Procédures légères

1 900 xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les groupes, ils subissent des destructions ou des lésions chimiques des organes de l'équilibre, des sections de nerf, des centrifugations de plusieurs jours ou la pose d'électrodes, avant dissection du système nerveux, pour étudier le développement des réseaux moteurs pendant la métamorphose. Le porteur décrit une gêne transitoire, l'animal lésé ne nageant plus qu'en hélice, et affirme une récupération rapide. Il indique recourir à la modélisation informatique mais juge "indispensable" d'interroger le système nerveux à chaque niveau.

Objectifs

Le but de nos travaux est de comprendre comment se construisent les réseaux de neurones impliqués dans la locomotion et comment se mettent en place leurs interactions avec les autres réseaux moteurs (notamment oculaires, posturaux et respiratoires) au cours du développement. Pour cela, nous avons choisi d’étudier un modèle d’amphibien anoure, Xenopus laevis, dont la métamorphose complète implique une refonte globale de son appareil posturo-locomoteur et des réseaux neuronaux qui le contrôlent. Ainsi, nous analysons les mécanismes qui permettent les adaptations motrices observées lors de la transformation entre le têtard et la grenouille. Par des analyses multiples et complémentaires (physiologiques, morphologiques, comportementales), nous comprendrons les mécanismes fins qui commandent à la construction du système nerveux, ainsi qu’à son fonctionnement et son adaptabilité.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet de recherche fondamentale dont l'objectif principal est de comprendre comment se mettent en place les réseaux de neurones moteurs au cours du développement et comment ces réseaux interagissent et s'adaptent pour assurer la fonction motrice la meilleure possible, quelles que soient les conditions intrinsèques ou extrinsèques à l'animal. De ces mécanismes fondamentaux d'adaptation pourront être identifiés, par la suite, des cibles potentielles de réadaptation fonctionnelle (notamment dans le cadre de lésions du système nerveux).

Procédures

* Injection de traceurs cellulaires sous anesthésie profonde - 460 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Destruction unilatérale des organes vestibulaires sous anesthésie profonde - 650 animaux - durée de l'intervention: 4 min; * Section du nerf de la ligne latérale sous anesthésie profonde - 80 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Lésion chimique des organes vestibulaires sous anesthésie profonde - 640 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Centrifugation - 480 animaux - durée de l'intervention variable: 10, 20 ou 30 jours; * Electromyographie (EMG): mise en place des électrodes sous anesthésie profonde - 50 animaux - durée de l'intervention: 3 min; durée des enregistrements des activités musculaires sur l'animal vigile: 20 min; retrait des électrodes sous anesthésie légère: 30 sec; * Etape finale de toutes les expérimentations, dissection complète du système nerveux sous anesthésie profonde - 1900 animaux – durée moyenne de l'intervention: 45 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont très limitées dans les protocoles que nous employons sur l'animal in vivo. Les incisions de la peau nécessaires aux lésions sensorielles et/ou l'injection de marqueurs neuroanatomiques cicatrisent extrêmement vite chez ces animaux et aucun signe d'infection n'est observé ensuite. La récupération de l'anesthésie est aussi très bonne et rapide. Seules les lésions sensorielles peuvent induire une gêne relativement importante de par une impossibilité transitoire de nager de façon normale, puisque l'animal ainsi lésé ne peut produire que des déplacements de type hélicoïdal. Néanmoins, cette gêne est très temporaire comme en attestent le retour rapide (moins de 2h pour l’hémilabyrinthectomie) à des comportements normaux (nutrition normale, déplacements spontanés, interactions normales avec les congénères…) et un taux de survie comparable aux animaux témoins. En effet, l’animal vestibulo-lésé reste capable de se déplacer librement, de se nourrir et de remonter respirer à la surface (juvénile) sans problème, et aucun signe de dépérissement particulier n'est observé en comparaison des animaux témoins qui ne subissent aucune intervention.

Devenir

Nos procédures incluant toutes une analyse électrophysiologique et/ou neuroanatomique sur système nerveux isolé in vitro, la totalité des animaux sera finalement mise à mort.

Remplacement

Pour remplacer les animaux dans nos études, nous avons recours à la modélisation informatique du comportement et/ou des réseaux de neurones impliqués afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, puisque nous réalisons une étude intégrée du développement de la fonction locomotrice (au sens large), il nous est alors indispensable d’interroger le système nerveux à chaque niveau, partant d’une analyse du comportement chez l’animal in vivo jusqu’à l’enregistrement sur système nerveux central isolé in vitro des propriétés électriques et morphologiques des neurones qui sous-tendent ce comportement.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons recours à des tests statistiques standards (t-tests, ANOVA) ou circulaires (souvent mieux adaptés aux comportements rythmiques tels que la locomotion). Le nombre d’animaux utilisés correspond au nombre minimal pour valider les résultats.

