Procédures légères

6 000 vaches laitières vont être utilisées, gardées en vie dans les élevages à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une unique prise de sang à la veine caudale, d'environ une minute, présentée comme une gêne légère et transitoire. L'objectif est de constituer une large cohorte de vaches Holstein pour identifier leur épigénome et créer un nouvel index de gestion de l'élevage. Le porteur qualifie cette étape d'"absolument incontournable" et affirme que la démarche "ne peut être conduite qu'au niveau de l'animal entier".

Objectifs

Globalement le projet établira les relations entre variations phénotypiques observables, la génétique, l’épigénome et l’environnement. La démarche mise en œuvre va contribuer à mieux définir les caratéristiques de chaque individu et offrira de nouveaux modèles d’évaluation plus fiables. Pour l’élevage et les éleveurs, une retombée de l’outil consistera dans l’identification de nouveaux indicateurs de gestion intégrant des données épigénétiques. Cet outil sera aussi utilisé pour rechercher des animaux capables de s'adapter aux changements environnementaux de par leur plus grande plasticité épigénétique et génomique. Ces connaissances aideront à définir de nouvelles stratégies de sélection visant des animaux plus robustes aptes à exprimer leur potentiel dans des conditions variables tout en maintenant leur santé et bien-être pour un élevage durable.

Bénéfices attendus

La collection d’échantillons biologiques ainsi que l’ensemble des données fourniront pour la première fois l’opportunité de traiter une large cohorte de vaches Holstein et d’en identifier l’épigénome. Cette étude originale est une première pour le monde de l’élevage. Cette étape est absolument incontournable pour déterminer la puissance de l’outil d’épigénotypage que nous développons et définir un nouvel index de management apte à prendre en considération tout l’historique de vie de l’animal. Cette démarche met les derniers progrès technologiques et méthodologiques de la biologie au service d’un élevage responsable et durable.

Procédures

Les vaches seront soumises à une seule prise de sang à la veine caudale pour le projet. La durée de l'intervention sur chaque animal dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins seront effectués lors de contensions prévues : soit au moment de l’alimentation aux cornadis soit au cours de la traite (robot de traite). La douleur occasionnée par l’aiguille de prélèvement est légère et transitoire. La ponction de sang est très limitée (2 x 5 ml) en proportion du volume sanguin de l’animal (de l’ordre de 50 litres total ; soit 1/10000ème).

Devenir

Les animaux restent dans les élevages à l'issue de la prise de sang.

Remplacement

Le projet est conduit sur l’espèce bovine pour l’espèce bovine. Il ne peut donc y avoir de remplacement. Il s’agit d’une démarche de biologie intégrative pouvant prendre en compte tous les processus biologiques et ne pouvant être conduite qu’au niveau de l’animal entier. Le choix de la race Prim’Holstein tient à sa prépondérance dans la production de lait française : nous étendrons l’étude à d’autres races laitières et allaintantes dès obtention des financements.

Réduction

Le nombre de vaches à inclure dans l’analyse est de l’ordre de 6000. Il est donc nécessaire d’inclure non seulement des vaches Holstein issues des fermes expérimentales qui offrent un suivi de conduite d’élevage mais aussi des vaches de fermes commerciales . Notre démarche s’apparente aux analyses épidémiologiques menées chez l’homme, le nombre important d’individus à inclure dans le protocole permet d’appréhender la grande variabilité phénotypique.

Raffinement

Une prise de sang à la queue représente une gène légère pour les vaches, et sans conséquences vu le volume de sang prélevé. Cependant, les animaux prélevés seront surveillés suite au prélèvement pour vérifier qu'il n'y a pas de problème. Le cas échéant, le vétérinaire de l'élevage sera appelé pour prendre en charge ledit problème.

Choix des espèces

Le projet s’interesse à l’espèce bovine et toute la démarche expérimentale proposée doit aboutir à la création d’un nouvel index de management permettant une intégration de l’historique de vie de l’animal. Cet index doit être un indicateur du bien-être et de la santé des vaches. L’établissement de cet index sera associé à une série de recommandations dont l’objectif final est l’expression du potentiel génétique de l’animal dans le respect de ses besoins. Une simple prise de sang reste un geste très peu invasif et peu douloureux, n’occasionnant qu’une gène transitoire. Toutes les vaches des élevages commerciaux identifiés et fermes expérimentales seront incluses dans le protocole, quelques soient leur âge, parité ou stades physiologiques (en cycle, en gestation, en lactation, tarie). Néanmoins leur statut sera noté avec précision.

