces molécules pourront dans le futur être utilisées pour développer de nouveaux traitements pour ces maladies que l’on ne sait pas traiter efficacement pour l'instant. Nous pourrons enfin déterminer si les anomalies sont différentes chez les mâles et les femelles ce qui pourrait amener à mettre en place des traitements différents en fonction du sexe considéré.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront gavées une seule fois afin que la molécule injectée passe chez les nouveaux-nés. Le gavage dure 10 secondes. Certains nouveaux-nés recevront tous les 2 jours (entre l'âge de 3 et 10 jours après la naissance) une injection sous-cutanée de la petite molécule à tester. L'injection dure 10 secondes. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils.

Impact sur les animaux

Une douleur peut exister au niveau du site d'injection des produits à administrer et au moment de la biopsie de la queue. Un stress, une difficulté respiratoire ou une difficulté à mettre bas peuvent éventuellement être associés au gavage des souris femelles.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des 4 procédures, puisque le projet est exclusivement destiné à analyser les cerveaux post-mortem.

Remplacement

La genèse de nouvelles cellules dans l’organisme vivant ne peut être pour l’instant reflétée dans son ensemble par des cultures de cellules étant donné la complexité de ces processus qui impliquent non seulement les cellules auxquelles nous nous intéressons - les oligodendrocytes - mais aussi les autres cellules du cerveau qui communiquent entre elles en permanence. Il en est de même de la synthèse de la myéline qui est aussi un processus particulièrement complexe dépendant de plusieurs types de cellules. Néanmoins nous avons précédemment acquis des données préliminaires en utilisant des oligodendendrocytes mis en culture en présence de petites fibres de verre mimant artificiellement l’axone des neurones. Les effets des signaux identifiés dans ces cultures de cellules doivent maintenant obligatoirement être vérifiés au niveau de l'organisme entier.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en nous limitant au nombre strictement nécessaire pour déterminer l'existence de véritables différences entre les groupes d'animaux qui sont comparés. Notre expertise dans le domaine indique qu'en dessous de 6 animaux par temps analysé et pour chaque sexe, on ne peut pas apporter une conclusion définitive aux questions que nous nous posons. Des tests statistiques sont utilisés pour valider le nombre d'animaux à utiliser et ensuite pour exploiter les résultats obtenus.

Raffinement

L'étude des maladies que nous souhaitons mener nécessite parfois l'administration aux mères des souriceaux que nous allons utiliser une molécule très souvent utilisée dans ce domaine de la recherche. L'administration se fait par voie orale et ne nécessite donc aucune injection. La molécule sera transférée aux petits de façon complètement indolore via l'allaitement. Cette administration orale tout comme les injections des anesthésiques sont réalisées par du personnel qui possède une grande habileté pour effectuer ces gestes. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place.

Choix des espèces

Les modèles des maladies qui nous intéressent n'existent que chez la souris. De plus, dans cette espèce, le production des oligodendrocytes et celle de la myéline sont comparables à ce que l'on sait de ces processus chez l'humain. Les stades du développement post-natal précoce 3, 7, 10, 15, 21 et 30 jours utilisés dans le projet correspondent à des stades critiques au cours de la production des oligodendrocytes et de la myéline qui entoure les axones. Au-delà de 30 jours la production de myéline est terminée dans la grande majorité des régions du système nerveux central qui doivent être myélinisées.

1056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère alors qu'elles incluent une microchirurgie cérébrale destinée à injecter une molécule qui détruit la myéline. S'y ajoutent des injections intra-péritonéales quotidiennes pendant cinq jours, l'implantation d'une mini-pompe sous la peau ou des injections répétées, et une biopsie de la queue sur animal vigile. L'objectif est de caractériser les progéniteurs neuraux susceptibles de réparer la myéline dans la sclérose en plaques. Le porteur affirme qu'aucune culture ne reflète cette genèse cellulaire dans un "organisme entier", les molécules prometteuses ayant été présélectionnées in vitro.