Raffinement

Tout au long de l’année, les animaux sont recueillis au stade d’embryons auprès d'une animalerie agréée et élevés dans l’animalerie xénope du laboratoire sous surveillance journalière, jusqu’aux stades développementaux d’intérêt. Les animaux ayant subis des interventions dans l’annexe de l’animalerie au laboratoire sont replacés, après 2 jours d’observation accrue (toutes les 2 heures en journée, par des personnels formés, selon une grille d'évaluation validée par le vétérinaire référent du Département), dans l’animalerie aquatique pour y poursuivre leur croissance sous contrôle journalier. Pour tous les animaux, et plus particulièrement ceux ayant subi une intervention, l’attention est mise sur les marqueurs potentiels de la douleur, bien que les interventions que nous pratiquons ne semblent pas générer de souffrance des animaux à ces stades. Toutefois, si des signes de souffrance devaient être observés chez un de ces jeunes animaux aquatiques (perte de poids, gonflement excessif, absence de réaction, perte anormale de pigmentation sont les points limites classiquement suivis), l’animal serait immédiatement retiré du protocole et mis à mort par immersion prolongée dans un bain concentré d’anesthésique.

Choix des espèces

Nous étudions la réorganisation dynamique du système nerveux et des fonctions sensori-motrices chez Xenopus, un anoure qui subit une métamorphose complète de son système locomoteur nécessitant le remodelage progressif des réseaux moteurs spinaux et supra-spinaux et de leurs afférences sensorielles. De plus, de très nombreuses études neurobiologiques ont été réalisées sur le développement du système locomoteur axial de cet animal, de l'éclosion jusqu’aux stades pré-métamorphose, nous offrant une base de données précieuses sur la structure, les propriétés fonctionnelles et la plasticité du réseau moteur qui contrôle la nage avant la métamorphose. Notons enfin que Xenopus joue depuis plusieurs années un rôle clé dans l'étude de l'organogenèse et de ses mécanismes moléculaires avec, entre autres, la production d'animaux transgéniques. Certains d'entre eux seront fort utiles, à l’avenir, pour nous aider à déterminer le rôle des afférences sensorielles dans la plasticité développementale des réseaux moteurs. Nous travaillons autour de la métamorphose, entre la fin de la période larvaire et le juvénile. En effet, c'est sur cette période que les réseaux et coordinations de type adulte se mettent en place à partir de l'organisation larvaire. Les lésions vestibulaires sont par exemple faites au stade larvaire pré-métamorphose, lorsque le système sensoriel est terminé et totalement fonctionnel et avant la mise en place des réseaux posturo-locomoteurs de la grenouille. Toutefois, certaines interventions sur les organes vestibulaires peuvent avoir lieu plus tôt, avant leur formation.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras dès le sevrage, elles sont soumises à un test de coordination motrice, à des prélèvements sanguins et à l'isolement, pour évaluer si l'exercice volontaire réduit des comportements dépressifs. Le porteur indique que le régime provoque surpoids, fatigue et troubles de la glycémie, et que l'isolement est source de stress. Il affirme que cette approche intégrée ne peut pas être reproduite in vitro et renvoie les retombées, une meilleure efficacité des antidépresseurs, à un usage futur.

Objectifs

L’obésité entraine une inflammation chronique qui altère la santé physique et mentale. Elle favorise notamment la dépression et réduit l’efficacité des antidépresseurs, renforçant ainsi l’intérêt de trouver des stratégies alternatives de traitement et d’en comprendre les mécanismes d’action. Dans ce contexte, l’activité physique est une option prometteuse. Ce projet collaboratif vise à déterminer si l’exercice volontaire peut réduire les comportements dépressifs dans un modèle de dépression inflammatoire (souris sous régime enrichi en graisses). Les mesures seront réalisées dans différents tissus afin d’appréhender l’impact de l’exercice sur les signalisations inter-organes, qui sont rarement prises en compte dans ce contexte. L’objectif sera ainsi d’obtenir une vision intégrée des mécanismes reliant les effets de l’exercice sur la santé mentale et de tester la pertinence de l’exercice dans le cadre d’une médecine personnalisée ciblant la dépression liée à des déséquilibres nutritionnels.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer la connaissance des mécanismes impliqués dans l’effet de l’exercice physique sur la santé mentale en lien avec les désordres nutritionnels. La réduction de l’inflammation par l’activité physique pourrait augmenter l’efficacité des traitements antidepresseurs chez les personnes souffrant d’obésité. Dans une optique de valorisation, nous vérifierons aussi les modifications du microbiote en réponse au régime obésogène et à l’activité en lien avec les comportements dépressifs pour renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique. Ce projet constitue donc une étape essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de la dépression.