28 vaches laitières vont être utilisées, gardées en vie et remises au troupeau à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent sept prises de sang et quatre prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-œsophagien sur douze semaines, ce sondage pouvant irriter l'œsophage. L'objectif est d'utiliser leur comportement alimentaire comme indicateur de performance technique et environnementale au pâturage, notamment des émissions de méthane. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse de l'animal et situe l'étude dans le contexte des "controverses liées à l'élevage bovin".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer finement l’impact du comportement alimentaire, tel qu’enregistré par des colliers d’activité du commerce, sur la physiologie digestive (pH et paramètres fermentaires du rumen, digestibilité de l’ingéré, métabolites sanguins…) les performances techniques (production, qualité du lait, efficience alimentaire…) et environnementales (émissions de CH4 entérique…) des vaches laitières au pâturage, en lien avec la biodiversité des prairies. In fine, les résultats pourraient permettre d’utiliser le comportement alimentaire, combiné à d’autres prédicteurs, pour améliorer le phénotypage de l’efficience alimentaire et environnementale des animaux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'améliorer la connaissance de l'impact du tri alimentaire sur la physiologie digestive, les performances techniques et les performances environnementales des vaches laitières. Ce travail permettra également d'étudier au pâturage les émissions de méthane entérique, qui ne sont habituellement mesurées qu'en bâtiment, via le développement matériel d'un appareil spécifique. In fine, le comportement pourrait être utilisé comme un proxy permettant de se passer de certaines mesures, qui peuvent parfois être invasives, pour étudier les effets de l'alimentation des vaches laitières au pâturage sur leurs émissions de gaz à effet de serre ou leur efficience alimentaire.

Procédures

Au cours des 12 semaines d'expérimentation, les animaux seront soumis à des prélèvements de sang et de fèces à 7 reprises et à des prélèvements de liquide ruminal à 4 reprises. L'ensemble des prélèvements sur un animal durera moins de 10min (sang/fèces < 5min, liquide ruminal environ 5 min)

Impact sur les animaux

Différents prélèvements sont prévues tout au long de l'expérimentation pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des vaches laitières. Il s'agit notamment de prises de sang, effectuée à la veine caudale, de prélèvements de fèces par fouille rectale et de prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-oesophagien. Ces prélèvements seront réalisés au cornadis et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation, qui sera toutefois effectuée par du personnel compétent et habitué à ces procédures. L'intubation des animaux pour les prélèvements de liquide ruminal est notamment susceptible d'induire une irritation temporaire de l'oesophage

Devenir

Les procédures mises en oeuvre sur les aimaux étant de classe légère, les animaux seront gardés en vie et replacés dans le troupeau à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

L'expérimentation porte sur la réponse zootechnique, physiologique et métabolique du comportement alimentaire de vaches laitières en lactation conduites au pâturage. Aucun modèle in vitro ou in sillico ne permet actuellement de reproduire la réponse de l'animal à l'ingestion de différents types de prairies sur l'ensemble de ces composantes et leurs interactions.

Réduction

D'un point de vue statistique, un calcul de puissance sur la base de données acquises dans de précédentes expérimentations portant sur l'impact zootechnique de la biodiversité des prairie ou sur les émissions de méthane entérique a permis de calculer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour pouvoir mettre en avant des différences de réponses zootechniques d'une part et en terme d'émissions de méthane entérique. Afin de ne pas remettre en cause la validité statistique des tests prévus, un effectif de minimum 12 vaches par lot est nécessaire. Pour pallier quelque éventuel problème pouvant affecter le nombre d'animaux (impossibilité de réaliser un prélèvement, maladie...) à inclure dans les analyses qui suivront l'expérimentation, nous recruterons deux lots de 14 vaches.

Raffinement

Les conditions de logement des animaux en stabulation répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Lors de la saison de pâturage, les animaux seront logés en extrieur, ce qui correspond à leur besoin "normal", tout en leur assurant un confort optimal. Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. En cas de souffrance ou de douleur prolongée à l'issue des prélèvements, les animaux concernés recevront un analgésique en vue d'en atténuer l'intensité.

Choix des espèces

Les ruminants, et notamment les bovins, sont les principaux consommateurs d'herbe pâturée. La connaissance des mécanismes digestifs en jeu dans la valorisation de l'herbe par les bovins sont un enjeu important au regard des controverses liés à l'élevage bovins (conditions de logement dans les bâtiment, utilisation de surface hors prairies qui pourraient être destinées à laproduction d'alimentation pour l'homme, rejet de gaz à effet de serre). Les vaches laitières utilisées seront en lactatction, puisqu'une partie des mesures nécessaires sera effectuée dans le lait.

15 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis, subissent des échocardiographies sous anesthésie et des prises de tension par brassard de queue, répétées à un, neuf et dix-huit mois, avant le prélèvement du cœur, des ganglions sympathiques et du cerveau. L'objectif est de mieux comprendre l'innervation sympathique du cœur et des vaisseaux, les retombées thérapeutiques contre l'hypertension ou l'infarctus étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir de l'expérimentation animale" pour mesurer ces paramètres physiologiques.

Objectifs

Les différents tissus de l’organisme sont approvisionnés en sang par les artères. Plus on s’éloigne du cœur, plus le calibre de ces artères est réduit. Les petites artères périphériques, comme les artères de la peau, ont la capacité de se contracter afin de contrôler la répartition du flux sanguin dans les différents organes de l’organisme. Le niveau de contraction de ces artères ou du cœur est sous le contrôle de nerfs appartenant au système nerveux sympathique, qui est impliqué dans toutes les réactions non conscientes comme le stress (qui provoque une accélération du rythme cardiaque par exemple). Cette étude de la mise en place et du maintien de l'innervation sympathique des vaisseaux et du cœur permettra de mieux comprendre l'origine et les mécanismes de certaines pathologies cardiovasculaires ainsi que leurs conséquences (hypertension artérielle, ischémie diabétique, infarctus du myocarde, cardiomyopathies dilatées, insuffisance cardiaque...), et ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont principalement d’ordre à faire progresser les connaissances scientifiques, mais à plus long terme pourraient être d’apporter de nouvelles thérapies pour les pathologies cardiaques ou l’hypertension en ciblant le système nerveux sympathique.