Objectifs

Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides ou myéline’ qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable dans la phase évolutive de la maladie. Deux sources de cellules sont à l’origine de nouvelles cellules capables de produire la myéline, encore appelées oligodendrocytes. Ces deux sources de cellules portent le nom de progéniteurs neuraux et progéniteurs péri-lésionnels. Elles naissent dans des régions distinctes du tissu nerveux chez le rongeur et existent aussi chez l’humain. Les progéniteurs neuraux sont beaucoup moins caractérisés que les progéniteurs péri-lésionnels. Dès la naissance et jusqu’à l’âge adulte, ils naissent dans une région du cerveau que l’on appelle la zone sous-ventriculaire (ZSV). Il est donc indispensable de bien les caractériser dès leur apparition étant donné leur importance dans la réparation de la myéline détruite au cours de la SEP. Le projet comporte 3 objectifs principaux : Objectif 1 : Caractérisation des propriétés des progéniteurs neuraux dans des conditions physiologiques en comparaison de conditions de destruction de la myéline ; Objectif 2 : Etude de la production des progéniteurs neuraux chez des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas certaines protéines impliquées dans ce processus ; Objectif 3 : Activation de la production de ces progéniteurs par des molécules chimiques préalablement sélectionnées en utilisant des cultures de cellules.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’identifier quel stade de maturation des progéniteurs neuraux il serait intéressant de cibler afin de pallier un défaut de production de myéline suite à une démyélinisation pathologique. Il permettra aussi de déterminer si des molécules préalablement identifiées en utilisant des cultures cellulaires ont une activité de régénération de la myéline dans le contexte inflammatoire qui accompagne classiquement la démyélinisation du système nerveux central que ce soit dans les modèles animaux ou chez l’humain.

Procédures

1 injection intra-péritonéale sera effectuée quotidiennement pendant 5 jours avant une microchirurgie cérébrale d'une durée de 30 minutes, réalisée sous anesthésie générale afin d'injecter la molécule induisant la démyélinisation. Selon les molécules à tester, une mini-pompe sera implantée sous la peau du dos des animaux afin de délivrer les molécules pendant 15 jours ou alternativement 1 injection intramusculaire sera effectuée tous les 4 jours pendant 3 semaines. Un tatouage et une biopsie de la queue à l'âge de 9-10 jours sont effectués sur les animaux vigils

Impact sur les animaux

Une douleur locale peut exister après les injections intra-péritonéales et intra-musculaires ainsi qu'à la biopsie de la queue. Une gène peut être associée à l'implantation sous-cutanée de la micropompe délivrant les molécules à tester ainsi qu'au niveau de la suture de la peau après la microchirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans chacune des deux procédures utilisées dans ce projet.

Remplacement

La genèse de nouvelles cellules dans l’organisme vivant ne peut être reflétée dans son ensemble par des cultures de cellules étant donné la complexité des processus impliquant non seulement les types cellulaires autres que les oligodendrocytes, mais aussi l’environnement des cellulaes. Néanmoins, les cultures cellulaires nous ont d’ores et déjà permis de sélectionner les molécules chimiques les plus prometteuses que nous devons maintenant valider dans un organisme entier. Ceci limite donc le nombre de molécules à évaluer chez l'animal.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en regroupant toutes les analyses histologiques que nous devons réaliser afin d'obtenir un maximum de résultats sur chaque animal et en partageant les tissus avec nos collaborateurs pour les analyses que nous ne maitrisons pas. Les nombres d'animaux utilisés sont issus de notre expertise dans le domaine donc de nos expériences précédentes.

Raffinement

Les modèles de démyélinisation que nous utiliserons dans ce projet sont ceux dont nous avons l’expertise depuis des années. Nos protocoles ont été optimisés et permettent d'induire des démyélinisations très reproductibles évitant d'avoir à augmenter le nombre d'animaux et ne produisant pas de trouble de la motricité. Lorsque nécessaire, nous utilisons des aiguilles extrêmement fines et spécifiquement mises à disposition de la communauté scientifique pour réaliser des injections chez la souris. Des tapis chauffants permettent d’accompagner le réveil des animaux anesthésiés.