Procédures

Tous les animaux subiront des tests non-invasifs pour caratériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur état de stress ou dépression. Nous réaliserons sur animal vigile 3 petits prélèvements de sang (2 gouttes à chaque fois) espacés d’un mois, pour effectuer le dosage du sucre et du lactate dans le sang. Voie et volumes respectant les recommandations. En fin de procédure, l’animal sera anesthésié par injection (voie et volume respectant les recommandations - durée 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux sous régime enrichi en graisse présenteront des symptômes similaires au cas d’obésité chez les humains (mobilité réduite et fatigue à cause du surpoids, problèmes de régulation du taux de sucre dans le sang). L’ensemble des animaux pourront subir du stress lié à l’isolement et lors de la réalisation du test de coordination motrice.

Devenir

Pour mener une étude intégrée et identifier les mécanismes d’interaction liant dépression, inflammation, obésité et activité physique, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure.

Remplacement

Notre procédure intégrée vise à identifier les mécanismes pouvant relier activité physique et réduction de l’état dépressif des animaux ce qui ne peut pas être réalisé in vitro. Il n'est pas encore possible de recréer de manière physiologique la communication inter-organes que nous souhaitons étudier puisque c’est l'impact de l'activité physique sur le métabolisme à travers la connexion des tissus hépatique, musculaires et nerveux via la circulation sanguine que nous observons. De plus, il est impossible d'observer les phénomènes dépressifs sur des cellules en culture. Les approches cellulaires pourront dans un deuxième temps présenter un intérêt pour aller décortiquer les bases biologiques et neurobiologiques des effets que nous aurons observés dans cette première partie plus globale.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel de statistique et des résultats précédents pour le calcul du nombre minimal d’animaux nécessaires dans ce projet. Nous utiliserons un logiciel pour la répartition aléatoire des animaux en lots en nous basant sur leur composition corporelle et leur glycémie. Nous profiterons de cette procédure pour prélever les fèces des animaux afin d’évaluer les modifications du microbiote en réponse au régime riche en graisse et à l’activité physique en lien avec les comportements dépressifs. Ces analyses conduites dans un second temps nous permettrons de renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique et de déposer une demande de projet future. Les données collectées concernant la croissance, la composition corporelle et l’activité physique viendront alimenter notre base de données et pourront servir ultérieurement.

Raffinement

La nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives des souris. Pour le change et la réalisation des tests comportementaux, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués afin de réduire le stress. Les animaux seront préalablement habitués aux différents tests. Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des obèses, nous utiliserons une grille de suivi adaptée avec des points limites. Nous avons défini des points limites ainsi que la conduite à adopter pour chaque situation pour éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles et femelles nourries dès le sevrage avec une diète enrichie en graisses (60% de lipides) et qui seront donc en situation d’obésité à leur arrivée. La même diète sera poursuivie pour ces animaux pendant toute la durée de la procédure. Nous avons choisi ce modèle car il est proche de l’obésité humaine sur le plan des causes, et permet de contrôler le degré d’obésité grâce à la durée et la période d’exposition à la diète riche en graisses. Tout comme ce qui est rapporté chez l’Homme, ce modèle est également associé à des troubles métaboliques et au développement d’une inflammation, qui jouent ensemble un rôle majeur dans les conséquences de l’obésité sur la santé physique, mais également mentale, en particulier les symptômes de dépression. Pour avoir des animaux développant le syndrôme métabolique (obésité, troubles de la glycémie) et dépressif, nous utiliserons des animaux ayant suivi un régime obèsogène pendant 12 semaines. Ce régime étant dispensé chez notre fournisseur à partir de l’âge de 4 semaines, nous commanderons donc des animaux âgés de 16 semaines à réception.

