Procédures légères

Entre deux et six frottis vaginaux, les premiers sous anesthésie gazeuse, puis une ponction du cœur sous anesthésie en prélèvement terminal : 30 souris femelles vont subir ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour la récolte de leurs tissus. Le but est de mesurer leur taux d'œstrogènes au fil du cycle hormonal, une protéine régulatrice de la peau n'ayant montré d'effets que chez les femelles dans des résultats préliminaires obtenus sur une lignée développée pour l'étudier. Le porteur choisit la souris pour une organisation des organes qu'il dit "très semblable à l'Homme" et des étapes du cycle hormonal conservées. Sur l'effectif, il écrit seulement que le nombre a été "défini a minima" pour des résultats interprétables, sans calcul ni chiffre par groupe.

Objectifs

L'objectif du projet est de mieux comprendre le rôle d'un protéine régulatrice impliquée dans la physiologie de la peau. Pour cela, un modèle de souris spécifique a été développé, ce qui permet l'étude du rôle de la protéine au sein de la peau. Des résultats préliminaires obtenus sur ce modèle, ont montré son implication dans le développement des vaisseaux sanguins ainsi que dans le métabolisme des lipides, mais cela uniquement chez les souris femelles. Ce rôle sexe-dépendant pourrait être expliqué par les hormones sexuelles, notamment les oestrogènes qui sont des hormones importantes chez les femelles. De plus, un article récent a montré l'expression de la protéine d'intérêt dans l'hypophyse, petite glande située sous le cerveau qui contrôle la sécrétion d'hormones responsables de la production d'oestrogènes. Pour cela, le taux d’œstrogènes dans le sang sera exploré dans le modèle d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur le contrôle de la production d'oestrogènes chez la souris. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies vasculaires et permettre le développement de thérapies à plus long terme.

Procédures

Entre 2 et 6 frottis vaginaux seront réalisés, geste qui dure une 15aine de secondes par souris. La ponction cardiaque en prélèvement terminal sera réalisé sur souris anesthésiées 1 fois et durera environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Le frottis vaginal réalisé pour vérifier le stade hormonal dans lequel les souris sont peut causer un léger stress momentané chez l’animal et sera donc réalisé sous anésthésie gazeuse au début pour diminuer ces effets.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour la récolte des tissus.

Remplacement

Les expérimentations in vitro on déjà été réalisées et ont donné des résultats concluants quant au rôle de la protéine dans la peau. Il est nécéssaire aujourd'hui de confirmer son rôle dans un modèle plus intégré comme la souris. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans la procédure, le nombre d’animaux a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée au moins trois fois par semaine grâcfe à des points limites précoces et prédictifs qui ont été définis.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation des différents organes qui nous intéressent très semblable à l'Homme et les différentes étapes du cycle hormonal sont conservées. Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 6-20 semaines pour rester cohérent avec les expériences déjà réalisées sur ce projet.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère, pour tester des cellules immunitaires modifiées contre la fibrose musculaire. Ces souris modèles de dystrophie reçoivent des injections de cellules anti-fibrose puis de vecteurs de thérapie génique, une échographie cardiaque sous anesthésie et un test de force par pincement de la queue, avant d'être tuées pour prélever muscles et cœur. Le porteur annonce peu de toxicité attendue et décrit des douleurs liées aux piqûres. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et que l'interaction des lymphocytes avec les cellules cibles exige un milieu physiologique.

Objectifs

Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Cependant, la présence de fibrose qui se développe au cours du temps, empêche le vecteur de thérapie génique de pénétrer correctement dans les tissus atteints réduisant ainsi son efficacité thérapeutique. Récemment, il a été montré dans des modèles de souris que certains types de cellules pouvaient être utilisés pour éliminer les cellules responsables de la fibrose. Il s’agit de lymphocytes T qui sont des cellules du système immunitaire et qui participent naturellement à la lutte contre les agents pathogènes menaçant notre intégrité physique. Ces cellules possèdent un récepteur qui va leur permettent de reconnaitre et de se fixer sur un déterminant que l’on appelle antigène, présent à la surface d’autres cellules et ainsi pouvoir éliminer ces cellules ciblées. Il est possible de modifier ce récepteur pour obtenir une cellule avec un récepteur spécifique de la fibrose. Ces cellules sont déjà utilisées chez l’homme dans le traitement de certains cancers du sang. Nous avons déjà démontré l’efficacité de ces cellules pour réduire la fibrose du muscle squelettique dans un premier modèle de souris. Nous souhaitons maintenant étendre cette preuve de principe à un autre modèle présentant des problèmes de fibrose à la fois dans le cœur et le muscle squelettique pour définir si l’approche peut être généralisée. Nous souhaitons enfin modéliser chez la souris une approche thérapeutique combinant un traitement par ces cellules ciblant la fibrose avec une thérapie génique pour traiter les dystrophies musculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique des cellules anti-fibrose pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.