Choix des espèces

La grande majorité des lignées transgéniques actuellement disponibles sont des lignées murines. De plus, les modèles de démyélinisation sont aussi pour la plupart développés chez la souris. Des animaux adultes âgés de 7 à 14 semaines sont utilisés afin de se placer dans des conditions d'animaux jeunes, puisque la sclérose en plaques atteint l'adulte jeune.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Modifiées pour reproduire le syndrome DYRK1A, elles subissent des imageries rétiniennes et une électrorétinographie sous anesthésie, avec pose d'électrodes, puis sont tuées avant réveil pour prélever cerveau et rétines. Le porteur présente les imageries comme sans contact et indique que la principale gêne tient au stress du transfert et à l'anesthésie. Il écarte le poisson zèbre, porteur de deux gènes proches, et conclut que la souris est l'espèce "la mieux adaptée".

Objectifs

Si l’augmentation d’expression d’un des gènes du chromosome 21 humain est considérée comme la cause de nombreux symptômes affectant les sujets atteints de trisomie 21, la diminution de son expression / de l'activité de la protéine codée par ce gène induit également des défauts de développement et de fonctionnement du système nerveux central. Le syndrome associé, initialement appelé MRD7, pour Retard Mental autosomal Dominant de type 7, a récemment été renommé syndrome DYRK1A. Il combine une déficience intellectuelle, une microcéphalie, des crises épileptiques et des troubles du spectre autistique. Trisomie 21 et syndrome DYRK1A sont également associés à des symptômes ophtalmologiques. Parmi eux, un épaississement rétinien a été observé chez les sujets trisomiques, et est retrouvé dans les modèles rongeurs. Aucune étude structurelle n’a encore été publiée en ce qui concerne les patients atteinst du syndrome DYRK1A, mais une pâleur du nerf optique a été rapportée. Elle pourrait être causée par un amincissement de la rétine, comme celui qui a été observé dans un modèle murin de la maladie. Dans ce dernier, une des deux copies du gène a été inactivée, ce qui conduit à une baisse d’expression de la protéine de 50%. Or chez les patients, on retrouve de nombreuses mutations ponctuelles n’affectant pas forcément le niveau d’expression de la protéine, ce qui peut influencer les symptômes – il y a de plus en plus d’indications que la quantité de protéine peut influencer sa répartition dans les cellules et/ou la répartition des protéines avec lesquelles elle interagit. Nous proposons donc d’étudier les conséquences de plusieurs mutations identifiées chez les patients, à travers la caractérisation ophtalmologique de modèles murins dans lesquels ces mutations ont été introduites.

Bénéfices attendus

Les données moléculaires disponibles pour certaines des mutations identifiées chez les patients atteints du syndrome DYRK1A laissent envisager des conséquences hétérogènes sur l’activité et/ou la stabilités des protéines mutées. Au niveau clinique, si nous mettons en évidence que ces différentes mutations conduisent à des changements rétiniens distincts et facilement détectables chez les patients, notamment à travers un examen rapide et non invasif (imagerie sans contact), on peut escompter une prédiction plus précise des conséquences de mutations nouvellement identifiées et donc une prise en charge adaptée plus précoce. Au niveau fondamental, disposer de données structurelles et fonctionnelles globales sur les rétines des différents modèles aidera à déterminer sur lesquels porter en premier nos efforts pour identifier l’impact sur les différentes populations neuronales de la rétine, une partie du système nerveux central dont la structure fine et régulière facilite les approches histologiques et fonctionnelles.

Procédures

La totalité des animaux (192) sera examiné par deux techniques d’imagerie rétinienne sans contact, la tomographie par cohérence optique (OCT) et le fond d’œil, qui sont complémentaires. Ces deux modalités seront pratiquées, après dilatation des pupilles (application d’une goutte de mydriatique par œil) sur une même anesthésie gazeuse (maximum de 15 minutes), destinée à obtenir l’immobilité durant l’examen. Deux tiers des animaux (128) seront examinés par électrorétinographie, qui permet d’évaluer la fonctionnalité de la rétine (durée de l’examen < 30 minutes). Après dilatation de la pupille, les animaux seront endormis par une injection intrapéritonéale d’anesthésique. Des électrodes de référence sous-cutanées seront insérées au niveau des joues et de la base de la queue, et des électrodes DTL (fins filaments souples conducteurs) placées sur les cornées. Pour les différents examens, les animaux seront placés sur des coussins chauffants pour maintenir leur température corporelle, et du gel ophtalmique appliquée sur les cornées pour les maintenir hydratée.