Procédures

Les animaux effectueront les trois premiers jours de l’expérimentation les tests physiologiques suivants : 1) Course sur un tapis : de 10 minutes 2) échocardiographie sous anesthésie gazeuse pendant 20 minutes 3)Une prise de tension par test dit de « tail cuff », sur animal vigile, la pression artérielle sera mesurée une fois pendant 3 jours consécutifs et la durée maximale de l’expérimentation est d’environ 20 minutes. Les mesures pourront être répétées chez les animaux à 1 mois, 8-9 mois et 18 soit 3 fois en tout.

Impact sur les animaux

Nous utilisons des cages de contention et nous posons un brassard de queue qui peuvent provoquer un stress léger.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures. Les organes (coeur, ganglions sympathiques, aorte, artères cutanées et mésentériques, et cerveaux) seront prélevés pour des études post-mortem.

Remplacement

Ce projet modélise plusieurs pathologies humaines, dans lesquelles le système nerveux sympathique est impliqué : l’hypertension artérielle d’origine sympathique et résistante aux traitements actuels, mais aussi l’arythmie et la fibrillation auriculaire, pour lesquelles les pistes thérapeutiques sont très limitées notamment de part un manque de connaissance de la régulation dynamique du système sympathique sur l’appareil cardio-vasculaire. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres physiologiques comme la pression sanguine ou le rythme cardiaque ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour les différentes lignées impliquées dans ce projet correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique valide. Statistiquement, nous utiliserons des tests non paramétriques. Ces tests ne faisant pas l’hypothèse de normalité de distribution des échantillons, il n’existe pas de nombre minimal d’échantillons pour les utiliser, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat statistiquement pertinent.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans un milieu enrichi en coton de nidification et avec un enrichissement de type dôme. Toutes les précautions sont prises afin d’assurer au mieux le bien-être de l’animal en réduisant au minimum leur stress lors des manipulations. Nous avons déterminé des critères d’arrêt précoce pour lesquels les animaux seront pris en charge et sortis des procédures. Pour ce faire, l’état général et le comportement des animaux seront suivis tout au long des procédures. Les animaux seront entrainés pour qu’il n’y ai pas de stress lors de la mise en cage de contention et les expériences nécessitant l’immobilité des animaux seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter tout stress.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car il existe de nombreuses lignées établies pour lesquelles des modifications génétiques permettent de suivre facilement des protéines ou de repérer des cellules spécifiques (gène fluorescent), ou dans lesquels un gène à été invalidé. Nous souhaitons visualiser et étudier l'effet de la perte d’expression de certaines protéines sur des animaux adultes, lors de la mise en place de l'innervation artérielle et cardiaque (0 à 5 mois après la naissance). D'après la littérature, l’innervation artérielle se met en place en 2 et 15 jours après la naissance mais sa maturation est effective à partir de 1 mois. Nous envisageons donc de réaliser nos études anatomiques et fonctionnelles au stade adulte (1-18 mois) en regardant spécifiquement l’évolution chez le très jeune adulte (1 mois), la souris « adulte » 8-9 mois et la souris agée (18 mois).

