Procédures légères
Rôle de la protéine NF2/Merlin dans la formation et la plasticité de la myéline chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées au sevrage si elles ne portent pas le génotype recherché, ou plus tard pour l'étude de la myéline dans leur cerveau, 1 730 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 880 en souffrance légère et 850 en souffrance modérée. À dix jours, chacune subit le prélèvement d'un millimètre de queue et un tatouage sur deux pulpes de doigts au plus, et des souris jeunes ou adultes reçoivent du tamoxifène dans le péritoine ou par gavage, une fois par jour pendant quatre à cinq jours, pour supprimer une protéine des cellules qui forment la myéline. Les souris testées passent trois tests comportementaux en trois semaines, sur l'intérêt social, la coordination motrice, la mémoire et la flexibilité cognitive, que le porteur qualifie de non invasifs sans les nommer. Il ajoute que les souris sans le génotype recherché seront, "lorsque cela est possible", proposées aux autres équipes de recherche de l'institut, sans chiffrer ces cas, absents de la déclaration, qui ne prévoit aucune souris gardée vivante.
Objectifs
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon acheminement de l’information nerveux, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. L’objectif de ce projet est de permettre la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la formation des gaines de myéline. La myéline étant une structure modulable tout au long de la vie, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement et chez l’adulte, représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Il a été démontré qu’une protéine, que nous appellerons protéine A, exprimée dans l’oligodendrocyte, contrôle la formation de la myéline dans des oligodendrocytes mis en culture. Nous souhaitons donc étudier en profondeur le rôle de cette protéine dans le déclenchement de la formation de la myéline chez l’animal, in vivo, au cours du développement et à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation au cours du développement et à l’âge adulte et de la remyélinisation permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de myéline. En effet, en identifiant les conséquences de la suppression de l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline, nous apporterons une meilleure compréhension de comment est régulée la formation de la myéline.
Procédures
Afin de connaitre le génotype des animaux générés pour cette étude (animaux dont trois gènes ont été modifiés pour supprimer l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes à l’âge adulte), un petit bout de tissu de 1mm sera prélevé sur chaque souris, une seule fois au niveau de la queue. Pour identifier les souris, elles seront toutes tatouées sur maximum deux pulpes des doigts. Ces deux gestes seront effectués sur des souris âgées de 10 jours (moins d’une minute par animal). De jeunes souris en développement ou adultes seront injectées par voie intrapéritonéale (dans le péritoine au niveau du ventre) ou administrées par voie orale par gavage (avec un produit conçu pour induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes), une fois par jour pendant quatre ou cinq jours consécutifs maximum, 1-2min/animal. Les tests comportementaux auxquels seront soumises les souris (pour apprécier l’intérêt social, la coordination motrice et la mémoire/flexibilité cognitive) sont non invasifs et seront effectués du moins au plus stressant, espacés d’une semaine entre chaque test. Chaque test dure au maximum 1 heure, entre le moment où la souris est sortie de sa cage et le moment où elle y retourne. Les animaux seront soumis à 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 3 semaines. Le 1er test sera réalisé une fois par jour pendant 5 jours, chaque animal réalisera 3 essais, et le test durera 1h par animal maximum. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le 2ème test qui sera réalisé 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (maximum 5 jours. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le dernier test composé de trois jours d’apprentissage et un jour de test (total 4 jours). Le placement de l’animal dans l’espace de test peut être une source de stress. En fin d’expérience, les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Un stress et/ou douleur de courte durée peut être observé chez les souris à la suite de la contention (prise de la souris dans la main de l’expérimentateur) et à l’injection de tamoxifène en intrapéritonéal et par gavage. Ces injections auront lieu quotidiennement pendant cinq jours. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation. Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage. L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire : - Soit au moment du sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt. Soit à des fins expérimentales nécessitant le prélèvement des cerveaux pour une étude structurelle et développementale de la myéline (A noter que lorsque cela est possible, les animaux non porteurs du génotype d’intérêt seront proposés aux autres équipes de recherche de l’institut.
Remplacement
La gaine de myéline est une structure en trois dimensions : c’est une extension de la membrane de l’oligodendrocyte qui s’enroule autour d’un axone (bras du neurone). Suivant le principe de remplacement, le rôle de la protéine A a bien été caractérisé sur des cellules mises en culture. Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le système nerveux central et surtout l'activité électrique des neurones. De plus, afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles et physiques, nous voulons analyser l’impact sur le comportement cognitif de l’animal.
Réduction
Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Ainsi, le nombre d’animaux généré (1730) sera limité au strict nécessaire pour obtenir une interprétation fiable des résultats et des données exploitables mathématiquement. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire, sans connaitre le profil génétique de l’animal pour ne pas influencer le résultat obtenu. Nous travaillerons pendant toute cette étude en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés.
Raffinement
L’animalerie est agréée : les conditions d’hébergement (stabulation en portoirs ventilés dans des conditions de température, hygrométrie, éclairage et espace maintenus dans les références recommandées) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (matériel de nidification et à ronger adaptés aux besoins des aniamux), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Toutes les injections seront faites par des personnes compétentes. Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et deux fois par semaines par notre équipe, pesés régulièrement au cours de leur procédure. Si les animaux présentent des signes de souffrance (plaie, amaigrissement, posture anormale, poil non soyeux, prostration, signes de douleur, zone d’injection gonflée ou indurée, petits exclus de la nichée, non pris en charge par sa mère), l’avis du vétérinaire référent sera immédiatement demandé et les traitements nécessaires seront appliqués. Si besoin pour éviter toute souffrance, l’animal pourra être euthanasié.
Choix des espèces
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes recherchés présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Dans un premier temps, nous avons choisi d’induire la délétion de la protéine A très tôt au cours du développement (à partir du jour postnatal 1 ou 14). Ainsi nous pourrons étudier dans le temps les conséquences de la perte de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline au cours du développement. Nous avons pour cela choisi 5 stades à étudier : P21 et P30 (différenciation oligodendrocytaire et myélinisation intenses), P60 (jeunes adultes, fin du développement), P120 et P180 (souris adultes âgées). Un âge avancé nous permettra de vérifier les modifications de la myéline induites par la modification génétique. Dans un second temps, nous induirons la délétion de la protéine A à 60-90 jours, donc chez l’adulte, un stade où le paysage myélinique est globalement formé. Ainsi, nous pourrons évaluer l’impact sur la myéline de la perte de la protéine après 1, 2 et 3 mois post-induction du modèle afin d’évaluer si les voies protéiques contrôlées par A sont indispensables au maintien des gaines dans le temps, mais également les conséquences sur le comportement des souris.
