Procédures légères
Rôle de l’environnement parental précoce sur le développement émotionnel et comportemental de rongeurs monogames et polygames
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres rongeurs : 250
500 rongeurs, 250 souris domestiques et 250 souris glaneuses, vont être utilisés et tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucun acte invasif n'est prévu, seulement des mesures comportementales et de la thermographie infrarouge pour comparer le développement émotionnel des jeunes selon un environnement parental monogame ou polygame. Les couples reproducteurs sont maintenus vivants le temps des tests successifs, puis les parents comme les jeunes sont mis à mort après le sevrage. Le porteur affirme que ces conséquences comportementales ne peuvent être évaluées autrement que sur des animaux, sans autre justification du choix.
Objectifs
La monogamie est rare chez les mammifères, mais existe chez quelques espèces de rongeurs, dont la souris glaneuse. Chez cette espèce, si les unités familiales biparentales sont les plus fréquentes, il n’est pas exceptionnel de trouver dans la nature des unités familiales composées de 2 voire 3 femelles et 1 mâle. Cette structure familiale polygame a un fort impact sur le succès reproducteur des femelles, qui auront moins de jeunes par portée et des portées plus espacées dans le temps comparativement à des femelles vivant seules avec un mâle. Par ailleurs, chez cette même espèce, le mâle s'impliquant fortement dans les soins parentaux, son départ ou sa mort constituent une perte en terme de soins aux jeunes difficilement compensable par la femelle. Chez les rongeurs polygames tels que la souris domestique, la structure familiale la plus commune dans le milieu naturel est composée d'un mâle adulte et de plusieurs femelles apparentées ou non, celles-ci contribuant à l’élevage des différents jeunes naissant au sein du groupe familial. Chez cette espèce, les soins paternels sont généralement peu intenses. Ces différentes structures familiales dans lesquelles naissent les jeunes mammifères constituent une diversité d’environnements précoces dont les conséquences sur le développement émotionnel et comportemental de la progéniture demeurent mal comprises. L'objectif de notre projet est d'en évaluer les effets sur les profils émotionnels de la progéniture. Ces profils seront caractérisés par une série de tests effectués à différents âges où des paramètres comportementaux constitueront la base de cette caractérisation. Ceux-ci seront toutefois complétés par des mesures physiologiques non invasives par l'emploi de la thermographie infrarouge. Les tests comportementaux seront répétés afin d'évaluer la stabilité des caractéristiques émotionnelles des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'apporter des informations d'une part sur les conséquences d'une monogamie contrariée chez les espèces monogames, du fait par exemple de la mort du partenaire, et d'autre part sur les conséquences d'une polygynie contrariée chez les espèces polygames, du fait par exemple de la non disponibilité de multiples partenaires lorsques les conditions écologiques dans lesquelles ces animaux évoluent se trouvent perturbées. Un autre bénéfice attendu est d'apporter des informations sur les traits émotionnels des rongeurs, et en quoi leur environnement précoce peut affecter ces traits. Une meilleure connaissance des caractéristiques émotionnelles de ces animaux peut notamment apporter des informations pertinentes relatives à l'appréciation de leur bien-être.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucun traitement invasif. Seules des mesures comportementales seront effectuées et des mesures non invasives de réponses émotionnelles par thermographie infrarouge.
Impact sur les animaux
Aucun acte invasif n'est prévu dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables pouvant survenir sont ceux que l'on peut occasionnellement observer ches les rongeurs hébergés en animalerie (apathie, stéréotypie, ou intolérance sociale). Des enrichissements continus (tubes de carton, barres de bois, nids) sont prévus pour palier à ces nuisances.
Devenir
Procédure 1: Les unités parentales (140 individus - 70 par espèce) sont maintenues jusqu’à la procédure n°3, où les jeunes individus sont alors sevrés. Les jeunes individus issus de la reproduction de ces unités parentales (360 individus – 180 par espèce) sont maintenus en vie pour être testés dans les procédures suivantes. Le projet portant sur les conséquences de l'environnement parental précoce sur développement comportemental et émotionnel des individus ceux-ci doivent être maintenus vivantpour les différentes procédures où les animaux sont testés à des âges différents. Procédure 2: idem. Les parents sont maintenus avec leurs jeunes, ces derniers ont alors 8 à 10 jours. Procédure 3: Après la reproduction et le sevrage de leurs jeunes, les animaux constituant les unités parentales seront mis à mort (140 individus - 70 par espèce). Les femelles potentiellement gestantes une seconde fois sont isolées des mâles, et mises à mort ainsi que leurs jeunes lorsque ces derniers atteignent l’âge du sevrage. Les jeunes sevrés sont conservés en vie pour les procédures suivantes (360 individus - 180 par espèce). Procédure 4: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour les procédures suivantes. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 5: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour la procédure suivante. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 6: Sur les 360 individus, 120 individus (60 au sein de chacune des deux espèces) seront utilisés dans cette procédure, les autres seront mis à mort dès que leurs congénères seront mis en couple reproducteur. A l'issue de cette procédure, ces 120 individus seront eux aussi mis à mort. Les individus mis en couple s'étant reproduits seront mis à mort ainsi que leur jeunes après leur sevrage.
Remplacement
Les conséquences des l’environnement parental précoce sur le développement des caractéristiques comportementales et émotionnelles des individus ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise.
Réduction
Le projet sera mené sur deux espèces distinctes: l'une monogame, la souris glaneuse, l'autre polygame, la souris domestique. Trois conditions parentales seront testées pour chacune d’elles : la monoparentalité (la femelle élève seule ses jeunes), la bi-parentalité (le mâle et la femelle élèvent le jeunes), la pluriparentalité (2 femelles et un mâle élèvent les jeunes). Une dizaine d'unités parentales par condition sont nécessaires afin d'obtenir une représentativité acceptable des conditions parentales testées. Pour chacune des deux espèces, cette trentaine d'unités parentales (10 mono-, 10 bi-, 10 pluri-parentales, soit 70 individus au total par espèce) produira un nombre moyen estimé de 6 jeunes par portée. Sur cette base, 70 individus parents produiront 180 souris glaneuses et 70 individus parents produiront 180 souris domestiques, soit un total de 500 animaux seront utilisées pour la globalité du projet. Ce projet est une étude longitudinale. Les différentes caractéristiques émotionnelles, sont évaluées sur les mêmes individus permettant ainsi de relier ces caractéristiques les unes aux autres, mais également de réduire considérablement le nombre d’individu testés si celles-ci devaient être évaluées indépendamment.
Raffinement
Des enrichissements environnementaux (matériels de construction de nid, rondins de bois à ronger) seront constamment fournis aux animaux, et un système de surveillance vidéo placé au dessus des cages pour notamment quantifier les comportements parentaux sans perturbations externes et permettra également de veiller à l'absence d'agressions au sein des cages. Tous les transferts des animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'emploi d'une petite boite dans laquelle l'animal sera incité à entrer. Les différents tests auxquels seront soumis les animaux seront brefs (10 minutes maximum), et non invasifs. Ces tests laissent généralement aux sujets la possibilité d’adopter une solution comportementale qui leur convient. C’est cette solution comportementale adoptée par l’animal qui constitue généralement la mesure expérimentale qui nous intéresse.
Choix des espèces
La souris glaneuse Mus spicilegus est une espèce monogame et la souris domestique Mus musculus domesticus est une espèce polygame. L'objectif de l'étude étant d'évaluer les conséquences du milieu parental et des soins parentaux sur le comportement et les profils émotionnels de la progéniture, et l'une de nos hypothèses étant que les environnements parentaux ont des effets différents selon que l'espèce soit monogame ou polygame, nous avons choisi deux espèces de rongeurs relativement voisines au système d'appariement différent. L'objectif du projet étant d'évaluer les conséquences des conditions de vie précoce des animaux sur leurs profils comportementaux, les indivdus seront testés tout au cours de leur développement: - des tests précoces, avant le sevrage, auront pour objectif d'évaluer la nature sécurisante que constitue l'environement parental. Les premiers tests auront lieu quand les animaux auront 9-10 jours, où les vocalisations ultrasonores des animaux lors de la séparation seront quantifiées. Des tests de ce type plus tardifs risquent de compromettre les productions ultrasonoes caractéristiques des jeunes souriceaux. A l'âge de 19 jours, les animaux seront testés selon un protocole différent, où les réponses comportementales à un situtation anxiogène seront évaluées en présence et en absence de membres de 'lunité parentale. Ces tests seront brefs et les animaux rejoindront leur unité parentale aussitôt après le test effectué. - des tests après le sevrage jusqu'à la maturité sexuelle seront éffectués pour évaluer les profils émotionnels des individus. - des tests sociaux de rencontre avec un congénère étranger de même sexe et de sexe opposé, et une évaluation des comportements reproducteurs seront effectués chez les ainmaux ayant atteint l'âge adulte (80-90 jours).
Etude de la physiopathologie des infections aspergillaires au cours de la BPCO
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 232 relevant de la gravité la plus élevée. Exposées douze semaines à la fumée de cigarette pour reproduire une bronchopneumopathie chronique, elles sont infectées par le champignon Aspergillus fumigatus par voie intranasale, puis subissent un prélèvement de sang rétro-orbital avant d'être tuées pour prélever poumons, rate, cœur et cerveau. Le porteur vise l'identification de marqueurs précoces d'une infection au pronostic sombre chez les patients atteints de BPCO. Il affirme que la complexité de la réaction de l'hôte rend un modèle in vivo "nécessaire".
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les aspergilloses invasives (AI) au cours de la BPCO. En effet, ces infections ont une incidence de 1,6-3,9%, surviennent principalement chez des patients BPCO traités par corticothérapie systémique, et sont associées à une mortalité élevée (72-100%). Cependant, peu de données sont disponibles sur la physiopathologie des AI au cours de la BPCO. L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle in vivo est nécessaire.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mieux comprendre la contribution des macrophages au défaut de réponse anti-Aspergillus au cours de la BPCO et d’identifier des marqueurs précoces afin d’améliorer la prise en charge diagnostique, thérapeutique et le pronostic de ces infections.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux vigiles sont : - L’inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus) - La réalisation de prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus)
Impact sur les animaux
- Inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : accélération transitoire du rythme respiratoire (le retour à la normale après quelques minutes sera vérifié). - Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale : ce prélèvement étant réalisé sous anesthésie, juste avant euthanasie des animaux, aucun effet indésirable ayant un impact durable n’est attendu.