8 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent trois anesthésies générales avec des injections dans sept sites musculaires puis des biopsies, et huit prélèvements sanguins vigiles, pour tester une thérapie génique visant à réduire l'expression de DNM2 dans les myopathies centronucléaires. Ces chiens porteurs d'une mutation spontanée ne seront pas tués à l'issue mais réutilisés dans d'autres procédures, en concertation avec le vétérinaire. Le porteur décrit le chien comme la "seule espèce disponible" reproduisant la mutation humaine et renvoie les retombées pour les patients à un éventuel essai ultérieur sur de jeunes chiens.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont un groupe de maladies humaines rares, liées à des mutations dans différents gènes mais ayant en commun des lésions du muscle typiques, une faiblesse musculaire et une perte de masse musculaire. Parmi les gènes en cause, celui codant pour la dynamine 2 (DNM2) subit des mutations qui rendent la protéine qu'il code plus active. Récemment, il a été démontré sur des modèles in vitro et dans des modèles murins, que la diminution de l'expression de DNM2 permet d'apporter un bénéfice thérapeutique très important, non seulement dans le cas de la myopathie centronucléaire liée à DNM2, mais aussi dans des myopathies centronucléaires liées à d'autres gènes, même la forme la plus sévère. Cette approche pourrait donc constituer une thérapie génique commune pour tout ce groupe de maladies rares, offrant une solution thérapeutique plus réaliste de mise en œuvre qu’une thérapie gène par gène, qui signifie parfois famille par famille. Il y a quelques années, un cas de CNM a été décrit chez un chien Border Collie de compagnie, dont la mutation causale se trouve dans le gène DNM2 et est identique à la mutation la plus fréquemment diagnostiquée chez les patients humains atteints d'une myopathie centronucléaire liée à DNM2. De par l'intérêt potentiel de cette mutation canine, et dans l'optique d'un essai de thérapie génique à haut potentiel de translation chez le patient humain, du sperme de ce chien a été congelé, à partir duquel une première portée a été générée, qui a permis de valider le fait que cette mutation était bien responsable d'une CNM chez tous les animaux porteurs. Chez les 4 animaux porteurs, une myopathie peu invalidante, lentement évolutive a été caractérisée. En parallèle, une approche de thérapie génique innovante permettant de réduire les niveaux de DNM2 a été mise au point et validée in vitro sur des cellules issues des 4 animaux porteurs. Ce projet a pour objectif de réaliser une première validation in vivo de cette approche thérapeutique, via des injections locales (intramusculaires) avant d’envisager des administrations systémiques sur de jeunes animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir une première évaluation de l'efficacité in vivo d'une approche de thérapie génique validée in vitro. Si l'efficacité est démontrée suite à ces injections locales (diminution de l'expression de DNM2 et amélioration de l'état du muscle), l'association la plus efficace sera testée dans un essai sur de jeunes chiens traités par voie générale, afin d'évaluer la capacité de ce traitement à stopper l'évolution de la maladie.

Procédures

Les chiens seront soumis à : - 3 anesthésies générales au cours desquels ils subiront des injections intra-musculaires (7 sites d'injection), puis des biopsies musculaires (durée de chaque intervention : 2 heures) - 8 prélèvement sanguins, vigiles. Durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux en lien avec le projet sont les suivantes : - Anesthésies générales répétées (nuisance modérée). - Abords chirurgicaux musculaires répétés, et risques de complications post-opératoires associées (même si très peu probables : infection du site opératoire, sutures qui ne tiennent pas, collection liquidienne sous-cutanée, hématome). - Confinement en zone d'hébergement spécifique (obligatoire suite à injection de vecteur viral) entraînant un arrêt durant une semaine des sorties quotidiennes dans les cours de détente.

Devenir

Les animaux concernés étant des animaux malades, ils ne pourront pas être replacés. Leur réutilisation sera envisagée, en concertation avec le vétérinaire en charge de l'animalerie.

Remplacement

Les produits de thérapie génique testés dans ce projet ont fait au préalable l'objet d'une validation in vitro. Leur efficacité doit dorénavant être testée in vivo dans un muscle mature afin de déterminer si l'efficacité observée in vitro peut être reproduite in vivo, permettant alors d'envisager un traitement par voie générale.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans le projet a été réduit au minimum nécessaire pour démontrer une efficacité de la thérapie génique au niveau de celle observée in vitro, et avec la même variabilité.

Raffinement

Les procédures chirurgicales mises en oeuvre seront réalisées sous anesthésie générale, et acompagnées d'une analgésie adaptée (morphiniques). Un soin important sera apporté aux gestes chirurgicaux afin d'éviter toute complication post-opératoire. Malgré cela, les plaies seront inspectées quotidiennement afin de détecter d'éventuelles complications le plus précocement possible. Des points limites adaptés à ces possibles complications ont été établis, permettant leur prise en charge rapide. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient d'interactions quotidiennes avec l'Homme et de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges, à l'exception de la semaine d'hébergement en zone confinée de niveau 2 suite aux injections du vecteur viral de thérapie génique. En compensation, du temps supplémentaire sera consacré par les zootechniciens pour des interactions avec les chiens durant cette période.

Choix des espèces

Le chien est la seule espèce disponible actuellement présentant spontanément la mutation dans le gène DNM2 la plus fréquemment rencontrée chez les patients atteints de myopathie centronucléaire liée à DNM2, et reproduisant le phénotype des patients atteints par cette maladie. Par ailleurs, des modèles canins spontanés de plusieurs autres CNM sont disponibles et l'un d'entre eux a récemment permis de motiver l'initation d'un essai clinique de thérapie génique. Si la stratégie de réduction de DNM2 par l'approche de thérapie génique testée ici s'avère effiace dans le modèle canin DNM2, elle pourra donc être élargie à d'autres modèles canins de CNM pour fournir une preuve de concept pré-clinique robuste permettant de poser les jalons d'un essai clinique chez les patients atteints de CNMs. Les animaux seront des adultes d'âge moyen (5 ans), car il s'agit d'animaux disponibles, dont l'état clinique est stable et compatible avec la mise en oeuvre de ce projet.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou une injection intraveineuse de bactéries Escherichia coli, avec prélèvements de sang, avant mise à mort pour récupérer leurs cellules immunitaires, afin d'étudier le rôle d'un gène dans l'inflammation liée à l'infection. Le porteur indique attendre une inflammation systémique accompagnée de douleurs légères à modérées environ une semaine après l'injection. Sur le remplacement, il décrit des résultats obtenus in vitro sur cultures de cellules, mais juge la vérification in vivo chez la souris nécessaire.