Impact sur les animaux

Les deux modalités d’imagerie, toutes deux sans contact, sont réalisées sur une courte anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum), utilisée uniquement afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. La seule nuisance en découlant est donc le stress lié au transfert de la souris de sa cage d’hébergement à la cage d’induction et l’exposition au gaz anesthésiant. L’euthanasie étant effectuée avant le réveil, la seule nuisance associée à l’électrorétinographie découle également de l’anesthésie (contention et injection intra-péritonéale).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort avant leur sortie d’anesthésie, soit à l’issue de l’imagerie (64), soit à l’issu de l’électrorétinographie (128), pour prélever cerveau et rétines pour les études histologiques ou moléculaires.

Remplacement

Il est impossible à l’heure actuelle d’obtenir une rétine complète in vitro. Obtenir des données structurelles et fonctionnelles facilement transposables à la clinique ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Le poisson zèbre ne peut être considéré ici, car il existe chez cette espèce deux orthologues de notre gène d’intérêt, ce qui rend délicat de reproduire l’impact d’une perte d’une copie ou de mutations ponctuelles. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. De plus, plusieurs lignées portant des mutations ponctuelles sont d’ores et déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet.

Réduction

Au cours d’une étude précédente portant sur des groupes de 12 mâles, nous avions constaté, chez les souris n’ayant qu’une copie fonctionnelle de notre gène d’intérêt, un net amincissement de la rétine ainsi qu’une réduction du nombre des vaisseaux sanguins, et un léger allongement des segments externes, effet miroir de ce que nous avons observé chez des souris ayant trois copies de ce gène. Un effectif de 12 mâles et 12 femelles par génotype permettrait de confirmer ces observations en ayant autant de femelles que de mâles pour chacun des génotypes, et de pouvoir détecter des variations d’amplitude des différents effets entre mutants. Nous n’avons encore effectué aucun enregistrement avec l’équipement électrorétinographique qui vient d’être récupéré auprès d’un autre laboratoire. En absence de données nous permettant d’estimer la dispersion des mesures dans nos conditions d’enregistrement, nous nous orientons vers les effectifs classiquement utilisés pour les études électrorétinographiques, avec 8 souris par génotype et par sexe. Afin de tirer au mieux parti des données acquises, nous utiliserons un test statistique permettant de considérer séparément les mesures obtenues sur les deux yeux d’un même animal, plutôt que leur moyenne, afin d'augmenter la puissance statistique.

Raffinement

Les animaux seront stabulés avec l’enrichissement classiquement utilisé dans notre animalerie (matériel de nidification). Les tests consistent en deux modalités d’imagerie non invasive (OCT et fond d’œil), ainsi que des enregistrements électrorétinographiques. Les deux premières procédures seront effectuées sur une même anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum) afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout desséchement cornéen. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil, qui intervient très rapidement après une anesthésie courte comme ici. L’électrorétinographie nécessite une anesthésie plus longue et sans mouvements oculaires pouvant nuire à la stabilité des enregistrements, comme parfois observés sous isoflurane. Les animaux seront donc anesthésiés à travers l’injection intra-péritonéal d’un mélange de kétamine et de médétomidine, et maintenus sur un coussin chauffant avec du gel ophtalmique appliqué sur les deux cornées. Des électrodes DTL (fins filaments souples) seront préférés aux anneaux d’or souvent utilisés chez l’animal. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil par dislocation cervicale soit à la fin de l’imagerie (4 animaux par génotype et par sexe), soit après les enregistrements électrorétinographiques (8 animaux par génotype et par sexe).

Choix des espèces

Obtenir des données structurelles et fonctionnelles sur la rétine, facilement transposables à la clinique humaine, ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Parmi les espèces dans lesquelles l’inactivation ou la mutation ponctuelle d’un gène peuvent être facilement obtenues, le poisson zèbre ne peut être retenu, car il possède deux autres gènes très proches du gène d’intérêt, rendant délicat la modélisation d’une perte de copie ou d’une mutation ponctuelle de ce gène. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. Plusieurs lignées avec des mutations ponctuelles sont déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet. Les souris devant être sacrifiées à 8 semaines pour des prélèvements histologiques, l’évaluation ophtalmologique sera réalisée au cours de la 8ème semaine, les animaux étant euthanasiés avant le réveil de l’anesthésie. A cet âge, la morphologie de la rétine est bien établie et les réponses électrorétinographiques stables.

1 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent un inhibiteur de macrophages dans la nourriture ou l'eau de boisson et des injections intrapéritonéales, avant mise à mort pour prélever les glandes surrénales, afin d'étudier le rôle des macrophages dans cet organe. Le porteur indique que les traitements oraux n'induisent pas d'effet indésirable en eux-mêmes mais qu'une dérégulation de la surrénale pourrait provoquer des changements de poids ou de l'hypertension. Il affirme d'abord chercher à remplacer les manipulations in vivo par de la culture cellulaire, puis conclut à la "nécessité" de recourir aux souris.

Objectifs

La glande surrénale fait partie des organes endocriniens dont le bon fonctionnement est clé pour la régulation de l’homéostasie de l’organisme. Bien que l’activité endocrine du cortex de la surrénale repose majoritairement sur l’axe hypothalamo hypophysaire et le système Rénine/Angiotensine, d’autres modulations de l’activité endocrine, notamment par des cellules du microenvironnement immunitaire, ont été décrites. En 1984, de nombreuses recherches ont montré que les macrophages résident généralement dans les organes endocriniens, y compris la glande surrénale. Postérieurement, des études dans le pancréas ou dans le testicule ont mis en evidence que les cellules endocrines avaient besoin de la fonction trophique des macrophages pour assurer le maintien de la structure tissulaire et bon fonctionnement de l’organe. En effet, il semblerait exister une symbiose entre les cellules endocrines et les macrophages, chacun influençant profondément l'un l'autre. Cependant, la fonction des macrophages dans la glande surrénale est encore mal comprise. Dans ce projet, nous visons donc à étudier le rôle des macrophages dans l’homéostasie de la glande surrénale et leur association potentielle au dévelopement des maladies surrénaliennes.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer un rôle global encore méconnu des macrophages dans le contrôle de la maturation et de l'homéostasie du cortex surrénalien. De même, notre projet envisage la réalisation du premier atlas haute résolution de toutes les cellules surrénales, y compris leur microenvironnement, grâce à des techniques d’analyse cellulaire à grande échelle. Tout cela nous permettra d’avoir un aperçu complet du rôle des macrophages dans le cortex surrénalien normal, et ouvrira la voie à des études futures visant à comprendre leur rôle potentiel dans les maladies surrénaliennes.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Alimentation supplémentée avec ou sans inhibiteur des macrophages : les souris, mâles et femelles confondus, âgées entre 3 semaines et 6 mois seront nourris une seule fois avec de la nourriture formulée avec l’inhibiteur des macrophages pendant différents temps (allant de 1 semaine de traitement à 6 mois) selon les expériences scientifiques et les analyses pour lesquelles elles seront utilisées. - Traitement avec un agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de mesurer la prolifération cellulaire pendant 1 semaine. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour étudier la prolifération cellulaire. - Traitement avec du KCl (chlorure de potassium) dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec du KCl pendant 24 heures. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour faire des tests de réponse hormonale. - Traitement avec un agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale dans l’eau de boisson : afin d’induire une atrophie de la glande surrénale, les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de stimuler la sécrétion hormonale pendant 1 semaine. - Injections intrapéritonéales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les souris (mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines), seront injectées soit avec l’agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire, l’agent permettant d’induire l’expression d’un système de marquage cellulaire ou l’agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale à différents temps. Ces injections seront réalisées au maximum deux fois en combinaison avec une ou plusieurs procédures décrites auparavant.

Impact sur les animaux

Les traitements réalisés par voie orale (formulées dans la nourriture ou dans de l’eau de boisson) n’induisent pas d’effets indésirables/délétères sur les animaux par eux-mêmes ni par la méthode d’administration. Cependant, on pourrait observer des effets indésirables associées à une possible dérégulation de la glande surrénale en absence de macrophages ou suite aux différents traitements, tels que des changements de poids ou de l’hypertension. En cas d’observation de ces effets indésirables sur les animaux, les traitements seront vite arrêtés et un retour à des conditions normales/physiologiques devrait avoir lieu dans les heures suivantes. Pourtant, on ne prévoit pas une durée de plus de 3 jours pour ces effets indésirables. De même, bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritonéales peuvent induire un stress sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des macrophages dans les divers processus impliqués dans le contrôle de l’activité endocrine de la surrénale.

Remplacement

Afin d’eviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés pouvant participer à la communication entre les macrophages et les cellules endocrines. Cependant, les processus de differentiation et mort cellulaire, production hormonale, réponse immunitaire ou renouvellement tissulaire sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que la glande surrénale est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour générer une régulation hormonale correcte. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultannées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse de qPCR et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les expériences impliquant le dosage hormonal, et compte-tenu de la variabilité intrinsèque de ces analyses, nous avons estimé à 12 le nombre d’animaux minimum nécessaires par groupe. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux nourris avec de la nourriture formulée avec l’agent pharmacologique inhibiteur des macrophages, seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur mise à mort. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’endocrinologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant des altérations dans les glandes surrénales, mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La maturation de la glande surrénale a lieu entre 3 et 6 semaines après la naissance. Pour cela, nous allons déterminer le rôle des macrophages pendant la maturation de la glande surrénale chez des souris agées de 3 semaines (souris jeunes non sevrées). Une fois mature, la glande surrénale, est renouvellée constamment pour s’assurer du bon fonctionnnement tout au long de sa vie. Dans le but de caractériser le rôle des macrophages dans le renouvellement et la production hormonale de la glande surrénale, des souris adultes âgées de 2 à 6 mois seront utilisés dans ce projet.

720 killifishs (classés en autres poissons) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Hébergés individuellement, ils subissent des tests de locomotion spontanée, d'anxiété et de cognition, un protocole d'exercice forcé de trois heures par jour et des séances de locomotion forcée, pour étudier un vieillissement accéléré. Le porteur décrit un amaigrissement et des changements comportementaux d'anxiété ou de résignation liés au vieillissement rapide de l'espèce. Il justifie le choix du killifish par sa rapidité et son coût moindre par rapport au rongeur et le présente comme un modèle "unique et indispensable".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certains phénotypes symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément, les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, (iii) des protocoles d'exercice chronique ou (iv) l'impact d'une manipulation génétique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion, du déclin cognitif. Ceci permettra de désigner de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutrionnelles ou certains types d'exercice physique afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Interventions: 1/génotypage: ne concerne que les animaux GMO, 1 intervention de deux minutes (sous anesthésie) 2/Locomotion spontanée: 3 interventions/poisson pour une durée de 90 minutes 3/Anxiété/cognition: deux interventions/poisson pour une durée de 60 minutes 4/Exercice chronique: 1 intervention/poisson 3heures/jours, 3 jours par semaine pendant 4 semaines 5/ Locomotion forcée: 2 interventions /poisson 120 minutes

Impact sur les animaux

Globalement pour l'ensemble de ces interventions, les nuisances où effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).

Devenir

L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le cerveau, le foie, l'intestin, ou le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui nécessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons générer 3 lignées génétiquement modifiées. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle killifish font de ces poissons un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement (principe de remplacement).

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction) (tests non paramétriques, e.g t-tests, test de Mann&Whitney, One or two-Way ANOVA).

Raffinement

Les animaux soumis inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une temperature de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie* lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). * :La procédure d'anesthesie se fait en plongeant le poisson dans un volume de 200mL d'eau osmosée où l'anesthésique est administrée par voie balnéatoire. L'anesthésie est jugée satisfaisante, lorsque le poisson est ventre en l'air avec mouvement operculaire lent.

Choix des espèces

L'African Turquoise Killifish ou Nothobranchius furzeri est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un nombre croissant de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le Turquoise killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser et étudier les pathologies liées à l'âge.