Procédures

- Prélèvement de sang: 1 seul prélèvement sous anesthésie gazeuse pour vérifier la présence des cellules anti-fibrose, durée 5 minutes. - Injection des cellules anti-fibrose sous anesthésie gazeuse : 2 injections à une semaine d'intervalle, durée 5 minutes. - Injection de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse : 1 seule injection 15 jours après la dernière injection de cellules, durée 5 minutes. - Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes. - Pour le test de force musculaire, le test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour injection du traitement et pincement de la queue pour le test de force musculaire. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques et le cœur et analyser au laboratoire les effets de nos traitements.

Remplacement

Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les cellules anti fibrose de mauvaise qualité. En effet, les cellules sont d’abord contrôlées et testés fonctionnellement in vitro avant leurs injections. Nous vérifions le phénotype des cellules en mesurant l’expression de différents marqueurs d’activations et de différenciations, et nous testons leurs capacités à reconnaître et à tuer leur cible. Afin de valider l’effet ces cellules sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.

Réduction

Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 212 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les cellules anti-fibrose par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous privilégierons des prélèvements de sang à la veine submandibulaire plutôt qu’au sinus rétro-orbitaire. Les quantités de cellules anti fibrose injectées sont faibles donc aucune toxicité n’est attendue. Les doses de vecteurs de thérapie génique administrées aux souris ne seront pas suffisantes pour induire de toxicité hépatique ou cardiaque ni même de douleur. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.

Choix des espèces

Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Le développement de la fibrose musculaire est progressif et varie d'un muscle à l’autre. Typiquement, dans les deux modèles de souris, pour des souris âgées de 2 mois, le diaphragme et un muscle spécifique du mollet (gastrocnemius) sont déjà très fibrosés alors que le cœur n’est pas encore atteint. Il faut attendre minimum 6 mois pour voir apparaitre du collagène dans le cœur de souris malades. D'autres muscles du mollet (par exemple le tibialis anterieur) présentent une fibrose variable à 2 mois alors qu’à 6 mois le processus fibrotique est déjà terminé. Chacun des deux modèles étudiés développent de la fibrose entre 2 et 6 mois en fonction des cycles de régénération musculaire. Nous utiliserons donc pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois pour lesquelles le processus de fibrose est juste présent dans les muscles squelettiques et des souris plus âgées de 6 à 10 mois dans lesquelles le processus de fibrose est présent dans le cœur.

248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs adénoviraux modifiés et deux prélèvements de sang sous anesthésie, pour cartographier la répartition de ces vecteurs dans l'organisme. Le porteur n'attend qu'une fièvre légère et passagère, et annonce une mise à mort pour analyser les organes. Il affirme que les expériences in vitro déjà menées ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant et juge l'utilisation d'animaux "indispensable" à ce stade.

Objectifs

Les adénovirus sont des virus infectant une variété d’hôtes dont l’homme. Ce sont à la fois des éléments pathogènes responsables d’infections léthales mais également des vecteurs pour la thérapie génique et la vaccination. Des essais cliniques utilisent également des adénovirus pour traiter les cancers. Malgré cela, le mécanisme d’entrée des Adénovirus qui peuvent être à la fois des agents pathogènes et des vecteurs thérapeutiques, n’est pas complétement connu. Dans le cas précis de l’Adénovirus humain de sérotype 3, il a été montré que l’interaction avec les cellules hôtes se fait avec un récepteur spécifique. Nous avons produit des vecteurs adénoviraux humains modifiés dans les résidus intervenant avec le récepteur spécifique. Nous avons ensuite montré par des expériences in vitro que certain de ces vecteurs ne sont plus capables d’entrer dans des cellules exprimant ce récepteur. Nos objectifs actuels sont d’évaluer la répartition dans le corps des différents vecteurs. Nous réaliserons une étude de répartition des différents vecteurs dans le corps. Nous analyserons cette distribution. Parallèlement, nous mesurerons la réponse inflammatoire, la toxicité sanguine et hépatique des différents vecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser distribution dans le corps de vecteurs adénoviraux modifiés au niveau d'une protéine. Il permettra de confirmer les données acquises par les études in vitro du rôle de certaines régions de la protéine adénovirale dans l’interaction avec le récepteur spécifique. Ces retombées d’ordre fondamental pourraient avoir également un impact thérapeutique en infectiologie ainsi qu’en cancérologie. En infectiologie, l’identification de régions clés de la protéine adénovirale pour la fixation sur le récepteur spécifique pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de molécules (approche pharmacologique) ciblant ces régions afin de contrôler l’infection par l’adénovirus . En cancérologie, le contrôle du tropisme des adénovirus pourrait permettre d’envisager de les rediriger vers les cellules tumorales dans des approches comme la virothérapie.

Procédures

Tous les animaux auront des injections (durée de l’injection 1 minute) sous anesthésie générale et deux prises de sang (durée 1 minute) sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures impliquent l’administration de vecteurs adénoviraux. Il n’est pas attendu de souffrance des animaux à ces étapes sous anesthésie. Après injection, certains animaux pourront éventuellement avoir une fièvre légère et de courte durée liée à l’inflammation induite par les vecteurs.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses sur organes.

Remplacement

Le but du projet est d'étudier de distribution des vecteurs adénoviraux chez la souris après deux modalités d’administration . Il a pour objectif d’identifier la capacité des vecteurs à infecter les cellules de différents organes. Il est possible d’analyser les interactions des vecteurs in vitro avec différents types cellulaires. Ceci a été réalisé précédemment par l’équipe avec les vecteurs adénoviraux que nous proposons de tester dans ce projet. Cependant, ces expériences in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire et cellulaire d’un organisme vivant tel que la souris, ni d’identifier des interactions vecteurs-cellules non attendues. L'utilisation d'animaux vivants à ce stade est donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les expériences, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le noùbre d'animaux par groupe a été évalué en fonction de publications précédentes. Ce nombre nous permettra d’évaluer la significativité des résultats obtenus (tests statistiques). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en œuvre séquentiellement. Ainsi, la deuxième procéure ne sera mise en œuvre que si les résultats obtenus dans la première procédure sont concluants.

Raffinement

- Les souris seront maintenues en environnement enrichi. - Toutes les injections réalisées seront réalisées sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale. - Les souris seront suivies tous les jours afin de suivre différents signes cliniques. - Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour les pathologies humaines. Nous utiliserons plus particulièrement un modèle de souris transgénique ayant un récepteur de la DSG2 humaine présent dans les mêmes organes que chez l’homme. Les animaux utilisés seront des adultes âgés de 2 à 4 mois. Ces animaux seront acclimatés dans la pièce d’expérimentation une semaine avant d'être inclus dans le protocole. La fourchette d’âge choisie permet de s’adapter aux contraintes de production (élevage de production réduit au minimum) et correspond à celle utilisée pour analyser la biodistribution de vecteurs adénoviraux.

200 petites roussettes, une espèce de requin, vont être utilisées dès le stade œuf dans des procédures classées en gravité légère, avec l'objectif de les relâcher en mer sous réserve de l'accord d'un vétérinaire. Elles sont marquées, mesurées chaque mois et exposées pendant un an à des champs électromagnétiques reproduisant ceux des câbles de parcs éoliens, avec des tests de respirométrie de 24 heures et des enregistrements vidéo de leur comportement. Le porteur reconnaît que la littérature manque de points limites pour l'expérimentation sur les poissons et que l'exposition prolongée pourrait altérer leur santé, auquel cas les individus seraient tués. Il présente le projet comme un appui à la fois à la conservation et à l'"exploitation durable" des espèces marines, dans le contexte du développement des énergies marines.

Objectifs

Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des vibrations, l’interruption de continuité écologique et des perturbations liées aux champs électromagnétiques qui peuvent avoir des impacts potentiellement négatifs sur les espèces marines. En transportant l’énergie produite, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles , qui utilisent les champs électromagnétiques pour se déplacer et se nourrir. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur leurs conséquences sur les communautés ichtyologiques restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à répondre à cette lacune et à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les requins, espèces élétro-sensibles. L’état de santé des individus sera évalué à travers un panel d’indicateurs : survie, mesures taille/poids (i.e. biométrie) et suivi de la croissance, développement, métabolisme énergétique (i.e. indicateur de stress évalué via des mesures de consommation d’oxygène au repos et à l’effort)

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. Il existe très peu de connaissances à ce sujet les requins. Ces connaissances relatives à la biologie de ces espèces d’intérêt serviront de cas concrets pour la mise en place de suivi pérennes des populations aux sein des OWF afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général. Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment les requins réagissent aux champs électromagnétiques. Ils permettront d’améliorer les connaissances des impacts des EMR sur les espèces marines et ainsi apporteront les informations essentielles aux gestionnaires et décideurs pour répondre aux enjeux de développement des EMR sans nuire au maintien de la biodiversité marine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de marquage sous cutané juste apres l'éclosion. Ce marquage durera une minute environ par individu. Cette marque permettra d'identifier chaque individu durant la phase expérimentale juvenile. Il y aura une procédure par individu qui durera 12 mois. Biométrie : une fois par mois les individus seront pesés et mesurés pour assurer un suivi de leur croissance et de leur bonne condition (indice de fulton) Mesures de respirométrie : chaque mois, chaque individu sera testé en respirométrie afin d’évaluer sa capacité métabolique aérobie. Ce test durera 24 h et 12 juvéniles par condition (i.e. contrôle, 3 différents champs électromagnétiques) seront testés soit 6 poissons par bassin. Tests comportementaux : les tests comportementaux auront lieu 1 fois par mois au stade juvenile soit pour 6 fois sur 6 mois. Une camera placée au dessus de chacun des bassins permettra d'enregistrer leur comportement à différents temps de la journée. L'experimentateur n'interviendra pas dans le bassin ni sur les animaux mais enclanchera les enregsitrement à des temps donné (1fois 2h le matin, 1 fois 2h l'apres midi, 1 nuit).

Impact sur les animaux

La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. L’ensemble des manipulations (mise en bassin, anesthésie, mesures taille poids, réveil, chasse avec un stick, respirométrie) seront réalisées sur une période de temps optimisée afin de minimiser un maximum ce stress. La condition des poissons (indice de condition, état général) sera évaluée au niveau individuel durant toute l’expérimentation. Le manque de connaissances sur l’impact des champs électromagnétiques sur les requins de manière générale ne permet pas de déterminer la sévérité de ce type d’exposition en amont. L’exposition aux champs électromagnétiques pourrait avoir des effets indésirables sur l’espèce étudiée. Li’solement sensoriel des individus dans les respiromètres pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Les individus seront relâchés dans l’environnement après accord d’un vétérinaire. Le cas échéant les individus seront euthanasiés. En effet les individus vont etre exposés de manière prologée à des champs électromagéntiques. SI cette expostion altere le développement ou a santé des individus ils ne pourront etre relachés dans l'environnement. Les individus marqués sont maintenus en vie et utilisés durant toute l’expérimentation

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l’impact des champs électromagnétiques sur les requins, aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne peut être envisagée puisqu’aucune méthode de remplacement ne saurait reproduire le développement et le comportement de cette espèce. Nous ne pouvons pas imiter la complexité d’un organisme en entier subissant des conditions particulières impactant sa biologie et son comportement en milieu naturel Aussi, pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique de l’écosystème marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie et la biologie des espèces vivants dans l’habitat impacté.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique L’exposition se fera au stade œuf de 4 semaines jusqu’au stade juvénile. En prenant en compte l’incertitude de la fécondation des œufs, du bon développement des embryons et la littérature existante, un nombre total de 25 individus par bassin est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats pouvant être extrapolé à l’échelle de la population.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors de l’élevage, de mesures biologiques telles que le poids et la taille, des tests comportementaux et l’évaluation de l’état de santé de l’organisme via des indicateurs de stress Une surveillance de routine sera effectuée quotidiennement dans les bassins d’élevage. Une bonne oxygénation du milieu et une température de 16°C seront maintenus tout au long de l’expérience, un cycle jour/nuit de 13h/11h. Les bassins seront enrichis de tubes PVC permettant de mettre à disposition des cachettes pour les individus. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Les individus seront retirés de la procédure dès qu’un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). Une fois éclos, les juvéniles seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bon état de santé des individus et bon état des installations. Des suivis plus poussés, notamment des tests comportementaux (e.g. prise alimentaire, locomotion) et écophysiologiques (métabolismes aérobie, indice de condition, croissance) , seront assurés par les agents une à deux fois par mois. Au bout d’un an, un point d’étape sera réalisé sur les travaux effectués sous la forme d’un rapport intermédiaire et d’une réunion dédiée. A l’issue de ces expérimentations, si les résultats le permettent, les données seront analysées et valorisées sous forme d’article(s) scientifique(s).

Choix des espèces

Les requins sont des espèces électrosensibles susceptible être impactées par les champs électro- magnétiques générés par les OWF. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude avec un degré de mobilité plus ou moins importants. La petite roussette (classée « préoccupation mineure » par l’IUCN) présente globalement une sédentarité au site avec des déplacements relativement limités. L'étude débutera au stade embryonnaire (oeuf de 3-4 semaines) jusqu'au stade juvénile de 6 mois. Les oeufs sont fixés par les femelles sur le lieu de ponte qui peut être par consequent un parc éolien. Ensuite, les juvéniles sont très peu mobiles à la naissance et vont rester sur la zone de ponte quelques mois. Afin d' évaluer l'impact des champs électromagnétiques sur le développement il est donc nécessaire d'exposer les individus à partir du stade embryonnaire. Le stade de 3-4 semaines permet de s'assurer de l'a viabilité et de la fécondation des oeufs avec un embryon qui commence à être visible. Cela permet de ne pas exposer d'oeufs dits "clairs" et non fécondés.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur leur pose un implant d'hydrogel chargé de leuprolide, une hormone qui supprime la production de testostérone, puis réalise onze ponctions de sang dans la veine caudale sur 56 jours sous anesthésie. Il indique surveiller un érythème et des démangeaisons au site d'implantation comme principaux effets indésirables. Ce test vise une libération prolongée du médicament chez l'humain, notamment dans le cancer de la prostate et l'endométriose, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne fournit ces données sans "perte d'informations".

Objectifs

Le leuprolide est utilisé chez l’homme pour moduler les niveaux hormonaux, en particulier dans le traitement de diverses maladies. En agissant sur le système endocrinien, le leuprolide permet de supprimer la production de certaines hormones, comme la testostérone, dans le but de traiter des maladies telles que le cancer de la prostate chez l’homme ou l'endométriose et les fibromes utérins chez la femme. L'utilisation clinique du leuprolide permet une régulation précise des niveaux hormonaux et contribue à améliorer la qualité de vie des patients souffrant de ces pathologies. A ce jour, le traitement nécessite une injection toutes les quatre semaines. Les implants en hydrogel offrent une méthode pratique et précise pour administrer des médicaments et/ou moduler les niveaux de substances biologiques. Leur capacité à libérer de manière contrôlée et prolongée des composés actifs les rend particulièrement efficaces pour étudier les effets de ces substances sur des modèles biologiques. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité d’implants d’hydrogel, chargés en leuprolide, à réduire la production de testostérone chez le rat.

Bénéfices attendus

L'administration de leuprolide sous forme d'implants d'hydrogel chez l'homme, permettrait une libération prolongée du médicament, réduisant la fréquence des administrations et améliorant ainsi la qualité de vie du patient.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ponction de 200 uL de sang complet dans la veine caudale (11 fois réparties sur 56 jours) sous anesthésie volatile (durée environ 2min, 104 animaux). Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie volatile (environ 3 min, 104 animaux). Les animaux seront soumis à une anesthésie volatile pour l'imagerie par échographie (envrion 5 min, 11 fois réparties sur 56 jours).

Impact sur les animaux

Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : erythème de différents grades en fonction de la réponse, démangeaisons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à 56 jours post implantation afin de prélever le site d'injection qui sera étudié lors d'analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Les tests in vitro ont permis de réduire le nombre de composés à tester. Les informations de biocompatibilité et de réduction de la production de testostérone sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux et compte tenu que les expériences ne sont pas de classe sévère, des cohortes d’animaux pourront être utilisées pour répondre à plusieurs objectifs (informations sur la biocompatibilité, informations sur l’efficacité de réduction de production de téstostérone). Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test t soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre de prélever le minimum de sang pour réaliser les dosages de testostérone et de leuprolide circulant. Les injections des implants d’hydrogel, l'imagerie ultrasonore et les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile). Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les injections. Parmi ceux-ci l’aspect de la peau, le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (analgésique, application de crème hydratante sur la peau), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluée et de taille suffisante pour permettre l'injection d'implants d'hydrogel et de prélever suffisement de sang afin de réaliser les dosages de testostérone et de leuprolide. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte (3 mois), afin que la production de testostérone soit maximale.

42 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes et réutilisées pour le renouvellement du troupeau. Le porteur leur impose une restriction alimentaire d'environ 20 % pendant quatre à six semaines et réalise cinq prises de sang à la queue, pour mesurer l'effet de la sous-alimentation sur la lactation et l'ingestion. Il indique que ce déficit reste inférieur à celui que les vaches connaissent en début de lactation et ne devrait pas provoquer d'effet indésirable. Il inscrit l'objectif dans une meilleure modélisation des rations et une "efficience alimentaire" accrue, et juge impossible de se passer de la vache laitière pour ces réponses zootechniques.

Objectifs

La disponibilité en aliments au cours du cycle de lactation chez la vache laitière n’est pas constante et peut conduire en élevage à des périodes de sous-alimentation. Cette situation est fréquente dans les systèmes d’élevages laitiers dans lesquels l’essentiel de l’alimentation est dépendant de la production de fourrages sur l’exploitation. Les périodes de sous-alimentation conduisent à des baisses de production et peuvent entraîner une mobilisation des réserves corporelles. Cependant, nos connaissances actuelles ne permettent pas de quantifier l’importance de ces évolutions de production et de mobilisation à moyen terme. De plus, lorsque l’offre alimentaire redevient à volonté, l’ingestion pourrait être stimulée par un besoin de reconstitution des réserves corporelles, après la mobilisation qui a pu avoir lieu pendant la période défavorable. En effet, on sait déjà que l’ingestion des brebis au cours du cycle est liée aux variations de l’état des réserves. Il est donc intéressant de vérifier si c’est aussi le cas chez les vaches laitières, et surtout de vérifier si cette influence est proportionnelle à l’importance ou à la durée de la mobilisation des réserves corporelles. L’objectif du projet est donc de quantifier l’effet de deux durées (4 et 6 semaines) de restriction alimentaire (environ 20% de la quantité ingérée à volonté des vaches laitières) sur l’évolution de l’ingestion, de la production laitière et des réserves corporelles pendant et après la phase de restriction. Les résultats nous permettront de mieux nourrir les animaux en tenant compte de l’évolution de la production et de la capacité d’ingestion. Et ainsi, assurer une meilleure nutrition et efficience alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous aideront à mieux modéliser les courbes de lactation et de capacité d’ingestion des vaches laitières, en particulier en fonction de la disponibilité en énergie, puisque ces éléments sont essentiels lors du calcul de ration. En effet, la prévision de l’ingestion est statique aujourd’hui (selon l’état de l’animal au temps T). Notre objectif à long terme est d’envisager une prévision dynamique, tenant compte du passé nutritionnel des vaches. Cela nous permettra de mieux alimenter les animaux en tenant compte de l’évolution de la production et de la capacité d’ingestion.

Procédures

Cette expérimentation concerne des animaux vigiles, élevés conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques. La majorité des mesures ne demande pas plus d’intervention que celles réalisées en routine sur les vaches laitières (mesure de l’ingestion et de la production laitière). Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue en semaine 3 de pré-expérience, 4 et 6 de restriction alimentaire, et 2 et 5 de post-restriction, soit 5 prises de sang au total pour toute l’expérimentation.