Objectifs

Les maladies infectieuses représentent un enjeu majeur en santé publique. Nous choisissons d’étudier l’impact d’une infection à Escherichia coli (E.coli), une bactérie connue pour augmenter la sévérité de l’infection et engendrer des septicémies dans le cas où l’infection est mal traitée, traitée tardivement ou en cas de résistance aux antibiotiques. Sans traitement, la plupart des personnes qui souffrent de septicémie meurent. L’infection à E.Coli peut également induire d’autres conséquences moins graves tels que des infections urinaires ou des péritonites, constituant un état inflammatoire souvent non traité malgré l’utilisation d’antibiotique limitant le développement des bactéries mais pas les conséquences de l’infection. Il est donc nécessaire de mettre au point des traitements innovants pour lutter contre l’inflammation successives à l’infection. Pour cela, une meilleure connaissance du dialogue entre les bactéries et l’hôte qu’elles infectent est indispensable pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prévention et prise en charge. Nous avons récemment identifié un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique jouer un rôle anti-inflammatoires dans des macrophages murins pour lesquels ce gène a été invalidé. Notre projet vise confirmer ces résultats dans un modèle de souris chez lesquelles la fonction de notre gène d’intérêt a été sélectivement supprimé dans les cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Nous voulons étudier l'impact de la déficience de notre gène d’intérêt sur la dynamique infectieuse des cellules immunitaires et son lien avec les conséquences inflammatoires de l’infection bactérienne à Escherichia coli sur les organes de la souris. Ce travail pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans l’inflammation induite par l’infection à Escherichia coli et ainsi d’identifier un nouvel acteur participant aux conséquences pathologiques de cette infection (i.e, septicémie, infections urinaires, diarrhées ou péritonites) afin d’en limiter les effets

Procédures

Par animal, sur 120 animaux : une contention (10 secondes) afin de réaliser une injection intrapéritonéale. Les animaux seront ensuite euthanasiés 48h post-injection afin de procéder au lavage péritonéal afin de récupérer les cellules immunitaires. Par animal, sur 120 animaux : une contention (30 secondes) par animal afin de réaliser une injection intraveineuse de bactéries. Par la suite, deux contentions (1 minute) afin de réaliser les prélèvements sanguins aux temps 6h et 24h.

Impact sur les animaux

Les nuisances expérimentales prévues sur les animaux sont celles liées : à leur manipulations/contentions qui peuvent générer du stress ou de l’anxiété ; aux douleurs légères causées par les injections intrapéritonéales ; aux douleurs légères causées par les injections intraveineuses et les prélèvement sanguins. Aucun effet adverse n'est attendu pendant le croisement des souris, puisque qu’aucun phénotype n'est dommageable. Des signes pathologiques accompagnées de douleurs légères à modérées sont généralement attendus beaucoup plus tard (i.e, après une semaine) correspondant à une inflammation systémique.

Devenir

L‘ensemble des animaux des deux procédures seront euthanasiés afin de pouvoir prélever les cellules immunitaires et certains organes pour quantification et analyses et pour la réalisation d‘expérimentations moléculaires et cellulaires in- vitro.