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
156 animaux, 140 poissons zèbres et 16 xénopes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les poissons zèbres tués à l'issue et les xénopes femelles réutilisées d'une année sur l'autre. Les xénopes reçoivent une injection d'hormone puis un prélèvement d'ovocytes par massage abdominal, les poissons zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire sous anesthésie. Ces gestes servent à des travaux pratiques de formation réglementaire, pour que des stagiaires s'entraînent aux manipulations, anesthésies et mises à mort sur espèces aquatiques. Le porteur indique privilégier des animaux de réforme et affirme que le remplacement par un modèle alternatif est "impossible" pour la partie pratique.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nous utilisons deux modèles expérimentaux, le xénope et le poisson zèbre, qui ne sont pas soumis aux mêmes procédures. Pour les Xénopes, les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée pouvant induire une douleur brève et localisée au point d’injection. De plus, ils peuvent ressentir du stress lors de la contention qui est nécessaire à l’immobilisation de l’animal. Les poissons zèbres sont exposés à une anesthésie par balnéation à faible dose d’anesthésiants qui est maitrisée depuis plusieurs années et n’induit pas d’effet indésirable.
Devenir
Poisson-zèbre : En fin de procédure les animaux seront euthanasiés. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
le nombre total d’animaux impliqués dans cette demande est de 156 animaux pendant 5 ans(140 poissons-zèbre, 16 xenope). Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal. des plantes en plastqiues sont presents dans les aquariums de Xénopes. Les poissons sont toujours hebergés en groupe. Les poissons et xénopes sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect physique ou comportement anormal et de lui attribuer un score . Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Les poissons-zèbres et les xénopes sont couramment utilisés à des fins scientifiques en raison de leur facilité d'élevage, de la disponibilité d'une vaste documentation et de l'existence d'une large communauté scientifique travaillant sur ces espèces. Ils sont considérés comme des modèles de choix en raison de leurs caractéristiques biologiques et des connaissances zootechniques disponibles. Ces deux espèces présentent des caractéristiques spécifiques qui les rendent adaptées aux procédures expérimentales telles que le prélèvement du sperme et d’ovocytes afin de réaliser des fécondations in vitro. Pour obtenir des pontes ou prélever du sperme, il est important d'utiliser des animaux matures sexuellement. Les xénopes nécessitent généralement une période d'environ un à deux ans pour atteindre cette maturité, tandis que les poissons-zèbres peuvent être utilisés à partir de trois mois, car ils ont un développement plus rapide.
Inactivation d’une protéine impliquée dans l’atrophie musculaire dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris porteuses d'une forme de dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent une injection intramusculaire puis des mesures de contractilité musculaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur décrit des risques d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à l'anesthésie et attend "à court terme" une amélioration du phénotype dystrophique, l'usage chez le patient restant renvoyé au long terme. Il affirme le modèle murin "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive de la maladie.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de tester une nouvelle molécule qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.
Bénéfices attendus
Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec notre molécule. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra musculaire (10 minutes) (avec analgésie et anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures de contractilité musculaire (40 minutes) (1 fois) (avec analgésie et anesthésie). Euthanasie après les mesures de contractilité musculaire.
Impact sur les animaux
Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des mesures de force, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître mais nous administrerons un analgésique avant la procédure et surveillerons les animaux pour réagir au plus vite. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie mais nous veillerons à que leur température reste constante. Enfin, les animaux pourraient être victimes d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Néanmoins les souris dystrophiques présentent une forte hétérogénéité surtout lorsque nous mesurons des paramètres tels que la force musculaire. En envisageons donc d’utiliser 6 animaux (6 muscles traitées), pour l’analyse des mitochondries et 12 animaux (12 muscles traités) pour les mesures de force. Sachant que l’expérience sera répétée, nous envisageons donc d’utiliser 12 et 24 animaux pour l’analyse des mitochondries et les mesures de force respectivement. Ce nombre d’échantillons permettra d’obtenir une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d'utiliser 60 souris dystrophiques et 60 souris contrôle. La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combine l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 11 semaines en début de procédure et de 21 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux adultes pour ne pas observer de biais dus à la croissance.
Evaluation de l’effet de composés dans un modèle de Schizophrénie induite par un traitement subchronique à la Phencyclidine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent 24 injections de phencyclidine, un psychostimulant censé reproduire des symptômes de schizophrénie, puis l'administration d'un composé à tester pendant jusqu'à 120 jours et jusqu'à 52 tests comportementaux mesurant leurs performances cognitives et locomotrices. Le porteur indique que ce traitement provoque une hyperlocomotion et des stéréotypies et que les tests peuvent induire un stress. Il affirme espérer "participer à la sélection de nouveaux traitements" et juge la souris impossible à remplacer, les réponses comportementales n'étant selon lui observables que chez l'animal vivant.
Objectifs
La schizophrénie est un trouble psychique sévère et chronique affectant environ 1% de la population âgée entre 15 et 30 ans. Cette maladie mentale est caractérisée par 3 catégories majeures de symptômes : les troubles cognitifs (attention, mémoire, fonction exécutive, vitesse de traitement de l’information), les symptômes positifs (différents types d’hallucination, par exemple visuelle, auditive, olfactive ou tactile et agitation) et les symptômes négatifs (anhédonie, manque d’énergie, perte de la volonté et d'initiative et isolement social). Certains symptômes de dépression sont également observés chez les patients atteints de la schizophrénie et il est difficile de faire la distinction entre les symptômes dépressifs et les symptômes négatifs. Le déclin cognitif est présent dès le stade précoce de la maladie et reste à ce jour difficile à traiter car les antipsychotiques actuels ont des effets très limités sur ce symptôme.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter la schizophrénie.
Procédures
Les animaux subiront 24 injections de PCP (Phencyclidine), un psychostimulant, sur une période de 12j, l’administration du composé à tester sur une durée maximale de 120j selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 52 tests de comportement évaluant la performance cognitive ou locomotrice des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux étant soumis à un traitement par du PCP, ils vont subir certains effets de ce produit comme une hyperlocomotion et l’apparition de certaines stéréotypies. Bien que les tests proposés ne soient pas contraignants, ils peuvent, notamment le test d’interaction social, induire un stress léger chez les animaux. De plus l’administration répétée de composés (PCP et molécules à évaluer) induit un inconfort.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse du développement des troubles liés à la schizophrénie nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Au regard de notre expertise et de la littérature, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 ou 15 animaux.Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux pourront être soumis à un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et réaliser leur nid et un tunnel suspendu. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Nous avons choisi cette espèce pour plusieurs raisons : sa pertinence scientifique, sa fiabilité, sa prédictivité, sa reproductibilité et son énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques. A côté de cela, il faut noter que nous avons une très bonne expertise de l’utilisation des souris dans les tests utilisés mais aussi dans l’utilisation du PCP comme inducteur de symptôme de la schizophrénie. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des animaux de 4 à 5 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée à l’âge et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des animaux de 4 à 5 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.
Tests de thérapies anti-cancéreuses contre les rechutes/métastases du cancer du côlon
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 625 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines, sous la peau ou dans le côlon par chirurgie pour reproduire un stade métastatique, puis des traitements et des chimiothérapies. Le porteur annonce des douleurs à l'injection, une perte de poids et des tumeurs douloureuses en développement. Il affirme qu'aucun autre modèle ne prend en compte à la fois la biodisponibilité d'une molécule et son effet dans un environnement tumoral complet et que le passage par l'animal est "nécessaire".