Devenir
Une mise à mort étant nécessaire pour permettre le recueil des échantillons utilisés pour la réalisation des analyses (poumons, rate, coeur, cerveau, LBA, sang par ponction intra-cardiaque), elle sera réalisée pour l'ensemble des animaux.
Remplacement
L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience, et le nombre de réplicats (n=2) sont réduits à leur minimum tout en permettant d’atteindre une puissance statistique significative dans l’analyse de nos paramètres, notamment de la mortalité, ainsi que des charges fongiques pulmonaires et cardiaques.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (notamment l’enrichissement des cages par ajout d’abri en carton et papier de nidification) et de réalisation des expériences (anesthésie lors de l’inoculation intra-nasale des conidies, de l’évaluation de la fonction pulmonaire, de la réalisation de prélèvements sanguins ; établissement de points limites et mise à mort en cas de dépassement de ces points) permettront de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Choix des espèces
L’étude des pathologies pulmonaires est facilitée chez la souris du fait de la grande disponibilité des outils d’exploitation et d’analyse, ce dont les autres espèces sont dépourvues. La BPCO touche majoritairement les adultes, très peu les populations jeunes ou les enfants, nous utiliserons donc des animaux adultes. Les souris commencent à être exposées à la fumée de cigarettes à partir de 7-8 semaines d’âge. Le protocole d’exposition à la fumée de cigarettes est de 12 semaines, afin de reproduire une inflammation pulmonaire chronique associée à une altération fonctionnelle pulmonaire. Les souris sont donc infectées par A. fumigatus à l’âge de 19-20 semaines.
Acquisition de gestes de base pour la manipulation de la souris dans le cadre de l’enseignement du BUT Génie Biologique parcours BMB en IUT
- Enseignement supérieur
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris vigile est utilisée par des étudiants de première année pour s'exercer à une injection intrapéritonéale, avec jusqu'à trois tentatives par animal, puis elle est mise à mort au CO2 faute de pouvoir être gardée entre deux semestres. Le porteur reconnaît qu'un geste mal exécuté peut provoquer une douleur. Il affirme cet apprentissage "indispensable" et juge la souris le modèle le plus pertinent, sans envisager d'alternative.
Objectifs
L'objectif du projet est l'acquisition des gestes de base sur la souris de laboratoire à des étudiants en 1ère année du BUT Génie Biologique.
Bénéfices attendus
Pour les étudiants, le projet permet l'apprentissage de gestes techniques de base sur la souris. Cet apprentissage est indispensable pour appréhender les travaux pratiques de physiologie animale / pharmacologie / toxicologie au cours des semestres suivants.
Procédures
Chaque souris vigile sera: - sortie de sa cage d'hébergement - maintenue dans le respect du bien-être animal, afin d'éviter tout stress - injectée avec 0,1 mL d'une solution de NaCl 0,9% en intra-péritonéal dans le quart inférieur droit, avec les gestes permettant de limiter tout stress ou toute douleur à l'animal. A la fin de la séance (environ 20 minutes), les souris sont remises en cage.
Impact sur les animaux
Etant donné qu'il s'agit de la première expérience des étudiants sur la souris vigile, un stress peut être ressenti par la souris. Une douleur peut être induite en cas de geste mal effectué lors de l'injection intra-péritonéale. Les formatrices qualifiées seront vigilantes afin de permettre au maximum la réalisation d'un geste correct. Le nombre de tentatives sera limité à trois pour chaque souris.
Devenir
Mise à mort par inhalation de CO2 avec un automate. Etant établissement d'enseignement, les souris ne peuvent pas être gardées dans l'attente d'un prochain projet utilisant les souris (enseignement semectrialisé).
Remplacement
Le modèle souris est le plus fréquemment utilisé comme animal de laboratoire. Dans le cadre de la formation BUT Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, ce modèle nous semble le plus pertinent, afin de former les étudiants aux gestes de bases de la manipulation sur animal. Donc, il nous semble difficile de remplacer la souris par un autre modèle.
Réduction
Pour la formation de nos 80 étudiants, seules 48 souris seront utilisées. Le nombre total d'animaux a été réduit à son maximum soit 3 lots de 16 souris. Quatorze étudiants + 2 formatrices = 16 souris. Ces trois lots seront utilisés à deux reprises, en prenant soin d'avoir un temps de récupération suffisant pour l'animal, entre deux manipulations.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe, dans des cages avec enrichissement modifiable (rouleau de papier, feuilles de papier ouaté)
Choix des espèces
Le modèle souris est le plus fréquemment utilisé comme animal de laboratoire. Dans le cadre de la formation BUT Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, ce modèle nous semble le plus pertinent, afin de former les étudiants aux gestes de bases de la manipulation sur animal. Souris adultes, poids moyen 30 grammes
Etude de la réponse inflammatoire dans les modèles d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
6 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 1 200 relevant de la gravité la plus élevée. Toutes subissent une biopsie de queue pour génotypage, une partie recevant des injections intracérébrales, la pose d'une fenêtre crânienne ou des injections dans la cisterna magna, avant une perfusion intracardiaque terminale pour prélever le cerveau. Le porteur suit la douleur au moyen d'une grille d'expressions faciales et administre buprénorphine et kétoprofène. Il affirme que la réaction inflammatoire de la maladie d'Alzheimer ne peut s'étudier que dans un "organisme entier", les cultures d'organoïdes ne la reproduisant pas.
Objectifs
Les études d’analyse génomique concernant la maladie d’Alzheimer montrent l’influence de gènes intervenant dans la réponse immunitaire notamment ceux exprimés dans les cellules de la microglie. Afin de suivre cette réponse inflammatoire durant l’évolution de la maladie nous allons utiliser une souris reportrice HexdtTomato. Chez cette souris les cellules de la microglie expriment une protéine fluorescente (dtTomato) sous le contrôle de la sous-unité bêta du gène hexominidase (Hexb) facilitant la localisation et le suivie de ces cellules in vivo et ex vivo. Nous allons utiliser cette souris dans nos modèles de la maladie d’Alzheimer. Ainsi nous allons déterminer l’influence de 2 gènes d'intéret dans la réponse inflammatoire dans le modèle de souris APPSwe/Ind. La souris APP Swe/Ind exprime une forme humaine de la protéine APP (Amyloid Precusor Protein) porteuse de la mutation humaine Swedish/Indiana. Cette souris développe des plaques amyloïdes à partir de 8 mois. Nous travaillerons sur des animaux âgés de 2 à 4 mois et de 10-11 mois. Nous voulons déterminer comment évoluent les cellules de la microglie à des temps précoces de la maladie (2-4 mois) et à des temps où la maladie est installée soit 10-11 mois. Ainsi on pourra définir les rôles de nos deux gènes d’intérêt dans l’évolution de la réaction inflammatoire au sein du modèle APP Swe/Ind.
Bénéfices attendus
La mise en œuvre de ce projet provient des résultats des analyses génétiques réalisées sur des malades de la maladie d’Alzheimer. En effet de nombreux gènes liés au système immunitaire ont été retrouvés tel que Trem2. En travaillant sur 2 temps, on peut voir comment la réaction inflammatoire évolue aux cours du développement de la maladie d’Alzheimer. La réalisation de ce projet nous permettra de caractériser les différents types de microglie et nous permettra de définir la « bonne microglie » qui favoriserait la clairance et la dégradation des plaques amyloïdes.
Procédures
En vue du génotypage des animaux, ces derniers doivent subir une biopsie de queue qui se fait sous anesthésie. Nombre 6900 fréquence une fois. Sur des animaux vigiles, nous effectuons des injections intrapéritonéales (nombre 600, fréquence 5, une fois par jour), intranasales ( nombre 800, fréquence 5 fois, une fois par jour ), intraveineuses ( nombre 800 fréquence une fois) et des gavages (nombre 600 fréquence une fois par jour pendant 30 jours ou une fois par jour pendant une semaine). Sur des animaux anesthésies avec un suivi postopératoire nous réalisons des injections intracérébrales (nombre 600 une fois Injection), injection dans la cisterna magna (nombre 200 une fois) et la pose d’une fenêtre crânienne (nombre 400 une fois). Sur des animaux anesthésiés nous les sacrifions après une perfusion intracardiaque (nombre 6900 une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux sont suivis régulièrement. Les effets indésirables dans ce projet sont essentiellement pour les procédures qui impliquent un acte chirurgical soit les procédures 6-7-9. Un tableau de « scoring » a été établi pour suivre les animaux (tableau joint). La durée maximale avant le sacrifice est de 7 jours dans le cas de la procédure 7. La phase post opératoire est la suivante: - lors de la phase de réveil, l’animal est placé dans une cage sur du papier propre afin d’éviter des contacts entre la sciure et la suture, et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie due à l’anesthésie. Pour la réhydratation de l’animal on injecte du NaCl 0.9% glucosé à 5% (500µl). - lors du réveil, les animaux reviennent dans la salle d’hébergement. Des observations fréquentes sont réalisées (2 fois par jour sur une semaine) pour vérifier l’état de la suture. Pour réduire la douleur due à certaines procédures chirurgicales nous utilisons BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. Les animaux reçoivent une nourriture humide et du Diet Boost gel pour récupérer son poids initial. -Si la perte de poids de l’animal dépasse 15% il est euthanasié. Si les animaux présentent une activité absente, une immobilité et des déplacements difficiles dans les 24 heures postopératoire, l’animal est sacrifié.
Devenir
L'ensemble de nos procédures se terminent par le sacrifice des animaux et par la réalisation de la procédure 8. En effet nous devons prélever le cerveau ce qui implique le sacrifice de l'animal pour déterminer le nombre de plaques amyloïdes, réaliser des dosages d'Abeta42, suivre l'activité de certaines enzymes intervenant dans le métabolisme de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP).
Remplacement
Les études d'analyse génomique concernant la maladie d'Alzheimer montrent l'influence de gène intervenant dans la réponse immune notamment les cellules de la microglie. Le développement de la maladie d'Alzheimer est accompagnée d'une réponse inflammatoire. Cette réponse ne peut se faire qu'au sein d'un organisme entier de l'animal. Les techniques de culture d’organoïdes in vitro ne nous permettent pas de suivre le développement d’une réaction inflammatoire lors du développement de la maladie d’Alzheimer. Mais l'utilisation d'une souris reportrice HexbdtTomato (sous unité beta du gène codant pour l'hexosaminidase), nous permettra de limiter le nombre de souris car les cellules de la microglie pourront être suivies grâce au gène rapporteur Tomato.