48 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie orale une surdose de vaccin coccidien destinée à provoquer une inflammation intestinale, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tués pour le prélèvement d'organes. L'objectif est de mettre au point un modèle standard d'inflammation servant à évaluer un additif alimentaire immunomodulateur. Le porteur indique s'appuyer d'abord sur des lignées cellulaires mais affirme devoir confirmer in vivo le mode d'action de l'additif chez le poulet.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif de développer un modèle d’inflammation standardisé chez le poulet de chair pour évaluer de nouvelles propriétés fonctionnelles d'un additif alimentaire permettant de moduler la réponse immunitaire innée. L'objectif étant de faire face aux infections retrouvées en élevage. Une attention croissante est accordée par les consommateurs à la qualité des produits qu’ils achètent, aux conditions d’élevage, aux pratiques agricoles et à l’impact sur le bien-être animal et l’environnement. Cependant, des maladies dont les origines sont multifactorielles peuvent parfois survenir en élevage. Pour exprimer tout leur potentiel génétique, les volailles doivent être maintenues en parfaite santé particulièrement sur le plan immunitaire. Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans la prévention des maladies et la croissance optimale des volailles. Les principales maladies aviaires sont caractérisées par un important processus inflammatoire dont l’étude constitue un intérêt en aviculture. En effet, la réduction de l'utilisation d'antibiotique au profit d'alternatives durables pour optimiser la croissance du jeune poussin tout en préservant sa santé digestive et une bonne mise en place de son système immunitaire sont en cours d'investigation. Parmi les stratégies utilisables, la nutrition joue un rôle important avec notamment l’incorporation dans les rations alimentaires d’additif pouvant moduler la réponse immunitaire non spécifique (innée), réponse prédominante chez le poussin. La nutrition animale s’intéresse de plus en plus aux propriétés spécifiques des divers substances comme les vitamines, les probiotiques, les plantes, les acides aminés ou autres pour soutenir les fonctions immunitaires des volailles dans un objectif de gestion intégrée de la santé. 70% de la capacité du système immunitaire des oiseaux se situe dans le tube digestif, aussi il est primordial de démontrer l'efficacité des additifs à moduler la réponse innée au travers de l’intégrité intestinale. Chez le poulet, les modèles d’inflammation sont le plus souvent réalisés in vivo afin d’évaluer les effets biologiques de l’incorporation des additifs dont l’activité immunomodulatrice aura été démontrée in vitro et ou ex vivo. La surdose de vaccin coccidien constitue un des moyens pour générer un modèle spécifique de réponse inflammatoire in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra (1) d’établir un modèle d’inflammation intestinal standard chez le poulet de chair afin de (2) pouvoir l’utiliser dans le but d’évaluer tous les additifs alimentaires dont l’effet immunomodulateur aura été montré soit dans la littérature, in vitro et ou ex vivo et (3) de confirmer l’effet en prenant en compte toutes les interactions cellulaires complexes qui ont lieu in vivo et qui peuvent influer sur la réponse inflammatoire. Ce projet permettra également de cibler les paramètres les plus pertinents pour évaluer la réponse inflammatoire dans des conditions expérimentales standardisées et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour répondre à l’hypothèse de l’étude en maitrisant mieux les écarts types de nos paramètres d’intérêt et raffiner les tests statistiques utilisés.

Procédures

Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoins nutritionels pendant 21 jours. A 15 jours d'age, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml de vaccin sera réalisée sur chaque animal de deux groupes sur trois. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progressivement en fonction de la déglutition de l'animal. Une partie des animaux seront soumis à un prélèvement sanguin 24 heures (1jour) post administration et l'autre partie 144 heures après (6 jours). A chaque temps de prélèvement, un volume de 2ml de sang nécessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de contention de l'animal ne dépassera pas 1 min.

Impact sur les animaux

La durée de la période de vaccination est trop courte (3 jours) pour enregsitrer une perte de poids quotidienne suite à la surdose de vaccination, inconfort et stress du au gavage et aux prises de sang.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux impliqués dans la procédure pour réaliser les prélèvements d’échantillons biologiques.

Remplacement

Pour réduire le recours à l’expérimentation animale le développement de méthodologies alternatives comme les lignées cellulaires sont largement utilisées en biologie cellulaire aviaire pour évaluer les mécanismes de la réponse immunitaire innée et l’effet immunostimulant de tout additif d’intérêt. Ces méthodes alternatives utilisées en première intention doivent cependant être confirmer in vivo afin de prendre en compte toutes les interactions cellulaires complexes qui ont lieu in vivo lors de l’ingestion des additifs chez le poulet. Sur la base des connaissances acquises in vitro, le développement d’un additif alimentaire avec une activité immunostimulante supposée implique de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur l’expression des gènes d’inflammation entre un groupe d’animaux non vacciné et vacciné. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentiel au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possible par animal.

Raffinement

Gavage :inconfort, stress de la contrainte lors du maintien des animaux, sont réduits par une manipulation empathique, délicate et compétente des animaux par les applicateurs de la procédure, un gavage unitaire de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL Prises de sang : inconfort et le stress dus à la contention de courte durée et la douleur légère liée à l’introduction de l’aiguille sont réduits par une manipulation délicate des animaux maintenus en décubitus latérale, un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie, en piquant le plus haut possible dans la veine jugulaire et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans la procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires Pas d'utilisation d'anesthésique local en vue du prélèvement de sang car cela nécessiterait de capturer deux fois les animaux (application du produit et réalisation du geste) entrainant un stress et un inconfort supplémentaire. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place au démarrage de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux ne se coincent pas les pattes dans les mailles de la grille et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture.L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (grelots scintillants), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les additifs alimentaires dont l’activité immunomodulatrice veut être confirmée au moyen de ce modèle d’inflammation, sont destinés à être incorporés dans les rations alimentaires distribuées aux volailles (poulets de chair). Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 21 jours. Des poulets juvéniles seront utilisés dans cette étude car à cet age le système immuitaire n'est pas totalment développé et il sera donc plus facile de mesurer la réponse inflammatoire.

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de tumeurs dans le péritoine, elles reçoivent des injections d'agents fluorescents et sont soumises à des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, puis tuées pour l'analyse de leurs organes. L'objectif est d'évaluer des agents de contraste destinés à aider les chirurgiens à distinguer le tissu cancéreux du tissu sain par fluorescence. Le porteur indique avoir écarté une partie des composés par des tests in vitro mais affirme ne plus pouvoir se passer de l'animal pour analyser la biodistribution.