Objectifs
Ce projet a pour but de développer des traitements spécifiques de la population de cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes dans les tumeurs. Cette population cellulaire est responsable du développement de cancer du côlon et est à l’origine des rechutes. De plus il a été démontrer que leurs propriétés intrinsèques leur permettent de résister aux thérapies conventionnelles, d’initier la rechute tumorale et la progression en maladie métastatique. Des traitements ciblant spécifiquement les CSCs pourraient être couplées à des traitements classiquement utilisés en clinique pour éliminer « les racines » de la tumeur et réduire la masse tumorale.
Bénéfices attendus
Sachant que 50% des cas de cancers du côlon vont générer des récidives qui peuvent évoluer en maladie métastatique, ces études pourraient à terme mener à la découverte de nouveaux traitements pour soigner un stade de la maladie actuellement incurable.
Procédures
Injection de nouveaux traitements expérimentaux et de chimiothérapie. Injection sous-cutanée de cellule tumorales humaines. Injection de cellules tumoral humaine dans un organe distant (rat, caecum ou rectum) pour créer un modèle d'étude du cancer à un stade métastatique nécessitant une intervention chirurgicale. Les injections de cellules se font une seule fois par animal et les traitements peuvent durer maximum 4 semaines.
Impact sur les animaux
L’injection de produit entraine une douleur à l’injection et les effets peuvent également engendrer un mal-être chez l’animal. Ces animaux pourraient montrer des signes tels qu’une perte de poids, un manque de vivacité, tremblement et/ou un pelage non nettoyé. Les tumeurs peuvent également en se développant générer de la douleur. La chirurgie va entrainer de la douleur et du stress chez l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car des paramètres interne à l’animal devront être analysés (tumeurs, nodule hépatique).
Remplacement
Ce projet vise à tester les molécules sur leurs propriétés curatives du cancer. L’utilisation d’animaux est nécessaire car aucun autre modèle ne permet de prendre en compte à la fois la biodisponibilité d’une molécule et son effet sur une tumeur dans un environnement tumoral complet (vascularisation, matrice, métabolisme…). Les paramètres précliniques (tolérance, croissance tumorale, développement de métastase, efficacité anti-tumorale) de ce projet doivent être obligatoirement testé chez l’animal.
Réduction
Les expériences seront réalisées par étape et passeront d’un protocole à l’autre uniquement dans le cas où ils auront eu des résultats positifs précédemment. En d’autres termes, seule la validation de la tolérance permettra de procéder aux expériences d’injection de cellules tumorale sous-cutanées (procédure 2) et les études de l’effet des traitements sur les métastases ne seront engagées uniquement dans le cas où ils auront déjà montré un effet sur les tumeurs sous-cutanées. De plus le nombre d’animaux par groupe est définit à son minimum : les tests de toxicité/tolérance =3, les tests sur greffe de tumeur en sous-cutané = 8 et pour le modèle métastatique = 8 par paramètre observé (nodule hépatique et survie) donc 16 au total. Les analyses statistiques de données au cours du temps en comparaison des traitements seront réalisées.
Raffinement
Réduction du stress des animaux: présence d’enrichissement dans les cages, maintien des animaux en groupes de 2 à 5 afin d’éviter l’isolement et les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris. Durant toute la durée d’un protocole, l’ensemble des animaux est pesé 1 à 2 fois par semaine en fonction de l’évolution du poids . De plus une grille de score est mise en place pour prendre en charge les animaux. Avant chaque chirurgie, un examen de l’animal permettra de confirmer son état de bonne santé (poids, état du poil, vivacité); les animaux choisis seront anesthésiés. Une médication pré et post- opératoire s’analgésique sera aussi mise en place pour contribuer au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des souris dépourvues de système immunitaire constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.
Mesures de la capacité d’ingestion des brebis
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
48 brebis de race Romane vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées en vie et renvoyées dans le troupeau d'élevage à l'issue. Chaque animal est placé en case individuelle sur caillebotis pendant les huit semaines de fin de gestation, avec des auges peseuses mesurant la quantité de fourrage ingérée. Le porteur indique que les agneaux mâles rejoindront le circuit de commercialisation et les femelles le renouvellement du troupeau. Il présente ce projet comme visant à actualiser des références d'alimentation vieilles de quarante ans, au service de la production ovine.
Objectifs
Dans un contexte de changement climatique mondiale, l'élevage ovins doit être autonome et résilient. Ce projet a pour objectif d'accompagner l'adaptation des systèmes de production face aux aléas et à ces changements climatiques en développant leur autonomie protéique et azotée. Un des enjeux principaux est d'adapter, au plus juste, l'alimentation aux besoins des animaux. Ces besoins sont couverts par les apports énergétiques et protéiques des rations alimentaires mais conditionnés par la capacité d'ingestion de l'animal. L'estimation de la capacité d'ingestion des animaux est donc déterminante pour le calcul des rations, elle varie en fonction de plusieurs facteurs (âge, taille, poids, race, stade physiologique...). Les références actuelles sur le sujet datent de plus de 40 ans et s'avèrent aujourd'hui parfois obsolètes car sous-estimées. Ce projet vise donc à réactualiser ces références sur des races précises en fonction de plusieurs types de fourrages. Dans cette étude, nous nous intéresserons plus particulièrement à la capacité d'ingestion de brebis de race Romane durant le dernier tiers de gestation et la phase d'allaitement, elles seront alimentées avec des fourrages secs aux caractéristiques contrastées (stades de récolte, valeurs d'encombrement et nutritionnelles).
Bénéfices attendus
L'enjeux de ce projet est d'optimiser l'utilisation des fourrages pour l'alimentation des brebis allaitantes, il permettra de : - créer de nouvelles équations de prédiction de l'ingestion - actualiser les références de capacités d'ingestion, durant des phases physiologiques clés (gestation et lactation) et sur différentes races (à l'échelle globale du projet) - tester différents facteurs de variation (poids de l'animal, taille de la portée de la brebis, qualité des fourrages). In fine, ce projet permettra aux éleveurs ovins de disposer de références actualisées quant aux capacités d'ingestion des ovins et d'assurer une couverture optimale des besoins des animaux en fonction de leur stade physiologique et de la qualité des fourrages proposés.
Procédures
Les brebis seront conduites en cases individuelles sur caillebotis pendant la période de fin de gestation (8 semaines) avec accès à deux auges peseuses automatisées. Les cases étant mitoyennes et les barrières ajourées, les interactions entre les animaux seront possibles (contacts visuels, olfactif, auditif et physique).
Impact sur les animaux
La procédure de mesure d'ingestion implique une période de mesures individuelles sur un dispositif de case individuelle sur caillebotis, ces cases sont équipées d'auges peseuses électroniques permettant une pesée automatique du fourrage. Afin de limiter tous risques d'inconfort pour la brebis des tapis en caoutchouc sont installés sur une partie des caillebotis assurant ainsi une zone de couchage confortable. Toutes les stalles individuelles sont installées dans une même pièce pour limiter l’isolement des animaux et réduire le stress éventuel, les animaux sont séparés par des barrières ajourées entre chaque case permettant des interactions sociales avec les congénères placés à proximité (les animaux peuvent se voir, s'entendre et se toucher).