Réduction
Le nombre d’animaux inclut dans ce projet a été établi par rapport à des études précédentes que nous avons effectuées. Nous utilisons les 2 sexes afin de minimiser le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre, nous effectuons sur un hémisphère cérébral pour les analyses immunohistologiques et sur le second les extractions d’ARNm ou de protéines. Le test d’analyse de variance (logiciel Graphpad) est le test que nous avons choisi afin de comparer les différents génotypes a été déterminé à l’aide du logiciel BiostatTGV. Nous utilisons le test Man et Whiney pour les études pilotes.
Raffinement
NOUS OBSERVONS REGULIEREMENT LES ANIMAUX. NOUS AVONS INCLUS DIFFERENTS POINTS LIMITES DANS NOS EXPERIENCES (PERTE DE POIDS, PILOERECTION, DOS ROND, HYPOACTIVITE, DEMARCHE ANORMALE). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU DE SCORING (NC3R) DANS LEQUEL NOUS SUIVONS LES PARAMETRES D'EXPRESSION FACIALES SUIVANTS : CONTRACTION ORBITRAIRE, GONFLEMENT DU NEZ, DES JOUES, POSITION DES OREILLES ET DES MOUSTACHES). L'EVALUATION DE LA DOULEUR PAR LE SUIVIE DES EXPRESSIONS FACIALES A ETE UTILISE DANS LE CAS DE CRANIOTOMY (SCIENTIFIC REPORTS (2019)9:359). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU OU SELON L'OBSERVATION EFFECTUEE NOUS NOTONS ZERO POUR UN CAS NORMAL,1 POUR UNE ALTERATION MODEREE ET 2 POUR UN SIGNE EVIDENT. LA SOMME DES OBSERVATION NOUS DONNERA UN SCORE QUI INDIQUERA L'ETAT DE L'ANIMAL. CONTRE LA DOULEUR, NOUS ADMINISTRONS DE LA BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. NOUS AJOUTONS DANS LES CAGES DE L’ALIMENT ET DE L’EAU EN GELEE. NOUS DEVELOPPONS DES CULTURES D’ORGANOÏDE MAIS NOUS POUVONS PAS ETUDIER L’ETABLISSEMENT DE LA REACTION INFLAMMATOIRE DANS LE DEVELOPPEMENT DE LA MALADIE D’ALZHEIMER AVEC CE TYPE DE MODELE.
Choix des espèces
Dans cette espèce différents outils génétiques existent : des souris transgéniques, KO, KI permettant de réaliser des études dans des conditions physiologiques. Nous disposons donc de modèle qui développe la maladie d'Alzheimer mais également de souris reportrice nous permettant de suivre des cellules de la microglie par l'expression d'une protéine fluorescente la protéine tomato. Ainsi en utilisant ces souris nous pouvons suivre le développement de la réaction inflammatoire lors de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. Pour cela nous travaillerons à deux temps, un temps précoce 2-4 mois et un temps plus tardif où la maladie est installée soit 10-11 mois. Au stade 10-11 mois nous pouvons observer des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris. Grace à la souris reportrice HexdtTomato, nous pourrons déterminer le rôle de la microglie dans la formation de ces plaques (taille, forme, ...).
Endothélium, un nouvel acteur de la neuroplasticité.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Rats : 1283
1 991 animaux non-humains, 708 souris et 1 283 rats, vont être utilisés et tués à l'issue, en majorité dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Ils sont soumis à un exercice imposé sur tapis roulant ou à une électrostimulation musculaire, puis, sous anesthésie, à une laparotomie, une thoracotomie, un prélèvement de sang intracardiaque et une perfusion transcardiaque qui provoque leur mort, avant décapitation et prélèvement du cerveau, des muscles et des vaisseaux. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance hormis l'inconfort de l'exercice imposé, et vise l'endothélium comme cible thérapeutique et l'électrostimulation comme alternative à l'exercice pour les personnes peu mobiles. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le modèle rongeur.
Objectifs
La neuroplasticité (capacité du cerveau à moduler le nombre et l’efficacité de ses synapses) est dépendante de l’activation des récepteurs TrkB (tropomyosin related kinase B) neuronaux par le BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Alors qu’il est bien admis que la principale source cellulaire du BDNF est le neurone, nos récents travaux supportent l’hypothèse originale selon laquelle l’endothélium serait également un acteur clé de la neuroplasticité. En effet, nous avons montré que : -l’endothélium (périphérique ou cérébral) exprimait fortement BDNF -50% du BDNF cérébral correspondait à du BDNF endothélial -la synthèse endothéliale de BDNF était corrélée positivement à la production d’oxyde nitrique(NO) et qu’il existait un feedback positif entre productions endothéliales de NO et de BDNF. Enfin, les pathologies associées à une dysfonction endothéliale, connues pour affecter négativement la santé cérébrale, réduisent l’expression endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. A l’opposé, l’exercice physique (EX), reconnu pour induire la neuroplasticité et améliorer les capacités cognitives, les augmente. De façon intéressante, bien que peu nombreux, de récents travaux montrent que l’électromyostimulation (EMS) reproduit les effets de l’EX sur la fonction endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. Cette analogie entre EX et EMS pourrait s’expliquer par la capacité des muscles squelettiques à sécréter une hormone: l’irisine; l’inactivation de l’irisine circulante réduisant les bénéfices cognitifs de l’EX chez la souris Alzheimer. Mais quelle est la cible cellulaire de l’irisine circulante : le neurone ? la cellule endothéliale cérébrale ? Par ailleurs, alors que nous avons récemment démontré que les effets salutaires de l’EX sur la santé cérébrale pouvaient également s’expliquer par son impact positif sur le système cardiovasculaire (voie hémodynamique), à ce jour il n’existe que peu de données sur les effets de l’EMS sur le débit sanguin cérébral (DSC). Dans ce contexte, les objectifs sont : 1) de montrer que le BDNF endothélial est un acteur clé de la neuroplasticité grâce aux caractérisations biochimique et cognitive d’une souris génétiquement modifiée incapable d’exprimer BDNF au niveau endothélial (endoBDNF-/-), 2) d’explorer la connexion existante entre irisine musculaire et BDNF endothélial, 3) d’étudier le rôle du BDNF endothélial sur la cognition 4) de connaître les effets de l’EX et l’EMS sur les paramètres cérébro-vasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester, d’une part, l’hypothèse selon laquelle la cellule endothéliale est une composante majeure de la neuroplasticité et, d’autre part, de comprendre comment la contraction musculaire (induite via l’EX ou l’EMS) impacte la santé cérébrale via l’étude du BDNF, de l’irisine et plus largement de la cognition. La compréhension des mécanismes impliqués nous permettrait : - De définir la cellule endothéliale comme une cible thérapeutique prometteuse aisément accessible dans la lutte contre les maladies neuro-cardio-vasculaires. En effet, l’endothélium est impliqué dans bon nombre de pathologies, soit comme déterminant physiopathologique, soit comme sujet à des dommages collatéraux. - De définir l’EMS comme une alternative au protocole d’EX chez les personnes n’ayant pas la motivation ou la capacité physique permettant de réaliser des séances régulières. Le but ultime étant de préserver et améliorer la cognition et donc la santé cérébrale.
Procédures
Tous les prélèvements effectués sur nos animaux (n=1991) se feront sous anesthésie générale (aucun prélèvement sur animal vigile). L’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée) sur des animaux vigiles (1 seule administration/animal). L’ensemble des animaux (708 souris + 1011 rats) inclus dans les procédures 1, 2 (EMS Chronique), 4 (Point 2 –Impact de l’EX ou l’EMS sur la cognition), 5 et 6 seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie générale de l’animal -Laparotomie, thoracotomie -Prélèvement intracardiaque de sang (~2 ml/rat et prélèvement des structures cérébrales ou cerveau entier -Prélèvement des muscles squelettiques (soléaires et gastrocnémiens) -Prélèvement des vaisseaux (aorte thoracique et abdominale). Concernant les animaux inclus dans les procédures 3 (32 rats) et 4 (Point 1-Impact de l’EMS sur la FC, PA et DSC, 240 rats): -Anesthésie générale -Contrôle et maintien de la température rectale à 37.5/38.5°C jusqu’à la mise à mort -Cathétérisme de la veine du pénis pour administration d’héparine et d’agents vasopresseurs si la pression artérielle est inférieure à 60 mm Hg. Cathéter mis en place en moins d’une minute. Durée entre 60 et 90 minutes. - Cathétérisme de l’artère carotide commune gauche en vue de la mesure de la PA et des prélèvements sanguins (mesure des GDS). Cathéter mis en place en moins de 10 minutes. Durée entre 60 et 90 minutes. - Intubation trachéale, mise sous respiration assistée et curarisation. Intubation mise en place en moins de 5 minutes. Durée 60 et 90 minutes. - Placement de l’animal sur l’appareil stéréotaxique - Incision du crâne et trépanation à l’aide d’un fraisage doux. Durée 5-10 minutes. - Placement de la sonde doppler sur la dure mère. Durée 5-15 minutes. - Mesure du DSC. Durée 30 minutes. - Mise à mort par décapitation => prélèvement cerveau - Laparotomie, thoracotomie => prélèvement d’organes A noter également que l’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée en subchronique par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance, ni effet indésirable est attendu sur nos animaux, tout au plus un inconfort lié au caractère imposé de notre protocole d’EX sur tapis roulant (procédure 1). Par ailleurs, afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, - Les actes chirurgicaux seront réalisés après prémédication à la buprénorphine (30 minutes avant induction de l’anesthésie afin d’en potentialiser ses effets) et sous anesthésie générale par du personnel statutaire qualifié et/ou par des étudiants en recherche préalablement formés. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée pour chaque animal afin d’éviter tout réveil pendant la chirurgie. - Les injections sous cutanées et intrapéritonéales seront réalisées avec des aiguilles 25G chez le rat et 27G chez la souris. - Le réveil des animaux anesthésiés sera réalisé en cage individuelle dans une salle de repos sous surveillance de l’expérimentateur et contrôle de la température corporelle. - Le stress des animaux dû à la nouveauté (expérimentateur, tapis roulant) sera prévenu par une phase préalable « d’habituation ». Dans la mesure du possible, les animaux d’une même expérience seront en contact avec un expérimentateur unique.