Objectifs

L'objectif de cette étude est de tester de nouveaux produits pour leur potentiel en tant qu'agents d'imagerie optique (utilisant la fluorescence). Nous avons d'abord vérifié en laboratoire si ces nouveaux produits étaient toxiques pour les cellules et s'ils pouvaient être absorbés par ces dernières. Ensuite, nous avons examiné les propriétés optiques de ces produits en utilisant différents systèmes. Les produits les plus prometteurs ont été testés sur des animaux porteurs de tumeurs cancéreuses dans le péritoine. Nous avons évalué les conditions optimales d'utilisation de ces produits, leur distribution dans l'organisme et leur pharmacocinétique. Maintenant, nous souhaitons tester ces produits pour l'imagerie de lésions plus petites dans le péritoine et comparer l'imagerie bioluminescente avec l'imagerie de fluorescence.

Bénéfices attendus

Nous voulons permettre et valider la détection en profondeur de lésions de faible taille dans le cadre de l'aide à la chirurgie par imagerie de fluorescence. L'aide à la chirurgie par imagerie de fluorescence est une méthode permettant au chirurgien de séparer le tissu cancéreux du tissu sain.

Procédures

Après le 7eme jour post-implantation tumorale, chaque souris sera imagée 2 fois par semaine par bioluminescence (injection de luciférine) pour une durée maximum de 15 min d’intervention. Ceci jusqu’à atteindre le 1.10e9 photons/pixel/seconde. Une fois le signal voulu atteint, pour chaque souris, il y a 3 types d’imageries différentes ante-injection et 3 imageries post-injection du composé. Les imageries durent au maximum 15mn sous anesthésie. Par exemple, la souris au temps 5h sera imagée par les 3 types d’imagerie avant l’injection du composé (imagerie contrôle) puis sera à nouveau imagée de la même manière au temps 5h. Ensuite, elle sera mise à mort afin d’effectuer des tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections péritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies

Devenir

Dans chaque procédure, tous les animaux impliqués seront mis à mort car pour chaque temps, des mesures ex-vivo sont nécessaires. Ainsi pour le même animal, nous ferons des analyses in vivo et ex vivo (analyse des organes) afin de multiplier le nombre de tests sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.

Remplacement

Les alternatives non animales pour ce projet ont été utilisées dans le cadre de la caractérisation optique et photo acoustique des composés fluorescents ainsi que de la cytotoxicité potentielle. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les propriétés optiques des composés ont été réalisés par imagerie de gouttes de solution En effet, nous avons réalisé des investigations in vitro afin d’observer le comportement biologique des molécules d’intérêt sur des cellules normales et cancéreuses, leur internalisation dans les cellules, leur cinétique, leur localisation sub-cellulaire ainsi que leur cytotoxicité. Ceci nous a permis de remplacer un certain nombre d’animaux A ce stade de nos recherches nous ne pouvons plus nous passer de l’utilisation de modèles animaux car aucun moyen in vitro ne nous permet d’analyser la biodistribution.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, un criblage a été fait sur les fluorophores afin d’en sélectionner seulement 3 parmi une vingtaine. Nous avons rélisé un design d’expérimentation qui utilise juste le bon nombre de souris, tout en ayant assez d’animaux pour effectuer les tests statistiques adéquats lors de nos anlalyses. Nous plafonnons le nombre d’animaux grâce à la multiplication des tests/analyses sur un seul animal (analyses ex-vivo après expérimentation animale d’imagerie). L’approche statistique et notre expérience nous permettent de réduire le nombre d’animaux au minimum afin d’obtenir des résultats exploitables. 5 animaux par conditions en biodistribution permettent une analyse fiable prenant en compte les variabilités inter individu.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre dans un établissement agréé. Des tests préliminaires ont déjà été effectués sur des modèles sous-cutanés, nous permettant d’affiner de manière précise la mise en œuvre de cette expérimentation. Nous tenons compte des meilleures conditions d'hébergement pour nos modèles murins et nous veillerons au bien-être animal de nos souris. Tous les personnels impliqués dans ce projet ont des compétences validées pour les manipulations des souris. Nous utilisons des souris permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le niveau de sévérité de ces expérimentations est modéré. Les différentes interventions sont réalisées sous anesthésie générale. Nous utilisons des points limites spécifiques et des critères d'arrêt de souffrance. Le suivi quotidien des animaux garantira leur bien-être, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Enfin, la mise à mort des individus est réalisée de manière règlementaire (dislocation cervicale).

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’homme, notamment dans le cadre d’études visant à comprendre le développement de cancers, la mise au point de nouveaux agents de contraste et de nouvelles thérapies avant d’entreprendre des études cliniques. La souris Nude permet le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. La méthode utilisée pour induire une tumeur est rapide, reproductible, et la bonne connaissance de ce modèle murin fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont connues (taille de la tumeur par exemple). C’est également un modèle expérimental robuste et adapté à l’étude de la biodistribution de fluorophores et de radiotraceur par imagerie du petit animal. De plus, la majeure partie des études expérimentales sur le cancer utilisent les modèles murins, ce qui permettra une comparaison et confrontation des résultats obtenus avec la littérature. Nous utiliserons des souris (athymic c'est à dire "sans thymus") de 6 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale avant le pic de production de globules blancs et la mise en place d'un système immunitaire innée à l’âge de 8 semaines.