Devenir
Pas d'abattage expérimental, les animaux seront gardés en vie. Les brebis retourneront dans le troupeau expérimental en conditions d'élevage classiques. Concernant les agneaux, les mâles rentreront dans la chaîne de commercialisation classique et les femelles seront gardées pour le renouvellement du troupeau.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à l'utilisation d'animaux qui nous permettent de répondre aux enjeux de ce projet et c'est pour cela que nous avons recours à des animaux. Le projet porte sur les capacités d'ingestion de la brebis de race Romane et permettra de produire des références qui seront étendues à l'élevage. Le contexte du projet est l'élevage ovin où l'animal est, par conséquent, au centre des préocupations. Centré sur les pratiques alimentaires en lien avec les performances zootechniques, ce projet necessite donc d'utiliser des ovins et plus précisément des brebis avec leurs agneaux.
Réduction
Compte tenu de la variabilité interindividuelle des mesures réalisées (ingestions, pesées, note d'état corporel...), le nombre minimum d'animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence au moins égale à 2 fois la valeur de l'écart-type des fidélités intermédiaires des mesures est de 6 avec une probabilité de 0.05. 6 individus sont donc nécessaires par lot, 4 traitements contrastés étant appliqués avec 2 répétitions, 8 lots de 6 brebis seront nécessaires par schéma expérimental, sur deux années. 48 brebis sont concernées par la procédure expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d'élevage éclairé naturellement. Les parcs d'élevage adjacents seront séparés par des barrières à claire-voie permettant un contact visuel entre animaux de différents parcs et diminuant l’angoisse possible liée au cloisonnement. La taille des cases est adaptée au gabarit de l’animal. Elle lui permet de se lever, se déplacer et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir et de s’entendre. Chaque brebis dispose d'une surface de 2.55 m². Des tapis en caoutchouc de 1m par 2m sont installés sur les caillebotis afin d'améliorer le confort des animaux. Les animaux seront préalablement habitués aux stalles pendant la période pré-expérimentale de 2 jours. Les animaux seront alimentés à volonté, deux fois par jour, et disposeront d’eau à volonté et d’une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les moutons seront suivis tous les jours lors de la distribution de l’alimentation par un animalier habilité, responsable de la mise en oeuvre du protocole.
Choix des espèces
Le projet porte sur les capacités d'ingestion de la brebis de race Romane et permettra de produire des références qui seront étendues à l'élevage. L'expérimentation porte sur l'étude des capacités d'ingestion sur des stades physiologiques précis, dans cette procédure les brebis seront gestantes. Les animaux du reste de l'expérimentation, hors procédures car conduits en lot en condition d'élevage classique seront en gestation puis à l'allaitement.
Formations réglementaires concepteur, applicateur et chirurgie expérimentale sur rongeurs
- Enseignement supérieur
Rats : 1080
2 280 souris et rats vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures classées sans réveil ou légères. Chaque stagiaire manipule et contentionne les animaux, pratique des injections et des gavages, puis réalise des castrations d'une heure ou des ovariectomies de deux heures sous anesthésie, pour la formation réglementaire des personnels d'expérimentation. Le porteur indique qu'un apprentissage sur mannequins et vidéos précède les gestes, mais présente le passage sur animal vivant comme "indispensable" pour appréhender ses réactions. Il compte trois souris et un rat par stagiaire et par séquence.
Objectifs
Il s'agit de réaliser la formation réglementaire (obligation réglementaire pour les personnels du domaine de l’expérimentation animale) dans l'année de prise de fonction des nouveaux personnels.
Bénéfices attendus
Les formations concepteur et applicateur doivent permettre : - la mise en œuvre de l'approche, de la manipulation, de la contention des rats et des souris selon les bonnes pratiques dans le respect du bien-être animal - une mise en œuvre de procédures expérimentales simples d'administration sous-cutanée, intrapéritonéale, de prélèvements sanguins et d'anesthésie-analgésie. La formation chirurgie expérimentale doit permettre : - de mettre en pratique les notions d'asepsie, de tenue d'instruments - de gérer l'anesthésie, l'analgésie et les bonnes pratiques chirurgicales - de réaliser de la chirurgie sur animal vivant à partir d'interventions simples.
Procédures
Manipulation, contention, administrations sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse et orale (gavage avec sonde souple) des animaux. Chaque animal sera soumis à deux manipulations consécutives (contention puis injection intraveineuse sous anesthésie par exemple) d'une durée d'une à deux minutes. Réalisation d'interventions chirurgicales de castration (durée de 1h) ou d'ovariectomie (durée de 2h) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Pour les formations concepteur et applicateur, les animaux subiront des manipulations, des contentions, des administrations et des anesthésies qui peuvent être à l'origine de réactions de stress. Pour la formation chirurgie expérimentale, les animaux subiront des interventions chirurgicales sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de session de formation, sauf lorsqu'une session de formation de chirurgie expérimentale suit une session de formation concepteur et applicateur, où les rats servent dans cette session de chirurgie expérimentale.
Remplacement
Pour les formations concepteur et applicateur, une première approche avec vidéos et entraînement sur mannequins inertes permet de s'exercer sans contrainte. Toutefois, un apprentissage sur animal vivant constitue une étape indispensable pour appréhender et maîtriser les réactions de l'animal vivant. Pour la formation chirurgie expérimentale, des matériaux inertes sont utilisés pour remplacer l'animal dans l'apprentissage préalable de la réalisation des sutures et de la tenue des instruments. L'apprentissage sur animal vivant est indispensable pour appréhender la gestion de l'anesthésie et analgésie et les réponses tissulaires aux lésions chirurgicales.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum en comptant trois souris et un rat par stagiaire à chaque séquence pédagogique de chaque session.
Raffinement
Pour les formations concepteur et applicateur, certains actes, comme les prélèvements de sang sont effectués sur animal anesthésié, de façon à réduire le nombre d'animaux et à réduire les risques de souffrance ou d'angoisse dus à une mauvaise manipulation. Pour la formation chirurgie expérimentale, l'anesthésie repose sur l'utilisation de plusieurs médicaments, hypnotique et analgésique, afin de supprimer toute douleur chirurgicale pendant les interventions.
Choix des espèces
Il s'agit des espèces animales les plus utilisées dans les projets de recherche et les activités pédagogiques nécessitant une autorisation de projet. Pour les formations concepteur et applicateur : Souris SWISS adultes jeunes et Rats Wistar ou Sprague Dawley adultes jeunes pour une manipulation aisée des animaux et représentaifs des animaux habituellement utilisés dans les projets. Pour la formation chirurgie expérimentale : Rats adultes jeunes ( 2 séances d'ovariectomie) et rats de réformes (séance de castration et de pose de cathéters vasculaires)
Developpement d’une approche translationnelle de thérapie cognitive combinée dans des modèles murins de troubles cognitifs liés à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent pendant six semaines un traitement par voie orale ou intranasale, subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, des séances d'IRM et de TEP, des prélèvements de sang et une restriction alimentaire, tout en étant laissées vieillir jusqu'à vingt-sept mois pour reproduire un déclin cognitif. Le porteur mentionne des tests comportementaux sans en préciser la nature, et reconnaît devoir accepter une détérioration physique liée à l'âge. Il affirme qu'il est "indispensable" de se reposer sur un modèle intégré et que le remplacement des souris n'est pas envisageable.