Devenir
L’intégralité des animaux inclus dans les 6 procédures seront mis à mort pour prélèvement des tissus (cerveau, muscles squelettiques, vaisseaux).
Remplacement
L’absence de méthodes substitutives (in vitro ou in silico) pour étudier : 1) l’influence des variations du flux sanguin (induites par l’EX ou l’EMS) sur la neuroplasticité et la cognition et, 2) l’étude des interactions entre les différents éléments intervenant dans la connexion muscle/cerveau, ne nous permet pas de remplacer le modèle rongeur (souris et rats).
Réduction
Une première approche nous permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés est de travailler avec des procédures standardisées - de la réception des animaux jusqu’à leur mise à mort. Ces procédures, disponibles au laboratoire sous forme de documents écrits précisant tous les détails pratiques, sont maitrisées par du personnel statutaire ; les souches d’animaux, leur âge et le nombre/groupe sont appropriés à la validation/invalidation de notre hypothèse. Par ailleurs, les expériences du projet tiennent compte des facteurs reconnus pour influencer la cognition (interaction sociale, poids corporel, prise de nourriture, cycle nycthéméral, hormones sexuelles). Une seconde approche est de soumettre les animaux d’un même groupe à 2 ou 3 procédures différentes. Concernant les analyses statistiques, nous utiliserons des tests adaptés aux petits échantillons et aux types de comparaison (multigroupes ou 2 groupes, analyses variable continue ou pas, mesures appariées ou pas). Les groupes à comparer sont déterminés avant de conduire les expériences et le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe tient compte : - de l’obligation de réduire le nombre d’animaux utilisés - de la variabilité interindividuelle quant à la réponse des animaux - de la possibilité d’échec dans la réalisation de certains gestes chirurgicaux - de la nécessité de conduire une étude statistique de qualité Ce nombre sera raisonnablement compris entre 8 (pour la mesure des paramètres cérébro-vasculaires et les analyses biochimiques) et 16 (pour l’étude de la cognition), compromis entre limitation du nombre d’animaux et obtention d’une analyse statistique fiable.
Raffinement
Afin de raffiner au maximum notre projet, Avant l’expérimentation Les rats et souris seront respectivement hébergés au nombre de 5 et 10 par cage afin de maintenir une interaction sociale et demeureront avec les mêmes congénères tout au long des procédures afin de ne pas rompre la hiérarchie intra-cage. Afin de déceler toute souffrance physique ou psychologique conduisant à un inconfort, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Par le biais d’une phase d’habituation (4/5 jours), les animaux seront entraînés à coopérer (renforcement positif) de manière à diminuer au maximum le stress de l’animal engendré par l’expérimentateur et/ou l’appareillage (tapis roulant). Pendant l’expérimentation La majorité des procédures utilisées nécessitera une anesthésie générale dont les effets seront potentialisés par une prémédication à la buprénorphine. Nos procédures seront pour la grande majorité « sans réveil », il n’en demeure pas moins qu’une vigilance particulière sera accordée aux soins pré- et per-opératoires. Nos procédures ne nécessiteront pas d’établir des points limites néanmoins, en ultime recours, nous prendrons les dispositions nécessaires afin de limiter toute souffrance animal par le biais d’une mise à mort par injection i.p. d’Euthasol. Après l’expérimentation Afin d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de notre expérimentation, une analyse statistique rigoureuse sera effectuée (cf point 3.3.6.2.).
Choix des espèces
Pour le Rat : -Forte analogie dans l’organisation des vaisseaux cérébraux homme/rat -Volume du cerveau et taille des vaisseaux appropriés aux techniques de dosages utilisées. Néanmoins, pour valider notre hypothèse selon laquelle l’endothélium est une source importante de BDNF cérébral, nous nous sommes orientés vers la fabrication et la caractérisation sur les plans cardiovasculaire et cérébral d’une souris génétiquement modifiée incapable de fabriquer du BDNF endothélial (endoBDNF -/-). Bien que les tailles du cerveau et des vaisseaux de souris soient plus petits, il n’en demeure pas moins que la morphologie du réseau vasculaire cérébral est hautement conservée entre rats et souris. La fabrication de la souris endoBDNF-/- a été financée par le Projet Structurant d’Envergure Région Bourgogne France Comté « BDNF cardiovasculaire et fonction cognitive » (106 364€) et sera valorisée par 3 équipes de recherche: INSERM U1093 CAPS(Dijon), EA4267 PEPITE(Besançon) et EA-481(Besançon). Les rats (Wistar) et les souris (C57BL/6J, endoBDNF-/- et littermates) seront utilisés au stade jeune adulte soit entre 7 et 9 semaines afin de s’affranchir des effets de l’âge sur le système cardiovasculaire et le système nerveux central.
Impact de la combinaison d’une exposition prénatale aux polluants atmosphériques et au stress sur le développement et le fonctionnement cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 180 tuées à l'issue et 60 réutilisées comme souris visiteuses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont exposées à une atmosphère reconstituant la pollution de Pékin, leurs descendants reçoivent une puce RFID, subissent trois contentions de 45 minutes puis des tests d'interactions sociales, de mémoire et d'anhédonie, cinq par groupe passant une imagerie cérébrale sous anesthésie. Le porteur indique viser des biomarqueurs et des conseils de prévention aux familles et aux décideurs, retombées renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que le niveau d'intégration cognitif requis interdit les modélisations informatiques et les espèces autres que les mammifères.
Objectifs
La pollution atmosphérique est un problème majeur de santé publique dans les zones urbaines. Outre les conséquences directes de l'inhalation de polluants sur le système cardiorespiratoire et les décès prématurés, l'exposition prénatale à la pollution urbaine serait associée à une augmentation du risque de développer des troubles psychiatriques, comme l’autisme ou la schizophrénie. Les dommages cérébraux liés à la pollution ont principalement été étudiés chez l’homme au travers d’études épidémiologiques. Ces dernières sont souvent limitées par des facteurs de confusion, qui résultent de l’histoire personnelle de l’individu et de l’évaluation rétrospective de l’exposition aux polluants. En outre, elles ne permettent généralement pas d’évaluer comment ces polluants affectent le système nerveux central. Les modèles animaux apportent des solutions à ces limites. Ils permettent une maîtrise des conditions d’exposition et la reproductibilité des expériences. Notre projet propose ainsi d’évaluer l’impact de l’exposition prénatale à des polluants atmosphérique sur le développement cérébral et le comportement. Par ailleurs, la vulnérabilité aux troubles psychiatriques correspond à une sensibilité qui varie d’un individu à l’autre. Celle-ci est conférée par des facteurs génétiques ou environnementaux, rendant les individus plus sensibles à des facteurs externes comme le stress. Afin de tester si la vulnérabilité induite par une exposition prénatale à des polluants atmosphériques augmente la sensibilité au stress, des souris gestantes seront exposées au cours de leur dernière semaine de gestation à une atmosphère type de la ville de Pékin, dans laquelle les taux de polluants moyens enregistrés dépassent les seuils limites recommandés par l’Organisation Mondiale de la Santé. Chez la descendance des souris exposées, nous évaluerons l’impact d’une telle exposition sur le comportement des animaux et en particulier sur leurs interactions sociales, connues pour être altérées dans l’autisme et la schizophrénie. Afin de tester la sensibilité au stress, la moitié des animaux sera exposée avant les tests à un stress aigu et l’autre non. Sur ces deux groupes d’animaux, nous testerons les capacités cognitives et sociales. Nous étudierons également la structure et le fonctionnement cérébral. Notre projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Les souris seront exposées à la pollution dans le premier et le comportement des descendants sera étudié dans le second.
Bénéfices attendus
Des résultats préliminaires obtenus dans le cadre d’un précédent projet ont montré une diminution des interactions sociales chez des femelles adolescentes dont les mères avaient été exposées à la pollution atmosphérique de la ville de Pékin, mais aucune différence n’avait été observée pour les mâles. Des différences d’expression de plusieurs gènes chez ces mêmes souris femelles ont également été montrées alors qu’aucune différence significative n’a été observée chez les mâles. Cette étude nous permettra de voir si les différences d’interactions sociales observées chez les femelles exposées in utéro à la pollution atmosphérique sont associées à des modifications cérébrales qui pourraient servir de biomarqueurs d’une telle exposition chez l’homme. Elle nous permettra également d’évaluer les conséquences de la combinaison de deux facteurs d’exposition environnementaux sur les comportements cognitifs sociaux et non sociaux non seulement chez les femelles, mais également chez les mâles chez qui aucune différence n’a pu être observée jusqu'alors. Cette double exposition, proche des conditions écologiques rencontrées par l’homme au cours de sa vie, nous permettra d’établir des stratégies de communication auprès des décideurs publiques ou de prévention dans les familles de personnes avec des troubles psychiatriques en leur conseillant d'éviter de vivre dans des zones fortement exposées à la pollution.
Procédures
La moitié des femelles gestantes sera exposée à une pollution atmosphérique type, équivalente à celle rencontrée dans la ville de Pékin dans le premier établissement utilisateur. Dans le second établissement, la moitié des animaux étudiés sera soumis à trois stress de contention d'une durée de 45 minutes qui précédent les tests d’interactions sociales et le premier test de mémoire. Tous les animaux étudiés seront soumis à des tests de comportement mesurant les interaction sociales (1 fois 10 min), la cognition (test de mémoire, 1 fois 10min puis le lendemain 2 fois 10 min) et l'anhédonie (3 jours consécutifs). Cinq animaux par groupe seront anesthésiés pour être étudiés par imagerie cérébrale. A 12 mois, les animaux qui n'auront pas été étudiés par imagerie cérébrale seront soumis à un test de reconnaissance sociale (3 fois 10 min) et un test de locomotion et d'anxiété (1 fois 10min).
Impact sur les animaux
Une puce RFID sera injectée à tous les descendants des souris gestantes. La moitié de ces descendants sera exposée trois fois à un stress de contention pendant 45 minutes avant l'évaluation de leurs interactions sociales et de leur cognition. Avant les tests d'interactions sociales, les animaux seront isolés pendant 30 min. Les animaux seront isolés pendant les tests de cognition pour des sessions inférieures à 10 min. Les animaux étudiés pour l’imagerie cérébrale seront anesthésiés. Les animaux soumis à des stress de contention sont considérés impliqués dans une procédure de sévérité modérée. Les autres animaux subissent une procéure de sévérité légère.