480 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis remis en élevage. Ils sont pesés cinq fois et immobilisés dans un hamac en position dorsale pour des prises de sang vigiles, des prélèvements de mucus nasal et des collectes de fèces, afin d'étudier le lien entre la génétique de deux lignées porcines et la composition de leurs microbiotes. Le projet vise à terme à utiliser le microbiote comme critère de sélection pour la filière porcine. Le porteur affirme que le porc est l'"espèce cible" et qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut atteindre ces objectifs.

Objectifs

Le terme microbiote désigne une communauté bactérienne qui occupe une niche écologique, qui peut être décrite par l'ensemble des genres bactériens qui la compose. Les organismes vivants cohabitent avec de telles communautés. Chez les animaux, elles colonisent un certain nombre de surfaces et notamment les cavités orales, nasales ou intestinales. Un des microbiotes qui a plus particulièrement été étudié ces dernières années est celui de l'intestin, puisqu'il participe au processus de digestion et contribue à la santé de son hôte. Pour les animaux d'élevage, la compréhension des mécanismes qui interviennent dans l'installation, le maintien ou l'évolution du microbiote intestinal au cours de la vie d'un animal est essentielle. Dans ce projet, notre objectif est d'établir si la génétique du porc est un facteur qui intervient dans la composition des microbiotes de la cavité nasale et des intestins. Dans ce but, nous réaliserons différents prélèvements dans deux lignées de porcs connues pour avoir des microbiotes différents. Du sang sera prélevé pour l'étude de marqueurs génétiques et métaboliques du porc ainsi que du mucus nasal pour vérifier le microbiote dans ce site. Les fécès produits spontanément seront utilisés pour vérifier la composition du microbiote intestinal. Ces paramètres seront mis en regard de l'état de santé global des animaux.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet amènera des informations sur la composition de différents microbiotes, leur évolution avec l'âge du porc et leur association à des marqueurs génétiques et métaboliqes du porc. A plus long terme, d'un point de vue plus appliqué, ces connaissances pourront être utilisées en sélection pour améliorer, via la prise en compte de la composition du microbiote, la santé des animaux.

Procédures

Les 480 animaux du projet dont pesés 5 fois, à la naissance, à 21 jours, à 28 jours au sevrage, à 68 jours en fin de post sevrage, et en fin d'engraissement vers 140 jours d'âge, avec une mesure de l'épaisseur de gras dorsal par ultrasons. Une pesée dure une quinzaine de secondes. Au sevrage et en fin de post sevrage, elle est réalisée durant le changement de local des animaux. Une prise de sang est réalisée sur 480 porcelets vigiles. Au même moment, il y a une collecte de fèces suite à une défécation spontanée et un prélèvement de mucus nasal. L'intervention impliquant la saisie de l'animal, sa contention et son isolement dans un hamac en position dorsale pour réaliser tous les prélèvements dure environ 3 minutes. Une collecte de fèces est réalisée à 120 jours à partir d'une défécation spontanée.

Impact sur les animaux

La saisie de l'animal provoque un stress léger et temporaire pour l'animal attrapé et pour ses congénères au niveau de la case d'hébergement. Le prélèvement de sang provoque une douleur légère et transitoire. Le prélèvement de mucus occasionne une gène légère au moment du raclement de la paroi nasale. Chaque pesée génère un stress léger et transitoire en raison de l'isolement et de la contention de l'animal nécessaire à une pesée individuelle.

Devenir

Les animaux sont remis en conditions d'élevage.

Remplacement

Les mesures sur le porc sont requises car il s'agit de l'espèce cible. L'objectif est d’explorer dans cette espèce l'influence génétique de l'hôte sur le microbiote intestinal et nasal, et les relations avec les paramètres sanguins. Il n'existe ni modèle in vitro ni modèle in silico permettant d'atteindre les objectifs fixés.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour obtenir des résultats exploitables et fiables en terme statistique.

Raffinement

Les animaux sont élevés avec un enrichissement du milieu adapté au porc incluant des cordelettes, des sacs en toile de jute, des pierres de sel à lécher, des chainettes et des ballons. Pour la prise de sang, la saisie et la contention des animaux sont réalisées par les membres du personnel expérimenté en charge du soin des animaux, auxquels les animaux sont familiarisés. Les prélèvements de sang et de mucus se font par des techniques maitrisées qui limitent la durée de contention de l'animal. Les points limites ont été établis en fonction d'une grille d'observation des animaux. Lorsqu'un point limite est atteint, le responsable d'élevage agit selon le plan établit avec le vétérinaire d'élevage, en accord avec le porteur du projet.

Choix des espèces

Le porc est l'espèce cible. Afin d'améliorer les conditions d'élevage du porc (bénéfice à long terme du projet), il est essentiel d'utiliser cette espèce. Les animaux sont étudiés entre la naissance et la fin d'engraissement. L'âge de 60 jours retenus pour le prélèvement de sang, de fèces et de mucus, correspond à une phase précoce de stabilisation du microbiote intestinal après le passage à l'aliment solide au moment du sevrage. L'âge de 120 jours retenu pour le deuxième prélèvement de fèces correspond à la fin d'engraissement à un stade où les animaux ne sont pas encore pubères.