Objectifs
Le projet répond au besoin clinique de développer la stratégie thérapeutique optimale visant à modifier la trajectoire cognitive de patients souffrants de troubles neurocognitifs légers et à risque d'évoluer vers une démence (troubles neurocognitifs majeurs). En effet, selon les rapports cliniques récents environ 35% des patients âgés répondant aux critères de MCI (Mild cognitive impairment), c'est à dire souffrant de troubles neurocognitifs légers vont développer dans les 5 années qui suivent une démence. Malgré le développement de biomarqueurs pronostiques permettant d’identifier précocement les sujets les plus à risque de développer une démence, les stratégies thérapeutiques actuellement à notre disposition sont peu efficaces pour modifier la trajectoire cognitive de ces patients. Il apparait donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques combinées efficaces afin d’améliorer la prise en charge des patients à risque. Dans ce projet expérimental nous testerons plusieurs molécules pharmacologiques susceptibles de potentialiser les effets bénéfiques de l’entrainement cognitif afin de sélectionner la combinaison optimale apportant un bénéfice fonctionnel, comportemental et neurobiologique dans plusieurs modèles de troubles cognitifs liés à l'âge chez les souris mâles et femelles.
Bénéfices attendus
CCe projet permettra de valider l’aspect translationnel de notre démarche grâce à l’étude « preuve de concept » engagée en parallèle au sein de notre équipe de recherche clinique et dont nous nous sommes inspirés pour élaborer le design expérimental de ce travail. L’une des molécules pharmacologiques testées dans ce projet pré-clinique sera le méthylphénidate qui est le traitement administré dans l’étude clinique PACTE. Ceci permettra d’évaluer 1- la comparabilité de la réponse au traitement de nos modèles murins avec les données humaines, 2- la pertinence des marqueurs fonctionnels et 3- d’étudier les mécanismes neurobiologiques de plasticité susceptibles d’expliquer les effets bénéfiques sur la cognition. Fort de cette démarche, ce projet permettra de comparer les bénéfices thérapeutiques (en premier lieu cognitifs) apportés par les différentes stratégies et molécules testées et de sélectionner la meilleure combinaison thérapeutique qui aura prouvé son efficacité sur les différents modèles murins de troubles cognitifs i.e. lié à l’âge et combinant âge + facteur de risque métabolique. Il sera aussi question d’identifier et de valider des biomarqueurs de suivi thérapeutique radiologiques, électrophysiologiques et biologiques translationnels. Si les résultats sont favorables, ces éléments serviront de base à l’élaboration d’un nouvel essai clinique orienté qui fera suite à l’étude PACTE actuellement menée chez les volontaires sains âgés.
Procédures
Sur 640 souris mâles et 480 souris femelles : Les souris recevront un traitement de 6 semaines selon une administration quotidiennement par voie orale ou intranasale dont le temps d’administration n’excèdera pas 5 min par animal. Concernant l’analyse comportementale les souris seront soumises à 3 séries d’évaluations d’une durée allant de 1 à 3 mois à raison de 30 min à 1h de test quotidien. L’entraînement cognitif sera quant à lui réalisé 3 fois par semaine pendant 6 semaines et ne durera pas plus d’une heure. L’examen d'imagerie cérébrale in vivo (IRM et TEP) sera réalisée à 3 temps et n’excèdera pas 1h15 par souris. Afin de mener les enregistrements EEG sur une partie des animaux, une chirurgie sera réalisée permettant l’implantation des électrodes. Celle-ci n’excèdera pas 45min par souris. Les enregistrements seront réalisés sur animaux vigiles au repos (acquisition de 24h) ou en cours de tâche comportementale (acquisition de 1h) grâce à un système d’enregistrement EEG sans fil (Neurologer, TSI). Ces enregistrements seront répétés 3 fois. Enfin sur l’ensemble des animaux, trois prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie, d’une durée maximale de 10min par souris.
Impact sur les animaux
Dans la perspective d’une utilisation clinique, les molécules pharmacologiques retenues dans ce projet sont connues pour leur bonne tolérance. Aucun effet indésirable n’est attendu. La combinaison avec l’entrainement cognitif n’est pas non plus problématique. Les voies d’administrations retenues pour ces molécules sont compatibles avec une prise chronique (via l’eau de boisson, la nourriture ou encore en intra-nasal). Une habituation à la contention préalable à l’induction du traitement sera réalisée pour l’administration intra-nasale afin de réduire le stress de l’animal. Lors de la chirurgie, nécessaire au positionnement des électrodes EEG, ou au cours des acquisitions en imagerie, l’induction et le maintien de l’anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie. Pour contrôler ces effets, nous veillerons sur l’état général des animaux pendant les procédures en contrôlant la température corporelle et la fréquence respiratoire. Si ces paramètres viennent à se dégrader rapidement nous mettrons fin à l'expérimentation. De même à l’issue de la chirurgie, au moindre comportement inhabituel d’un animal, nous procéderons à une surveillance plus stricte et en cas d'atteintes des points limites, nous procéderons à la mise à mort de l’animal. Concernant l’évaluation comportementale une habituation à la manipulation sera réalisée à l’arrivée des souris pour réduire le stress. La principale nuisance est la restriction alimentaire qui sera maintenue sur une période relativement longue (2 fois 2 mois espacés d’1 mois) afin de motiver les animaux dans les tâches de conditionnement opérant. Nous ne dépasserons pas une réduction de 10 % du poids corporel de référence afin de limiter l’impact sur les animaux âgés. Enfin les animaux seront confrontés aux effets du vieillissement sur l’organisme : perte de poids, une altération du pelage, une diminution de la mobilité etc. Nous serons donc contraints d’accepter un certain degré de détérioration physique lié à l’âge. Aussi, au fur et à mesure que les changements observés s'accumulent ou augmentent en "intensité", la fréquence de la surveillance augmente en conséquence. Au moindre comportement inhabituel et changements brutaux de l’intégrité physique d’un animal, nous procéderons à une surveillance plus stricte et en cas d'atteintes des points limites, nous procéderons à la mise à mort.