Remplacement

L’absence d’un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique infectieuse des cellules immunitaires a récemment été identifié dans un modèle d’invertébrés suggérant un rôle anti-inflammatoires en réponse à une infection bactérienne. Des expériences réalisées in vitro ont confirmé le rôle anti-inflammatoire de ce gène d’intérêt lors de la stimulation de cultures de cellules immunitaires de souris qui démontrent une meilleure capacité d’élimination des bactéries. Ces expérience suggèrent que l’invalidation du gène d’intérêt identifié pourrait permettre de lutter contre les conséquences pathologiques d’une infection bactérienne. Il convient maintenant de vérifier ces données in vivo chez la souris dans un contexte d’infection bactérienne intégrant les interactions multi-organes.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible grâce à l’expertise et aux précèdent résultats de l’équipe infectieux du centre. Pour obtenir une puissance statistique suffisante par un test ANOVA ou de Student bilatérale entre les groupes, nous avons déterminé que 15 souris par groupe et par sexe seraient nécessaires ; cette estimation a été calculée grâce à un logiciel de biostatistique.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites en particulier lors des deux procédures sur des temps courts (24h-72h). Cinq paramètres seront étudiés : perte de poids mesurée au moment de chaque injection et/ou prélèvements, apparence physique, comportement, comportement dû à l’injection et/ou au prélèvement et état des sites d’injection et de prélèvement lors de cette procédure. La perte de poids sera mesurée toutes les 48h par rapport au poids de la souris avant injection. Concernant les points limites, un niveau trop élevé de douleur, par rapport aux scores, conduira à l’euthanasie de l’animal. Dans le cas où des signes de mal-être ne nécessitant pas d'euthanasie s’accumulent, tels qu’une perte de poids >20% (par rapport au poids initial), des égratignures, une agitation et des irritations cutanées, une prise en charge de chaque point individuellement sera réalisé (telle que la désinfection avec de la vétédine) et les souris seront suivies régulièrement sur 24h pour déterminer si leur état est temporaire ou les prémices d’un score supérieur.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris car : 1) c’est un modèle largement reconnu dans la communauté scientifique pour sa pertinence dans l’analyse des réponses inflammatoires aux infection bactériennes 2) Les techniques de modifications génétiques ciblées disponibles chez la souris permettent de mettre en évidence l'implication de certains gènes dans des mécanisme physiopathologiques au sein de population cellulaire spécifiques. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 8 à 20 semaines dont le système immunitaire est mature.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragment tumoral sous la peau ou une injection de cellules tumorales issues de tumeurs pédiatriques, puis jusqu'à trois traitements par jour et des prélèvements de sang hebdomadaires, pour étudier le sarcome d'Ewing et chercher des cibles thérapeutiques. Le porteur indique que les tumeurs greffées ne devraient pas provoquer de gêne particulière et que les prélèvements au niveau de la joue entraînent une douleur brève. Sur le remplacement, il décrit des travaux in vitro et en microfluidique déjà menés, mais conclut que les modèles murins restent "nécessaires" avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Pour la compréhension de la biologie des tumeurs pédiatriques telles que le sarcome d’Ewing et les sarcomes Ewing-like, il est important d’étudier : 1) la structure 3D de la chromatine (structure de l’ADN compacté) avec les modifications et l’accessibilité de cette structure dans les cellules cancéreuses. 2) les marques épigénétiques (modifications chimiques de l’ADN et des protéines associées qui permettent la régulation de l’expression des gènes) et 3) l’expression des gènes. En effet, il existe très peu d’étude sur ce sujet et en ce qui concerne les sarcomes d’Ewing-like il n’en existe aucune. Cela est dû au fait qu’il n’existe qu’une seule lignée cellulaire établie à partir de PDX d’un sarcome d’Ewing-like avec une fusion particulière, mais aucun autre modèle n’est établi pour les autres types de fusion que nous souhaitons étudier. Le seul moyen de pouvoir les étudier et d’établir des lignées cellulaires, est la génération de modèle PDX. Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro en utilisant la technologie de CRISPR qui permet d’invalider un gène ou via une banque de petite molécule approuvée par la FDA, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.

Procédures

Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.

204 cailles japonaises vont être utilisées, 94 tuées pour prélèvement de tissus et 110 femelles remises à des professionnels de la filière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles, hébergés seuls, subissent des prélèvements de semence trois fois par semaine et un stress chronique de trois semaines fait de stimulations négatives imprévisibles, suivis de tests de peur comme l'immobilité tonique. Le porteur affirme que ce protocole n'induit ni douleur aiguë, ni perte de poids, ni apathie chez les oiseaux. Le projet vise à mesurer si un stress subi par le père se transmet à sa descendance via l'ARN des spermatozoïdes.

Objectifs

Alors que l’importance de la mère dans la transmission d’un phénotype à sa descendance a largement été étudiée chez beaucoup d’espèces, la part du mâle reste largement méconnue. Récemment, il a été montré que des souris mâles stressées avant accouplement transmettaient leurs comportements liés au stress à leur descendance et que cette transmission était liée au contenu en ARN des spermatozoïdes. Une telle transmission d’effets paternels liés au stress reste à démontrer chez les oiseaux, alors qu’elle peut avoir des répercussions importantes sur le comportement et le bien-être de ces animaux, notamment des espèces d’élevage. Les objectifs de ce projet sont donc de (1) évaluer, chez des oiseaux domestiques, si des effets paternels liés au stress peuvent être transmis à la descendance et si c’est le cas (2) identifier les ARN spermatiques potentiellement impliqués dans cette transmission.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de démontrer pour la première fois dans une espèce aviaire l’existence de la transmission d’effets paternels et d’évaluer l’importance des ARN spermatiques dans cette transmission.

Procédures

Des prélèvements de semence sont prévues sur animaux vigiles à raison de trois fois par semaine, entre 8 et 25 semaines d'âge (50/mâle). Les animaux seront soumis à un stress chronique de trois semaines à partir de 11 semaines d'âge (1/animal). Différents stress comportementaux (immobilité tonique - 5 min/1 fois par âge, test d'exploration - 5 min/1 fois par âge, test d'émergeance - 5 min/1 fois par âge) seront utilisés pour évaluer l'effet du stress chronique. Ces tests seront appliqués à l'âge adulte sur tous les animaux et à 3 semaines uniquement sur les animaux de première génération.

Impact sur les animaux

Afin de contrôler finement la reproduction des animaux (prélèvement de semence et ponte), l’hébergement en cage individuelle est nécessaire notamment pour éviter l'agressivité des animaux matures sexuellement. Les mâles seront donc hébergés en cage individuelle et les femelles en groupe de 4. Chez les mâles, le prélèvement de semence reste un acte non invasif chez cette espèce. Afin de limiter au maximum le stress lié à la manipulation, seuls trois prélèvements seront effectués par semaine, entre le début de maturité sexuelle (âge= 8 semaines) et les inséminations (âge= 25 semaines). Les femelles seront passées en cage uniquement sur la période de reproduction entre 11 et 20 semaines. Les inséminations artificielles sont des procédures classiquement développées en élevage. Nous limitons cependant le nombre d’insémination à quatre par mois afin de limiter tout stress lié à la manipulation excessive des individus. Le stress chronique est induit par une accumulation de stimulations négatives délivrées de manière imprévisible sur une durée de 3 semaines ( à partir de 11 semaines de vie). Cependant, aucune des stimulations choisies n’induit de douleur aigue et c’est l’accumulation de ces stimulations et leur caractère imprévisible qui induit l’état de stress. Les études menées ont montré que ce protocole n’entrainait pas de perte de poids significative, d’apathie ou de signe évident d’état douloureux chez nos oiseaux. De même, les procédures d'évaluation du stress (tests comportementaux) n'induisent aucune douleur aigüe et n'entrainent aucune perte de poids, apathie ou signe évident d’état douloureux chez nos oiseaux.

Devenir

Les mâles seront euthanasiés pour prélèvement de tissus (60 individus F0 et 30 individus F1). Les femelles seront replacées auprès de professionnels de la filière (110 animaux).

Remplacement

Ce projet concerne la reproduction d’espèces aviaires. A l’heure actuelle, aucune alternative in vitro n’existe pour la production de spermatozïdes fécondants ou de fécondation in vitro chez ces espèces et aucune autre alternative n'existe pour évaluer l'impact du stress sur les individus.

Réduction

Ce protocole est un projet innovant, pour lequel nous n'avons pas de données préliminaires. Cependant, d'après nos expériences précédentes, nous savons que des groupes de 10 mâles, avec au moins 4 femelles par mâle, est nécessaire pour mettre en évidence un effet sur la fertilité de la caille. De plus, pour l'exploration des effects moléculaires au niveau du spermatozoïde, un effectif minimal de 22 individus par groupe est nécessaire (pour des analyses exploratoires et candidates). Ces animaux sont obligatoirement à ajouter à ceux impliqués pour l'évaluation de la fertilité car un même échantillon de semence ne pourra être utilisé que pour un seul objectif scientifique. Au total, 64 mâles et 80 femelles sont donc concernés. Afin de vérifier l'impact du stress chronique, des tests de comportement seront effectués. D’après nos expériences précédentes où nous avons étudié chez la caille japonaise les conséquences comportementales du stress, des effectifs de N= 15 individus par groupe est nécessaire. Au total, l'ensemble de mâle F0 (n=64) et les 30 mâles et 30 femelles sont concernés.

Raffinement

Les animaux seront élévés au sol sur copeaux jusqu'à leur puberté (âge = 8 semaines) où ils seront passés en cage afin de controler la reproduction et de permettre le prélèvement de semence. Pendant toute la durée d'élevage (au sol comme en cage), les animaux auront un contact visuel, olfactif et sonore entre eux. Une phase d'habituation au prélèvement de semence sera effectuée sur les mâles par massage dorsal depuis l’âge de 8 semaines afin de limiter tout stress lié à la manipulation. Aucune douleur aigüe n'est attendue suite au protocole de stress chronique. Cependant, tout signe de stress accru notamment lié aux manipulations répétitives est fortement surveillé. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.

Choix des espèces

La petite taille, la prolificité et la rapidité de renouvellement des générations font de la caille un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, ainsi que pour l'analyse d'effets intergénérationnels. De plus, ces animaux sont connus pour être sensibles au stress et il existe chez cette espèce, les biotechnologies nécessaires pour étudier la biologie du spermatozoïde. Les animaux doivent être matures sexuellement afin d’étudier leur reproduction, soit entre 8 et 25 semaines d’âge.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit sous anesthésie l'implantation d'un capteur de télémétrie dans la cuisse, puis reçoit deux fois par semaine des injections de molécules agissant sur la sérotonine, dans un criblage visant à moduler la pression artérielle après une lésion de la moelle épinière. Le porteur indique que les molécules testées disposent d'une autorisation de mise sur le marché et n'attend que des hausses transitoires de pression, et précise que chaque rat est utilisé dans dix à douze expériences avant d'être tué pour récupérer le capteur, opération impossible sans détruire l'artère fémorale. Il justifie le rat par sa taille, qui facilite la chirurgie, et par la continuité avec un projet antérieur.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52,5 cas/million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensori-moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes cliniques comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles cardiovasculaires contribuent à 40 % des décès chez les patients blessés. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats avec ces blessures, l'administration quotidienne d'un agoniste (molécule qui reproduit les effets d’un neurotransmetteur) de la sérotonine (5HT, molécule fonctionnant sur certains récepteurs du système nerveux central) favorise la récupération de la locomotion. Outre ce rôle démontré dans le contrôle moteur, la 5HT joue également un rôle dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module entre autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Cela nous a conduit à développer un protocole expérimental basé sur l'utilisation chronique d'agonistes 5HT, comme cela a été fait pour la locomotion. Notre précédente étude est partie de cette hypothèse. Dans ce cadre des animaux présentant une lésion de la moelle épinière dite haute ont été traités de façon pendant 28 jrs avec la quipazine, un agoniste 5HT, et les résultats ont confirmés les précédentes études sur la récupération locomotrice mais ont aussi mis en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires (fréquence cardiaque et pression artérielle). Dans ce cadre et en collaboration avec une équipe de médecins en rééducation fonctionnelle de l’hôpital, nous souhaiterions mettre en place une étude clinique. Si notre molécule est complexe à mettre en œuvre chez l’humain car pas encore utilisée en routine, nous savons que des molécules 5HT sont régulièrement utilisées pour soigner d’autres troubles. Nous voudrions donc faire un criblage des molécules connues, et tester si en injection unique, certains effets seraient similaires à ceux de notre molécule. Cette pré-étude permettrait de réduire de beaucoup les animaux utilisés dans un futur projet avec la nouvelle molécule sélectionnée.

Bénéfices attendus

Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Afin de pouvoir plus rapidement lancer une étude clinique, nous recherchons ici, une molécule pharmacologiquement similaire mais déjà utilisée en routine chez l'humain dans d'autres domaines. Le bénéfice a court terme, nous l'espérons, est l'amélioration des conditions des patients atteints de lésions de la moelle épinière (diminution du nombre de dysreflexie autonome, augmentation de la pression artérielle et diminution de la fréquence cardiaque).

Procédures

Chaque animal (24 animaux au total) subira une chirurgie d’implantation d’un capteur de télémétrie en fémoral. Ce capteur leur permettra d’être libre de leur mouvement dans la cage. Cette chirurgie durera 1h sous analgésie et anesthésie. Ils seront ensuite injectés 2 fois par semaine en sous-cutanée. Ces moélcules sont des agonistes serotoninergiques (molécule fonctionnant sur certains récepteurs du système nerveux).

Impact sur les animaux

Les molécules testées sont toutes avec une autorisation de mise sur le marché et donc avec des effets secondaires minimes, connus et validés par l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) ou par un comité d'éthique pour les études cliniques. Nous prévoyons d'observer des augmentations transitoires et modérée de pressions artérielle ou de ne rien observer. Les animaux pourront éprouver de la douleur post-opératoire malgré un suivi poussé et un protocole mis au point avec des vétérinaires. La chirurgie est peu invasive et cet état est très transitoire.

Devenir

Il est nécessaire de récupérer les capteurs et cela ne peut se faire sans abimer de façon définitive l'artère fémorale.

Remplacement

Le système serotoninergique est complexe avec une quinzaine de types ou sous-types de récepteurs différents et se retrouve à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modèle de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet.

Réduction

Les animaux seront réutilisés sur 10 à 12 expérimentations soit de leurs 8 semaines d'âge à leur 20 semaines d'âge. Ainsi la réutilisation des animaux sur l'ensemble des molécules ici testées va permettre de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés dans le projet. De plus, les animaux seront des individus excédentaires d'élevage interne (tant que possible). Les analyses statistiques seront des comparaisons non paramétriques de type Kruskall-Wallis suivi de test ad-hoc avec correction de type Bonferroni.

Raffinement

La procédure de chirurgie a été mise au point avec 2 vétérinaire dont un extérieur et raffiné au fur et à mesure de notre expérience. Elle est faite sous anesthésie et analgésie, avec une perfusion pour éviter la déshydratation, sous contrôle de la température et avec des personnes compétences et qui se sont formés au sein d’un centre de chirurgie. Une fois implantés les animaux sont totalement libres de leurs mouvements et n’ont aucune contrainte malgré des enregistrement de pression artérielle en cours. Les animaux seront hébergés par deux dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification).

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat car il est notre modèle sur le précédent projet et le sera sur le prochain lorsqu’une ou des molécules de choix auront été déterminées. Précédemment le rat avait été choisi car le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et SCI). Nous utiliserons les animaux dès leurs 8 semaines d'âge soit à l'âge adulte. Nous ne les garderons pas au-delà de 20-21 semaines pour rester dans le cadre du précédent projet.