20 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection intrapéritonéale d'un analogue de la thymidine, puis est tuée pour prélever ses embryons et analyser la prolifération cellulaire des arcs pharyngés au cours du développement craniofacial. L'objet du projet est d'étudier le rôle de deux gènes du chromosome 21 humain dans la trisomie 21, avec l'espoir lointain d'identifier des biomarqueurs pour un futur traitement. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode autre que l'étude in vivo" et que la souris est proche de l'humain sur le plan génétique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier le rôle de deux gènes, présents sur le chromosome 21 humain, dans la prolifération cellulaire au niveau des arcs pharyngées, lors du développement du complexe crânio-facial dans la trisomie 21 (T21). Pour ce faire, nous avons défini deux objectifs principaux : -Objectif 1 : Évaluer la prolifération et la progression du cycle cellulaire : Pour définir le taux de prolifération et la durée du cycle cellulaire, nous prélèverons des embryons 2 heures après l'injection d’un analogue nucléosidique synthétique dont la structure chimique est similaire à celle de la thymidine (un composé de l'ADN) et qui peut être incorporé à la place de la thymidine dans les molécules d'ADN nouvellement synthétisées par les cellules en cours de division. Les cellules qui ont récemment répliqué ou réparé l'ADN peuvent être détectées à l'aide d'anticorps spécifiques en utilisant des techniques telles que l'immunohistochimie ou l'immunofluorescence (techniques histologiques). En outre, le nombre de cellules positives nous permettra d'évaluer le nombre de cellules en prolifération. -Objectif 2: Evaluer le pourcentage de cellules qui sont sorties de cycle cellulaire : Pour les études de la sortie du cycle cellulaire, les embryons seront prélevés 24 heures après l’injection.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l'une des principales caractéristiques associées à la T21, à savoir les anomalies crâniofaciales, est importante car cette pathologie offre de grandes opportunités pour découvrir des mécanismes novateurs et communs à d’autres maladies. En effet, le dimorphisme crânio-facial et la déficience intellectuelle se retrouvent dans de multiples autres troubles physiques et mentaux. En comprenant l'effet du surdosage de deux gènes, présents sur le chromosome 21 humain, sur la prolifération cellulaire au niveau des arcs pharyngés, pendant le développement du complexe crânio-facial dans la trisomie 21, nous pourrons identifier et valider de nouveaux mécanismes impliqués dans le phénotype crânio-facial caractéristique de la T21. Cela nous fournira de nouveaux paradigmes sur le développement du système crânio-facial pendant la gestation et à la naissance des individus atteints de la T21. En particulier, nous serons en mesure d'identifier des biomarqueurs pour surveiller plus précisément le surdosage du gène cible pour le futur traitement des patients.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, les souris ne seront soumises qu'une seule fois à une injection d'une molécule chimique pouvant s'insérer dans l'ADN (durée de l’acte : 30 secondes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, des injections intrapéritonéales d'une molécule chimique pouvant s'insérer dans l'ADN seront réalisées chez des femelles gestantes. La contention nécessaire pour réaliser cette injection peut provoquer un léger stress chez l'animal pendant une courte période ainsi qu'une douleur légère à l'injection de courte durée.

Devenir

L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires et histologiques sur les arcs pharyngés.

Remplacement

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que les origines développementales des pathologies génétiques associées à des dysmorphismes crânio-faciaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. A ce jour, il n’existe pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines.

Réduction

Afin d’effectuer toutes les expériences notre étude nécessitera 20 souris femelles. Nous réaliserons tout d’abord les tests préliminaires avec 4 femelles gestantes afin de mettre au point les protocoles histologiques. Les expériences seront poursuivies avec les protocoles donnant les meilleurs résultats. Nos expériences principales seront construites sur des groupes de 5 échantillons (embryons) par génotype pour avoir un résultat significatif. Nous allons utiliser 8 femelles gestantes pour répondre à nos 2 objectifs. Cependant nous évaluons le taux de fausse gestation ou de portées trop petites (ne contenant pas 3 contrôles et 3 mutants) à 50% ce qui nous amènera à utiliser 16 femelles gestantes au maximum pour obtenir le nombre d’embryons nécessaire.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien tout au long du projet. Les animaux sont évalués tous les jours pour des signes de douleur suivant l’échelle de l’évaluation de l’état corporel et comportement naturel : (hérissement du poil, attitude voûtée , prostration, amincissement des flancs…)Dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus, soignés ou euthanasiés selon leur état. Une attention particulière sera faite concernant le point d’injection. Un suivi sera fait 30 minutes après afin de s'assurer qu'il n'y ait pas de boursouflure ou suintement et dans ce cas, la souris serait alors traitée avec un antiseptique local si nécessaire ou mis à mort. Tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par groupe de 2 minimum pour éviter l'isolement et garder le lien social. Les femelles gestantes auront un carré de cellulose dans les cages leur permettant de faire un nid.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. La souris est physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique de la souris sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez la souris ce qui permet de multiples applications. Les souris femelles gestantes seront injectées à 8.5 jours post accouplement et les embryons seront utilisés aux stades embryonnaires suivant : 1)E8.5 - pour définir l’index de prolifération et la longueur du cycle cellulaire 2)E9.5 - pour les études de la sortie du cycle cellulaire ; les embryons sont prélevés 24 heures après l’injection Ces stades embryonnaires ont été choisis parce que chez la souris, le développement crânio-facial commence à E8.5.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer, elles subissent un test de reconnaissance d'objets puis le test de la piscine de Morris, qui les oblige à nager, pour étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans les déficits de mémoire. Le porteur reconnaît que la nage forcée est stressante et présente un risque d'hypothermie et de fatigue. Il justifie le recours à la souris par la "nécessité" d'un organisme vivant proche de l'humain.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer résulte d'une lente dégénérescence des neurones. Elle se caractérise par des troubles de la mémoire, de l'orientation dans le temps et dans l'espace. Le patient perd progressivement son autonomie. Bien que plusieurs hypothèses aient été avancées, les causes exactes de la maladie restent complexes. Ces dernières années, la recherche a montré un intérêt croissant pour l'étude des cellules sénescentes. Les cellules sénescentes sont des cellules qui ont définitivement cessé leurs activités initiales ainsi que leur multiplication. Elles restent cependant très actives et produisent des protéines qui peuvent être nocives pour le tissu cérébral. La sénescence cellulaire est un des mécanismes naturels du vieillissement, mais elle peut devenir pathologique si les cellules sénescentes s'accumulent. Des recherches ont montré un lien entre l'accumulation des cellules sénescentes et la maladie d'Alzheimer chez l'Homme et la souris. Cependant, les mécanismes par lesquels la sénescence contribue aux symptômes de la maladie d'Alzheimer ne sont pas clairs. Pour tenter de comprendre le rôle de la sénescence dans la maladie d'Alzheimer, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées capable de développer la maladie d'Alzheimer. Chez ces souris, nous empêcherons la production de p21 ou de p16, deux protéines impliquées dans l'activation de la sénescence cellulaire. Nous examinerons l'effet de l'inhibition de l'une ou l'autre de ces protéines sur les capacités de mémoire et d'orientation spatiale des animaux.

Bénéfices attendus

En bloquant la production de ces protéines, nous espérons réduire, modifier ou retarder les symptômes associés à la maladie d'Alzheimer. Comme p16 et p21 semblent jouer des rôles distincts, nous pensons que la perte de chaque protéine entraînera des changements spécifiques.

Procédures

À 4 mois, l'ensemble des animaux seront soumis à deux tests comportementaux. Le premier, le test de reconnaissance d'objets, il n'induit pas de stress et dure 5 jours consécutifs. Le second, la piscine de Morris, d'une durée de 15 jours, est considéré comme provoquant une légère nuisance. Pendant les six premiers jours, 4 sessions de 90 secondes sont organisées par jours. Les jours 7, 14 et 15 une session de 60 secondes par jours est organisée.

Impact sur les animaux

La réalisation du test de la piscine de Morris implique de faire nager les souris. Les souris savent nager spontanément mais l’eau n’est pas leur élément favori. Ainsi le test est considéré comme stressant. Les nuisances potentielles sont le risque d’hypothermie et la fatigue due à la nage.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après 15 jours de tests. Les cerveaux seront prélevés pour l'analyse des marqueurs de sénescence cellulaire de la maladie d'Alzheimer.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle animal, ici la souris, se justifie par le fait que les anomalies observées (altération de la mémoire) nécessitent un modèle vivant suffisamment proche de l'Homme.

Réduction

Pour assurer la fiabilité des tests statistiques, il faut utiliser au moins 16 animaux par groupe. Au total, il y aura 8 groupes d'animaux. Nous utiliserons donc 128 animaux. Nous utiliserons 64 femelles et 64 mâles.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement du début à la fin de l'expérience. Si les animaux montrent des signes de souffrance, d'inconfort ou de douleur, ils seront exclus des tests et traités ou euthanasiés en fonction de leur état. Les animaux seront habitués au manipulateur avant les tests et seront gardés en groupes d'au moins deux individus. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un nid sera placé dans leur cage. Pendant l'essai en piscine de Morris, les souris seront surveillées par caméra. Les individus présentant des signes de fatigue seront retirés de la piscine. Pendant l'intervalle entre les essais (15-20 minutes), l'animal sera séché et placé sous une lampe chauffante pour une période de repos.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiopathologiques et moléculaires des maladies neurodégénératives nécessite l'étude d'un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n'y a donc pas d'autre méthode que l'étude chez l'animal. La souris est une espèce physiologiquement proche de l'homme chez laquelle il est possible d'effectuer des manipulations génétiques afin d'obtenir un modèle de pathologies humaines. De plus, les études sur le modèle humain sont limitées, contrairement au modèle murin qui permet d'accéder à différents tissus et différents stades de la pathologie. Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de l'âge de 4 mois. Cet âge correspond à l'apparition des symptômes chez la souris.