Devenir
L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportementale et d'imagerie du vivant ou EEG avant leur mise à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle assurant le lien entre la recherche fondamentale et la recherche clinique et permettant le transfert des connaissances vers des applications thérapeutiques au bénéfice du patient. Cherchant à évaluer le bénéfice comportemental et fonctionnel de stratégies thérapeutiques pro-cognitives, il est indispensable de se reposer sur un modèle intégré et le remplacement des souris par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce contexte. Toutefois l’ensemble des molécules pharmacologiques utilisées dans ce travail ont fait l’objet d’études préalables permettant de valider les propriétés recherchées pour cette étude.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à cette étude requière un nombre total de 1316 animaux. Le nombre minimal d’animaux nécessaire a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les animaux utilisés pour effectuer les tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses d’imagerie ainsi que l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires. De même afin de limiter les animaux nécessaires à la mise au point du protocole, une étude préliminaire validant la faisabilité de l’ensemble des évaluations sera menée sur un petit nombre d’animaux avant d’élargir les effectifs. Les études statistiques seront réalisées à l’aide de tests paramétrique t test de student ou non paramétrique test de Mann whitney selon la normalité de la distribution déterminée selon le test de Shapiro Wilk. Pour les évaluations longitudinales une ANOVA à deux facteurs sera effectuée. Pour l’ensemble de ces analyses les différences seront significatives lorsque p
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.
Choix des espèces
Les souris sont des rongeurs faciles à manipuler, prenant moins de place dans une animalerie et demandant un entretien plus simple et plus économique que les rats. De plus, des projets précédents menés au laboratoire sur la souris ont permis d'établir les bases du projets actuels par l'étude de l'influence de l'âge sur les effets de médicaments psychotropes. L'utilisation de cette base de données pré-existante permettra de réduire le temps et le nombre d'animaux dédiés à la mise au point de ce projet. D’autre part le modèle de syndrome métabolique mis en place au laboratoire n’a été validé que chez les souris C57Bl6/j reconnues pour être particulièrement sensibles à un régime enrichi en gras. Enfin, nous disposons d’outils fiables et de protocoles bien validés pour l'évaluation comportementale et les analyses en imagerie chez la souris. Les modèles murins que nous souhaitons exploiter doivent présenter un déclin lié à l’âge c’est pourquoi l’ensemble des animaux diète normale ou diète enrichie seront utilisés à partir de 16 mois d’âge (âge où les premiers désordres comportementaux et notamment des altérations cognitives légères se manifestent) et suivies jusqu’à environ 27 mois. Pour autant les souris du modèle syndrome métabolique seront mises sous diète enrichie à partir de l’âge de 8 semaines, âge le plus couramment utilisé dans la littérature pour induire des troubles métaboliques chez ces souris
Des interactions cellulaires à l’emergence de mouvements morphogénétiques.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
560 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et 186 maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme. La seule procédure déclarée est le prélèvement de deux millimètres carrés de nageoire caudale sous anesthésie, pour génotyper des lignées mutantes, le travail scientifique portant sur les embryons précoces. Le porteur revendique le poisson zèbre pour éviter, contrairement à la souris, de tuer la mère afin d'accéder aux œufs. Il indique tester des méthodes de génotypage moins invasives, encore trop peu fiables pour être utilisées.
Objectifs
La construction d’un organisme, mais aussi la dissémination de cellules cancéreuses, implique des migrations cellulaires, qui sont souvent des processus collectifs : les interactions entre cellules sont nécessaires à la bonne migration des cellules et à la coordination de leurs mouvements. Nous avons ainsi mis en évidence dans l’embryon précoce de poisson un nouveau type de guidage des cellules par celles qui les suivent, basée sur la transmission d’une information mécanique. Le projet vise d’une part à mieux comprendre ce mécanisme (comment une information mécanique oriente-t-elle l’activité migratoire d’une cellule), et d’autre part à comprendre comment, à partir des interactions cellule-cellule, émergent des mouvements morphogénétiques complexes et coordonnés.
Bénéfices attendus
Nos travaux trouvent des applications en cancérologie, de nombreuses cellules métastatiques migrant collectivement, et en médecine régénérative, où l’un des grands enjeux actuels est de réussir à reproduire et contrôler in vitro les processus de morphogenèse. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales), mais la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo.
Procédures
Sur certains animaux, l'extrémité de la nageoire caudale inférieure est prélevée, afin de séquencer leur ADN. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale. L'intervention prend moins d'une minute. Le tissu prélevé est de 2 mm2, et repousse en 2 semaines environ. Un animal ne subit cette intervention qu'une seule fois au cours de sa vie.
Impact sur les animaux
D'après la littérature disponible, le prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale inférieure peut causer une douleur à l'animal. Pour l'éviter, une analgésie est mise en place avant l'intervention, et maintenue après intervention en cas de signes de douleur.
Devenir
A l'issue du prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale, les animaux de génotype d'intérêt sont conservés (2/3 des animaux), les autres sont mis à mort. Tout au long du projet, les animaux atteignant l'âge de réforme (2 ans), sont mis à mort. La moitié des animaux seront de ce fait mis à mort au cours du projet. Ainsi, en fin de projet, sur les 560 animaux ayant subi un prélévement de l'extremité de la nageoire caudale, 560 * 2/3 * 1/2 = 186 animaux, qui seront maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme.
Remplacement
Nos travaux visent à mieux comprendre comment les interactions entre cellules modulent leurs déplacements et permettent la mise en place de grands mouvements morphogénétiques coordonnés. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales) et elles le sont par d’autres équipes. Néanmoins, la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo. C’est d’ailleurs l’un des enjeux de ces travaux que de parvenir à comprendre les bases cellulaires des mouvements morphogénétiques pour pouvoir les reproduire in vitro, dans le cadre d’approches en médecine régénérative. L'embryon précoce de poisson permet l’analyse des phénomènes qui nous intéressent sans aucune procédure invasive, tout en assurant une proximité évolutive avec l'humain. Comparé à d’autres modèles, comme la souris, il permet ainsi de ne pas mettre à mort la mère pour accéder aux œufs. Aucune expérimentation n’est effectuée sur les animaux (embryons précoces uniquement). Par contre, le maintien de certaines lignées mutantes implique leur génotypage, qui nécessite le prélévement de tissu.
Réduction
Le projet nécessite l’utilisation de 7 lignées mutantes (phénotype non dommageable), dont le génotypage implique le prélèvement de l’extrémité de la nageoire caudale. Le nombre d’animaux nécessaires au projet est calculé comme suit : nombre de reproducteurs nécessaires à un instant donné (dépendant de la fréquence d’emploi de la lignée, varie de 5 à 10 couples), multiplié par le nombre de générations nécessaires pour couvrir la durée du projet (un couple restant fertile +/- 18 mois, 3 générations sont nécessaires), divisé par 0.8 (pour prendre en compte les animaux infertiles ou d’enventuels biais de sexe ratio, qui font que certains adultes ne sont pas utilisables). Pour les lignées mutantes, s’ajoute à cela le fait qu’un tiers des animaux élevés sont sauvages (les embryons homozygotes ne se développent pas et laissent donc 1/3 de sauvages et 2/3 d’hétérozygotes). Pour 7 lignées mutantes, cela représente 560 animaux environs. Les autres lignées utilisées sont des lignées transgéniques (phénotype non dommageable) porteuses de rapporteur fluorescents, qui peuvent donc être génotypées par simple observation des larves avant élevage. Ceci réduit le nombre d’animaux élevés, et réduit le nombre de prélèvement nécessaires au génotypage. Enfin, nous testons des méthodes alternatives au prélèvement de l’extrimité de la nageoire sur adulte, mais pour l’heure, elles ne sont pas suffisemment fiables pour être utilisées.