Impact sur les animaux

La diminution des apports alimentaires de 5 kg (en matière sèche) représente en moyenne environ 20% de la quantité ingérée à volonté des vaches laitières en milieu de lactation. Or, le déficit alimentaire est assez fréquent chez les bovins : quelques fois, l’éleveur décide volontairement de sous-alimenter certains animaux pour avoir une meilleure efficience alimentaire. Les animaux sont habitués à des phases de sous-alimentation. C’est notamment le cas pour les vaches laitières en début de lactation, période pendant laquelle elles mobilisent leurs réserves corporelles pour satisfaire à leurs besoins. L’importance du déficit alimentaire induit par la restriction alimentaire du présent projet sera inférieure à la limite de ce que les vaches ont l’habitude de vivre au début de lactation et ne devrait donc pas induire des effets indésirables sur les animaux. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache.

Devenir

Les animaux, n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptibles d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie, seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est possible.

Remplacement

L’expérimentation concerne directement les réponses zootechniques de capacité d’ingestion et de production de lait des vaches laitières. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui ingèrent la ration et qui produisent du lait. Les modèles de prévision disponibles prédisent assez mal ces réponses sur des rations restreintes telles que celles offertes dans ce projet expérimental.

Réduction

Le nombre de vaches laitières de chaque lot a été calculé pour pouvoir mettre en évidence des différences entre les traitements. Compte tenu du schéma expérimental en continu, il est difficile de diminuer le nombre d’animaux sans risquer de perdre trop en puissance statistique.

Raffinement

Les seuls actes invasifs seront des prises de sang réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse : : 5 prélèvements au total. Les vaches seront maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est parfaitement adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux, sanitaires. Elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue en France et dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre septembre et novembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.

Lavées par l'intérieur de la mamelle après stimulation jusqu'à quatre fois, et vaccinées jusqu'à deux fois par cette même voie, des vaches en tarissement peuvent développer des mammites non infectieuses de moins de 24 heures, en plus d'hématomes, d'inflammations locales et de phlébites. 10 vaches vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec aussi une injection de vaccin dans le muscle, deux sous la peau et une à deux prises de sang par semaine. Le porteur écrit que des analyses récentes de son équipe montrent que ces vaccins à base de levure ne causent "aucune réaction adverse chez le bovin", et prévoit un antibiotique à large spectre en cas de mammite infectieuse après une administration dans la mamelle, dans un projet qui vise à réduire l'usage des antibiotiques en élevage. Toutes seront tuées à l'issue : appartenant à une espèce destinée à l'alimentation humaine, elles auront reçu des formulations sans autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Limiter l’usage des antibiotiques représente un enjeu sociétal prioritaire. Dans ce contexte, la vaccination joue un rôle important dans la réduction de l’incidence et la sévérité des infections. Des alternatives aux vaccins privilegiant la réponse humorale demeurent un besoin dans la lutte contre certaines maladies animales, notamment les mammites à Staphylococcus aureus chez les ruminants. Les mammites sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Les vaccins actuels contre ces infections sont peu efficaces et des nouvelles approches vaccinales doivent être proposées. Des analyses in vivo récemment mises en place par notre équipe montrent que l’administration par les voies systemique (intramusculaire) et locale (intramammaire) de vaccins à base de la levure du boulanger (Saccharomyces cerevisiae - SCe) inactivée par la chaleur ne cause aucune réaction adverse chez le bovin. De plus, cette plateforme vaccinale a permis l’induction d’une réponse lymphocytaire antigène-spécifique dans le sang et la glande mammaire de vaches laitières. Basé sur ces observations, le présent protocole a pour but d’évaluer l’efficacité in vivo d’un vaccin contre les mammites à S. aureus.

Bénéfices attendus

Les vaccins actuels contre les mammites, basés sur des approches traditionnelles (bactéries inactivées), sont peu efficaces et ce constat est attribué à leur incapacité à déclencher une réponse immunitaire à médiation cellulaire (modulée par les lymphocytes). Les connaissances apportées par ce projet contribueront au développement de nouveaux vaccins contre les mammites dans le cadre du programme jeune chercheur de l’ANR. Ces vaccins exploiteront la levure du boulanger comme vecteur d’antigènes et cela permettra la production de vaccins plus sûrs, moins coûteux et stockables sans chaine de refroidissement. A long terme, cette stratégie pourra être utilisée pour la mise en place de vaccins contre d’autres maladies des animaux de rente, contribuant à la réduction de l’usage d’antibiotiques au sein des élevages.