Devenir
Tous les animaux d'étude, c'est-à-dire les descendants des mères exposées (N=120), seront mis à mort à la fin de la procédure pour étudier leur cerveau. Les mères (N=30) seront mises à mort après le sevrage pour étudier l'impact de l'exposition directe à la pollution sur leur cerveau. Les souris visiteuses pour les tests des interactions sociales (N=60) seront réutilisées dans d'autres projets.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant et ne peuvent donc être remplacés par des modélisations informatiques. Pour les mêmes raisons, ces expériences ne peuvent pas être conduites chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
Toutes les méthodes possibles sont utilisées pour limiter le nombre d’animaux et prendre en compte leur bien-être et leur potentielle souffrance. La réduction du nombre d’animaux sera liée au fait que les mêmes animaux seront étudiés par plusieurs tests de comportement (interactions sociales, cognition sociale et non sociale, anhédonie). Ces mêmes animaux seront également utilisés pour des analyses neuroanatomiques. Les tests statistiques nous permettent d'estimer que nous devons utiliser 15 animaux par groupe pour chaque condition expérimentale pour que le nombre d’animaux utilisés corresponde au minimum requis pour que les données soient scientifiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont exposés in utéro à des atmosphères polluées (exposés) et non polluées (contrôles) en isolateurs dans des cages enrichies. Après leur exposition, les animaux seront transportés en groupes par un transporteur agréé en cages de transport. Lors du transport, les cages seront munies d'un enrichissement (papier permettant de réaliser des nids), de nourriture sous forme de pellet et d'eau sous forme de gelée. Tout au long des expériences les animaux seront maintenus en conditions standard comportant un enrichissement (cotons permettant de réaliser des nids, éléments de jeux tels que tunnels, bâton de bois, igloos). Afin de suivre leur évolution individuelle, ils seront identifiés à l’aide de puces RFID injectées en sous cutanés à la base du cou au moment de leur sevrage (P21) grâce à une procédure non invasive sans anesthésie ni chirurgie. Nous étudierons l’effet sur les deux sexes pour vérifier l’absence de différence entre les sexes. Les animaux seront observés tous les jours pour détecter toute manifestation de souffrance. Nous surveillerons particulièrement les changements de poids, l’apparence physique (poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés) et le changement de comportement (vocalisations non-sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile, yeux fermés). En cas de signes de mal-être, la fréquence d’observation passera à 2 fois par jour. En cas de persistance au-delà de 48h, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant qui ne peuvent être remplacés par des modélisations informatiques ou des espèces autres que les mammifères. Nous étudierons le comportement des animaux à partir de l'adolescence (à partir de 30 jours post-natal) et jusqu'à l’âge adulte (>P90), car c'est une période clé du développement cérébral pour des manifestations phénotypique caractéristiques des troubles du spectre autistique ou de la schizophrénie (troubles cognitifs, de la communication et des interactions sociales). Nous étudierons également les animaux au cours du vieillissement, car l'exposition précoce à la pollution atmosphériqu a été associée chez l'homme à l'apparition anticipée de marqueurs de vieillissement.
Activités de référence et de recherche liées aux différentes espèces de Trichinella
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
9535 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque souris reçoit une infestation orale par le parasite Trichinella, que le porteur décrit comme asymptomatique chez cet hôte, avant sa mise à mort pour collecter muscles, intestins et moelle osseuse. Le projet sert à entretenir une collection de souches et à produire des antigènes de référence pour le diagnostic, sans analyse statistique du nombre d'animaux. Le porteur affirme qu'aucun cycle du parasite n'est réalisable sans la souris, tout en présentant à long terme des protéines recombinantes censées éviter ce recours.
Objectifs
Trichinella est un parasite nématode cosmopolite qui infeste tous les mammifères monogastriques. Il circule principalement dans la faune sauvage mais aussi chez les porcs domestiques plein-air. On le retrouve en Europe principalement chez les renards, loups, sangliers, porcs et petits rongeurs. Les larves musculaires de ce parasite sont présentes dans les cellules musculaires striées squelettiques de l’hôte infesté et y survivent pendant plusieurs années. Les animaux se contaminent en consommant des carcasses contaminées. L’homme se contamine lui aussi par la consommation d’une viande crue ou peu cuite, voire des produits charcutiers puisque ni la fumaison, ni la salaison ne sont des méthodes assainissantes. Il n’existe pas de traitement contre Trichinella ni de vaccins. Le règlement EU 2020/1478 impose le diagnostic systématique à l’abattoir des carcasses d’animaux sensibles. Concrétement, en France tous les chevaux, tous les porcs plein-airs et les porcs reproducteurs sont contrôlés par les services vétérinaires (Laboratoires Départementaux d’Analyses) ainsi que les sangliers selon les circuits de distribution. Le projet soumis visera à répondre aux besoins de préparation de matériel de référence pour le diagnostic et le maintien de la souchothèque de Trichinella indispensable à ces activités. Ce projet aura également pour objectifs de développer de nouveaux outils, des antigènes d’intérêt de diagnostic et/ou vaccinaux qui permettraient de recourir à l’ingénierie de production de protéines recombinantes, évitant ainsi la production d’antigènes sur animaux à l’avenir.
Bénéfices attendus
Le projet permettra des bénéfices immédiats pour : - la protection des consommateurs par le suivi d’un plan assurance qualité permettant de vérifier la performance des contrôles sanitaires des viandes issues d’espèces animales sensibles à Trichinella (porcs, chevaux, sangliers) ; - le suivi des status sérologiques des animaux (porcs, sangliers); - la détection de la maladie chez l’humain par la production de réactifs de référence fiables et reproductibles destinés aux producteurs de trousses commerciales de diagnostic. Les bénéfices attendus à plus long terme : - l’amélioration des tests de détection (animaux et humains) ; - production de protéines recombinantes en remplacement du recours aux animaux (souris) pour la production d’antigènes issus des parasites ; - identification de cibles vaccinales pour protéger les élevages porcins et permettre l’amélioration du bien-être animal en évitant la contamination des porcs plein-air.
Procédures
La seule intervention qui sera faite sur les animaux consistera en une infestation par voie orale du parasite Trichinella. Les animaux ingéreront un volume de 20 uL d’eau contenant les larves. Cela se réalise une seule fois sur chaque animal.
Impact sur les animaux
L’infestation par Trichinella spp. est asymptomatique chez l’animal (contrairement à l’humain) et n’induit pas d’inconfort ou de stress chez l’animal. Les souris infectées ne sont pas contagieuses entre-elles et peuvent de fait rester en groupe de 5 individus dans une cage.
Devenir
Les animaux étant infestés par un parasite zoonotique, ils doivent être mis à mort en fin d’expérimentation d’autant plus que nous aurons besoin de collecter les tissus : muscles, intestins grêles ou moëlle osseuse en post mortem. Les souris seront donc toutes mises à mort.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de réaliser un cycle parasitaire de Trichinella sans recours à l’animal. Nous ne nous pouvons donc pas nous affranchir des modèles souris qui restent à l’heure actuelle les plus communément utilisés à la fois pour l’entretien des souches parasitaires, pour les préparations de lots d’antigènes et pour l’étude des relations hôtes-parasites.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au maximum pour les différentes expérimentations prévues sans risquer de compromettre les résultats. Pour l'une des expérimentations de ce projet une première étape se fera sur culture cellulaire ce qui permettre de réaliser une première sélection avant de faire une confirmation des résultats par expérimentation animale. Enfin les souris naïves utilisées pour la collecte de moëlle osseuse dans une des expérimentations animales seront aussi utilisées pour la collecte de muscles afin de réduire le nombre de souris utilisées. Aucune analyse statistique ne sera réalisée.
Raffinement
L’infection par Trichinella ne provoque pas de symptômes chez l’animal aux doses que nous utilisons, ni douleur, ni stress. L’infection se fait par voie orale sous un volume de 20 uL pour la souris. Néanmoins, lors de la surveillance quotidienne des animaux si une souffrance était constatée l’animal serait mis à mort. Les souris sont hébergées par groupe de 5 dans une même cage. L'hébergement se fera en présence d'enrichissement classique (carré de coton, abri en plastique, balcon, roue).
Choix des espèces
L’espèce souris est particulièrement sensible à l’ensemble des souches parasitaires de Trichinella et constitue l’espèce animale privilégiée pour l’entretien de la souchothèque. Elles seront commandés à un poids (20 à 30g ) permettant une infection avec une charge parasitaire optimale pour obtenir le meilleur rendement par animal tout en restant asymptomatique et limiter ainsi le nombre d’animaux.
Etude de l’effet d’inhibiteurs de cytokines, d’interleukines et d’intégrines sur des modèles de rétinopathies prolifératives murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rétinopathies leur sont induites par une exposition des mères et des portées à 75 % d'oxygène, par impacts laser sur l'œil ou par ultrasons, suivis d'injections intraoculaires répétées de composés à tester. Le porteur reconnaît une détresse respiratoire des mères, euthanasiées dès le retour à l'air normal, les souriceaux étant confiés à une mère adoptante. Il affirme que la néovascularisation de la rétine ne peut être modélisée in vitro et justifie ainsi le recours à la souris.
Objectifs
Les pathologies ophtalmiques tel que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) sont les premières causes de handicap visuel chez les personnes adultes. Ces pathologies, sont caractérisées dans leur forme tardive par l’apparition de néovaisseaux pathologiques, de fuites vasculaires et d’une inflammation chronique qui peuvent mener à une cécité définitive. Actuellement la prise en charge des patients est composée d’injections intraoculaire répétées d’anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Cependant, certains patients restent ou deviennent résistants à ce traitement. Dans ce contexte, nous proposons de tester l’effet de molécules inhibitrices de l’inflammation et/ou de la vascularisation dans divers modèle murin mimant la DMLA et la RD.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’effet anti-angiogénique de certaines molécules dans les différents modèles de rétinopathie et de dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) chez la souris, ce qui pourrait par la suite bénéficier aux patients atteints de rétinopathie diabétique proliférante ou de DMLA humide.
Procédures
Dans le cas de la rétinopathie induite par l’oxygénation : Les femelles et leurs portées seront vigiles et seront soumises à une concentration d’oxygène de 75 pour cent pendant 5 jours. Les souriceaux vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1 min/souris). Dans le cas de la sonication : Les souris seront anesthésiées pendant 5 mins et vont être soumises à une injection intrapénienne et à des ondes ultrasons au niveau de l’œil pendant 60 secondes. Par la suite, des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont être réalisées 1 fois par jour pendant 7 jours sur souris anesthésiées afin d’évaluer l’évolution des fuites vasculaire causé par la sonication. Enfin, deux injections intraoculaires de composé thérapeutique (1min/souris) seront réalisées sur souris anesthésiées. Dans le cas de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser : Les souris seront anesthésiées et vont recevoir 4 impacts laser par œil, la durée de ce traitement est d’environ 1 min par souris. Des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont ensuite être réalisés 1 fois par jour pendant 7 jours chez ces souris anesthésiées afin d’évaluer la croissance vasculaire liée aux impacts laser. Les souris vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1min/souris). Après la réalisation des actes décrits, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Le modèle de rétinopathie induit par l’oxygène (OIR) peut induire chez les femelles un stress physique et une douleur causer par une détresse respiratoire. Ceci peut donc engendrer chez les souriceaux une malnutrition ainsi qu’un stress thermique. La sonication, le laser ainsi que les injections intra oculaires peuvent engendrer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire dû à l’anesthésie mais également une légère douleur au niveau de l’œil causé par une neuro-inflammation.
Devenir
A l’issu des expérimentations les souris vont être euthanasiées, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
La néovascularisation caractéristique de la rétinopathie diabétique et de la dégénérescence maculaire liée à l'age (DMLA) ainsi que les fuites vasculaires sont le résultat d’une interaction complexe entre les vaisseaux de la rétine de la choroïde et de leur environnement. Ceci ne peut pas être modélisée complètement in vitro
Réduction
Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire (1621) pour avoir une puissance statistique suffisante afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences. Les variabilités interanimal et inter-expériences ont pu être déterminées au cours d’expérimentations précédentes avec des protocoles identiques autorisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 ou par portée dans des cages ventilées. Pour les femelles et leurs portées, les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Pour les mâles, les cages comportent plusieurs cotons et un bâton à ronger. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou par le personnel de l’animalerie. Les animaux auront une période de 5 jours d’acclimatation avant l’expérimentation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. L’âge des animaux est suivi par rapport à leurs dates de naissance (fournies par le fournisseur) qui sont indiquées sur les étiquettes de leurs cages. Les animaux sont numérotés par des bagues à l’oreille. Si nécessaire et en cas d’agressivité les mâles seront séparés et isolés (seul par cage). Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasirons les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante à la sortie du caisson. Lors des procédures expérimentales les souris seront sous anesthésie général, sous anesthésie local pour les injections intraoculaires et sur un tapis chauffant pour prévenir tous risquent d’hypothermie. Toute atteinte oculaire inattendue (inflammation, gonflement) entrainera l’euthanasie de l’animal).
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé dans les maladies oculaires. En effet, le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) et de sonication sont 3 modèles qui ont été établie chez la souris. La souris est un petit animal facile à manipuler et qui comporte beaucoup de similitude physiologique avec l’homme. Dans le cas de l’OIR les animaux seront utilisés dès 7 jours de vie. La mise en place des vaisseaux rétiniens se fait lors des 3 premières semaines de vie de la souris, l’hyperoxygénation entre le 7ème et le 12ème jour de vie de la souris nous permet d’induire une rétinopathie. Dans le cas du CNV et de la sonication les souris seront utilisées à partir de la 8 semaines de vie, en effet c’est l’âge ou le système visuel et inflammatoire de la souris est établi.
POTENTIEL THERAPEUTIQUE D’UN CIBLAGE DES MEMBRES DE LA FAMILLE DE LA TRISTETRAPROLINE, DE LA PROTEINE HUR, de RBM3, de la galectine-1, de la GAL3BP ET DES P-BODIES DANS LES MALADIES CHRONIQUES HEPATIQUES ALCOOLIQUE ET NON-ALCOOLIQUES ET LE CARCINOME HEPATOCELLULAIRE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2728 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une maladie chronique du foie et un cancer hépatique leur sont induits par des régimes gras ou alcooliques et des injections de carcinogènes comme le tétrachlorométhane et la diéthylnitrosamine, avec un suivi par IRM et un isolement d'hépatocytes par exsanguination terminale. Le porteur affirme que la plupart de ces protocoles n'occasionnent "aucune souffrance", les désordres métaboliques et tumeurs restant selon lui asymptomatiques tant que le foie fonctionne. Il conclut que le recours aux souris ne peut être remplacé par des modèles in vitro pour ces mécanismes inter-organes.
Objectifs
Le syndrome métabolique, l’obésité, l’infection par des virus de l’hépatite B et C ainsi qu’une consommation abusive et fréquente d’alcool, sont des causes majeures de pathologies hépatiques chroniques. Ces maladies sont associées à une accumulation de graisse dans le foie qui va progressivement induire une lipotoxicité et de nombreuses altérations cellulaires et métaboliques. Ces altérations conduisent au développement progressif d’une inflammation et d’une fibrose hépatique, qui peut ultimement dégénérer vers une cirrhose hépatique et un carcinome hépatocellulaire (CHC). Nos travaux au laboratoire ont permis de mettre en évidence le rôle critique de protéines appelées «AUBPs » (AU-rich elements binding proteins), qui régulent la dégradation et la traduction des ARNm. Nos travaux précédents ont permis de mettre en évidence l’importance de ces protéines dans le développement des hépatopathies stéatosiques non-alcooliques et le CHC. Nos travaux précédents et nos données préliminaires ont également mis en évidence l’altération d’oncogènes appellés “Galectines” à des étapes précoces comme la stéatose et qui pourrait donc jouer un rôle crucial dans la progression de la stéatose vers le CHC. Cependant, le rôle de ces protéines, dans les pathologies hépatiques reste à ce jour peu connu. Afin de mieux comprendre le rôle de ces protéines in vivo, notre projet suivra les objectifs suivants : 1. Etudier les conséquences des altérations de l’expression/de l’activité de nos candidats sur la physiologie, la survie et la prolifération des hépatocytes. 2. Etudier le rôle de nos candidats dans la stéatose et la fibrose hépatique. 3. Elucider le rôle physiopathologique de nos candidats in vivo dans le développement du carcinome hépatocellulaire.
Bénéfices attendus
De nombreuses études indiquent que le régime alimentaire, le diabète et l’obésité mais aussi la consommation chronique et excessive d’alcool représentent des facteurs de risque important pour le cancer du foie. En raison de l’augmentation rapide et mondiale de ces maladies, une augmentation des cas de cancer du foie est attendue dans un futur proche. Le rôle de nos protéines d’intérêt dans le développement des maladies chroniques du foie et du carcinome hépatocellulaire (CHC) reste encore peu connu. Les expériences prévues dans cette demande devraient apporter des informations importantes concernant la fonction de ces protéines mais aussi d’évaluer le potentiel thérapeutique de leur ciblage afin de prévenir les maladies métaboliques du foie et leur progression vers le CHC.
Procédures
Procédure 1 : Régime prolongé en graisse et sucre (4 semaines); Régime alcoolique (10 jours); Anesthésie kétamine/xylazine (isolement hépatocytes: 1 x 10 min. Procédure 2 (Durée totale du protocole: 16 semaines): Injection de virus adéno-associés (AAV8: 1 x 10 min); Régime prolongé en graisse et sucre (12 semaines); Tests tolérances glucose (GTT)/ pyruvate (PTT)/ insuline (ITT) (2 heures/test); Cages Métaboliques (habituation + expérience: 8 jours); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 3 (Protocole C1: durée totale du protocole : 28 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (2 x 10 min); Régime prolongé en graisse et sucre (24 semaines); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 3 (Protocole C2: durée totale du protocole : 8 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime déficient en méthionine et choline (4 semaines); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 4 (Protocole D1: durée totale du protocole: 38 jours) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime alcoolique (10 jours); Injection tétrachlorométhane (CCL4: 1 x 10 min); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 4 (Protocole D2: durée totale du protocole : 8 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime alcoolique (4 semaines); Injection CCL4 (12 x 10 min); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 5 (durée totale du protocole : 9 mois): Injection de diethylnitrosamine (DEN: 10 x 10 min); Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Imagerie (IRM: 1 x 30 min/mois pendant 7 mois); Mise à mort (1 x 10 min); Régime alcoolique (2.5 mois). Procédure 6 (durée totale du protocole : 9 semaines): Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques (par injection i.v : veine caudale sans anesthésie: 1 x 10 min); Imagerie (IRM: 1 x 30 min/semaine); Mise à mort (1 x 10 min).
Impact sur les animaux
L’expression de nos protéines d’intérêts sera modulée à l’aide de vecteurs viraux permettant d’augmenter ou de diminuer l’expression de nos protéines spécifiquement dans les hépatocytes (Protocoles B, C, D et E). Nos travaux précédents ont démontré que cette méthode n’occasionne aucune souffrance chez les animaux et est très efficace pour moduler l’expression des gènes au niveau hépatique. L’injection de virus par voie rétro-orbitale est une procédure maitrisée qui n’occasionne aucune nuisance particulière. Une approche pharmacologique, avec des inhibiteurs d’une protéine appelée “HuR” est également proposée. D’après la littérature, aucune souffrance n’est attendue chez les animaux traités avec ces molécules. Dans nos procédures B, C et D, nous prévoyons d’utiliser des modèles de stéatose et fibrose hépatique induit par des régimes alimentaires (régime riche en graisse et en sucre ou avec une diète alcoolique). Nous n’attendons pas de souffrance particulière chez les animaux nourris avec ces diètes. Nos études précédentes ont montré que le développement de la stéatose et de la fibrose hépatique induite par ces régimes n’occasionne aucune souffrance chez les animaux. Pour la procédure d’isolement d’hépatocytes primaires (Protocole A), une anesthésie profonde de l’animal suivi d’une exsanguination par ouverture de la veine cave est réalisée. Cette procédure terminale est donc rapide et n’induit aucune souffrance particulière chez les animaux. Le développement de tumeurs (Protocole E) hépatiques peut induire une insuffisance hépatique qui se manifesterait par un ictère, une diminution de l’activité physique, une prostration ainsi qu’une diminution de la prise alimentaire et du poids du sujet. Cependant, le développement de petites et moyennes tumeurs dans le foie (
Devenir
Pour la procédure expérimentale 1, l’isolement des hépatocytes primaires de souris est une procédure terminale qui implique la digestion du foie par de la collagénase. L’isolement des hépatocytes est une étape clé dans ce projet qui nous permettra de confirmer les résultats obtenus sur des lignées cellulaires immortalisées sur les hépatocytes. Pour les autres procédures (2 à 6), les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de récupérer le foie mais aussi les autres organes métaboliques (tissus adipeux, pancréas, muscle) et le plasma dans le but d’étudier l’impact de la modulation de l’expression (AAV8) ou de l’activité de nos candidats (TTP, BRF1, BRF2, HuR, EDC4, RBM3, LGALS1, LGALS3BP) dans les processus associés aux pathologies chroniques hépatiques (alcooliques et non-alcooliques) et la carcinogenèse hépatique.
Remplacement
L’utilisation d’animaux ne peut actuellement pas être substituée par des modèles alternatifs in vitro ou in silico, pour étudier les altérations métaboliques ou hépatiques. D’une part, les pathologies hépatiques nécessitent le concours et la communication de différentes cellules composant le foie (i.e, cellules de Kupffer, cellules stellaires, cellules immunes, cellules endothéliales, etc). D’autre part, un contrôle par le système nerveux central et périphérique du métabolisme hépatique, ainsi que la communication entre les organes (par exemple foie-muscle, foie-tissu adipeux ou foie-pancréas) et le système immunitaire jouent un rôle clé dans le développement de ces pathologies. Concernant la carcinogénèse hépatique, il est également bien établi que le microenvironnement tumoral composé de vaisseaux sanguins mais aussi de fibroblastes et de cellules immunitaires, joue un rôle primordial et déterminant dans l’initiation et le développement de cancers au sein d’un organe. La plupart des modèles cellulaires disponibles (cultures ou co-cultures en 2D ou 3D) in vitro sont des cellules cancéreuses qui ont déjà été transformées (mutations) et dont le métabolisme est fortement altéré. L’absence d’un microenvironnement physiologique, de vascularisation et d’interactions avec le système immunitaire rendent ce type d’étude in vitro sur le métabolisme et le cancer peu pertinent et difficile à extrapoler aux situations in vivo chez la souris et encore plus chez l’humain. A l’heure actuelle, ces systèmes in vitro ne permettent donc ni d’étudier des processus métaboliques complexes, ni la progression tumorale dans un contexte physiopathologique pertinent au sein d’un organe particulier ou de tout l’organisme. En accord avec cette notion consensuelle dans ce domaine de recherche, nous avons montré dans le cadre d’une étude précédente, des divergences importantes entre les données in vitro et in vivo. En effet, l’une de nos études étudiant le rôle d'une protéine appelée "tristetraproline" (TTP) dans le développement de CHC, a démontré un rôle suppresseur de tumeur de cette protéine in vitro et oncogénique in vivo. Les analyses in vivo nous apportent donc des informations clés et actuellement impossibles à obtenir avec des méthodes alternatives permettant de mieux comprendre la physiopathologie de ces cancers et la pertinence des candidats potentiellement susceptibles de représenter des cibles thérapeutiques chez l’humain.
Réduction
Des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour chaque expérience ont été effectué sur la base de données publiées antérieurement et de notre propre expertise dans ce domaine. Ces analyses nous permettent de limiter le nombre d'animaux de façon importante tout en assurant l’obtention de résultats significatifs. Effectuer les expériences planifiées avec un nombre d’animaux plus restreint est selon notre opinion éthiquement discutable, car hautement susceptible de ne pas permettre l’obtention de résultats pertinents. Une telle situation invaliderait nos expériences rendant tous nos efforts de recherche inutiles ainsi que l’utilisation et la mise à mort d’animaux vaines. Il est à noter également que la constitution de bio-banques avec les organes et tumeurs résultant de ces études sont susceptibles d’être réutilisés dans des projets futurs (en particulier les groupes contrôles) réduisant ainsi le nombre d’animaux à utiliser ou le besoin de recourir à l’expérimentation animale dans de futures études. La mise en place de protocoles non-invasifs de bio-imagerie médicale (IRM et CT-scan) permet d’optimiser la qualité des résultats (nombres et tailles des tumeurs qui se développent au cours du temps). Mais surtout, ces protocoles donnent lieu à une forte diminution du nombre d’animaux car ils évitent la mise à mort de différents groupes d’animaux en fonction du temps pour étudier le développement et la progression des cancers hépatiques.
Raffinement
Pour affiner les conditions expérimentales, nous avons fixé des règles fermes quant aux limites de l'expérience. En effet, comme décrit, le poids, l'apport alimentaire, l'activité, le développement des tumeurs et l'état général des souris seront suivis de près et des analgésiques seront administrés en cas de besoin. Si les limites de l'expérience sont dépassées et que les analgésiques n'ont pas d'effet positif (après 24h), les animaux seront mis à mort. Nous aimerions cependant rappeler encore une fois que les désordres métaboliques et le développement de tumeurs hépatiques restent principalement asymptomatique chez la souris (comme chez l’humain) tant que la fonction du foie est préservée (entre 10 et 20% d’hépatocytes encore fonctionnels), ce qui est le cas dans la majorité des protocoles proposés. Le nombre d’animaux, et la mise à mort de différents groupes d’animaux en fonction du temps pour étudier le développement et la progression des cancers hépatiques ont été fortement diminués, en particulier grâce à la disponibilité et la mise au point de protocoles non-invasifs de bio-imagerie médicale (IRM et CT-scan). Ce choix nous permettra également d’optimiser la qualité de nos résultats (nombres et tailles des tumeurs qui se développement au cours du temps). Finalement, l'anesthésie sera utilisée pour toutes les injections afin d'éviter le stress de l'animal, mais aussi pour éviter les blessures accidentelles lors de l'intervention. Les mâles agressifs seront aussi séparés du reste de la cage pour éviter les combats.
Choix des espèces
Pour l’ensemble des protocoles de cette autorisation, des souris mâles seront utilisées. Tout comme chez l’humain, les œstrogènes ont un rôle protecteur sur le développement de CHC chez la souris. Il est donc plus difficile d’induire de manière efficace et reproductible des tumeurs hépatiques chez les femelles. Par ailleurs, les œstrogènes peuvent prévenir du développement de la stéatose. Il est donc préférable d’utiliser des souris mâles pour étudier les maladies chroniques hépatiques. Les souris C57BL/6J seront utilisées car cette lignée répond très bien aux diètes obésogènes ou aux diètes déficientes en choline/méthionine. Ces souris sont infectées par des virus avec un très bon rendement. En effet, plus de 80% de leurs hépatocytes expriment les gènes encodés par ces virus d’après nos expériences. La totalité des C57BL/6J développent des tumeurs dans les conditions expérimentales utilisées. Ce modèle de souris, tout comme le développement de CHC à la suite d’une induction par DEN ou après une transfection hydrodynamique de MYC et p53 muté, ont été validé par de multiples études, y compris les nôtres, auparavant.
Induction de tumeurs pulmonaires dans un modèle de souris mutantes K-rasG12D et implication de la protéine Atad2 (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intra-trachéale unique de particules virales déclenchant une mutation cancéreuse dans les poumons, avant d'être tuées pour analyse pulmonaire. Ce volet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer des données sur le rôle d'un facteur à bromodomaine dans le cancer du poumon. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reflète la dynamique observée in vivo et conclut à la nécessité du modèle animal.
Objectifs
La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.
Bénéfices attendus
Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.
Procédures
Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.
Impact sur les animaux
Dans cette partie du projet, les souris recevront les particules virales.
Devenir
A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.
Remplacement
Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.
Réduction
Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.
Raffinement
Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.
Choix des espèces
Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.
Evaluation de l’état de santé de la population de baleines à bosse de La Réunion en lien avec le réchauffement climatique
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux par an sur quatre ans) vont être biopsiées dans leur milieu naturel puis laissées sur place, dans des procédures classées en souffrance légère. Le prélèvement de peau, réalisé par tir d'un emporte-pièce à courte distance sur animal vigile, provoque une réaction de surprise, un spasme et une accélération de la nage, que le porteur présente comme sans conséquence importante d'après la littérature. Le projet vise à évaluer l'état de santé de la population face au réchauffement climatique et au dérangement lié au whale-watching. Le porteur affirme qu'aucun autre modèle ne peut se substituer au prélèvement sur ces baleines sauvages.
Objectifs
Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les caractéristiques biochimiques tels que les indices d’adiposité, de fécondité et du régime alimentaire (isotopes stables et acides gras) sont intimement corrélés aux conditions environnementales. Dans le contexte du réchauffement climatique, ce programme se propose d’échantillonner 40 individus (30 adultes et 10 baleineaux) par an sur une période de 4 ans (2023-2026), dans le but de contribuer à une vision d’ensemble sur l’état de santé des populations de baleines à bosse de l’Hémisphère sud et d’évaluer leur vulnérabilité face au changement climatique. Au niveau local, ces données apporteront des connaissances importantes pour évaluer le niveau de vulnérabilité des individus venant se reproduire dans la zone d'étude, face aux dérangements répétés et aux perturbations liés à l’activité croissante du « whale-watching ». Ces données permettront également de mieux interpréter les modèles visant à expliquer l’influence de facteurs environnementaux sur le niveau de fréquentation de la zone d'étude par les baleines.
Bénéfices attendus
Ce programme se propose d’échantillonner au maximum 40 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux) par an sur une période de 4 ans (2023-2026) en vue d’analyser divers paramètres biochimiques (indices d’adiposité, de fécondité et marqueurs de régime alimentaire-isotopes stables et acides gras). Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les paramètres biochimiques pré-cités sont intimement corrélés aux conditions environnementales. L’évaluation de ces paramètres biochimiques pour cette population permettra de disposer d’un état de référence pour ce stock, tout en suivant son évolution temporelle. De plus, la comparaison de ces paramètres biochimiques avec ceux des autres stocks permettra de disposer d’une vision globale de l’état de santé des populations de baleines à bosse à l’échelle de l’Hémisphère sud. Ces données seront également pertinentes pour la mise en place de mesures de gestion à l’échelle locale afin de préserver la quiétude des animaux venant se reproduire dans la zone d'étude.