Raffinement
L’unique procédure de ce projet est le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire caudale, afin de génotyper les lignées mutantes. Pour réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux : - la surface de nageoire prélevée est limitée à 2 mm2. - une analgésie est mise en place avant le prélévement, par traitement à la Lidocaïne, prolongée si nécessaire après prélévement. - après prélèvement, les animaux doivent être maintenus isolés, le temps que le génotypage soit réalisé. Celui-ci sera effectué le plus rapidement possible, pour limiter la durée de l’isolement. Les animaux isolés sont maintenus à proximité d’autres animaux, assurant un contact visuel. Si le génotypage n'a pas été effectué sous 15 jours, les animaux sont hébergés avec au moins 2 autres animaux d'un fond génétique différent, permettant une identification visuelle simple.
Choix des espèces
Nous utilisons le poisson zèbre pour ses qualités en terme d’accessibilité à l’embryon (développement externe), d’imagerie (embryon translucide autorisant l’imagerie de processus internes sans acte invasif), de génétique (génome séquencé, nombreuses lignées disponibles), et de proximité à l'humain. L’accessibilité et la transparence de l’embryon permettent d’effectuer nos travaux sans les gestes invasifs qui seraient nécessaires sur un modèle mammifère, et de limiter le nombre d’embryons utilisés (embryons suivis sur plusieurs heures au lieu de sacrifier de nombreux embryons). Enfin, il existe une large littérature scientifique utilisant le poisson pour aborder des questions proches des nôtres sur lesquelles nous nous appuyons pour concevoir nos expériences. Le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire pour génotypage sera réalisée entre 1 et 6 mois.
Etude de la relation entre les différents carburants énergétiques clefs du cerveau chez le raton
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 189 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, les ratons tués à l'issue et les mères réutilisées pour d'autres protocoles. Les ratons sont séparés de leur mère avant le sevrage, soumis à une nutrition artificielle de trois jours puis à une procédure terminale de trois heures associant anesthésie, prélèvement de sang, imagerie et provocation d'une hypoglycémie ou d'une hyperglycémie. Le porteur décrit ces manipulations comme un moyen d'étudier le métabolisme cérébral pour mieux nourrir les bébés prématurés humains, retombée renvoyée au long terme. Il affirme qu'aucune préparation in vitro ne peut reproduire la relation entre les carburants énergétiques du cerveau, l'oxygénation et le débit sanguin.
Objectifs
L’objectif est d'obtenir un cadre pour une nutrition personnalisée axée sur le cerveau des bébés prématurés, sur la base d’une surveillance en temps réel du flux sanguin et de l’oxygénation cérébrales d'un côté et des métabolites sanguins de l'autre. En effet, les connaissances actuelles ne portent que chez l'adulte. Pour atteindre ce but, nous étudierons la relation entre les différents carburants énergétiques clefs du cerveau, le débit sanguin cérébral et l'oxygénation cérébrale sur la base de données obtenues chez le raton, dans différentes conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
L'objectif de l'expérimention animale est de fournir des connaissances sur l'effet de la nutrition sur le métabolisme cérébral, ce qui permettra de mieux prendre en charge des bébés prématurés chez l'homme et éviter ainsi certains retards de développement cérébral.
Procédures
Pour les ratons : nutrition artificielle de ratons séparés de leur mère avant le sevrage complet pendant 3 jours puis une procédure terminale de 3h comprenant anesthésie, analyse de sang, imagerie médicale, hypoglycémie ou hyperglycémie, euthanasie. Pour les rates : 1 euthanasie au bout de quatre portées.
Impact sur les animaux
L'étude implique un sevrage précoce des ratons, une modification du régime alimentaire des animaux (variation du niveau de protéine et du niveau de graisse) pendant une semaine, et la réalisation d'une anesthésie sans réveil (avec analyse de sang, imagerie médicale, hypoglycémie ou hyperglycémie), suivi d'une euthanasie.
Devenir
Tous les ratons seront mis à mort pour l'étude du sang et du cerveau par des méthodes biologiques. Toutes les rates seront gardées en vie et proposées pour d'autres protocoles.
Remplacement
Aucune préparation in vitro ne permet de reproduire la relation entre les différents carburants énergétiques clefs du cerveau (oxygénation, débit sanguin), notamment sa réaction en fonction de l'alimentation et de la glycémie.
Réduction
Le nombre de rats nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l'interprétation statistique de nos résultats. Pour chiffrer nos effectifs et obtenir un nombre suffisant de données interprétables, nous avons pris en compte les problèmes techniques qui surviennent lors de la réalisation du modèle animal d'une part et lors de l'imagerie médicale d'autre part.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des animaux avant toute expérience. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies, selon le protocole mis en place à l'animalerie. L’état de santé des rates et des ratons sera surveillé tout au long de l’expérience. Avant la naissance, un matériau de nidification à base de papier sera disposé dans la cage. Pour les rates gestantes puis allaitantes, nous surveillerons les critères suivants : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Pour les ratons, pendant la phase d'allaitement (de la naissance à quinze jours après la naissance), nous surveillerons la prise de poids et l'éventuel rejet du nid par la mère. Pour les ratons après la séparation de leur mère, la portée sera conservée (tous les animaux ensemble) ainsi que le matériel de nidification, imprégnée de l'odeur de la mère. Le matériau de nidification facilitera la régulation de la température des animaux et le matériau de nidification imprégné de l'odeur de la mère limitera le stress. De la nourriture humidifiée sera placée dans la cage ainsi qu'un biberon d'eau plein, gouttant, afin de faciliter le repérage de la source d'eau par les ratons. Le ventre des ratons, lorsqu'il est encore assez transparent, sera surveillé pour s'assurer que les ratons s'alimentent correctement. Le ventre des ratons sera massé deux fois par jour pour favoriser la défécation. Pour toutes les expériences d'analyse de sang et d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous analgésiques. Une grille de cotation adaptée permet d'identifier et d'utiliser des points limites précoces et adaptés et de définir des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l'utilisation de petits animaux (rat). Les rats sont très couramment utilisés en recherche, notamment pour les recherches en imagerie du cerveau. Nous allons utiliser des rats utilisés en routine en laboratoire. Les animaux seront évalués entre 13 et 22 jours, pour travailler sur un cerveau non mature et jeune afin d'avoir des conditions de métabolisme énergétique proches du bébé chez l'homme.
Maintien de lignées transgénique murine pour l’étude de la dysfonction adipocytaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
6 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, entretenues pour maintenir des lignées transgéniques liées à l'obésité. Chaque animal subit une pose de bague sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, les reproducteurs étant réformés puis tués ou réutilisés, les autres orientés vers d'autres procédures ou tués selon leur génotype. Le porteur signale des cas de cannibalisme des parents sur les petits et des dystocies conduisant à euthanasier les femelles. Il affirme que l'élevage de ces lignées est le "seul moyen" de les étudier et que les expériences doivent être menées dans un "organisme intégré".