Procédures

Prélèvement sanguin: une, éventuellement deux prises par semaine. Une période de repos d’au moins 5 jours sera instituée avant un nouveau prélèvement. Immunisation par la voie intramusculaire : 1 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation par la voie intramammaire : 2 fois (maximum) espacées d’au moins 4 mois, le cas échéant. L’intervention dure moins 5 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation par la voie souscutannée : 2 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Stimulation et lavage intramammaire. 4 fois (maximum) espacées d’au moins 15 jours. L’intervention dure moins 10 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Hématomes et inflammation locale suite aux immunisations. Phlébites suite aux prélèvements sanguins. Mammites non infectieuses de courte durée (< 24h) suite aux stimulations locales et aux lavages. La contention peut engendrer du stress et les différentes injections ou lavage intramammaire peuvent engendrer une douleur pour l’animal si réalisées par une personne peu expérimentée.

Devenir

S’agissant d’individus d’une espèce destinée à l’alimentation humaine ayant subi des traitements avec des formulations dépourvues d’une autorisation de mise sur le marché, l’ensemble des animaux sera mis à mort. Etant donné que les animaux seront maintenus au sein d’une plateforme de recherche en infectiologie, le replacement ou adoption de ces animaux n’est pas envisageable.

Remplacement

Les cellules bovines ne peuvent pas être remplacées par celles d’une autre espèce ou par une lignée cellulaire commerciale. De plus, bien souvent les résultats de protection contre l'infection obtenus avec l’immunisation des rongeurs ne sont pas transposables aux ruminants.

Réduction

Notre équipe a précédemment observé qu’un animal sur quatre ne présente pas une réponse immunitaire mesurable suite à des immunisations avec l’ovalbumine et d’autres antigènes. Ainsi, un collectif de cinq animaux par groupe représente le minimum pour obtenir des résultats se prêtant à des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. De plus, afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, notre schéma expérimental a été conçu de façon à remplacer le groupe d’animaux contrôles (non-immunisés) par un contrôle endogène. Concrètement, les analyses sur les échantillons sanguins et de secretion mammaire stimulés ex vivo/in vitro seront réalisées avant et après les immunisations ou stimulations in vivo la glande mammaire. De plus, 2 quartiers non-stimulés seront utilisés comme témoins pour les analyses.

Raffinement

Les prises de sang et les immunisations ne nécessiteront qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Pour les immunisations et lavages intramammaires, les animaux seront retenus en groupe de 5 dans la salle de traite, pour une période courte (inférieure à 30 min). Suite aux immunisations et lavages, les animaux seront surveillés pour la présence de signes systémiques et locaux de réaction adverse. Pour cela, l’état général et la température corporelle des animaux, ainsi que la présence d’hématomes et d’inflammation sera évalué au moins 1 fois par jour pendant la période d’une semaine après chaque administration. Le cas échéant, ces signes seront traités avec un anti-inflammatoire non stéroïdien approuvé pour l’usage chez le bovin. En cas de mammite infectieuse suite aux administrations intramammaires, les quartiers affectés seront soumis à un traitement antibiotique à spectre large. Enrichissement du mileu: pierre de sel, brosse de grattage, tapis de couchage, paille Enrichissement social : confinement en groupe et visite régulière des animaliers Une récompense positive (céreales) sera fournise aux animaux après les prélèvements et lavages intramammaires.

Choix des espèces

Les infections mammaires des bovins sont fréquentes en élevage. Elles sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Des vaccins plus efficaces contre ces infections doivent être mis au point. Le choix de l’espèce cible pour la mise en place de ce protocole est justifiée par l’observation que les résultats de protection contre l'infection obtenus avec des modèles murins sont peu transposables aux bovins. Les expérimentations seront réalisées sur des vaches en tarissement car ces animaux correspondent à la catégorie ciblée par notre approche vaccinale en cours de développement.