Procédures
Les biopsies cutanées seront effectuées sur animaux vigiles. Un animal sera prélevé une seule fois. La biopsie cutanée dure généralement quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les biopsies cutanées sont réalisées sur de nombreuses espèces de cétacés, des plus petits delphinidés aux plus grands mysticètes. De nombreuses publications scientifiques sont disponibles sur l’impact de la pratique des biopsies sur les individus et les populations. Sur les grands cétacés, il a été montré que la pratique de biopsies n’a pas de conséquences importantes. De plus, bien qu’il y ait généralement une réaction de surprise lors de l’impact (spasme du corps, accélération de la nage), les animaux reviennent rapidement à leur activité initiale.
Devenir
Les objectifs du projet impliquent le prélévement de biopsie cutané sur des animaux vivants dans leur milieu naturel. Les individus prélevés seront laissés dans leur habitat naturel
Remplacement
Les objectifs du programme imposent le prélèvement de biopsie cutanée sur des baleines à bosse dans le but d’évaluer l’état de santé la population par l’analyse de divers paramètres biochimiques (indices d’adiposité, de fécondité et marqueurs de régime alimentaire) en vue notamment de leur conservation. Aucun autre modèle ne peut être substitué.
Réduction
Dans un souci de comparaison des paramètres biochimiques analysés avec les autres stocks de baleines à bosse de l’Hémisphère sud, ce programme se propose d’échantillonner, via une biopsie cutanée un maximum de 40 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux) par an, sur une période de 4 ans (2023-2026) dans la zone d'étude. Le nombre choisi permet de disposer d’un nombre suffisant de biopsies pour des analyses statistiques fiables, tout en permettant d’échantillonner une portion restreinte de la population. Le nombre d’échantillons prélevés sera adapté en fonction de la fréquentation annuelle des baleines à bosse (rabaissé en cas de faible fréquentation). La photo-identification des individus biopsiés permettra d’éviter de prélever le même individu à deux reprises.
Raffinement
Les groupes de baleines à bosse seront approchés lentement et progressivement par les ¾ arrière, non seulement pour éviter l’effet de surprise et minimiser l’angoisse, mais aussi pour permettre à l’équipe d’attribuer un indice comportemental à chaque individu. Le point limite le plus précoce correspond à un indice de 2. Si le groupe est difficile à approcher (individus farouches ou score >2, état de la mer mauvais), ou que plus de 3 tentatives d’équipement auront été infructueuses, un autre groupe sera recherché. Seuls les individus en bonne condition physique seront prélevés. De même, les mères accompagnées de très jeunes baleineaux ne seront pas prélevées. Le prélèvement de biopsie sera réalisé : •après la désinfection préalable de l’emporte-pièce, afin de minimiser l’infection de la plaie et d’éviter la contamination de l’échantillon de biopsie, •perpendiculairement au corps de l’animal, à une distance courte (4 à 10 m), afin de disposer d’une puissance de tir optimale permettant le prélèvement d’une quantité suffisante de peau et de lard sous-cutané, et évitant toute rétention de la flèche de prélèvement sur l’animal, responsable d’angoisse et de réactions fortes. •Au niveau de la zone située sous la nageoire dorsale, zone connue pour induire le moins de réaction physique et physiologique •par des personnes formées et expérimentées, afin de limiter les tentatives en autorisant un taux de réussite optimal. La réaction de l’individu cible, ainsi que du groupe auquel il appartient, sera suivie pendant 15 minutes et les comportements seront consignés. La présence d’un vétérinaire et de membres de la structure chargée du bien être au sein de l’équipe permettra le contrôle du respect du principe des 3 R et des points limites. L’identification des individus prélevés par la méthode de photo-identification permettra d’éviter de prélever deux fois le même animal et autorisera le suivi de sa cicatrisation à plus ou moins long terme, lors des diverses prospections ultérieures
Choix des espèces
Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les marqueurs biochimiques tels que les indices d’adiposité, de fécondité et les marqueurs de régime alimentaire sont intimement corrélés aux conditions environnementales. L’analyse de ces paramètres biochimiques des différents stocks de l’Hémisphère sud et leur suivi temporel permet non seulement de dresser l’état de santé de ces populations, de disposer d’un état de référence et de suivre l’évolution temporelle de ces indices dans un contexte global de réchauffement climatique. L’évaluation de leur état de santé et de leur condition physique permettra de mieux comprendre les mécanismes qui influence leur migration et leur niveau de vulnérabilité face aux interactions avec les activités anthropiques. Au niveau mondial, le statut de conservation de cette espèce est identifié comme « préoccupation mineure » sur la liste rouge UICN. Nous souhaitons prélever 30 baleines adultes et 10 baleineaux. Une partie des analyses consistent en l’estimation de la concentration en Polluants Organiques Persistants (POPs) chez les mâles adultes. Le prélèvement sur les baleineaux permettra de disposer d’un état initial de concentration en POPs afin d’étudier la bioaccumulation chez les adultes.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge dans les cellules oligodendrogliales sur la cognition des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1734 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à modéré, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et une lignée conservée pour de futures études. Elles subissent un génotypage par prélèvement d'oreille ou de queue, des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie stéréotaxique du cortex moteur et des tests d'apprentissage moteur sur roue à échelons, une perte de poids atteignant 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à décrire le rôle de cellules de la myéline dans le déclin cognitif lié à l'âge, le porteur renvoyant au conditionnel et au long terme l'espoir de "rajeunir" ces cellules chez l'humain. Il affirme que les organoïdes "ne suffisent pas" et présente le recours à la souris comme "nécessaire".
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Notre équipe a récemment découvert un activateur épigénétique dépendant de l'âge (enzyme Ten-Eleven Translocation 1 (TET1)), nécessaire à la différenciation et à la remyélinisation des oligodendrocytes, mais défaillant dans le vieillissement. Nous avons développé une lignée de souris, dans laquelle l'ablation de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (lignée de souris Tet1cKO) imite un phénotype myélinisant semblable au vieillissement, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier le rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement. Nous avons également identifié une cible TET1 spécifique à l'oligodendrogliale : le symporteur SLC12A2, dont l'expression à l'interface neurogliale diminue avec l'âge, entraînant directement une myélinisation défectueuse (caractérisée par un gonflement). Dans ce projet, nous allons 1/ Caractériser le rôle du vieillissement oligodendroglial sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, en utilisant notre modèle de souris Tet1cKO ; 2/ Identifier les gènes cibles TET1 réactivés lors de tâches d'apprentissage moteur ; 3/ Caractériser le rôle de l'ablation de Slc12a2 sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, à l'aide d'un modèle de souris (Slc12a2icKO) et d'un lentivirus Scl12a2KO. En caractérisant mieux le rôle dépendant de l'âge des cellules oligodendrogliales sur la fonction neuronale et les capacités comportementales, notre projet aborde pleinement le rôle de la myélinisation sur la cognition, ce qui pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des oligodendrogliaux dans le vieillissement, en particulier autour de la compaction de la myéline, et l'identification des voies spécifiques aux oligodendrogliaux nécessaires aux fonctions cognitives. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Certains peuvent être génotypés de manière non invasive (lampe UV, 5 secondes, une fois). D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées en IP pour la recombinaison du tamoxifène (4 fois par semaine, une fois). Des souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être sacrifiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Au cours de cette DAP, les animaux subiront les différents génotypages soit par punch à l'oreille pour les adultes ou le prélèvement d'un bout de queue pour les souriceaux. Il subiront, en fonction de la procédure, ou de l'anesthésie à l'isoflurane (en induction (4%) et/ou en entretien (2 à 3%)) ou de l'anesthésie injectable kétamine - Xylazine. Les animaux seront soumis à différents tests d'apprentissge, et de mémorisation. Lors du test d'apprentissage moteur dependant de la plasticité myélinique, à l'aide de dix cages équipées d'un roue à 38 échelons, les animaux seront hébergés à un animal par cage. Quelques animaux pourront recevoir du Tamoxifène en injection intrapéritonéale. Enfin certains animaux subiront une chirurgie stéréotaxique d'une durée de 30 minutes.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corrélerer l'analyse comportementale par une anlayse au niveau moléculaire et/ou cellulaire. Une cohorte des lignées de souris générées sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et d'iPSCs. En effet, pour notre approche lentivirale Slc12a2KO, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires (Olineu), afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 9 ou 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque analyse (immunohistochimie, électrophysiologie,...).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un cycle obscurité-lumière de 12h à 21°C(±1°C) dans des cages ventilées (12vol/h), sous environnement contrôlé et enrichi (alternance entre dôme en carton et en plexiglax, coton Nestlets). Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers dévoués et formés, chargés de veiller à leur bien-être. Lors de l'apprentissage face à une roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour les injections IP, nous alternerons les côtés et les souris seront surveillées pour détecter toute perte de poids, éruption cutanée ou infection. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection de buprénorphine (0,5-1 mg/kg, IP), le jour de la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Pendant la chirurgie, nous appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure, nous procéderons à une infiltration de lurocaïne avant incision de la peau. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique avant de retourner dans la pièce d'hébergement. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est contenue (inférieure à 20 % du poids corporel d'origine). Si l'état général du corps semble médiocre (perte de mobilité, dos arqué, incapacité à se toiletter) ou si la perte de poids est égale ou supérieure à 20 %, les souris auront atteint des points limites et seront euthanasiées et retirées de l'étude.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Notre modèle Tet1cKO, que nous allons recréer dans notre installation, combine les lignées Olig1-cre et Tet1-flox, induisant une ablation constitutive de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (cellules Olig1+). Le modèle Slc12a2icKO sera créé dans l'institut en combinant les lignées Plp-creERT et Slc12a2-flox, induisant une ablation inductible par le tamoxifène de Slc12a2 dans les oligodendrocytes matures (cellules PLP+). La lignée transgénique PDGFRa-eGFP est une lignée, dans laquelle la fluorescence GFP imite le schéma d'expression de PDGFRa, permettant la détection et l'isolement de cellules progénitrices d'oligodendrocytes. Pour études comportementales, des souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, âge idéal pour cette approche, puisque les souris sont jeunes et actives. Pour établir des modèles in vitro, les souriceaux de 7 jours et des animaux de 2 mois et 12 mois seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux, nécessaires à une culture tissulaire efficace et viable.