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie du tissu adipeux (TA). Ainsi, au laboratoire nous nous intéressons à trois grandes voies et à leur rôle dans l’homéostasie adipocytaire : ->la seipine est une protéine dont l’absence entraine une perte massive de tissus adipeux, nous avons généré des souris constitutivement déficientes en seipine dans tout l’organisme et des souris avec une déficience induite dans le tissus adipeux -> Nos travaux récent suggèrent que les point de contact entre le réticulum et la mitochondrie ont un rôle important dans le tissu adipeux, nous avons généré une souris déficiente pour une des protéines clés de ces points de contact ->L’accumulation du cholestérol semble avoir un effet délétère sur l’homéostasie de l’adipocyte. Nous avons généré une lignée de souris doublement déficiente pour les enzymes qui assurent l’estérification du cholestérol. Afin de réaliser les projets apafis déjà autorisés, et nos futurs travaux, nous avons besoin d’entretenir l’élevage de ces animaux.
Bénéfices attendus
L’élevage de ces lignées est le seul moyen de les étudier car elles ne sont disponibles commercialement. Les résultats des études réalisées avec ces lignées pourraient permettre de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les conséquences néfastes de l'obésité avec notamment une focalisation sur les facteurs de risques cardiométaboliques.
Procédures
Anesthésie à l’isoflurane pour identification de l’animal avec pose de bague Biopsie de queue 1 fois dans la vie de l’animal pour génotypage et/ou phénotypage
Impact sur les animaux
En règle générale, il n’y a pas de nuisance prévue. Néanmoins, il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur leur petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux sont isolés avec un enrichissement adapté et peuvent être exclus de l’aspect reproduction. De plus, des cas de dystocies peuvent être observées chez les femelles qui doivent alors être euthanasiées.
Devenir
Après 6 à 8 mois après l’accouplement, les reproducteurs sont réformés et soit euthanasiés ou réutilisés dans d’autres procédures. Pour les autres animaux, en fonction de leur génotype les animaux seront utilisés dans des procédures expérimentales dans le cadre d’une utilisation continue, ou sinon ils seront euthanasiés
Remplacement
Nos trois principales hypothèses de travail sont étudiées en parallèle dans des lignées d’adipocyte, les 3T3-L1 ainsi que des biopsies de tissu adipeux de patients bénéficiant de chirurgies bariatrique. Ces modèles ont permis de remplacer les modèles animaux dans la détermination du rôle de différents gènes dans la dysfonction adipocytaire et ils permettent également de déterminer quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires associés dans l'adipocyte. Les expériences proposées chez l’animal correspondent à des questions qui doivent impérativement être adressée dans des organisme intégrée permettant de faire le lien entre dysfonction adipocytaire et maladies métabolique.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 6250 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistique adaptés
Raffinement
Lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du Nestlet (coton) est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum J+3 après la mise bas ; une étiquette est apposée pour signaler ce report. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Les gestes invasifs tel que le baguage et biopsie sont réalisés sous anesthésie générale, excepté pour une des lignées, qui est intolérante à l'anesthésie avant l’âge adulte (détresse respiratoire) chez laquelle ces gestes sont réalisés à l’état vigile.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiométaboliques associées à l’obésité. De plus, l’ajout de séquences Lox sur les différents gènes d’intérêt, nécessaires à leur délétion, n’a été réalisé que dans le modèle murin. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils d'analyse biochimique. Nous utilisons les animaux de 8 à 10 semaines qui sont matures sexuellement pour l’élevage. Nous utilisons des animaux de 8 à 10 semaines pour nos procédure, car c’est à ce stade que les dysfonctions adipocytaires sont les plus marquées.
Caractérisation de la fonction musculaire dans un modèle murin de maladie dégénérative neuromusculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
324 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et 50 animaux réutilisés pour l'élevage ou d'autres projets. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et la pose d'une bague à l'oreille à quinze jours, puis un test de force musculaire sous anesthésie, tout en développant une perte de coordination et une intolérance à l'effort. L'objet est de caractériser la composante musculaire d'une maladie neuromusculaire génétique. Le porteur affirme que la coordination des processus en jeu ne peut être étudiée qu'in vivo, sur un animal vivant.
Objectifs
Ce projet vise à étudier une maladie neuromusculaire d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une perte de coordination des mouvements avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré et des crises d’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre la composante musculaire de cette maladie en étudiant la fonction musculaire de façon non invasive dans un modèle qui possède une perte totale du gène responsable de la maladie et qui développe une forme modérée de la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, à moyen terme, une meilleure compréhension des anomalies de la fonction musculaire et des anomalies moléculaires et biochimiques dans cette maladie, ce qui permettra de mettre en place des essais pré-cliniques afin de tester l’efficacité d’agents pharmacologiques. A long terme, l’identification de solutions thérapeutiques efficaces permettra le transfert de ces données vers la clinique pour une meilleure prise en charge et prévention de la maladie
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute. Le projet comprend aussi un test de force musculaire non invasif sous anesthésie générale (10-15 min).
Impact sur les animaux
Les souris modèles développent une maladie neuromusculaire progressive avec la perte de la coordination des mouvements et une intolérance à l’effort uniquement décelable grâce aux tests de comportement, ce qui peut induire un léger stress. Ces souris ont une alimentation et une durée de vie normales. Pour l’identification et le génotypage des animaux, le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. A l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort dus au poids de la bague.
Devenir
Les animaux reproducteurs seront utilisés pour générer le nombre d’animaux nécessaires pour la procédure expérimentale. Les animaux de génotypes non-utiles seront recyclés pour les croisements ou d’autres utilisateurs, ou mis à mort. Les animaux des cohortes expérimentales sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et biochimiques
Remplacement
Bien que l'analyse de la fonction musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, la coordination des processus biologiques qui la régule et leurs répercussions fonctionnelles ne peuvent être étudiées qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
Les souris étant génétiquement modifiées, un élevage spécifique est mis en place. Les souris surnuméraires et de génotypes utiles sont recyclées pour les croisements ou pour d’autres utilisateurs. L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses expérimentales. L’utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l’établissement des données expérimentales, à l’aide des analyses statistiques effectuées précédemment. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des mesures de force musculaire rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors du protocole de la mesure de la force musculaire.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines puisque 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos premières données de l’étude du modèle montrent que ce modèle reproduit la maladie étudiée dans ce projet. Pour l’élevage de la lignée, des souris âgées entre 8-20 semaines seront utilisés pour s’affranchir d’éventuelle baisse de production après 6 mois. L’identification et la biopsie pour le génotypage se font à 15 jours. Pour la procédure expérimentale, deux stades seront étudiés pour les test de force musculaire: 20 et 40 semaines. A 40 semaines, une intolérance à l’effort a déjà été identifiée dans une expérience pilote menée dans une précédente animalerie sur un nombre limité d’animaux en utilisant un protocole de tapis roulant, démontrant des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire. Ensuite, les analyses biochimiques montrent des anomalies dès 20 semaines pouvant potentiellement entraîner des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire.